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1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR
INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS E NATURAIS
PROGRAMA DE PS GRADUAO EM QUMICA
Samantha Leite da Trindade
DETERMINAO E DISTRIBUIO DE ELEMENTOS-TRAO
EM FRUTAS REGIONAIS
BELM
2010
Livros Grtis
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Milhares de livros grtis para download.
2
Samantha Leite da Trindade
DETERMINAO E DISTRIBUIO DE ELEMENTOS - TRAO
EM FRUTAS REGIONAIS
Belm
2010
Dissertao de Mestrado apresentada para a obteno de grau de mestre em Qumica. Programa de Ps-Graduao em Qumica. Instituto de Cincias Exatas e Naturais. Universidade Federal do Par. rea de concentrao Analtica. Orientadora Prof. Dr. Kelly das Graas Fernandes Dantas
3
4
Samantha Leite da Trindade
DETERMINAO E DISTRIBUIO DE ELEMENTOS - TRAO
EM FRUTAS REGIONAIS
Data da aprovao: Belm PA. 29 - 04 - 2010
Banca examinadora
Prof. Dr. Kelly das Graas Fernandes Dantas
Faculdade de Qumica UFPA Orientadora
Prof. Dr. Regina Celi Sarkis Mller
Faculdade de Qumica UFPA Membro
Prof. Dr. Dulcidia da Conceio Palheta
Instituto de Sade e Produo Animal UFRA- Membro
Dissertao apresentada para a obteno de grau de mestre em Qumica. Programa de Ps-Graduao em Qumica. Instituto de Cincias Exatas e Naturais. Universidade Federal do Par.
5
Dedico esta dissertao aos meus exemplos
de vida, Edson Vasconcelos , Eliana Maria e
Raimundo Pimentel que sempre me estimularam a
dar este grande passo. Estas trs pessoas, com
muita sabedoria, discernimento, bom senso e
dedicao estiveram ao meu lado me encorajando
nas horas difceis e me aplaudindo nos momentos
de glria. Obrigada Sr.Edson e D.Eliana por serem
meus pais e Raimundo Pimentel por ser meu fiel
companheiro. Obrigada por serem profissionais
corretos e competentes, fonte de inspirao, apoio e
ensino dirio.
6
Agradecimentos
Deus por iluminar meu caminho e me dar fora para seguir sempre em
frente.
Aos meus familiares que sempre me deram amor e fora, valorizando meus
potenciais.
s minhas irms (Eliane, Penlope e Rebeca), e sobrinhos (Ana Carolina e
Samuel Henrique) que amo tanto.
A minha orientadora Prof. Dra. Kelly das Graas Fernandes Dantas, por sua
dedicao, pacincia, sensibilidade, apoio e, acima de tudo, exigncia durante
esta jornada.
UFRA, em especial professora Dra. Dulcidia Palheta por ceder os
equipamentos para as anlises.
professora Dra. Regina Celi Sarkis Mller por ceder o seu laboratrio para a
digesto das amostras.
Ao professor Dr. Alberdan Silva, pelas anlises realizadas em seu laboratrio.
minha querida amiga e irmzinha do corao Samara Mescouto pelo seu
apoio, incentivo e pacincia.
Aos meus grandes amigos Aline, Diomar, Emanuelle, Larissa, Lcia Marcela,
Kelly, Rosngela, Vanessa, Marcelo, Fbio Mota, D.Francisca, Raimundinho,
D. Hero, Kiara, Natlia, Flvio, Antnio, Silvana, minha querida Dorazilma, que
sempre me incentivaram e proporcionaram momentos de laser, imprescindveis
ao bom andamento deste estudo.
7
todo grupo de Espectrometria Analtica Aplicada pelo agradvel convvio e
pelo verdadeiro esprito de grupo e em especial Patrcia Nunes e Jnior
Batista pela grande fora que me deram nas frias para o encerramento do
trabalho experimental.
banca pelas valiosas sugestes e trabalho dedico avaliao do presente
trabalho.
Ao rgo financiador FAPESPA pela ajuda financeira para a execuo do
presente trabalho.
E a todos aqueles que de alguma forma contriburam para esta dissertao
torna-se realidade, o meu MUITO OBRIGADA.
8
Algo s impossvel at que algum duvide e prove o contrrio
(Albert Einstein)
9
RESUMO
No presente trabalho foram realizados estudos envolvendo a determinao e
distribuio de elementos-trao em amostras de aa (Euterpe oleracea
Mart.), bacur (Platonia insignis Mart.), castanha-do-par (Bertholletia
excelsa), cupuau (Theobroma Grandiflorum) e pupunha (Bactris gasipaes
H.B.K) por espectrometria de absoro atmica com chama (FAAS). Nos
resultados obtidos para Cu, Fe, Mn e Zn nos digeridos das amostras por FAAS,
o ferro foi encontrado em maior teor (23,4 a 46,2 g g-1) seguido do zinco (6,3 a
46,6 g g-1) e cobre (2,9 a 47,5 g g-1). Baixos nveis de mangans foram
encontrados nas frutas estudadas. O bacuri apresentou um elevado nivel de Fe
(46,2 g g-1) enquanto a castanha-do-par e pupunha mostraram elevados
nveis de zinco (46, 1 e 46,6 g g-1).O fracionamento de Cu, Fe e Zn nas
fraes lipdicas, proticas e nos resduos foi realizado usando extrao slido-
lquido combinada com FAAS. Os valores encontrados mostraram um teor
considervel desses elementos nas fraes lipdicas e proticas de bacuri e
pupunha. Os maiores nveis de cobre, ferro e zinco na amostra de aa foram
obtidos no resduo. A cromatografia de excluso por tamanho (SEC) com
deteco UV e espectrometria de absoro atmica em forno de grafite
(GFAAS) foram usados para investigar a associao de cobre as protenas
presentes na polpa de aa. A concentrao de cobre nos digeridos e no
extrato de protenas foram 10,5 e 0,81 g g-1, respectivamente. Cobre foi
encontrado associado s fraes de protenas correspondentes 0,45, 3,8 e
64,5 kDa. Os nveis de Cu nessas fraes variaram de 0,46 a 17,69 g L-1.Os
resultados obtidos na polpa de aa por cromatografia de excluso por tamanho
com off-line deteco GFAAS mostraram que cobre est associado s
protenas de alta massa molecular, baixa massa molecular e compostos no
proticos.
Palavras-chave: elementos-trao, frutas regionais, especiao, SEC, GFAAS.
10
ABSTRACT
In this present work, studies involving the determination and distribution of trace
elements in aa (Euterpe oleracea Mart.) Bacuri (Platonia insignis Mart.)
Brazil-nut (Bertholletia excelsa), cupuassu (Theobroma grandiflorum) and
pupunha (Bactris gasipaes HBK) samples by flame atomic absorption
spectrometry (FAAS). In the results obtained for Cu, Fe, Mn and Zn in digests
samples, the iron was found in highest content (23.4 to 46.2 g g-1) followed by
zinc (6.3 to 46.6 g g-1) and copper (2.9 to 47.5 g g-1). Low levels of
manganese were found in the fruits studied. Bacuri showed a high level of Fe
(46.2 g g-1) while Brazil-nut and pupunha showed high levels of zinc (46, 1 and
46.6 g g-1). The Fractionation of Cu, Fe and Zn in lipidic and protein fractions
and residues was carried out using solid-liquid extraction combined with FAAS.
The values found showed a considerable content of these elements in lipidic
and protein fractions of bacuri and pupunha. Higher levels of copper, iron and
zinc were obtained in the residue of the aa sample. Size exclusion
chromatography (SEC) with UV detection and furnace graphite atomic
absorption spectrometry (GFAAS) were used to investigate the association of
copper with the proteins present in aa pulp. The concentration of Cu in
digests and extract of proteins obtained were 10.5 and 0.81 g g-1, respectively.
Protein fractions obtained by SEC-UV were collected and Cu was determined
by GFAAS. Copper was found bound in protein fractions corresponding to 0.45,
3.8 and 64.5 kDa. The levels of copper in those fractions varied from 0.46 to
17.69 g L-1. Results obtained for aa pulp by size exclusion chromatography
with off-line GFAAS detection showed that copper is associated to proteins of
high molecular weight (HMW), low molecular weight (LMW) and non-proteic
compounds.
Keywords: Trace elements, regional fruits, speciation, SEC, GFAAS.
11
LISTA DE TABELAS p.
Tabela 1 - Constante de estabilidade de alguns quelatos comuns (relao 1:1
de Ligante e on metal H2O a 20C)....................................................................
15
Tabela 2 - Parmetros instrumentais usados na determinao de Fe, Mn, Cu
e Zn nas amostras de frutas por FAAS..............................................................
33
Tabela 3 - Condies operacionais para SEC usando gradiente isocrtico....... 41
Tabela 4 - Programa de aquecimento do forno de grafite.................................. 43
Tabela 5 - Concentraes de Cu, Fe, Mn e Zn, em g g-1, nas amostras de
aa, bacur, castanha-do-par, cupuau e pupunha e seus respectivos
desvios - padro (n = 3).....................................................................................
44
Tabela 6 - Concentraes de Cu, Fe, Mn e Zn em mg/100 g..........................
Tabela 7 - Tabela Brasileira de composio de alimentos em mg / 100g de
parte comestvel TACO Verso 2 (NEPA / UNICAMP 2006).............................
45
46
Tabela 8 - Tabela Brasileira de composio de alimentos em mg / 100g de
parte comestvel TACO Verso 1(NEPA / UNICAMP 2004)............................
47
Tabela 9 - Contribuio das frutas analisadas como fonte de Cu, Fe, Mn e Zn
para a dieta diria (%VD)* de um adulto.............................................................
48
Tabela 10 - Limites de deteco (mg L-1) e quantificao (mg L-1) para Cu,
Fe, Mn e Zn por FAAS........................................................................................
48
Tabela 11 - Concentrao total de protenas, em mg g-1, nas fraes
proticas de aa, bacur e pupunha e seus respectivos desvios-padro (n =
2).........................................................................................................................
Tabela 12 - Concentraes de Cu, Fe e Zn e a somatria das fraes das
amostras de aa, bacur e pupunha com seus respectivos desvios-padro (n
= 3)......................................................................................................................
49
52
12
LISTA DE ABREVIATURAS
SDS Dodecil sulfato de sdio
HPLC Cromatografia de Lquida de Alta Eficincia
SEC UV Cromatografia de Excluso por Tamanho com deteco no
Ultravioleta- Visvel
GFAAS Espectrometria de Absoro Atmica em Forno de Grafite
FAAS Espectrometria de Absoro Atmica com Chama
rpm Rotao por minuto
HMW High Molecular Weight
LMW Low Molecular Weight
LOD Limite de deteco
LOQ Limite de quantificao
TACO Tabela de Composio de Alimentos
13
LISTA DE FIGURAS p.
