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DETECCIÓN MOLECULAR DE CARBAPENEMASAS Dra. Lucía Martínez Lamas. Servicio de Microbiologí a, Complejo Hospitalario Universitario de Vigo. En los aislados de Klebsiella nosocomial se ha detectado un aumento del grado de
resistencia antibiótica durante los últimos 20 años; este
proceso se ha visto facilitado por el hecho de que los genes
que codifican los determinantes de resistencia a antibióticos a
menudo se encuentran en plásmidos transferidos con alta
frecuencia entre las cepas de K. pneumoniae y otros géneros
de enterobacterias, como sucede con las β-lactamasas de
espectro extendido (BLEE) (1).
Dra. Lucia Martínez Lamas
Hasta 1995, la resistencia carbapenem era resultado alteraciones en la
permeabilidad de la pared y/o desrepresiones de AmpC. Desde la descripción de la
primera carbapenemasa cromosómica en 1995 en Japón (Serratia marcescens IMP-1)
(2), hasta la aparición en 2001 de la primera carbapenemasa plasmídica (Klebsiella
pneumoniae KPC) (3) la dispersión de estos determinantes de resistencia se mantuvo
controlada.
Desde la aparición de las enzimas KPC, el número de carbapenemasas plasmídicas
ha proliferado y se han difundido rápidamente hasta convertirse en un problema
global, dispersándose por todo el mundo y siendo responsables de numerosos brotes
nosocomiales (4). Estas enzimas poseen la capacidad de hidrolizar una amplia
variedad de β-lactámicos, incluyendo los carbapenems y cefalosporinas de tercera
generación (5) Lo que supone un aumento el perfil de resistencia de BGNs y la
1991 P. aeruginosa Japón
1995 Serratia IMP-1 codificación plasmídica
R carbapenem: porinas/ AmpC desreprimida, carbapenemasas cromosómicas
2001 K. pneumoniae KPC codificación plasmídica
DISPERSIÓN GLOBAL DE
CARBAPENEMASAS PLASMÍDICAS
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limitación de la utilidad clínica de los carbapenems, considerados antimicrobianos de
última línea en el tratamiento de BGN multirresistentes.
Clasificación general de las carbapenemasas
Los carbapenemasas se han organizado sobre la base de homología de
aminoácidos en el sistema de clasificación molecular de Ambler. Las β-lactamasas de
clase A, C, y D, todos comparten un residuo de serina en el sitio activo, mientras que
las enzimas de clase B requieren la presencia de zinc para la actividad (y por lo tanto
se conocen como metalo-beta-lactamasas). Las clases A, B y D son las de la mayor
importancia clínica entre los patógenos nosocomiales.
Carbapenemasas clase A:
� Primera identificada en 1982 (SME cromosómica en S.marcenscens)
� Inhibidas ác. borónico, no por EDTA.
� Hidrólisis eficiente de todos los beta-lactámicos (incluido aztreonam, menor
hidrólisis de las cefamicinas).
3
� Codificación cromosómica: Serratia marcescens enzyme (SME-1, -2 y -3), no
metalloenzyme carbapenemases (NMC-A), imipenem-hydrolyzing β-
lactamases (IMI-1 Y -2)
� Codificación plasmídica: Guiana Extended-Spectrum (GES): variante de BLEE
hidrolian débilmente carbapenémicos.
Klebsiella pneumoniae carabapenemases (KPC)
� Codificación plasmídica (transposón Tn4401)
� Asociada a resistencia a otros antibióticos (aminoglucósidos,
fluoroquinolonas)
� Altamente transferible
� Once variantes, mayor diseminación: KPC-2 y KPC-3, tipo ST-258.
� Descrita en Enterobacterias, P. aeruginosa, A. baumanii.
� Primera descrita en 1996 en EEUU.
Distribución mundial de carbapenemasa KPC (4)
4
Carbapenemasas clase B: metalo-betalactamasas
� Primera identificada en 1991 Japón (Pseudomonas IMP-1)
� Dependencia de Zn para la hidrólisis eficiente de β-lactámicos
� Inhibición por EDTA, no inhibición por inhibidores de β -lactamasas.
