designer steroids
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Designer Steroids
Corso di Chimica Analitica V
A.A. 2012/2013
Dalle Luche Greta
Dilillo Marialaura
Lari Matteo
Introduzione
Per Designer Steroids si intendono tutti i composti steroidei non reperibili commercialmente e impiegati come sostanze dopanti.
Comprendono molecole studiate per la ricerca farmaceutica e mai giunte sul mercato oppure, meno frequentemente, di steroidi appositamente sintetizzati.
Cos’è uno steroide anabolizzante?
Effetto anabolizzante – incremento della produzione di proteine, lipidi complessi e polisaccaridi.
Effetto androgenico – comparsa di caratteri sessuali secondari maschili.
1986. Heidi Krieger atleta della RDT sottoposta a sua insaputa, all'assunzione di steoidi.
La struttura chimica degli steroidi
Storia dei designer steroids
2002 – Norbolethone – Don Catlin
2003 – Tetrahydrogestrinone – Don Catlin
2004 – Madol – Michael Sekera
2002 – Norbolethone – Don Catlin
Ormone della crescita sintetizzato nel 1966 ma mai commercializzato per motivi di tossicità
Catlin et al. Rapid Comm Mass Spectr 2002, 16
2003 – Tetrahydrogestrinone – Don Catlin
Steroide anabolizzante sintetizzato da Partick Arnold come sostanza dopante per aggirare i controlli antidoping.
Catlin et al. Rapid Comm Mass Spectr 2004, 18
Caso BALCO: il commercio illegale del THG fu scoperto in seguito alla denuncia anonima di Trevor Graham, un
preparatore atletico, che inviò anonimamente alla USADA una siringa contenente lo steroide. Il laboratorio fu chiuso e
il suo presidente, Victor Conte, e il chimico organico responsabile delle sintesi, Patrick Arnold, incarcerati.
2004 – Madol – Michael Sekera
Desoxymethyltestosterone con forte effetto anabolizzante negli animali sintetizzato nel 1961, mai commercializzato perché causa danni epatici ed ipertrofia cardiaca.
Sekera et al. Rapid Comm Mass Spectr 2005, 19
Procedura generale d’analisi: matrici
Urine – poco invasiva, facilmente conservabile
Sangue – invasiva, richiede presenza di personale medico specializzato
Capelli (meno diffusa) – vantaggio di monitorare nel tempo l’assunzione di sostanze dopanti
Procedura generale d’analisi: riferimenti
Materiali certificati (quando disponibili)
Bianchi spikati con opportune aliquote di reagenti puri
Campioni reali da studi di escrezione – campioni di matrice biologica ottenuti dopo somministrazione di una sostanza proibita o di un metodo proibito (numero consistente di dati)
Procedura generale d’analisi: trattamento del campione
Tampone fosfato (Ph=7.0) Idrolisi enzimatica (β-glucuronidasi) 50°C/1h
Tampone carbonato/bicarbonato di sodio(Ph=9.5) Estrazione liq-liq (pentano, etere, tert.-butil metil etere)
Portato a secco e ripreso con i solventi di eluizione (+ deriv. per GC-MS)
Donike et al. Deutsche Zeitschrift Sportmed. 1984; Catlin et al. Rapid Co mmun. Mass Spe ctro m. 20 04; Sekera et al. Rapid Co mmun. Mass Spe ctro m. 2005; Thevis et al. J. Mass Spectrom 2005 ;Costas et al. Rapid Comm. Mass Spectrom. 2007; Mazzarino et al. Anal. Biochim Chem 2008
La maggior parte degli steroidi anabolizzanti è escreta dal corpo sotto forma di glucuronide. Il trattamento enzimatico risulta necessario per rimuovere la coniugazione tra l'anello A dello steroide e la molecola di acido glucuronico.
Procedura generale d’analisi: le tecniche
Saggi immunologici
GC-MS HPLC-MS MS/MS GC-IRMS
Tecniche spettroscopiche (es. NMR)
Problema analitico
Nel caso dei designer steroids l’analita è potenzialmente sconosciuto e, senza opportuni accorgimenti, non è possibile individuarli con metodi di analisi convenzionali.