Figura 1 - Minerais ligados em diferentes tipos de protenas............................... 12
Figura 2 - Biodisponibilidade relativa de fontes de zinco e mangans................. 19
Figura 3 - Aa (Euterpe oleracea Mart.)............................................................... 20
Figura 4 - Bacur (Platonia insignis Mart.)............................................................. 21
Figura 5 - Castanha-do-par (Bertholletia excelsa).............................................. 22
Figura 6 - Cupuau (Theobroma Grandiflorum).................................................... 23
Figura 7 - Pupunha (Bactris gasipaes Kunth)....................................................... 24
Figura 8 - Diagrama de blocos de um espectrmetro de absoro atmica........ 30
Figura 9 - Espectrofotmetro de feixe simples...................................................... 31
Figura 10 - Esquema de um espectrofotmetro de feixe nico............................ 32
Figura 11 - Determinao dos totais de Cu, Fe,Mn e Zn nos digeridos de aa,
bacur, castanha do par, cupuau e pupunha por FAAS................................
36
Figura 12 - Extrao das fraes lipdicas............................................................ 37
Figura 13 - Extrao da frao protica................................................................. 38
Figura 14 - Concentrao de protena total........................................................... 39
Figura 15 - Distribuio de Cu na frao protica do aa por SEC UV e SEC -
GFAAS.....................................................................................................................
41
Figura 16 - Esquema do sistema SEC-UV.............................................................. 42
Figura 17 - Esquema do sistema off-line SEC-GFAAS........................................ 42
Figura 18 - Porcentagem de Cu, Fe e Zn nas fraes: aa (a), bacur (b) e
pupunha (c)..............................................................................................................
53
14
Figura 19 - Estrutura fosfolipdio (A) e do sulfolipdio (B)....................................... 57
Figura 20 - Perfis cromatogrficos dos padres de protenas ferritina, albumina,
mioglobina e seleno-metionina por SEC-UV a 295 nm...........................................
Figura 21 - Perfil cromatogrfico das protenas presentes no aa por SEC-UV a
295 nm........................................................................................................................................
Figura 22 - Nveis de cobre associados s protenas presentes no aa..................
59
60
61
15
SUMRIO
1 INTRODUO.................................................................................... 1
2 OBJETIVOS........................................................................................ 3
2.1 OBJETIVO GERAL........................................................................... 3
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS............................................................ 3
3 REVISO DA LITERATURA.............................................................. 4
3.1- IMPORTNCIAS BIOLGICAS DO COBRE, FERRO, MANGANS
E ZINCO NO ORGANISMO HUMANO......................................................
4
3.2 - BIODISPONIBILIDADE DOS MINERAIS.......................................... 7
3.2.1 - Biodisponibilidade do Zinco........................................................... 8
3.2.2 Biodisponibilidade do Ferro........................................................... 8
3.2.3 - Biodisponibilidade de Mangans.................................................... 9
3.2.4 Biodisponibilidade do Cobre.......................................................... 10
3.3 FATORES QUE INTERFEREM NA BIODISPONIBILIDADE DE
ALGUNS MINERAIS..................................................................................
10
3.4 MINERAIS QUELATADOS............................................................... 11
3.4.1 Formao dos minerais quelatados............................................... 14
3.4.2 Absoro dos quelatos.................................................................. 16
3.4.3 Biodisponibilidade dos quelatos.................................................... 17
3.5 FRUTAS DA REGIO AMAZNICA................................................ 19
3.5.1 Aa................................................................................................ 19
3.5.2 Bacur............................................................................................ 21
3.5.3 Castanha do par.................................................................... 22
3.5.4 Cupuau........................................................................................ 23
3.5.5 Pupunha........................................................................................ 24
3.6 CONSIDERAES SOBRE AS PROTENAS................................. 25
3.7 ESPECIAO QUMICA.................................................................. 26
3.8 TCNICAS ANALTICAS.................................................................. 29
16
3.8.1 Espectrometria de Absoro Atmica com Chama FAAS)........... 29
3.8.2 - Espectrofotometria UV Visvel..................................................... 30
4 METODOLOGIA.................................................................................. 32
4.1 INSTRUMENTAO......................................................................... 32
4.2 REAGENTES E MATERIAIS............................................................. 34
4.3 PROCEDIMENTO ANALTICO......................................................... 35
4.3.1 Preparo de amostras..................................................................... 35
4.3.2 Digesto das amostras.................................................................. 35
4.3.3 Remoo da frao lipdica........................................................... 36
4.3.4 Extrao seqencial...................................................................... 37
4.3.5 Protena total................................................................................. 39
4.3.6 Determinao dos teores totais de Cu, Fe, Mn e Zn por
espectrometria de absoro atmica com chama (FAAS).........................
40
4.3.7 Teste da adio e recuperao...................................................... 40
4.3.8 Otimizao da separao cromatogrfica dos padres de
protenas...................................................................................................
40
4.3.9 Deteco de Cu associado s protenas presentes no aa por
SEC UV...................................................................................................
41
4.3.10 Deteco das espcies de Cu associadas s protenas do aa
por SEC GFAAS......................................................................................
42
5 RESULTADOS E DISCUSSO........................................................... 43
5.1 CONCENTRAO DOS ELEMENTOS NAS AMOSTRAS.............. 43
5.2 TEOR DE PROTENA TOTAL.......................................................... 48
5.3 TEOR DE Cu, Fe E Zn NA FRAO LIPDICA................................ 50
5.4 DETERMINAO DE Cu, Fe E Zn NAS FRAES PROTICAS
DE AA, BACUR E PUPUNHA................................................................
51
5.5 SEPARAO CROMATOGRFICA DAS PROTENAS PADRO
E PROTENAS PRESENTES NO AA POR SEC UV...........................
59
17
6 CONCLUSO...................................................................................... 63
7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.................................................... 64
1
1. INTRODUO
A qualidade de produtos alimentcios tem recebido especial ateno devido
a sua importncia na nutrio e sade humana1. Nos ltimos anos, tem
crescido o interesse na avaliao de macro e microelementos em uma
variedade de amostras de alimentos 2. Os alimentos so uma das principais
fontes de metais para o corpo humano. A maior parte dos ons metlicos
presentes na alimentao esto vinculados a determinadas protenas ou
enzimas e exercem os seus efeitos estruturais como stios ativos ou centros de
comando em processos como catalisadores, substrato e de ativao,
transporte e armazenamento 3.
Para a obteno de uma alimentao saudvel a partir das cadeias
agroalimentares, destacam-se os alimentos funcionais, assim denominados por
conterem substncias capazes de promover efeitos benficos sade,
associados preveno de doenas, entre estas as cardiovasculares, cncer,
diabetes e osteoporose. Dentre os grupos de alimentos que se enquadram
nessa categoria encontram-se as frutas por conterem substncias muito
importantes para a sade, tais como: antocianinas presentes no aa; taninos
no caju; carotenides na manga; cido ascrbico (precursor da vitamina C) no
camu-camu; ferro no aa, banana e puru, alm de outros 4.
A determinao do teor total do metal ingerido pelo organismo no
possibilita traar um perfil da eficincia de sua absoro. Existe a necessidade
de saber a biodisponibilidade do metal, ou seja, a proporo do nutriente que
absorvida e utilizada pelo organismo. Tcnicas de especiao qumica, como a
extrao de elementos-trao usando diferentes meios extratores, podem
auxiliar na avaliao da biodisponibilidade destes minerais possibilitando a
obteno de novos dados para prever sua absoro 5. Neste sentido, a
determinao de elementos-trao em alimentos tem se transformado em um
importante campo na anlise de alimentos 1.
2
A regio amaznica apresenta uma vasta disponibilidade de frutas com
elevado teor nutricional, entre elas destacam-se a pupunha (Bactris gasipaes
H.B.K), que uma fruta tropical da famlia das palmceas e outras frutas
conhecidas da regio norte como a castanha-do-par (Bertholletia excelsa), o
aa (Euterpe oleracea Mart), o bacur (Platonia insignis Mart) e o cupuau
(Theobroma grandiflorum Schum).
Nutricionalmente, o aa rico em antocianinas, entretanto, no que se refere
aos elementos minerais, particularmente o ferro, h muito que se estudar, uma
vez que a literatura escassa e os dados so pouco confiveis em funo da
compilao, quantidade de amostras utilizadas, metodologias e variao
edafoclimtico 6.
A pupunha potencialmente nutritiva apresenta na sua composio alguns
minerais, tais como fsforo, clcio, magnsio, zinco, entre outros. rica em
protenas e vitaminas A, B1 e C. J as castanhas-do-par so ricas em selnio,
embora a quantidade de selnio varie consideravelmente 7. So tambm uma
boa fonte de magnsio e tiamina. Algumas pesquisas indicaram que o
consumo de selnio est relacionado com uma reduo no risco de cncer de
prstata 8. Isto levou alguns analistas a recomendarem o consumo de
castanhas-do-par como uma medida preventiva 9. Estudos subsequentes
sobre o efeito do selnio no cncer de prstata foram inconclusivos10.
O desenvolvimento de procedimentos analticos que visam aperfeioamento
do preparo de amostras para determinao de elementos-trao em amostras
de frutas regionais, possibilita uma maior confiabilidade e melhores limites de
deteco. Com esse estudo pode-se obter mais informaes sobre as formas
qumicas desses elementos-trao nas amostras de alimentos regionais e
proporcionar um maior valor agregado s frutas regionais.
http://pt.wikipedia.org/wiki/Sel%C3%AAniohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Sel%C3%AAniohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Magn%C3%A9siohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Tiaminahttp://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A2ncer_de_pr%C3%B3statahttp://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A2ncer_de_pr%C3%B3statahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Castanha-do-par%C3%A1#cite_note-8#cite_note-8
3
2 - OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Determinao e distribuio de elementos-trao em frutas regionais.
2.2 Objetivos especficos
Determinao de Cu, Fe, Mn e Zn em amostras de aa, bacur,
castanha-do-par, cupuau e pupunha;
Distribuio de Cu, Fe e Zn em aa, bacur e pupunha por FAAS;
Distribuio de Cu em aa por SEC-UV e SEC-GFAAS.
4
3. Reviso da literatura
3.1 Importncias biolgicas do cobre, ferro, mangans e zinco no organismo
humano
Diversos minerais desempenham diferentes papis essenciais no nosso
organismo, podendo estes estar livres ou associados a outras espcies que
desempenham funes fisiolgicas para o bom funcionamento do organismo 11.