� Hidrolizan todos β -lactámicos excepto aztreonam.
� Identificados numerosos grupos: IMP,
VIM, GIM, SPM y SIM y numerosas
variantes.
� Codificación cromosómica (Aeromonas
hydrophila, Chryseobacterium spp. y
Stenotrophomonas maltophilia).
� Transmisión por integrones y plásmidos (Serratia, Klebsiella,
Pseudomonas, Escherichia, Acinetobacter, Citrobacter y Enterobacter).
Distribución mundial de carbapenemasa IMP,VIM (4)
5
� NDM-1:
� Primera identificada en paciente sueco hospitalizado en India (K.
pneumoniae) 2008.
� Gen localizado en un elemento genético (blaNDM-1 gen) muy
móvil, patrón de difusión más complejo y más impredecible que
KPC.
� Asociado a numerosos determinates de resistencia, sólo
sensible a colistina y tigeciclina.
� Identificada en Enterobacterias (K. pneumoniae, E.coli y E.
cloacae) y Acinetobacter spp.
� Identificada en agua en Nueva Delhi, ¿Balcanes, Reino Unido
reservorios endémicos?
Carbapenemasas clase D: OXACILINASAS
� OXA-40 primera identificada en EEUU en A. baumannii.
� Más de 100 enzimas, hidrólisis preferente oxacilina.
� Inhibición débil por ácido clavulánico, sulbactam o tazobactam, no
existen inhibidores efectivos.
� Hidrólisis poco eficiente de carbapenemes, prácticamente inexistente en
cefalosporinas de tercera y cuarta generación.
� Mayoría codificación cromosómica.
� Enterobacterias (OXA-48, OXA-181), A. baumanii (OXA-23, OXA 24,
OXA-58, OXA-143), P.aeruginosa (OXA-40, OXA-50).
La descripción de la primera OXA-48 se hizo en el 2003 en Turquía,
produciéndose desde entonces la diseminación endémica Europa, Sudeste
mediterráneo y África, se cree que su introducción en Europa está relacionada con los
refugiados de Libia. La primera identificada e España fue en Barcelona en 2009.
Para ver la situación actual y distibución de las distintas
carbapenemasas en Europa, ver “Glasner C, et al.
Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in Europe: a
survey among national experts from 39 countries, February 2013.
Eurosurveillance 2013; 18, 28 (7). Todos los países, en este
estudio de vigilancia, indicaron que el estado epidemiológico era peor que en el 2010,
aumentando el número de países con brotes.
6
Carbapernemasas en España (2012) (8, 9)
Estudios recientes reflejan el aumento en los aislamientos de enterobacterias
productoras de carbapenemasas en nuestro país:
Las NDM-1 en España:
� 2011 cuadro diarreico paciente español tras viaje y asistencia sanitaria
en India: coprocultivo E. coli (CTXM-15 + NDM-1).
� 2012 paciente español apendicitis perforada en India: absceso
abdominal K.pneumoniae NDM-1.
� 2012 colonización rectal gemelos nacidos en Bombay K.pneumoniae
SHV-31 y NDM-1.