Necessità di metodi analitici che permettano la determinazione di
steroidi sconosciuti.
Esempi di metodi analitici
Mazzarino M., Turi S., Botre F. “A screening method for the detection of synthetic glucocorticosteroids in human urin by liquid chromatography-mass
spectrometry based on class-characteristic fragmentation pathways” Analytical and Biochimical Chemistry 2008, 390
Nielen M. W. F., Bovee T.F.H., van Engelen M. C., Rutgers P, Hamsers A. R. M., van Rhlyn J. A., Hoogenboom L. A. P.“Urine testing for Designer
Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification”
Analytical Chemistry 2006, 78
Thevis M., Geyers H., Mareck U., Schänzer W. “Screening for Unknown Synthetic Steroids in Human Urine by Liquid Chromatography-Tandem
Mass Spectrometry” Journal of Mass Spectrometry 2005, 40
“A screening method for the detection of synthetic glucocorticosteroids in human urine by liquid
chromatography–mass spectrometry based on class-characteristic fragmentation pathways”
13 glucocorticosteroidi + Deflazacort (ISTD)
Campioni positivi d’urina ottenuti da studi d’escrezione forniti dal laboratorio WADA di Cologne
Sistema HPLC-ESI-QqQ in modalità Precursor Ion Scan
“A screening method for the detection of synthetic glucocorticosteroids in human urine by liquid chromatography–mass spectrometry based on class-characteristic fragmentation
pathways ”
Procedura sperimentale – Pretrattamento campione
• Tampone fosfato pH 7,4• 50μL β-Glucurunidasi • Alcalinizzazione, 1 ml
Tampone carbonato (pH=9)
Idrolisi50°C per 1h
3mlCampione
Estrazione
Ripreso in 50µl di fase mobile
• 10mL tert-butilmetiletere• Evaporazione a secchezza
IniezioneHPLC (15µl)
“A screening method for the detection of synthetic glucocorticosteroids in human urine by liquid
chromatography–mass spectrometry based on class-characteristic fragmentation pathways ”
Condizioni d’analisi HPLC
Colonna C18 (2,1 x 150 mm)
Fase mobile (A) Acetonitrile 0,1% Acido Formico(B)Acqua 0,1% Acido Formico
Gradiente di eluizione B: 15%100%
Fase mobile 0,25 mL/min
Spettrometro di massa
Sorgente ESI in modalità positiva
Energia di collisione 30eV
Analizzatore Triplo quadrupolo
Masse per il Precursor Ion Scan
237,2 e 279,4 m/z
“A screening method for the detection of synthetic glucocorticosteroids in human urine by liquid
chromatography–mass spectrometry based on class-characteristic fragmentation pathways ”
Cromatogramma acquisito in modalità precursor ion scan di un bianco fortificato
Cromatogramma acquisito in modalità precursor ion scan di un campione positivo al
Betamethasone
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
Preparazione del campione:
procedura standard. Campione iniettato in 60 uL metanolo, acido acetico(0.1%) contenente 5mM di acetato di ammonio (1:1)
Analisi in sistema LC-ESI-MS/MS in modalità Precursor Ion Scan
Ripetizione dell'analisi in caso di profili sospetti, in modalità Product Ion Scan
Stima dei detection limit
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
Le modificazioni nella struttura degli steroidi solitamente vanno a variare il peso molecolare dei composti, l'elemento sul quale si basa l'identificazione nei test antidoping.
Tuttavia esistono degli ioni secondari che si mantengono invariati dipendentemente dalla posizione della modifica.