Essenciais na nutrio humana, os minerais encontrados em maiores
concentraes no corpo humano, so denominados de macrominerais, no qual
esto presentes o clcio, cloro, fsforo, potssio e o sdio.
Os elementos-trao ou microminerais so minerais que correspondem a
quantidades menores que 0,01% da composio corporal. Dos elementos-
trao, nove so considerados essenciais, como cobalto, cobre, cromo, iodo,
ferro, mangans, molibdnio, selnio e zinco12. Existem especulaes sobre
outros minerais, denominados de novos microminerais, descobertos desde
1990, como o alumnio, arsnio, boro, bromo, cdmio, chumbo, estanho, flor,
germnio, ltio, nquel, rubdio, silcio e vandio, que so considerados
essenciais para algumas espcies 13.
Um aspecto fundamental que deve ser ressaltado relaciona-se aos valores
de ingesto dirios de referncias de minerais essenciais na nutrio humana,
tais como, Cu, Fe, Mn e Zn. Segundo a Food and Drug Admistration (FDA) a
quantidade recomendada para Cu, Fe, Mn e Zn corresponde a 2, 18, 2 e 15
mg/Kg de massa corprea, respectivamente14.
O mangans um constituinte essencial do corpo humano, uma vez que
est envolvido na ativao de enzimas e na formao de ossos e cartilagens.
Este mineral absorvido no intestino delgado e para ser transportado deve
estar ligado a uma macroglobulina e transferrina. A deficincia deste mineral
em seres humanos bem estabelecida, tendo como os principais sintomas a
perda de peso, dermatite temporria e, ocasionalmente, nusea e vmito, uma
5
alterao na cor do cabelo e crescimento lento de cabelo e plos15. De acordo
com Hendler16, as melhores fontes de mangans na alimentao so os gros
integrais, nozes, frutas e hortalias frescas. Porm, no caso de elevados
ndices de mangans, do ponto de vista toxicolgico 17, 18, deve-se suspeitar de
exposio ocupacional (metalurgia e minerao), caracterizando seu potencial
txico, resultando em anorexia, fraqueza, apatia, loucura mangnica, manias,
comportamento violento, tremores simulando Parkinson e depresso 19.
O zinco largamente encontrado na natureza. Dietas com altas
concentraes em protenas so ricas em zinco. Por outro lado, alimentos ricos
em carboidratos normalmente apresentam baixa concentrao desse elemento
20. Este elemento essencial para mais de 300 enzimas em muitas espcies.
As enzimas dependentes de zinco participam no metabolismo de carboidratos,
lipdeos, protenas e cidos nuclicos21.
A importncia do zinco na nutrio humana tem sido reportada desde 1934
22, o qual considerado um elemento-trao essencial para o homem, pois est
associado produo de insulina, componente de mais de 90 enzimas
relacionadas com catlise cido-base e est relacionado com a sntese do DNA
e RNA. A deficincia deste metal no organismo pode provocar retardo no
crescimento das crianas, falta de apetite, leses de pele, alopecia,
dificuldades de cicatrizao, etc. A ingesto de grandes quantidades deste
metal resulta em febre, nuseas, vmitos e diarria.
O ferro um metal de transio, considerado um micronutriente essencial
para os humanos desde 1860. A extenso da sua utilidade biolgica est na
capacidade de existir em diferentes estados de oxidao e de formar muitos
compostos na forma de complexos 23. Constituinte da hemoglobina, o ferro
requerido para o transporte de oxignio e dixido de carbono, estando assim,
ligado diretamente no processo de respirao celular 24, 25. Os compostos de
ferro presentes no organismo humano podem ser agrupados em duas
categorias: os que exercem funes metablicas ou enzimticas (hemoglobina,
mioglobina e enzimas) e os associados com o ferro de reserva. O ferro catalisa
6
a produo de radicais livres atravs da reao de Fenton, induzindo a
peroxidao lipdica. Para exercer sua ao cataltica, o on frrico precisa ser
liberado da protena que o carrega e reduzido para Fe2+, a forma ferrosa. O
ferro corporal encontrado em maior proporo na hemoglobina, e em menor
na mioglobina, na transferrina e na ferritina. Radical superxido (O2) capaz de
reduzir o Fe3+, ligado ferritina, a Fe2+, que ento liberado e se torna
disponvel para catalisar uma reao de oxidao autopropagativa 26, 27.
Estudos de Salonen et al 28 forneceram as primeiras evidncias em humanos
de que a sobrecarga de ferro, medida como concentraes elevadas de
ferritina, fator de risco para doena coronariana isqumica. Hirano et al. 29
verificaram que a incubao de homocistena com ons frricos resulta em
peroxidao lipdica semelhante causada por homocistena e ons cpricos.
Aproximadamente 67% do ferro total presente no organismo se encontra na
hemoglobina, que constituda por quatro subunidades, sendo que cada
subunidade est associado a um grupo heme. Essa molcula tem somente
quatro tomos de ferro, considerados essenciais, pois quando combinados com
o oxignio em nvel dos pulmes, estes so liberados nos tecidos 30,31. O ferro
atua tambm em processos metablicos, como na sntese de purinas
(compostos estruturais do DNA e RNA), carnitina, colgenos e
neurotransmissores (dopanina, serotonina e norepinefrina) 31.
As funes do cobre esto ligadas a utilizao do ferro na sntese de
hemoglobina, absoro de ferro do intestino delgado e mobilizao do ferro nos
tecidos. A oxidao do ferro permite que ele se ligue a protena que o
transporta. O cobre essencial para sntese da camada de mielina que recobre
o sistema nervoso central. Uma amino-oxidase que contm cobre (lisil oxidase)
est envolvida nas ligaes cruzadas de cadeias polipeptdicas na elastina e
colgeno. Enzimas contendo cobre so necessrias na converso de tirosina e
requerem cobre para ter atividade biolgica. O cobre est envolvido na
formao de tecido sseo e reproduo 32. No se deve ter nveis de
molibdnio superior a 3 mg/L da dieta total, pois esse mineral reduz a absoro
7
do cobre, pela formao do tiomolibidato de cobre 33. A deficincia manifesta-
se com os seguintes sintomas: ataxia, incoordenao muscular, paralisia
parcial, anemia, reduo no crescimento, despigmentao, fragilidade ssea,
diarria e perdas reprodutivas 33.
3.2 Biodisponibilidade dos minerais
Um dos fatores que interferem na biodisponibilidade dos minerais diz
respeito s interaes que ocorrem entre os mesmos 34. De acordo com Couzi
et al.34, as interaes podem ser diretas ou indiretas. As diretas so geralmente
fenmenos competitivos que ocorrem durante a absoro intestinal ou
utilizao tecidual, enquanto que as indiretas ocorrem quando um mineral est
inibindo o metabolismo do outro, de maneira que a deficincia de um acarreta
em prejuzo da funo do outro 34.
Algumas interaes parecem estar bem estabelecidas e, sob algumas
circunstncias, podem ter implicaes profundas na sade humana 34. Com
tudo deve-se considerar que uma simples presena de um mineral na frmula
ou dieta no garante a sua absoro pelo organismo, pois estes possuem
vrias interaes entre si. A biodisponibilidade deles, ou seja, a proporo de
nutrientes que realmente utilizada pelo organismo, depende de vrios fatores,
tais como, a forma qumica que eles se encontram, a quantidade na dieta e a
matriz que ele est incorporado como, fitatos, oxalatos, entre outros 35.
O metabolismo dos minerais no pode ser considerado separadamente,
pois fatores fisiolgicos e nutricionais podem interferir na absoro, no
transporte e no armazenamento. Dessa forma, pode ocorrer tanto deficincia,
por m absoro, quanto toxicidade, devido ao acmulo do produto no
organismo 36.
8
3.2.1 Biodisponibilidade do Zinco Existem muitos fatores que podem modificar a absoro de zinco, sendo
que estes podem ser considerados como ativadores ou inibidores deste
processo de absoro.
Entre os ativadores da absoro do zinco esto o citrato e aminocidos
como glicina, histidina, lisina e metionina. Encontram-se tambm o cido
picolnico, secretado pelo pncreas e a vitamina B6 que aumenta a secreo de
cido picolnico. Entre os inibidores da absoro do zinco esto os cidos
oxlico e ftico, taninos, fibra, selnio, ferro e clcio. A eficincia do processo de
absoro deste mineral est entre 15 a 40%, portanto, o zinco pouco
absorvido, sendo excretado em grandes propores pelas fezes. Por outro
lado, na forma orgnica, o zinco est protegido do cido clordrico e passa para
o duodeno, onde eficientemente absorvido pelas clulas da mucosa,
carregadas negativamente. Os complexos orgnicos so prontamente
absorvidos para a corrente sangunea, tornando-os altamente biodisponveis s
necessidades orgnicas e funcionais.
Os resultados da biodisponibilidade de zinco utilizando fontes orgnicas e
inorgnicas so variados. Pimentel et al.37 no observaram diferena na
biodisponibilidade de zinco, na forma de zinco metionina, quando comparado
com a forma inorgnica de zinco. Entretanto Wedekind et al. 38 realizando
estudo sobre a biodisponibilidade de diversas fontes de zinco, observou uma
biodisponibilidade do metal de 117%, na forma de zinco metionina, em uma
dieta purificada, 177% em uma dieta com soja isolada e 206% em uma dieta
composta por milho e soja, comparada com 100% de biodisponibilidade do
zinco para o sulfato de zinco.
3.2.2 Biodisponibilidade do Ferro
Segundo Underwood 39, a absoro de ferro afetada pela idade, nveis de
ferro no organismo, condies do trato intestinal (stios de absoro),
9
quantidade e forma qumica do ferro ingerido e quantidade e proporo de
outros minerais e compostos na dieta, os quais podem interagir com o ferro. Os
metais bivalentes que afetam a absoro de ferro na dieta so o cobre,
mangans, cobalto, cdmio, os quais podem competir pelo stio de absoro do
ferro. Poucos estudos foram conduzidos para determinar a biodisponibilidade
de fontes orgnicas de ferro. Spears et al.40 comparando fontes de ferro
metionina com fontes inorgnicas concluram por meio da concentrao de
hemoglobina que a biodisponibilidade do ferro orgnico foi de 180% quando
comparado s formas inorgnicas consideradas como 100%. Geralmente, os
resultados so pobres quando se utilizam fontes inorgnicas. Por outro lado, a
utilizao de ferro na forma de quelatos tem melhorado o nvel de ferro
heptico, formao de hemoglobina e o crescimento dos recm-nascidos 41.
