diagnostigo genetico preimplantacional manuel gasco

DIAGNOSTIGO GENETICO PREIMPLANTACIONAL

Manuel Gasco

El diagnóstico genético preimplantacional El diagnóstico genético preimplantacional (DGP) es el estudio del material genético (DGP) es el estudio del material genético del embrión para detectar determinadas del embrión para detectar determinadas alteraciones. Con este estudio genético alteraciones. Con este estudio genético parcial podemos seleccionar los parcial podemos seleccionar los embriones cromosómicamente normales embriones cromosómicamente normales antes de su transferencia al útero antes de su transferencia al útero materno. materno.

AneuploidíasAneuploidías

MonosomíasMonosomías TrisomíasTrisomías TriploidíasTriploidías

La técnica consiste en extraer una o dos La técnica consiste en extraer una o dos células de un embrión de más de seis células de un embrión de más de seis células para analizar su material genético.células para analizar su material genético.

Three day old embryos

FISH: FISH: HHibridación "in situ" con sondas ibridación "in situ" con sondas fluorescentes de DNAfluorescentes de DNA..

PCRPCR

Cromosomas: X, Y, 13, 16, 18, 21 y 22Cromosomas: X, Y, 13, 16, 18, 21 y 22

FISHFISH

Sondas fluorescentes q se ligan a Sondas fluorescentes q se ligan a cromosomas específicos y son marcadas cromosomas específicos y son marcadas con biotina, estos son detectados con con biotina, estos son detectados con anticuerpos conjugados con fluorocromos anticuerpos conjugados con fluorocromos específicos y se observan bajo específicos y se observan bajo microscopía de fluoerescencia.microscopía de fluoerescencia.

X

Y

Interphase nucleus

Normal DiploidTriploid

Tetraploid Missing chromosomes

Normal DiploidTriploid

Tetraploid Missing chromosomes

Monosomy Double trisomy

PGD

Lepidium meyenii (Maca) incrementa el tamaño de la camada en ratonas adultas

normales

Ruiz Ana, Stephanie Salazar, Norma Aspajo, Julio Rubio, Manuel Gasco, Gustavo Gonzales.

Instituto de Investigaciones de la AlturaDepartamento Académico de Ciencias Biológicas y Fisiológicas

Facultad de Ciencias y FilosofíaUniversidad Peruana Cayetano Heredia

INTRODUCCION

• Maca es una crucifera q crece exclusivamente entre 3800 y 4500 msnm en los andes centrales peruanos y ha sido utilizada por siglos como nutriente y como potenciador de la fertilidad.

• Estudios previos han demostrado efectos positivos de la maca sobre la espermatogénesis (Gonzales GF, 2001, 2003, 2004; Chung, 2005; Bustos-Obregòn, 2005) y sobre el comportamiento sexual (Zheng BL, 2000; Cicero AF, 2001, 2002) mientras que en hembras solo hay un estudio reportado donde determinan que la maca no modifica la tasa de implantación en ratonas (Oshima M, 2003).

OBJETIVO

• Determinar el efecto del extracto acuoso de Maca en ratonas adultas sobre los índices reproductivos y peso uterino (ratonas ovariectomizadas).

METODOS

• Ratonas de la cepa Balb/C, fueron divididas en 3 grupos:

Indices Reproductivos Sitios de ImplantaciónPeso Uterino

Ratas Ovariectomizadas

Vehículo Maca1 g/kg

Maca0.5 g/kg

VehículoMaca1 g/kg

Vehículo

Preparacion del Extracto Acuoso

• El hipocótilo seco molido se hierve en agua durante 2 hrs, se filtra y se refrigera a -70oC y luego al proceso de liofilizado.

• 2.2 g del liofilizado se diluye en agua destilada hasta obtener una dosis de 1g/kg.

Estudio de los sitios de Implantación

• El tratamiento fue durante 22-28 días (15 días previos a la monta y durante los primeros 7 días de gestación).