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
“Characterization of chemically modified steroids for doping control purposes by electronspray ionization
tandem mass spectrometry” Thevis at al. 2005
21 steroidi, con struttura di 4,9,11-triene, 3-keto-4-ene e 3 keto-1-ene
sono indagati riguardo ai loro cammini di frammentazione
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
“Characterization of chemically modified steroids for doping control purposes by electronspray ionization
tandem mass spectrometry” Thevis at al. 2005
21 steroidi, con struttura di 4,9,11-triene, 3-keto-4-ene e 3 keto-1-ene
sono indagati riguardo ai loro cammini di frammentazione
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
“Characterization of chemically modified steroids for doping control purposes by electronspray ionization
tandem mass spectrometry” Thevis at al. 2005
4,9,11-triene (analoghi del gestrinone)
m/z 241 e 199
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
“Characterization of chemically modified steroids for doping control purposes by electronspray ionization
tandem mass spectrometry” Thevis at al. 2005
4,9,11-triene (analoghi del trenbolone)
m/z 227 e 249
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
“Characterization of chemically modified steroids for doping control purposes by electronspray ionization
tandem mass spectrometry” Thevis at al. 2005
3-keto-4-ene (analoghi del testosterone)
m/z 109 e 97
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
“Characterization of chemically modified steroids for doping control purposes by electronspray ionization
tandem mass spectrometry” Thevis at al. 2005
3-keto-1-ene (analoghi del 1-testosterone)
m/z 187
Steroidi commericiali scelti come modelli:
Gestrinone
Trenbolone
Testosterone
1-testosterone
5 Steroidi sintetizzati strutturalmente correlati ai modelli:
Ethyltestosterone
Norbolethone
Dihydrogestrinone
THG
Propyltrenbolone
ISTD: d4-THG
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
Steroidi commericiali scelti come modelli:
Gestrinone
Trenbolone
Testosterone
1-testosterone
5 Steroidi sintetizzati strutturalmente correlati ai modelli:
Ethyltestosterone
Norbolethone
Dihydrogestrinone
THG
Propyltrenbolone
ISTD: d4-THGI cromatogrammi dei rispettivi ioni precursoni sono
generati dai composti di riferimento in soluzione 2ug/mL in acetonitrile
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
Steroidi commericiali scelti come modelli:
Gestrinone
Trenbolone
Testosterone
1-testosterone
5 Steroidi sistetizzati strutturalmente correlati ai modelli:
Ethyltestosterone
Norbolethone
Dihydrogestrinone
THG
Propyltrenbolone
Tutti i composti scelti, ad eccezione di Androsterone e Etiocholanone, hanno una consistente affinità protonica grazie alla funzionalità chetonica in posizione 3. La protonazione permette la ionizzazione con interfaccia ESI.La presenza di AcNH4 nella soluzione eluente favorisce la formazione di addotti con l'azoto in composti con una ridotta affinità protonica.
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
Corsa cromatografica
Colonna C18 (5 μm;70x4.0mm)
Fase mobile (A) CH3COOH(0.1%) con 5 mM di AcNH4(B) Acetonitrile
Gradiente di eluizione 0 min: 10%B10 min: 100%B
Spettrometro di massa
Sorgente ESI in modalità positiva
Spray voltage 5500 V Ion source 350°C
Azoto (4.6x10-5 Torr) Gas nebulizzante e di collisione
Analizzatore QqQ (Tandem Massa)
Range precursor scan 250-500m/z
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
Il protocollo genera spettri diagnostici che comprendono i segnali di steroidi endogeni come Androsterone e Etiocholanone. L'osservazione di picchi ulteriori rispetto a quelli dei composti endogeni può significare la presenza di agenti anabolici sconosciuti ma strutturalmente correlati.
Per questo è registrato il cromatogramma, in modalità Precursor Ion Scan di un bianco, cioè un campione di urina negativo.
È stato scelto di lavorare in Base Peak chromatogram. Visualizzando ad ogni punto della corsa solo il frammento più abbondante.
Il protocollo genera spettri diagnostici che comprendono i segnali di steroidi endogeni come Androsterone e Etiocholanone. L'osservazione di picchi ulteriori rispetto a quelli dei composti endogeni può significare la presenza di agenti anabolici sconosciuti ma strutturalmente correlati.
Per questo è registrato un cromatogramma di base analizzando in modalità Precursor Ion Scan un bianco, cioè un campione di urina negativo.