Uma possvel explicao para estes resultados que o ferro na forma de
quelato passa melhor pelas barreiras placentrias e mamrias.
3.2.3 Biodisponibilidade de Mangans Com base na deposio ssea, Baker e Halpin 42 no observaram diferena
na biodisponibilidade de fontes organometlicas e inorgnicas de mangans.
Entretanto, Henry et al.43 observaram que a biodisponibilidade da fonte
orgnica de mangans foi significativamente maior do que as fontes
inorgnicas (xido e sulfato de mangans). Comparando a biodisponibilidade
do quelato de mangans ao xido de mangans, em dieta composta por milho
e farelo de soja, Fly et al.44 verificaram que a forma orgnica apresentou
biodisponibilidade de 147% comparada a forma de xido (100%). Compilando
dados sobre a biodisponibilidade de fontes de mangans, Ammerman et al. 45
concluram que a biodisponibilidade relativa para o mangans- metionina (Mn-
metionina) e mangans proteinado foram de 120 e 110%, respectivamente,
quando comparadas ao sulfato de mangans (100%).
10
3.2.4 Biodisponibilidade do cobre
Um aumento na biodisponibilidade do cobre de fontes orgnicas,
comparadas s fontes inorgnicas foi observado por Baker et al. 46 por meio de
comparaes da quantidade de cobre acumulado no fgado. Aoyagi e Baker 47
tambm demonstraram uma melhor biodisponibilidade do cobre na forma
orgnica, principalmente devido molcula do quelato proteger o mineral
contra interaes com outras substncias como a L-cistena e glutationa
redutase, que so capazes de reduzir a absoro de cobre no intestino. Em
outro estudo, Aoyagi e Baker 47 concluram que a biodisponibilidade aparente
do quelato de cobre foi de 120% quando comparada forma inorgnica de
sulfato de cobre (100%). Guo et al.48 verificaram uma biodisponibilidade de
111% e 109% para cobre lisina e cobre proteinato, respectivamente, quando
comparados com o sulfato de cobre (100%).
3.3 Fatores que interferem na biodisponibilidade de alguns minerais
O tanino, um adstringente encontrado em certos vegetais, possui a
capacidade de ligao s protenas inibindo enzimas digestivas e reduzindo a
biodisponibilidade do ferro e da vitamina B12. Em altas doses pode lesar a
pele, principalmente o epitlio, e o fgado. D colorao amarronzada em
muitos vegetais quando so cortados. Est presente em altas doses no ch, no
caf, no chocolate, nas bananas, no espinafre, na chicria, na ma, no
ruibarbo, na cebola, na uva, no milho e na cenoura 49.
Outros inibidores da absoro e da biodisponibilidade do ferro so as
substncias fenlicas como os polifenis, os fitatos dos cereais (os mais
importantes inibidores) e fibras como a celulose, hemicelulose e lignina, a
albumina da clara (a retirada da clara pode aumentar em mais de 10% a
absoro do ferro) do ovo, a fosfitina da gema do ovo, as protenas das
leguminosas e elementos inorgnicos como clcio, mangans, cdmio, cobre e
11
cobalto. Um dos mais importantes captulos dos fatores antinutricionais so os
inibidores das enzimas (substncias, que so capazes de modificar a
velocidade de uma reao qumica, servindo como catalisadores biolgicos).
A casena, protena do leite, inibe a absoro do zinco, o mesmo ocorrendo
com o fitato.
Dois outros antagonistas dos minerais encontrados em muitas plantas o
cido oxlico, cido orgnico dicarboxlico, que se liga firmemente ao clcio e
outros minerais-traos no deixando que sejam aproveitados pelo organismo.
encontrado em maiores quantidades em chs, no ruibarbo, no espinafre e em
menores teores na beterraba, nos morangos, no nabo, ervilha, alface e na
beterraba.
O cido ftico derivado do cido fosfrico abundantemente encontrado nos
cereais, legumes e sementes de oleaginosas. um forte quelante, substncias
qumicas que se ligam firmemente os metais como ferro, clcio e zinco
formando complexos inaproveitveis para os seres humanos. Os quelantes
tambm atuam para remover substncias txicas do organismo e so usados
em muitos medicamentos como o ferro quelato. O cido ftico encontrado em
legumes, gros de cereais, tanto no germe como no farelo, noz e, em menor
quantidade, nos feijes verdes, cenoura, brcolis, batatas, batatas doces e
morangos.
O EDTA, um aditivo alimentar, tambm apresenta sua funo inibidora de
alguns minerais. Alm disso, existe alguns minerais que influenciam na m
absoro de outros minerais 50.
3.4 Minerais Quelatados
Os microminerais possuem baixa biodisponibilidade, o que segundo Mabe 51
pode estar relacionado com a formao de complexos com outras substncias
no trato digestivo diminuindo a solubilidade desses elementos, o que justifica o
12
interesse em explorar fatores que aumentem a absoro ou metabolizao de
elementos-trao.
Neste sentido, fontes quelatadas ou orgnicas de minerais tm sido
utilizadas devido apresentarem maior biodisponibilidade. Os minerais
quelatados ou orgnicos so assim denominados por serem constitudos por
ons metlicos ligados a substncias orgnicas.
So denominados quelatos, os compostos constitudos por ons metlicos
que se ligam com substncias orgnicas como aminocidos, peptdeos ou
complexos polissacardeos que proporcionam a esses ons alta disponibilidade
biolgica, alta estabilidade e solubilidade 52.
Os quelatos so o resultado do compartilhamento de eltrons entre um
metal e um ligante. Ligante a substncia orgnica que est ligada ao metal 53.
O ligante geralmente um nion ou uma molcula que tenha um tomo com
um par de eltrons com valncias disponveis. Os ligantes comuns contm
nitrognio, oxignio, enxofre, halognios ou uma combinao deles devido s
suas estruturas eletrnicas. Os ligantes so no- metlicos, portanto, orgnicos
54. Na Figura 1 so apresentadas estruturas, representando minerais
quelatados.
Protena ligada a diversos
stios ativos
Molcula da ferritina
L - Selenometionina
Figura 1 Minerais ligados a diferentes tipos de protenas
13
Segundo Kratzer e Vohra 55, o quelato um complexo metlico, onde o
metal apresenta mais ligaes do que sua valncia e este ligado a um ligante
doador. O complexo possui um tomo de um elemento no centro da molcula e
um ligante ao seu redor. Quando o ligante possui mais de um tomo doador o
complexo se torna um anel heterocclico chamado de anel quelato.
Os minerais quelatados so definidos por Leeson e Summers 56 como
sendo uma mistura de elementos que so ligados a algum tipo de carreador o
qual pode ser um aminocido ou polissacardeo que possuem a capacidade de
se ligar a metal por ligaes covalentes atravs de grupamentos amino ou
oxignio, formando assim uma estrutura cclica.
Por sua vez, Ensminger e Oldfield 57 definem que esses quelantes tm o
papel de aumentar a absoro e a disponibilidade desse mineral no organismo,
alm de aumentar a sua estabilidade fsica reduzindo assim a tendncia do
micronutriente de se separar do alimento.
Segundo Leeson e Summers 53, existem trs grupos de quelatos que so
reconhecidos pelo sistema biolgico:
Grupo I: Quelatos que servem de transportadores e de armazenamento
para ons metlicos. Com este tipo de quelato o metal requer um ligante
com propriedades qumicas e fsicas que o quelato capaz de ser
absorvido, transportado no sangue e passar pela membrana celular,
enquanto o on metlico utilizado no local em que exigido.
Ex: aminocidos, especialmente a cistena e a histidina;
etilenodiaminotetractico (EDTA).
Grupo II: Quelatos que so essenciais no metabolismo. H um nmero
de quelatos no organismo com estrutura na qual o on metlico est
presente na forma quelatada, a qual necessria para desempenhar
funes metablicas. A hemoglobina um exemplo deste grupo de
quelatos.
14
Grupo III: Interferem na utilizao de ctions essenciais e no possuem
nenhum valor biolgico. Dentre este o cido ftico (quelato de zinco) que
pode interferir com o metabolismo normal por tornar esse mineral
essencial indisponvel para as funes metablicas.
3.4.1 Formao dos Minerais Quelatados
Para a formao dos quelatos pode-se lanar mo de numerosas molculas
como ligantes que tm funo especfica no metabolismo. Elas so de baixo
peso molecular e a capacidade oxidativa ou "ligante" depende do tamanho da
molcula e da presena de radicais carboxlicos. As principais so os cidos
aminado, ascrbico, ctrico, glucnico e EDTA. Normalmente, um mineral pode
fazer a ligao com uma, duas ou vrias dessas molculas para formar um
"composto mineral organicamente ligado" ou quelato, podendo assim ser
vendido como fonte de mineral. A afinidade de um quelato com o on metlico
pode ser expressa quantitativamente como sendo uma constante de
estabilidade. Na Tabela 1 so apresentadas relaes de constantes de
estabilidade de alguns ligantes. Observa-se que os quelatos formados com o
cobre possuem a maior constante de estabilidade e que para cada ligante a
estabilidade dos quelatos varia em ordem decrescente para o cobre, nquel,
cobalto, ferro, mangans e magnsio, respectivamente.
15
TABELA 1: Constante de estabilidade de alguns quelatos comuns (relao 1:1 de
Ligante e on metal H2O a 20C)
Ligante Cu2+ Ni2+ Zn2+ Co2+ Fe2+ Mn2+ Mg2+
Glicina 8,5 6 5 5 4 3 2
Cistena - 10 10 - 6 4 4
Histidina 10,5 9 7 7 5 4 4
Histamina 10 7 5 5 4 - -
EDTA 19 18 16 16 14 13,5 9
Guanosina 6 4 4,5 3 4 3 -
cido oxlico 6 5,5 5 4,5 4,5 4 3
cido saliclico 11 7 7 7 6 6 -
Tetraciclina 8 6 5 5 5 4 4
Fonte: Leeson e Summers (2001)
A "Association of American Feed Control Officials" AAFCO 58 define esses
produtos minerais orgnicos da seguinte forma:
Quelato metal-aminocido resultante da reao de um sal metlico
solvel com aminocidos na proporo molar, isto , um mol do metal
para um a trs moles (preferencialmente dois) de aminocidos na forma
de ligao covalente coordenada. O peso molecular mdio dos
aminocidos hidrolisados pode ser, aproximadamente, de 150 dltons e
o peso molecular resultante do quelato no deve exceder a 800 dltons;
Complexo aminocido-metal resultante da complexao de um sal
metlico solvel com aminocido(s);
Metal (Complexo aminocido especfico-metal) resultante da
complexao de um sal metlico solvel com um aminocido especfico;
Metal proteinado resultante da quelao de um sal solvel com uma
protena parcialmente hidrolisada;
Complexo metal-polissacardeo resultante da complexao de um
sal solvel com polissacardeo.