Detección de carbapenemasas:
Desde el punto de vista del laboratorio clínico la detección de carbapenemasas es
compleja, debido fundamentalmente a: el grado de expresión de carbapenemasas
variable in vitro y la expresión de fenotipos resultado de varios mecanismos de
resistencia superponibles (4, 9)
Ejemplos de intervalos de CMI variables en cepas productoras de distintas clases
de carbapenemasas:
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TIPO CARBAPENEMASA AB
RANGO
(µg/Ml) % S*
ETP 2-4 0
IMP <1->8 66,3 OXA-48 (n=163)
MEM <1->8 30
ETP 1->4 0
IMP <1->8 15 VIM-1 (n=60)
MEM <1->8 18,3
ETP 4->4 0
IMP <1-2 100 IMP (n=5)
MEM 2->8 20
ETP >4->4 0
IMP 4->8 0 KPC (n=8)
MEM 2->8 25
Enzima MIC (mg/L)
Imipenem Meropenem Ertapenem
KPC 0.5 - >32 0.5 - >32 0.5- >32
IMP/VIM/NDM 0.5- >32 0.5 - >64 0.38 ->32
OXA48/OXA181 0.25 - 64 0.38 -64 0.38 - >32
Perfiles de resistencia resultado de la superposición de varios mecanismos de
forma conjunta:
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A.- Métodos fenotípicos de detección:
A.1.-Recomendaciones de la SEIMC detección fenotípica de resistencias en
bacilos gramnegativos (2011)
*Excepciones: Proteus / Providencia / Morganella, sólo valorar meropenem y/o ertapenem; Enterobacter,
sólo valorar imipenem y meropenem.
Problemas del el test de Hodge:
- Falta de especificidad: falsos positivos en
aislados hiper-AmpC, sobre todo con discos de IPM
o ERT / CTX-M-15 / pérdida de porinas.
- Falta de sensibilidad falsos negativos en
productores de NDM / OXA
EUCAST DESACONSEJA SU USO DESDE 2013
Enterobacterias* Meropenem CMI > 0,5 mg/l Ertapenem CMI > 0,5 mg/l Imipenem CMI > 2 mg/l
Test de Hogde modificado
+ -
No carbapenemasa Estudio de sinergia con inhibidores
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A.2.- Recomendaciones EUCAST 2013:
Algoritmo detección de carbapenemasas
B.- Medios diferenciales / cromogénicos
� Uso sobre colonia o muestra directa (hisopo rectal)
� Medios “caseros”:
� MAC + IMP (1mg/L)
� MAC + disco 10µg ETP / MP/ IMP
� Medios cromogénicos comerciales:
� CHROMagar KPC: Meropenem alta concentración + moléculas
cromogénicas. (S: 43%, E: 67,8%)
� Brilliance CRE (Oxoid): carbapenem + componente cromogénico.
� Chrom ID CARBA (bioMérieux): carbapenem + componente cromogénico.
Limitaciones del uso de medio cromogénicos: baja sensibilidad (límite: 102-103/ml de
UFC en muestra directa), detectan resistentes por cualquier mecanismo, se afectan
por el tiempo de incubación y pérdida de detección de carbapenemasas con débil
hidrólisis (KPC / OXA-48).
.
En los estudios comparativos (10, 11):
� Las tres placas mostraron el mismo límite de detección para KPC y NDM.
� ChromID ESBL y CHROMagar KPC fallaron en la detección de OXA-48
Meropenem, diámetro < 25 mm o CMI > 0,12 mgL en todas las
Enterobacteriaceae
Sinergia solo con APBA / PBA
KPC u otra clase de carbapenemas A
Metala-beta-lactamasas
AmpC (cromo o plas) más pérdida de porinas
Sin sinergia Sinergia solo con DPA /
EDTA Sinergia con APBA /
PBA y cloxacilina
BLEE más pérdida porinas y OXA-48
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� ChromID ESBL fue el único medio para detectar VIM
� Tienen utilidad en brotes.
Estudios de comparación de los métodos descritos:
Cuando se comparan los medios selectivos en agar, MALDI-TOF, PCR y métodos
fenotípicos para la detección de carbapenemasas en enterobacterias, todos los
métodos mostraron deficiencias en la detección, ratificando la necesidad del uso de
métodos genotípicos en los casos negativos o discrepantes para asegurar el resultado.
C.- Detección génica: “GOLD STANDART”
La detección de carbapenemasas por métodos genotípicos puede llevarse a cabo por:
� PCR- multiplex“caseras”: Partiendo de colonias, usando varios juegos de
plásmidos para detectar las principales carbapenemasas.
� PCR multiplex comerciales: Muestra directa/colonia. PCR en tiempo-real
� Micromatrices (microarrays): Partiendo de colonia.