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
Viene analizzato un bianco di urina fortificato con 50 ng/mL di
Gestrinone
Dihydrogestrinone
Ethyltestosterone
Propyltrenbolone
ISTD: d4-THG
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
Viene analizzato un bianco di urina fortificato con 50 ng/mL di
Gestrinone
Dihydrogestrinone
Ethyltestosterone
ISTD: d4-THG
5Precursor Ion Scan
5Spettri di massa
Viene analizzato un bianco di urina fortificato con 50 ng/mL di
Gestrinone
Dihydrogestrinone
Ethyltestosterone
Propyltrenbolone
ISTD: d4-THG
In presenza di picchi non riconosciuti nel cromatogramma ottenuto per Precursor Ion Scan, l'analisi del campione è ripetuta in modalità Product Ion Scan con diversi voltaggi, con lo scopo di ottenere informazioni strutturali dettagliate.
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
Viene analizzato un bianco di urina fortificato con 50 ng/mL di
Gestrinone
Dihydrogestrinone
Ethyltestosterone
Propyltrenbolone
ISTD: d4-THG
In presenza di picchi non riconosciuti nel cromatogramma ottenuto per Precursor Ion Scan, l'analisi del campione è ripetuta in modalità Product Ion Scan con diversi voltaggi, con lo scopo di ottenere informazioni strutturali dettagliate.
Spettro in Product Ion Scan di propyltrenbolone ottenuto a 35 V(M+H)+=313
“Screening for unknown synthetic steroids in human urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry”
“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-
of-Flight Mass Spectrometry Identification”
Campioni utilizzati
• Analisi di campioni di urina maschile e femminile
• Analisi di campioni di urina maschile e femminile fortificati tramite aggiunta di 15ng/ml di THG (designer steroid)
“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-
of-Flight Mass Spectrometry Identification”
Procedura sperimentale
• Pretrattamento campione
• LC/Bioassay
• LC/QTOF
“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-
of-Flight Mass Spectrometry Identification”
Procedura sperimentale – Pretrattamento campione
• Tampone (pH=4.8)• 20μL β-Glucurunidasi e arilsolfatasi• 37°C per una notte
• Lavaggi con tampone pH=4.8, H2O, MeOH:H2O 1:1• Eluizione con 4ml ACN:H2O 90:10 • Preconcentrazione
a 2mL (N2, 40°C)
“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-
of-Flight Mass Spectrometry Identification”
Procedura sperimentale – LC/Bioassay
“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-
of-Flight Mass Spectrometry Identification”
Procedura sperimentale – LC/Bioassay
Corsa cromatografica
Fase stazionaria C18 (5μm; 3.0x150mm)
Fase mobile (A) Acqua:Acetonitrile 10:90(B) Acqua:Acetonitrile 90:10
Flusso 0.4mL/min
Gradiente di eluizione 0min: 65%A, 35%B20min: 100%B
“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-
of-Flight Mass Spectrometry Identification”
Procedura sperimentale – LC/Bioassay
Cultura cellulare- Cultura di cellule di lievito ricombinante contenente il gene per l’espressione sia del recettore umano α-androgeno (AR) e della proteina yeast-enhanced green fluorescent (y-EGFP)- Lievito inserito in terreno di cultura e incubato per 24-48h (30°C)- Conservato a 4°C e, prima dell’utilizzo, aggiunta di 10mL di terreno con agitazione (225rpm) a 30°C per un giorno (fase Log)- Diluzione e aggiunta CuSO4
“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-
of-Flight Mass Spectrometry Identification”
Procedura sperimentale – LC/Bioassay
Piatto con recettore di androgenecità Piatto senza recettore di androgenecità
- 2μL DMSO + 50μL H2O - Su ogni piatto viene depositata una quantità di eluito pari a 20s di corsa cromatografica - 200μL di soluzione di coltura di lievito - Misura dell’intensità di fluorescenza a t=0 (fluorescenza iniziale) e t=24h mediante Cytofluor Series 4000 multiplate well reader (λexc=485nm; λemi=530nm)
“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-
of-Flight Mass Spectrometry Identification”
Procedura sperimentale – UPLC/QTOF
• Portato a secchezza e ripreso con ACN (50μL)• Trasferito nel vial e riportato a secchezza• Ripreso con 30%ACN e 70%H2O e iniettato (20μL)
Corsa cromatografica
Colonna C18 (1.7μm; 2.1x50mm)
Fase mobile (A) Acido formico:Acqua:Acetonitrile 0.2:90:10(B) Acido formica:Acqua:Acetonitrile 0.2:10:90
Gradiente di eluizione 0min: 70%A; 30%B2min: 100%B
Flusso 0.2mL/min
Spettrometro di massa
Sorgente ESI (30V) in modalità positiva
Analizzatore Q-TOF (Tandem Massa)
Energia di collisione 25eV
Range 80-1100m/z
“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-
of-Flight Mass Spectrometry Identification”
“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-
of-Flight Mass Spectrometry Identification”
LC/Bioassay
NO
FINE
CxHyOz nel database?