16
3.4.2 Absoro dos quelatos
As fontes minerais, mais comumente utilizadas na nutrio so as
inorgnicas como sulfatos, fosfatos, carbonatos, cloretos e xidos. Quando
estas fontes chegam ao estmago, ocorre uma dissociao das molculas,
liberando os ons metlicos como Zn2+, Mn2+ e entre outros 59.
No intestino, o transporte dos ons para o interior das clulas d-se pela
difuso passiva ou pelo transporte ativo, ou seja, para que esses ons sejam
absorvidos, e atinjam a corrente sangnea, rgos e tecidos, eles necessitam
estar atrelados a um agente ligante ou molcula transportadora, que permita a
passagem atravs da parede intestinal. Muitas vezes estes ons no encontram
o agente ligante e acabam sendo excretados. Nessas condies podem ocorrer
perdas pela reao com compostos, como colides insolveis ou no processo
de competio pelos stios de absoro entre os elementos minerais, com
interaes antagnicas que inibem a absoro 60.
Existe tambm um efeito de inibio da absoro de minerais por outras
substncias ou nutrientes quando apresentadas nas formas inorgnicas, dentre
elas o cido oxlico e ftico, taninos, fibras e entre outras. Por sua vez, os
minerais quelatados apresentam absoro superior aos inorgnicos, pois
geralmente, usam as vias de absoro das molculas orgnicas que se ligam a
eles, o que faz com que no tenham problemas de interaes com outros
minerais.
A absoro dos minerais quelatados pode ocorrer sob duas formas: o
mineral pode ser ligado borda em escova sendo absorvido pela clula
epitelial ou como ocorre na maioria das vezes onde o agente quelante
absorvido levando junto consigo o metal 55.
Segundo Kratzer e Vohra 55, o mecanismo pelo qual o agente quelante
melhora a atuao do mineral, depende da capacidade do ligante em
seqestrar o mineral, ou de sua habilidade em competir com outros ligantes,
formando complexos solveis com o mineral.
17
Para Clydesdale 61, um ligante forma um composto solvel com o mineral
sendo com isso melhor absorvido pela mucosa intestinal. Conforme Spears 62,
o ligante pode formar um complexo estvel no trato intestinal, evitando com
isso que o mineral forme complexos insolveis, dificultando a sua absoro. No
caso dos aminocidos quelatados, o elemento mineral metlico na molcula
quimicamente inerte por causa da forma de ligao. Esta ligao estvel, no
sofrendo dissociao das molculas quando atingem o estmago.
No jejuno, o aminocido do mineral quelatado, age como agente
transportador, permitindo a passagem do mineral atravs da parede intestinal
para a corrente sangunea (diretamente para o plasma). A separao do
aminocido quelante d-se no local onde o elemento mineral metlico ser
utilizado 63.
3.4.3 Biodisponibilidade dos quelatos
A biodisponibilidade tambm pode ser definida como a frao do mineral
que realmente absorvida e utilizada pelo organismo 59.
Existem muitos fatores que influenciam a biodisponibilidade dos minerais,
especialmente dos minerais - trao, tais como: nvel de consumo do mineral,
forma qumica, digestibilidade da dieta, tamanho da partcula, interaes com
outros minerais e nutrientes, agentes quelantes, inibidores, qualidade da gua,
condies de processamento e idade 64.
A partir da observao dos resultados de estudos nos ltimos 20 a 30 anos
torna-se claro a superioridade de biodisponibilidade dos quelatos quando
comparados aos sais. Entretanto, qualquer avaliao que queira realar a
biodisponibilidade como caracterstica de importncia dos quelatos deve ter
fontes mais solveis; como os sulfatos, como parmetro de comparao, uma
vez que a disponibilidade de cobre e zinco a partir de xidos mnima para
aves e sunos 46, 66, 67.
18
Alm disso, as respostas aos minerais quelatados so mais aparentes
quando os nveis de fitatos das dietas so elevados 38.
Desta forma, a vantagem dos minerais quelatados sobre as fontes
inorgnicas pode no ser to evidente em todas as situaes, o que pode
confundir a interpretao dos resultados. Da mesma forma, quando oferecidos
na forma inorgnica, os minerais passam a ter forte interferncia entre si. Em
geral a biodisponibilidade dos minerais na forma quelatada dependente de
trs condies bsicas na estrutura do composto:
a) Da forma de ligao com o metal - Nos quelatos formados com dois ou
trs aminocidos, o on metlico fica inerte na molcula, entrando com
facilidade nas vias metablicas, pois assume a caracterstica da
molcula orgnica;
b) Do peso molecular do quelato - O baixo peso molecular a chave
para a absoro como molcula intacta. Se o peso molecular de um
quelato for maior do que 800 dltons, certamente sofrer prvia hidrlise
na luz do trato digestivo e a absoro pela mucosa no ser garantida
58;
c) Da constante de estabilidade do quelato - Deve ser constitudo de
dois ou trs anis de aminocidos quelantes para serem estveis. Se a
constante de estabilizao dos aminocidos grande, estes iro resistir
ao de peptidases que quebram as ligaes peptdicas internas,
liberando o tomo de metal na molcula 63. Alm disso, a
biodisponibilidade dos minerais tambm varia de acordo com o tipo de
fonte mineral (Figura 2).
19
3.5 Frutas da regio amaznica
Algumas frutas de origem amaznica, como a castanha-do-par (Bertholletia
excelsa), cupuau (Theobroma Grandiflorum) e aa (Euterpe oleracea Mart)
so hoje amplamente comercializados em todo o mundo, e algumas delas
ainda so produzidos em diferentes continentes longe da Amrica do Sul. No
entanto, muitos outros frutos so consumidos apenas a nvel local ou regional e
sua composio qumica ainda desconhecida. O interesse em frutas
regionais tem aumentado bastante nos ltimos anos, por causa da incessante
busca de novos produtos e sabores exticos e, por outro lado, devido a sua
produo e comercializao que so considerados uma boa maneira de
aumentar a renda do pequeno produtor. Neste contexto, dados da composio
mineral so necessrios como uma primeira indicao do valor nutritivo das
frutas amaznicas 1, 2.
3.5.1 Aa
O aaizeiro (Euterpe oleracea Mart.) nativo da Amaznia brasileira e o
Estado do Par o principal centro de disperso natural dessa palmcea.
FIGURA 2: Biodisponibilidade relativa de fontes de zinco e mangans. Adaptado de Polli (2002).
20
Populaes espontneas tambm so encontradas nos Estados do Amap,
Maranho, Mato Grosso, Tocantins e em pases da Amrica do Sul
(Venezuela, Colmbia, Equador, Suriname e Guiana) e da Amrica Central
(Panam) 67, 68.
Figura 3 Aa (Euterpe oleracea Mart.)
O aaizeiro se destaca, entre os diversos recursos vegetais, pela sua
abundncia e por produzir, importante alimento para as populaes locais,
alm de ser a principal fonte de matria-prima para a agroindstria de palmito
no Brasil 69, 70.
Tambm ocorre em reas de terra firme, principalmente quando localizadas
prximas s vrzeas e igaps.
Dos frutos do aaizeiro extrado o vinho, polpa ou simplesmente aa,
como conhecido na regio. Com ele so fabricados sorvetes, licores, doces,
nctares e gelias, podendo ser aproveitado, tambm, para a extrao de
corantes e antocianina 71.
O caroo, do qual a borra utilizada na produo de cosmticos, as fibras
em mveis, placas acsticas, compensados, indstria automobilstica, entre
outros. A polpa representa 15% e aproveitada, de forma tradicional, no
consumo alimentar, sorvetes e outros produtos derivados 72.
21
O aa considerado um alimento de elevado valor calrico, com alto
percentual de lipdeos, e nutricional, pois rico em protenas e minerais 73.
3.5.2 Bacur
O bacurizeiro (Platonia insignis Mart.) uma espcie arbrea nativa da
Amaznia Oriental Brasileira 75, 76, 73. Os frutos dessa Clusiaceae ocupam
posio de destaque na preferncia dos consumidores dos Estados do Par,
Piau e Maranho, onde se encontram densas e diversificadas populaes
naturais 77. Sendo o bacurizeiro uma rvore de usos mltiplos (fruto, madeira,
ltex) e com alto valor econmico, deve ser mantido em seu ambiente natural,
bem como ser plantado ou manejado em reas degradadas.
Existe pouca informao sobre a composio qumica de P. insignis, sendo
que os estudos existentes referem-se composio da polpa do bacuri e
sementes 77, 78.
Figura 4 Bacuri (Platonia insignis Mart.)
O seu desenvolvimento ideal em reas litorneas, no exigindo grandes
cuidados operacionais e possibilitando o cultivo de baixo custo em virtude do
aproveitamento de solos desgastados por culturas anuais. Sua propagao
ocorre pelas sementes ou por brotaes que surgem, espontaneamente, nas
22
razes das plantas adultas 80, 79, 73. Alguns tipos, de ocorrncia rara, apresentam
frutos desprovidos de sementes 77, os quais tm despertado pouco interesse,
pois apresentam tamanho diminuto e baixo teor de slidos solveis totais na
polpa 81. A polpa do bacuri muito utilizada na alimentao para a produo de
sucos, sorvetes, musses, dentre outras formas.
3.5.3 Castanha-do-par
A castanha-do-par ou castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) a
semente da castanheira, uma rvore da famlia botnica Lecythidaceae, nativa
da Floresta Amaznica que chega a atingir entre 30 a 45 metros de altura. Ela
ocorre em rvores espalhadas s margens do Rio Amazonas, Rio Negro, Rio
Orinoco, Rio Araguaia e Rio Tocantins.
Figura 5 Castanha-do-par (Bertholletia excelsa)
As sementes ou castanhas so de forma angulosa, tendo no seu interior a
amndoa, de alto valor econmico e nutricional. O ourio permanece na
rvore por 15 meses, quando chega a pesar cerca de 1,5 Kg 82.
Seu valor biolgico grande para fins alimentcios, pois contm em torno de
17% de protena cerca de cinco vezes o contedo protico do leite bovino in
natura. Seu teor de gordura extremamente elevado, em torno de 67%, com
23
somente 7% de carboidrato (fibras), alm das vitaminas A, C, B1, B2 e B5. Rica
em fsforo e clcio o alimento do planeta mais rico em selnio.