ALTERNATIVA COMERCIAL:
PCR tiempo-real: Microarray:
Experiencia de los autores
En la tabla siguiente se puede apreciar una serie de datos de 10 enterobacterias
productoras de carbapenemasas: 6 K. pneumoniae y 4 Enterobacter cloacae, el origen
de la muestra donde fueron aisladas, las diferentes CMI a tres carbapenemes, los
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resultados del test de Hodge, de dos medios cromogénicos y sus diferencias, y las
enzimas detectadas por PCR casera. (La KPC de control en la PCR fue positiva.)
Organismo Muestra ETP MP IMP Hodge
MEDIO
ChromID
carba
MEDIO
Brilliance
CRE
PCR
K. pneumoniae Orina 8 2 1,5 + + + OXA48
K. pneumoniae Esputo 3 0,5 1,5 + + + OXA48
K. pneumoniae Sangre 32 2 4 + + + OXA48
E. cloacae Orina 0,38 0,094 0,38 ? - + NDM?
E. cloacae Orina 0,75 0,064 0,79 ? - - NDM?
K. pneumoniae Orina >8 >32 >32 + + + OXA-48
K. pneumoniae Catéter >8 NR 2 + + + OXA-48
E. cloacae Orina 4 NR 0,5 ? - + BIC?
K. pneumoniae Fístula 4 2 >16 + + + ??
E. cloacae Orina NR >32 >32 + + + VIM?
La técnica de microarray permitió detectar mecanismos de resistencia que creaban
confusión en los sistemas fenotípicos empleados:
Presencia
CARBA AMPC ESBL gen CARBA gen AMPC grupo CTX-M
NA NA NA NA NA NA
Y Y Y OXA-48 DHA 1,type-15 like*
Y - - OXA-48 - -
Y Y Y OXA-48 DHA 1,type-15 like*
- Y - - ACT/MIR -
- Y - - ACT/MIR -
Y - Y OXA-48 - 1,type-15 like*
Y - - OXA-48 - -
- Y - - ACT/MIR -
Y - Y VIM - -
Y - Y VIM - 9
Y - Y VIM - 9
ORGANISMO PCR RT-PCR MICROARRAY
K. pneumoniae OXA48 OXA CMTX-15, DHA,OXA-48
K. pneumoniae OXA48 OXA OXA-48
K. pneumoniae OXA48 OXA CMTX-15, DHA,OXA-48
E. cloacae NDM? NEGATIVA ACT/MIR
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E. cloacae NDM? NEGATIVA ACT/MIR
K. pneumoniae OXA-48 OXA CMTX-15, OXA-48
K. pneumoniae OXA-48 OXA OXA-48
E. cloacae BIC? NEGATIVA ACT/MIR
K. pneumoniae ?? VIM/NDM SHV+VIM
E. cloacae VIM NR VIM
KPC POSITIVO KPC NR
Comparando los resultados obtenidos por PCR casera (PCR) y RT-PCR (CPE
Checkpoints) todas las K. pneumoniae productoras de carbapenemasas resultaron
concordantes por ambos sistemas. Los resultados de difícil interpretación mediante la
PCR casera se confirmaron como negativos por el sistema a tiempo real, siendo estos
mismos los aislados los productores de cefamicinasa de tipo AmpC detectados por el
microarray.
Conclusiones
� En España estamos asistiendo a un aumento significativo en los últimos años
de bacterias productoras de carbapenemasas, especialmente OXA-48.
� La detección de este tipo de microorganismos en el laboratorio es compleja
aunque ha de considerarse prioritaria.
� Los test fenotípicos puede proporcionar una aproximación para la detección de
carbapenemasas. Los métodos genotípicos son los que confirmarán
definitivamente estos determinantes de resistencia.
� Los sistemas comerciales de PCR a tiempo real o microarray ha permitido el
acceso a los sistemas genotípicos al laboratorio clínico, obteniéndose
resultados con gran rapidez y estableciéndose así medidas preventivas que
limiten la difusión de este tipo mecanismos de resistencia.
Bibliografía
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13
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