Confronto riferimento?
FINE
NO
NO
SI
SI
SI
“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-
of-Flight Mass Spectrometry Identification”
Biogrammi
Steroidiendogeni
Steroide esogenoWell Plate m/z [M+H]+ Formula
elementareSteroide
24 289.2170 C19H28O2 Testosterone
31 291.2321 C19H30O2DHT
(metabolita)
34-35 291.2328 C19H30O2 Androsterone
33 313.2173 C21H28O2 ?
“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detection and Electron Quadrupole Time-
of-Flight Mass Spectrometry Identification”
[M+H+]
[313-H2O][295-C2H5]
[313-C4H6O]
97 109
C21H28O2
SteroideIdrossilato
17-idrossi, 13-etil, 11-deidro steroide
17-idrossi,17-etil steroide
Scheletro 4,9,11-triene[C4H15O]
Assenza frammentazioneAnelli A e B
Conclusioni
• Lo studio di metodi analitici per l’identificazione di designer steroids segue di pari passo l’evoluzione di metodi adeguati all’identificazione del maggior numero possibile di sostanze proibite con caratteristiche analoghe. Questa ricerca risulta ancora più rilevante dal fatto che la lista di sostanze proibite stilata dal WADA è una lista “aperta”.• I metodi di analisi proposti infatti risultano utili non solo per la determinazione di designer steroids, ma sono un potente metodo di screening per steroidi esogeni, metaboliti e proormoni.• La presenza di steroidi endogeni all’interno delle urine è rivelata mediante tali metodi di analisi: sono resi necessari accorgimenti per la distinzione tra specie esogene ed endogene
Bibliografia
Gerace E. “Analytical strategies for determining doping agents of the last generation” Tesi di dottorato WADA “”The 2012 prohibited list, international standard” Catlin et al. “Detection of norbolethone, an anabolic steroid never marketed, in athletes’ urine” Rapid
Comm. Mass Spectr. 2002, 16. Catlin et al. “Tetrahydrogestrinone: discovery, synteses, and detection in urine”Rapid Comm. Mass
Spectr. 2004, 18. Sekera “Another designer steroid: discovery, synthesis, and detection of ‘madol’ in urine” Rapid Comm.
Mass Spectr. 2005, 19. Pozo O. et al “Efficient approach for the comprehensive detection oh unknown anabolic steroids and
metabolites in human urine by Liquid-Chromatography- Electrospray-Tandem Mass Spectrometry” Anal Chem 2008, 80
Schänzer W. “Metabolism of anabolic androgenic steroids” Clinical Chemistry 1996, 42 Mazzarino M., Turi S., Botre F. “A screening method for the detection of synthetic glucocorticosteroids in
human urin by liquid chromatography-mass spectrometry based on class-characteristic fragmentation pathways” Analytical and Biochimical Chemistry 2008, 390
Thevis M., Geyers H., Mareck U., Schänzer W. “Screening for Unknown Synthetic Steroids in Human Urine by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry” Journal of Mass Spectrometry 2005, 40
Nielen M. W. F., Bovee T.F.H., van Engelen M. C., Rutgers P, Hamsers A. R. M., van Rhlyn J. A., Hoogenboom L. A. P.“Urine testing for Designer Steroids by Liquid Chromatography with Androgen Bioassay Detction and Electron Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification” Analytical Chemistry 2006, 78
Grazie per l'attenzione
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