Alguns estudos mostraram que essa oleaginosa ajuda a prevenir cncer,
esclerose mltipla e mal de Alzheimer. Sua frao oleosa rica em cido graxo
monoinsaturado (48%) sendo indicados na preveno de doenas
cardiovasculares, controles glicmicos e de peso. Fonte riqussima de selnio,
a castanha-do-par cuida da fora do sistema imunolgico, ou seja, na
preveno do cncer, ajuda no equilbrio do hormnio ativo da tireide e age
como antioxidante, protegendo o organismo contra os danos provocados pelos
radicais livres 83.
3.5.4 Cupuau
A fruta Theobroma Grandiflorum, mais conhecida como cupuau, nativa
da Amaznia Oriental, sendo consumida em larga escala em toda a regio
norte do Brasil 84. O cupuauzeiro uma rvore do bosque tropical mido
atingindo at 18 metros de altura, sendo cultivado desde o estado de So
Paulo, no Sudeste, at Roraima, no extremo norte do Pas. Mas outros pases
como Equador, Guiana, Martinica, Costa Rica, So Tom, Trinidad e Tobago,
Gana, Venezuela e Colmbia tambm cultivam o cupuau. Polpa e sementes
so as partes mais utilizveis do fruto 85.
Figura 6 Cupuau (Theobroma Grandiflorum)
24
Da polpa, so produzidos sucos, cremes, doces, compotas, sorvetes,
biscoito e iogurtes, alm de licores deliciosos. Das sementes o mundo pde
conhecer o "cupulate", um subproduto que tem caractersticas nutritivas, sabor
e aroma parecidos ao chocolate. Ele pode ser produzido tanto em p como em
tabletes 86. Em termos nutricionais, a polpa do cupuau pobre em protenas e
gorduras, mas apresenta uma grande quantidade de fsforo, clcio e vitamina
C. J as sementes so ricas em protenas, gorduras, carboidratos e fibras 87.
3.5.5 Pupunha
A pupunha (Bactris gasipaes Kunth) uma planta perene, nativa da
Amaznia, que possui grande importncia econmica para a regio, sendo
cultivada para produo de frutos e palmito, tanto em monocultivo como em
sistemas agroflorestais.
A pupunha, da famlia das Palmceas, foi cultivada pelos amerndios pr-
colombianos na regio neotropical mida. Atualmente, essa espcie encontra-
se distribuda desde Honduras at a Bolvia.
Figura 7 Pupunha (Bactris gasipaes Kunth)
Seus frutos, de sabor muito apreciado, esto integrados nos hbitos
alimentares da rea que cobre os estados do Acre, Amap, Amazonas, Par,
25
Maranho, Mato Grosso, Rondnia e Roraima. Na regio ainda predomina o
consumo do fruto, mas a produo de palmito a partir do cultivo da pupunheira
comea a aumentar, com plantios em escalas considerveis no Par, Acre,
Rondnia e Mato Grosso.
A inflorescncia aparece nas axilas das folhas senescentes. Aps a
polinizao, os cachos podem conter entre 50 e 1000 frutos. Diversos fatores,
tais como nutrio ou polinizao deficiente, estiagem, competio, e ataque
de insetos e doenas podem causar o aborto e contribuir para o baixo peso
mdio do cacho.
Floresce quase o ano inteiro, porm com maior intensidade durante os
meses de agosto a dezembro. A maturao de seus frutos ocorre
principalmente nos meses de dezembro a julho. Atualmente, sua importncia
como alimento e o seu potencial tecnolgico tm sido incentivados atravs de
pesquisas realizadas no Brasil, Colmbia, Peru e Costa Rica 88.
3.6 Consideraes sobre as protenas
As protenas so as molculas orgnicas mais abundantes e importantes
nas clulas e perfazem 50% ou mais de seu peso seco. So encontradas em
todas as partes de todas as clulas, uma vez que so fundamentais sob todos
os aspectos da estrutura e funo celulares 89. Existem muitas espcies
diferentes de protenas, cada uma especializada para uma funo biolgica
diversa. Alm disso, a maior parte da informao gentica expressa pelas
protenas.
Todas contm carbono, hidrognio, nitrognio e oxignio, e quase todas
contm enxofre. Algumas contm elementos adicionais, particularmente
fsforo, ferro, zinco e cobre. Seu peso molecular extremamente elevado 90.
A protena um macronutriente com muitas funes. Fornecem
aminocidos, que so os elementos que compem as protenas e so usados
para a formao de msculos e outros componentes do corpo que contm
26
protenas, incluindo imunoglobulinas, albumina, enzimas e hormnios. O
organismo sintetiza aminocidos no essenciais, enquanto outros que so
essenciais precisam ser fornecidos por fontes alimentares. As protenas e
outros compostos contendo nitrognio so constantemente degradados e
reconstrudos. Todas essas perdas devem ser repostas por um suprimento
contnuo de aminocidos fornecidos pela dieta 91.
As protenas so responsveis pela formao e manuteno dos tecidos
celulares e pela sntese dos anticorpos contra infeces. Produzem ainda
energia e ajudam na formao da hemoglobina do sangue e de variadas
enzimas. Em casos de carncia, a falta de protenas causa debilidade, edemas,
insuficincia heptica, apatia e at baixa das defesas do organismo. Em caso
de excesso, existe o risco de acidificao sangunea, gota e doenas renais e
reumticas 92.
Nem todas as protenas vegetais so iguais e as protenas de soja so as
nicas protenas de base vegetal que tm uma qualidade protica igual da
carne, leite e ovos. Essa protena de alta qualidade vem em trs formas
principais para mxima flexibilidade nas aplicaes alimentares: farinhas de
soja, protena concentrada de soja e protena isolada de soja 93.
3.7 Especiao Qumica
Recentemente, grandes esforos no campo da biologia e cincias
ambientais tm sido centrados na rea de especiao qumica. Cada vez mais,
se tem confirmado que a mobilidade, disponibilidade e distribuio das
espcies qumicas, no dependem somente de suas concentraes, mas
principalmente das associaes qumicas e fsicas que ocorrem no ambiente.
Mudana no ambiente quer seja de origem antropognica ou natural, pode
influenciar o comportamento tanto de elementos essenciais, como de
elementos txicos atravs da alterao das formas com que estes se
apresentam no meio 94.
http://www.solae.com.br/soyessentials/soyprotein.html#qualidadeprot%E9ica#qualidadeprot%E9icahttp://www.solae.com.br/soyessentials/soyprotein.html#formas#formashttp://www.solae.com.br/soyessentials/soyprotein.html#formas#formas
27
Nas recomendaes da IUPAC 2000, o termo espcie qumica definido
como uma forma especfica de um elemento definido com relao
composio isotpica, estado de oxidao ou eletrnico, e/ou estrutura
molecular ou complexada. Foi estabelecida anlise de especiao como a
atividade analtica de identificao e/ou quantidade medida de uma ou mais
espcie qumica individual, assim concluindo que especiao envolve a
distribuio entre espcies qumicas definidas em um sistema 94, 95. Nas ltimas
dcadas, um grande nmero de metodologias analticas tem sido publicado
para separao e determinao de diferentes espcies qumicas de selnio 96,
cromo 97, mercrio 98, arsnio 99, entre outros, presentes em diferentes tipos de
amostras.
Segundo, Takcs e colaboradores 100 , a complexao do cobre pela matria
orgnica dissolvida pode alterar sua especiao e solubilidade. McGeer e
colaboradores 101 evidenciaram que a complexao por substncias hmicas
aquticas atenuou a biodisponibilidade do cobre para peixes submetidos
exposio crnica com o metal. No caso do cobre, sua disponibilidade biota
governada pela presena do on livre em soluo 102, 103. Howarth e Sprague
104, por exemplo, observaram que a toxicidade do cobre para peixes est
fortemente relacionada com a concentrao do on livre. Pagenkopf e
colaboradores 105 e Sunda e Guillard 106 demonstraram que a toxicidade do
cobre est relacionada concentrao do on livre em soluo e no a sua
concentrao total. Mais recentemente, entretanto, Meylan e colaboradores 107
avaliaram a acumulao de cobre por algas em resposta a mudanas na
especiao do metal em guas superficiais e concluram que a concentrao
intracelular de cobre variou em funo da forma trocvel do metal, ou seja, a
somatria entre as concentraes do on livre e de complexos inorgnicos
fracos. Todos estes estudos evidenciam que a especiao de metais ,
portanto, uma questo da maior relevncia uma vez que seu conhecimento
pode ter implicaes diretas sobre aspectos ecotoxicolgicos.
28
bem sabido que elementos como Fe, Cu e Zn, apresentam afinidade com
enxofre e por tanto tendem a formar complexos com aminocidos,
oligopeptdeos e polipeptdeos 108.
A funo de muitas biomolculas e, em particular, metaloprotenas,
criticamente depende de sua interao com os elementos, principalmente com
metais de transio 109. Algumas protenas (por exemplo, metalotionenas) so
produzidas sob estresse de metais pesados durante a poluio
como por exemplo a albumina e a transferrina, que so transportadores de ons
de nutrientes essenciais, e atuam como ativadores de enzimas 109.
A especiao de metais trao, em amostras ambientais, biolgicas,
industriais, requer o emprego de mtodos de determinao com elevada
sensibilidade e seletividade. Por isso mtodos como espectrometria de
absoro atmica com chama (FAAS) 110, espectrometria de absoro atmica
com atomizao eletrotrmica (ETAAS) 111, espectrometria de massa com
plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) 112, e espectrometria de emisso
ptica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) 113, tm sido
preferencialmente usados. Dependendo do analito de interesse, da matriz da
amostra e da tcnica utilizada, esses elementos podem ser quantificados em
concentraes na ordem de ng L-1.
Tcnicas cromatogrficas baseiam-se na separao de componentes de
uma determinada amostra presente em um solvente (fase mvel) devido as
diferentes interaes com a coluna, fase estacionria. A cromatografia de
excluso por tamanho fornece a separao em funo do peso molecular dos
compostos, sendo que no ocorre interao entre esses e a coluna. O
mecanismo de separao mecnico. Existem dois diferentes procedimentos
de separaes de excluso por tamanho, a permeao e a filtrao em gel. Na
filtrao em gel os componentes e a fase mvel so polares, enquanto na
permeao deseja-se separar espcies apolares. O tamanho do poro da coluna
responsvel pela separao dos compostos de uma amostra. As espcies de
baixo peso molecular penetraro nesses poros, tornando a eluio mais
29
demorada, tendo assim um maior tempo de eluio. O contrrio ocorre com
espcies de maior peso molecular 114, 115, 116.