• Las ratonas fueron sacrificadas al día 7 de preñez, el útero fue removido y se observaron los sitios de implantación, los embriones fueron contados y pesados.

Estudio de los Indices Reproductivos

• 15 días previos a la monta, durante la preñez y 21 días post parto, las hembras fueron administradas con maca o vehículo.

• Se registró el número de crías vivas al día 4 y 21, el día de la abertura vaginal y la tasa sexual (fracción masculina).

INDICES REPRODUCTIVOS

Indice de Fertilidad(♀ preñadas/♀copularon) X 100

Indice de Gestación(♀ con crías vivas/♀ preñadas) X 100

Indice de Viabilidad Post-natal(crías vivas día 4/crías vivas) X 100

Indice de Viabilidad al destete(crías vivas al día 21/crías vivas día 4) X 100

Efecto estrogénico de Maca

?

Ratonas ovariectomizadas30d

Administró 42 días de Maca o Vehículo

Análisis Estadísticos

• Normalidad de los datos: Test de Kolmogorov-Sminorv.• Peso corporal, sitios de implantación, longitud de la

gestación y tamaño de camada se evaluaron con el test t de Student’s.

• Analisis multivariado fue utilizado para determinar si el tratamiento con maca influye sobre el número de crías y sobre el día de la abertura vaginal.

• Los índices reproductivos fueron analizados con el test de proporción pareada.

• P<0.05 fue estadísticamente significante.

RESULTADOSINDICES REPRODUCTIVOS EN RATONAS QUE RECIBIERON MACA O

VEHICULO

80

82

84

86

88

90

92

94

96

98

100

Indice de Fertilidad Indice de Gestacion Indice de ViabilidadP osnatal

Indice de Viabilidad alDestete

%

Vehículo

Maca

Sitios de Implantación

12345678

9101112131415

Sitios de Implantación

Num

ero

de im

plan

taci

ones

Vehículo

Maca

Longitud de la Gestación

15

16

17

18

19

20

21

Longitud de la Gestación

Día

s d

e p

reñ

ez Vehículo

Maca

Efecto de la maca sobre el tamaño de la camada

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Día 1 Día 4 Día 21

Nú

me

ro d

e c

ría

s

Vehículo

Maca

* *

* P<0.05 respecto al grupo vehículo

Día del Abertura Vaginal

0

5

10

15

20

25

30

35

<7 crías ≥ 7 crías

Día

de

la a

ber

tura

vag

inal

Vehículo

Maca

Ratonas Ovariectomizadas

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Peso Uterino

Peso

ute

rino

en m

g

Vehículo

Maca

*

CONCLUSIONES

La administración de maca (1 g/kg) a ratones hembras normales en edad reproductiva incrementa el tamaño de la camada, sin afectar los índices de fertilidad, de gestación, de viabilidad post-natal, de viabilidad al destete, número de implantaciones y apertura vaginal.

La administración de maca (0.5 g/kg/) aumenta el peso uterino en ratonas ovariectomizadas, luego de 42 días de tratamiento.

RATAS TRATADAS CON MACA NEGRA (Lepidium meyenii) DURANTE UN CICLO

ESPERMATOGÉNICO

J. Nieto, M. Gasco, J.Rubio, S. Yucra, GF Gonzales

Instituto de Investigaciones de la AlturaFacultad de Ciencias y Filosofía

Universidad Peruana Cayetano Heredia

INTRODUCCIÓN

• La espermatogénesis en rata dura 12.5 días.• La Maca presenta diferentes ecotipos de acuerdo al color de su

hipocotilos (13 descritos).• La Maca amarilla, roja y negra obtenidas de Carhuamayo Junín, tienen

diferentes componentes nutricionales al compararlos entre ellos. (Yllescas, 1994)

• 2005 : Effect of short-term and long-term treatments with three ecotypes of Lepidium meyenii (MACA) on spermatogenesis in rats. (C. Gonzales, J. Nieto, S Yucra, J. Rubio, M. Gasco, C. Góñez, S. Miranda and GF Gonzales) (en revisión)

• Maca Negra tuvo el mejor efecto en conteo de espermatozoides y motilidad; maca amarilla tuvo un efecto intermedio; mientras que maca roja no tuvo efectos a nivel de estos parámetros.