3.8 Tcnicas analticas
3.8.1 Espectrometria de Absoro Atmica com Chama (FAAS)
A constante busca por mtodos analticos capazes de proporcionarem, ao
mesmo tempo, alta taxa de amostragem com baixo custo operacional,
repetibilidade e reprodutibilidade apropriadas, limites de deteco da ordem de
g L-1 ou melhores, alm de produzirem resultados com confiabilidade
metrolgica sem prejuzos ao ambiente e sem gerao de resduos (qumica
limpa), representa elevado interesse para as indstrias de equipamentos, para
os pesquisadores da rea de qumica analtica (em especial), para os
laboratrios de controle de qualidade e para as instituies responsveis pelo
monitoramento ambiental ou de outra natureza 117. A espectrometria de
absoro atmica com chama rene quase todas estas caractersticas, mas os
limites de deteco so inapropriados para a determinao de muitos analitos.
Neste sentido, procedimentos automatizados, empregando-se injeo em fluxo
para separao e/ou pr-concentrao dos analitos em espectrometria de
absoro atmica por chama (FAAS), tem sido apresentados como alternativas
de sucesso, podendo ser aplicado para uma extensa variedade de amostras.
O mtodo baseia-se na absoro de radiao eletromagntica,
normalmente na regio do visvel e ultravioleta, por tomos neutros no estado
gasoso 118.
O espectrmetro de absoro atmica um equipamento que permite a
anlise quantitativa de elementos metlicos em solues lquidas, gasosas e
slidas 119. Os componentes bsicos de um espectrmetro incluem a fonte de
radiao, sistema de atomizao, conjunto monocromador, detector e
processador (Figura 8).
30
I0 It
Figura 8 Diagrama de blocos de um espectrmetro de absoro atmica
A atomizao pode ser feita em chama, em tubo aquecido acoplado a
gerador de hidretos, atravs da gerao de vapor frio e eletrotermicamente em
forno de grafite, ou em outros sistemas alternativos.
3.8.2 Espectrofotometria UV - Visvel
A Espectrofotometria um dos mtodos instrumentais de anlise de
espcies qumicas. o mtodo de anlise ptica mais usada nas investigaes
fsico qumicas.
O espectrofotmetro (Figura 9) um instrumento que permite comparar a
radiao absorvida por uma soluo que contm uma concentrao
desconhecida do analito, selecionar o comprimento de onda da radiao
adequada anlise de um determinado componente do analito, medir a
intensidade I do feixe emergente que corresponde a um determinado feixe
incidente I0, convertendo o sinal recebido no detector em medida de
absorbncia para o comprimento de onda da anlise e por fim determinar a
concentrao de vrias solues a partir do grfico da variao de absorbncia
em funo da concentrao de vrias solues padro 120.
Fonte de radiao
hv
Sistema de atomizao
M + hv M*
Conjunto
monocromador
Detector
(Transdutor)
Amostra com teor
C do analito M
31
Figura 9: Espectrofotmetro de feixe simples.
A espectroscopia de absoro molecular baseada na medida da
transmitncia T ou absorbncia A de solues contidas em clulas
transparentes tendo um caminho ptico de b, dado em cm. A concentrao c
de um analito absorvente est relacionada linearmente com a absorbncia,
conforme representado na equao.
A = - log T = log P0 / P = . b. c
A Lei de Beer se aplica a um meio contendo mais de uma espcie de
substncia absorventes. Esta lei bem sucedida ao descrever o
comportamento da absoro de meios contendo concentraes de analito
relativamente baixas, neste sentido a Lei de Beer limitada 121.
Os componentes do instrumento so fonte, seletores de comprimentos de
onda, recipientes para amostra, transdutores de radiao e processadores de
sinal e dispositivos de leitura 122.
O esquema abaixo mostra claramente o funcionamento de um
Espectrofotmetro de feixe simples (Figura 10).
32
Figura 10: Esquema de um espectrofotmetro de feixe nico.
4. METODOLOGIA
4.1. Instrumentao
A determinao dos teores totais dos metais e nas protenas de cada frao
utilizando reagentes extratores foi realizada no Laboratrio de Anlises de
Minerais da UFRA e foram conduzidas em um espectrmetro de absoro
atmica com chama (SpectrAA 220, Varian) e sistema de aquisio de dados em
plataforma Windows. Lmpadas de catodo oco (HCL) de Cu, Fe, Mn e Zn foram
usadas como fontes de radiao.
Os parmetros instrumentais usados para a determinao de Fe, Cu, Mn e
Zn por FAAS so apresentados na Tabela 2.
33
Tabela 2. Parmetros instrumentais usados na determinao de Fe, Mn, Cu e Zn nas
amostras de frutas por FAAS
Parmetros Fe Mn Cu Zn
Comprimento de onda (nm) 248,3 279,5 324,8 213,9
Corrente da lmpada (mA) 10,0 5,0 7,0 5,0
Resoluo espectral (nm) 0,5 0,2 0,5 0,5
Na digesto das amostras foi utilizado um bloco digestor Tecnal (Modelo TE-
040/25-1).
Um espectrofotmetro de feixe simples com caminho tico de 1 cm foi
utilizado na determinao de protenas totais nas amostras de amndoas da
castanha-do-par e polpas de aa, bacur, cupuau e pupunha.
Na determinao do pH foi utilizado um peagmetro (marca WTW, Modelo
pH 330i).
Um agitador por efeito vrtex foi utilizado no procedimento de extrao
seqencial.
Uma centrfuga (Centribio, modelo 80 2B) foi utilizada na separao das
fraes proticas.
Um cromatgrafo lquido de alta resoluo (Varian) equipado com vlvula de
injeo Rheodyne (Modelo 7125, Cotati, CA, EUA) e uma coluna cromatogrfica
de excluso por tamanho foi utilizado na separao cromatogrficas das
protenas presentes no extrato de aa.
Um espectrmetro de absoro atmica com atomizao eletrotrmica em
forno de grafite (SpectrAA 220, Varian) equipado com amostrador automtico
(GTA 110), com corretor de fundo de lmpada de deutrio, tubo de grafite com
aquecimento longitudinal (HGA Varian) e sistema de aquisio de dados em
plataforma Windows foi usado na determinao de cobre. Lmpada de catodo
oco (HCL) de cobre foi usada como fonte de radiao. O gs argnio foi utilizado
como gs de purga em uma vazo de 3 L min-1 de argnio. Todas as medidas
34
foram obtidas por absorbncia integrada (integrao do sinal transiente de
absorbncia em funo do tempo).
4.2 Reagentes e Materiais
Todos os reagentes utilizados foram de grau analtico. Empregou-se gua
destilada - desionizada em sistema de purificao ELGA (resistividade 18,2
M .cm), permitindo-se assim obter gua com elevado grau de pureza. O cido
ntrico (Quimex, So Paulo, Brasil) utilizado na preparao das solues
analticas e na digesto cida, foi purificado em subdestiladores de quartzo
(Marconi, modelo MA 075). Na digesto das amostras tambm foi utilizado
H2O2 (Quimex, So Paulo, Brasil). Os padres dos elementos Fe, Cu, Mn e Zn
foram preparados em meio HNO3 7,8 % (m/v). Ar e acetileno foram utilizados
como gs oxidante (3,5 L/min) e combustvel (1,5 L/min) na determinao de
Cu, Fe, Mn e Zn, respectivamente.
Os materiais plsticos de polietileno, vidrarias e as ponteiras das
micropipetas aps usados foram lavados com gua, depois com gua
desionizada e, em seguida, foram imersos em um banho de soluo de 10%
(v/v) de HNO3 por 24 h. Posteriormente, esses materiais foram lavados
abundantemente com gua desionizada e secos.
Todas as amostras foram armazenadas sob refrigerao em frascos de
polietileno.
No procedimento de extrao seqencial foram utilizados CHCl3 (Quimex,
So Paulo, Brasil), CH3OH (Quimex, So Paulo, Brasil), NaOH (Synth,So
Paulo, Brasil), HCl (Synth, So Paulo, Brasil), Tris-HCl (Sigma Aldrich) em pH =
8,0, SDS em Tris-HCl em pH = 8,0 (Sigma Aldrich). Acetona 80% (v/v) foi
utilizada na precipitao das protenas.
As amostras das frutas utilizadas neste trabalho foram coletadas no
Mercado do Vr-o-Peso, na cidade de Belm (PA).
35
4.3 Procedimento analtico 4.3.1 Preparo de amostras As amostras (amndoa da castanha-do-par e polpas de aa, bacur,
cupuau e pupunha) foram inicialmente secas em estufa a uma temperatura de
aproximadamente 35 C durante 3 dias, at peso constante. Em seguida, foram
pulverizadas com o auxlio de um processador de alimentos. Aps essa etapa,
uma parte da amostra foi armazenada em frasco de polietileno, em temperatura
ambiente no dessecador.
4.3.2 Digesto das amostras
A digesto das polpas e amndoas foram realizadas em triplicatas (n=
3). Sub-amostras de cerca de 0,4 gramas foram pesadas e transferidas para
tubos de digesto, sendo em seguida adicionados 1,0 mL HNO3 concentrado
(14,0 mol L-1). A mistura foi mantida em overnight. Antes de ser colocado os
tubos com a mistura no bloco digestor foram adicionados 2,0 mL HNO3
concentrado (14,0 mol L-1) e 1,0 mL de H2O2 30% (m/m) e em seguida as
amostras foram colocadas no bloco digestor a temperatura de 130 C.
Transcorrido 3 horas do incio do processo de digesto, a temperatura foi
elevada 150 C. Verificado a diminuio da formao de gases aps 2 horas
nesta temperatura e finalmente para garantir que toda gordura presente nas
amostras fosse digerida, a temperatura foi elevada para 180 C e mantida
durante 1 h. Os tubos de digesto foram retirados do bloco e resfriados a
temperatura ambiente. Aps o resfriamento, os digeridos obtidos foram
transferidos para frascos volumtricos e os volumes ajustados para 25 mL com
gua desionizada. O branco analtico foi preparado pelo mesmo procedimento
sem a adio da amostra. A acidez final foi de 7,8% (v/v). A figura abaixo ilustra
o procedimento para a determinao total de Cu, Fe, Mn e Zn nos digeridos de
aa, bacur, castanha do par, cupuau e pupunha por FAAS.
36
Figura 11: Esquema referente ao procedimento de preparo de amostra para a
determinao total de Cu, Fe, Mn e Zn nos digeridos de aa, bacur, castanha do
par, cupuau e pupunha por FAAS
4.3.3 Remoo da frao lipdica
A frao lipdica foi obtida pesando em frascos volumtricos uma massa de
aproximadamente 5,0 g de cada amostra previamente pulverizada. Em seguida
foram adicionados 40 mL da soluo extratora de clorofrmio (CHCl3) e
metanol (CH3OH) (2:1 v/v). O frasco contendo a soluo extratora e a amostra
foram submetidos a agitao por efeito vrtex durante 10 minutos. Este
procedimento foi feito em triplicata (n= 3). A separao dos sobrenadantes foi
feita atravs de uma filtrao simples. O slido final foi seco em estufa a uma
temperatura de 30 C por 20 minutos. O sobrenadante rico em lipdeos foi
submetido a evaporao temperatura ambiente.. A frao lipdica obtida foi
submetida a uma digesto cida em bloco digestor como realizado para
determinao total dos elementos estudados. Aps a digesto, as solues
obtidas foram analisadas por FAAS. O procedimento de extrao dos lipdeos
mostrado na Figura 12.
37
Figura 12: Extrao das fraes lipdicas.
4.3.4 Extrao seqencial
Aproximadamente 1,0 g das amostras pulverizadas sem lipdeos foram
pesadas em frascos de polietileno e 20 mL de soluo extratora foram
adicionadas. As solues de NaOH 0,05 mol/L, HCl 0,05 mol/L, soluo
tampo de Tris-HCl (pH= 8,0) 0,05 mol/L, soluo tampo de Tris-HCl (pH=
8,0) 0,05 mol/L em 1% (m/v) SDS e gua 60 C foram empregadas como
agentes extratores no procedimento de extrao seqencial.
Para a extrao de protenas de alta massa molecular (HMW: high
molecular weight) e baixa massa molecular (LMW: low molecular weight) foi
utilizada uma soluo de NaOH 0,05 mol/L. As protenas de baixa massa
molecular foram extradas usando uma soluo de HCl 0,05 mol/L. A soluo
tampo de Tris HCl (pH = 8,0) e gua desionizada 60 C foi usada na
extrao das protenas solveis. Com a adio de um surfactante aninico
38
soluo de Tris HCl (pH = 8,0), como o SDS (Dodecil sulfato de sdio), foram
extradas as protenas insolveis.
O resduo da extrao de NaOH foi submetido a extrao com HCl e assim
sucessivamente. Em seguida foram agitadas em vrtex por 30 minutos e
posteriormente centrifugadas por 10 minutos a 3500 rpm. Os sobrenadantes
obtidos foram filtrados em filtros de nylon com poros de 0,45 m.
Para a ltima extrao foram adicionados 20 mL de gua desionizada no
resduo e levados a banho Maria 60 C por 30 minutos e posteriormente
centrifugados por 10 minutos a 3500 rpm.
Para a purificao das fraes durante a extrao seqencial, as protenas
foram precipitadas com 80% (v/v) de acetona a -14 C durante 30 minutos. Os
precipitados obtidos foram centrifugados durante 10 minutos a 3500 rpm. O
sobrenadante foi eliminado e os resduos foram submetidos a uma digesto
cida conforme apresentado no item 4.2.2. O procedimento de extrao
seqencial apresentado na Figura 13.
1,0g da amostra s/
lipdios
Agentes
extratores
3x
30 min.10 min
sobrenadante
acetona
80% da
sol.final
30 min, -14C
metaloprotenas
Acetona (3x)
FAAS
Digesto cidacentrifugao
Figura 13: Extrao das fraes proticas
39
4.3.5 Protena total Para a quantificao de protenas nas diferentes fraes proticas obtidas
durante a extrao seqencial das amostras de aa, bacur, castanha-do-par,
cupuau e pupunha foi utilizado o mtodo de Bradford.
As amostras foram inicialmente submetidas leitura de pH e posteriormente
foi adicionado 0,5 mL da soluo de NaOH 0,1 mol/L em 0,5 mL de cada
amostra para obter um pH na faixa de 10,0 a 11,0. Aps adio da soluo de
NaOH 0,1 mol/L, foi retirada uma alquota de 200 L da amostra e
acrescentado 2mL do reagente de Bradford. As amostras foram deixadas para
reagir por um perodo de 5 minutos. Aps este tempo a protena foi
quantificada atravs de um espectrofotmetro no comprimento de onda igual a
595 nm (Figura 14).
O mtodo de Bradford consiste em um mtodo analtico simples, preciso e
rpido sendo indicado para quantificao de protenas. O principal componente
do reagente o corante Coomassie Brilliant Blue G-250 que em soluo cida,
ao ligar-se com protenas apresenta absorbncia alterada de 465 nm para 595
nm. A faixa de linearidade do mtodo de 2 a 20 g /mL de protena.
Figura 14: Determinao de protena total
40
4.3.6 Determinao dos teores totais de Cu, Fe, Mn e Zn por espectrometria de
absoro atmica com chama (FAAS)
Para a determinao dos teores totais dos metais nos digeridos da
amndoa da castanha-do-par e nas polpas do cupuau, bacur, pupunha e
aa por FAAS, foram construdas curvas analticas de 5 a 15 mg/L Fe, 1,0 a
4,0 mg/L Mn e 0,5 a 1,5 mg/L Zn e 1 a 4 mg/L Cu em meio HNO3 7,8% (v/v).
4.3.7 Teste da adio e recuperao O teste de adio e recuperao foram realizados nos digeridos das
amostras e nas fraes obtidas na extrao seqencial. Nos digeridos e nas
fraes foram adicionados de 2,0 mg L-1 Cu, 5,0 mg L-1 Fe e 1,0 mg L-1 Zn.
4.3.8 Otimizao da separao cromatogrfica dos padres de protenas
As solues das protenas foram preparadas atravs da dissoluo de 2 mg
mL-1 ferritina, 2 mg mL-1 albumina, 2 mg mL-1 mioglobina e 2 mg mL-1 seleno-
metionina em 0,0025 mol L-1 Tris-HCl (pH 7,4) contendo SDS (0,5% m/v). A fase
mvel foi sonicada durante 20 min a fim de remover completamente o oxignio
dissolvido antes de iniciar os experimentos.
As condies cromatogrficas usadas para a separao das protenas padro
por cromatografia de excluso por tamanhos (SEC) so apresentadas na Tabela
3. A separao foi realizada usando um gradiente isocrtico de SDS (0,5% m/v)
em 0,0025 mol L-1 Tris-HCl (pH 7,4). O pH foi ajustado com 50% (v v-1) cido
clordrico. O eluente da coluna de excluso por tamanhos foi passado por um
detector UV e o comprimento de onda de 295 nm foi selecionado para
monitoramento das protenas. O cromatograma obtido foi registrado.
41
Tabela 3 - Condies operacionais para SEC usando gradiente isocrtico.
Coluna Biosep - SEC - S 3000 (300 mm x 7.8 mm)
Ala de amostra
( L)
20
Vazo do eluente (mL min-1)
0,6
Eluente 0,0025 mol L-1 Tris-HCl (pH 7,4) em SDS (0,5% m/v).
Deteco das protenas
UV a 295 nm
4.3.9 Deteco de Cu associado s protenas presentes no aa por SEC-UV
O extrato obtido no item 4.2.4 em meio NaOH para amostra de aa foi
injetada no sistema SEC-UV (Figura 15).
1,0g da amostra
s/ lipdios
10 mL NaOH
0,05M
3x
15 min. 10 min.sobrenadante
acetona
80% da
sol.final
30 min, -14C
metaloprotenas
Acetona (3x)Solubilizao
0,05 mol/L Tris-HCl em
pH = 8,0 em 5% (m/v) de SDS
Diluio 10x
em pH = 7,4
20L da amostraSEC-HPLC
Liofilizada GFAAS
HNO3 0,028 mol/L
Figura 15: Esquema do procedimento para deteco de Cu na frao protica do aa por SEC UV e SEC GFAAS
42
Fase mvel
Espectrofotmetro
UV
HPLC
Coluna
20 L
amostra
Fase mvel
Espectrofotmetro
UV
HPLC
Coluna
20 L
amostra
Espectrofotmetro
UV
HPLC
Coluna
20 L
amostra
Liofilizao das
fraes por 24 h
HPLCColuna
Coleta das fraesFase mvel
Amostrador
automtico
GFAAS
200 L HNO30,028 mol L-1
Liofilizao das
fraes por 24 h
HPLCColuna
Coleta das fraesFase mvel Liofilizao das
fraes por 24 h
HPLCColuna
Coleta das fraesFase mvel
Amostrador
automtico
GFAAS
200 L HNO30,028 mol L-1
As condies usadas para a separao das protenas so as mesmas detalhadas
na Tabela 3. O esquema referente ao sistema SEC on-line UV mostrado na
Figura 16. O perfil cromatogrfico obtido foi registrado.
Figura 16 - Esquema do sistema SEC on-line UV.
4.3.10 Deteco das espcies de Cu associadas s protenas do aa por SEC-
GFAAS
O extrato obtido no item 4.2.4 em meio NaOH para amostra de aa foi
injetada no sistema SEC-UV e as fraes foram coletadas de 1,0 em 1,0 min
em copos do amostrador automtico do forno de grafite (Figura 17).
.
Figura 17 - Esquema do sistema off-line SEC-GFAAS
43
As condies usadas para a separao das protenas so as mesmas
detalhadas na Tabela 3. As fraes coletadas foram liofilizadas. Aps a
liofilizao, as fraes foram solubilizadas em 0,028 mol L-1 de HNO3. Em
seguida, cobre foi determinado nas fraes por GFAAS. As condies
instrumentais para determinao de Cu por GFAAS so apresentadas na
Tabela 4.
Tabela 4 - Programa de aquecimento do forno de grafite
Etapa Temperatura (C)
Tempo (s)
(rampa, patamar)
gs purga
(L min-1)
Leitura
1 95 5, 40 3,0 No
2 120 10, 30 3,0 No
3 1000 (Tp) 5,20 3,0 No
4 2300 (Ta) 2, 0 0 Sim
5 2400 1,3 3,0 No
Tp: Temperatura de pirlise; Ta: Temperatura de atomizao.
5. RESULTADOS E DISCUSSO
5.1.Concentrao dos elementos nas amostras A presena de carbono residual nas solues das amostras digeridas
crtica para vrias tcnicas analticas, porm o uso de solues de cido ntrico
mais concentrado pode acarretar em melhor oxidao da matria orgnica 123.
44
A possibilidade de se diminuir a quantidade de reagentes atrativa por
diversos fatores, tais como reduo dos resduos gerados, custo, contaminao
e da intensidade do branco analtico. Alm disso, a gerao de solues com
menor teor de cidos interessante devido a no necess
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