Efectos de diferentes ecotipos de Maca ( 42 días) en la longitud del estadío VIII del epitelio del túbulo seminífero (cm.), conteo de espermátides, producción diaria de espermatozoides (DSP) y

tránsito de espermatozoides en ratas.

• Los datos son promedio ± EE. *P<0.01; **P<0.02 with respect to control group. Number of rats per group is between parentheses.respecto al grupo control. El número de ratas por grupo están entre los paréntesis.

OBJETIVO GENERAL

• Determinar el efecto de la maca negra, un ecotipo de la maca (Lepidium meyenii) sobre la producción diaria de espermatozoides, conteo de espermátides, conteo de espermatozoides y niveles de hormonas en un ciclo espermatogénico.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Determinar el efecto de la maca negra a diferentes tiempos de administración(1,3,5,7 y 12 días) durante un ciclo espermatogénico.

• Determinar el efecto de la maca negra en la histología del testículo y del epidídimo durante un ciclo espermatogénico.

• Determinar el efecto de la maca negra sobre los niveles de testosterona intratesticular y sérica.

MÉTODO

• Se administró a ratas Holtzman adultas 2gr/Kg de MN (666.6 mg.) y vehículo durante 1, 3, 5, 7, y 12 días.

• Un día después de cada tratamiento las ratas fueron sacrificadas y evaluadas.

• Se pesaron los órganos sexuales: epidídimos, testículos, vesícula seminal y próstata.

• Se evaluaron los niveles de testosterona sérica e intratesticular.

RESULTADOS

Producción Diaria de espermatozoides (DSP)

12,00

14,00

16,00

18,00

20,00

22,00

Treatment Time (days)

DS

P (

x10

6)

1 3 5 7 12

* a

c b

b

b

A

(p<0.05)(p<0.05)

Conteo de espermatozoides en epidídimo

70.00

90.00

110.00

130.00

150.00

170.00

190.00

210.00

230.00

Time of Treatment (days)

Ep

idyd

imal sp

erm

co

un

t (x

106

)

Black Maca Control

1 3 5 7 12

**

*c d

c

d

cad

B

Conteo de Espermatozoides en el Conducto deferente

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

Time of Treatment (days)

Va

s d

efe

ren

s s

pe

rm c

ou

nt

(x1

06 )

Black Maca Control

1 3 5 7 12

*

**

c

C

MN 7 DIAS VS MN 12 DÍAS

Área tubular y luminal maca negra durante 7 y 12 días

*P<0.05 respecto al area tubular

Se contaron 20 tubulos por animal, 100 por grupo.

0

5

10

15

20

25

30

35

7 Days 12 Days

% o

f lum

inal

are

a re

late

d to

tub

ular

are

a

Control Black Maca

*

Efectos de Maca Negra en los túbulos seminíferos administrada a ratas durante 7 y 12 días. A,C: Grupos controles de ratas tratadas durante 7 y 12 días,

respectivamente; B,D: Maca Negra tratada durante 7 y 12 days, respectivamente. HE stain. ×100 magnification. Las barras representan 500

um.

Histología de la cola del epidídimo en ratas machos adultos tratadas con Maca Negra durante 7 y 12 días. A, C: grupos Control de ratas tratadas durante 7 y 12 días, respectivamente; B, D grupos de Maca Negra (2g/kg) tratada durante 7 y 12 días, respectivamente. HE stain. Magnificación: X 10. Las barras representan 500 um.

MACA NEGRA 7D TESTOSTERONA

INTRATESTICULAR

Niveles de testosterona Intratesticular (TTI) y testosterona sérica (TS)- ng/g

testículo

  C MN

TTI 16,89 ± 2.03 17,22 ± 3.67

T SERICA 264.73 ± 34.11 229.46 ± 47.18