diagnóstico laboratorial de micoplasmas animales · diagnóstico laboratorial de micoplasmas...
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Diagnóstico laboratorial de micoplasmas animales
José B. PovedaJosé B. Poveda
UNIDAD DE EPIDEMIOLOGÍA Y MEDICINA PREVENTIVAFACULTAD DE VETERINARIA. ULPGC
Mollicutes
Los micoplasmas o más correctamente Mollicutes constituyen un grupo de bacterias de pequeño tamaño
que carecen de pared celular
micoplasmas mesoplasmas
ureaplasmasespiroplasmas
fitoplasmas
entomoplasmasacholeplasmas
eperythrozoon haemobartonellas
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mbp
Clostridia
Mollicutes
Bacilli
Spirochaetes
Bacteroidetes
Chlamydiae
delta proteobacteria
epsilon proteobacteria
beta proteobacteria
gamma proteobacteria
Firmicutes con bajo contenido G+C
Se caracterizan por su pequeño genoma(0.58 a 1.38 Mbps )
Poseen un bajo contenido en G+C (23 a 40 mol%).
M. capricolum subsp. capricolum (Mcc)
M. capricolum subsp. capripneumoniae (Mccp)M. sp. bovine group 7 (Mbg7)
M. mycoides subsp. mycoides LC (MmmLC) M. mycoides subsp. capri (Mmc)
M. cottewii M. yeatsii
M. gallisepticum
M. genitalium
M. pneumoniaeM. penetrans
U. parvum
M. pulmonisM. hyopneumoniae
M. conjunctivae
M. adleri
M. primatum
M. agalactiae
M. bovisM. hominis
M. alkalescensM. arginini
M. auris
An. bactoclasticumA. laidlawii
Ca. Phytoplama aurantifolia
As. anaerobium
S. citri
M. putrefaciens
M. species serogroup 11
M. mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC)
100
100
100
100
100
100
50
93
100
89
0.1
Spiroplasma
Pneumoniae
Hominis
Phytoplasma Acholeplasma
Haemoplasmas
Mollicutes
Los Mollicutes, son bacterias mínimas que poseen un amplio espectro de hospedadores
rumiantes aves
humanospeces
artrópodos
reptilesplantas
Muchos hospedadores para tan pequeña cantidad de genes
LOS MYCOPLASMAS SON COMENSALES Y PATÓGENOS DE DIFERENTES ESPECIES DE ANIMALES INCLUYENDO
PECES, REPTILES, AVES Y MAMÍFEROS
LOS MYCOPLASMAS SON COMENSALES Y PATÓGENOS DE DIFERENTES ESPECIES DE ANIMALES INCLUYENDO
PECES, REPTILES, AVES Y MAMÍFEROS
PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA BOVINA (CBPP)
Mycoplasma mycoides subsp. mycoides
8
1847
1860
1841
1846
1864
PERSPECTIVA HISTÓRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LA PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA BOVINA
PERSPECTIVA HISTÓRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LA PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA BOVINA
9
1853
Exístía previamente en Africa?
1880
1858
1843
1868
En el siglo 19 el comercio de ganado conduce a la rápida expansión de la enfermedad
América del Surnunca fue contaminada
PERSPECTIVA HISTÓRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LA PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA BOVINA
PERSPECTIVA HISTÓRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LA PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA BOVINA
LA PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA BOVINA SIGUE SIENDO UNO DE LOS MAYORES IMPEDIMENTOS PARA LA CRÍA DEL
GANADO VACUNO EN EL AFRICA SUBSAHARIANA
LA PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA BOVINA SIGUE SIENDO UNO DE LOS MAYORES IMPEDIMENTOS PARA LA CRÍA DEL
GANADO VACUNO EN EL AFRICA SUBSAHARIANA
Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae
PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA CAPRINA
AGALAXIA CONTAGIOSA DE LOS PEQUEÑOS RUMIANTESMycoplasma agalactiae
PLEURONEUMONÍAS CAPRINAS
Mycoplasma mycoides subsp. capri
ARTRITIS MAMITIS Y NEUMONÍAS CAPRINAS
Mycoplasma capricolum subsp. capricolum
ARTRITIS Y MAMITIS CAPRINAS
Mycoplasma putrefaciens
NEUMONÍA ENZOÓTICA PORCINA
Mycoplasma hyopneumoniae
AFECCIONES POR MYCOPLASMA BOVIS
Mycoplasma bovis
ENFERMEDAD CRÓNICA RESPIRATORIA DE LAS AVES
Mycoplasma gallisepticum
SINUSITIS DEL PAVO
Mycoplasma meleagridis
SINOVITIS INFECCIOSA AVIAR
Mycoplasma synoviae
ANEMIA INFECCIOSA FELINA
Mycoplasma haemofelis Candidatus Mycoplasma haemominutum
Candidatus Mycoplasma turicensis
ANEMIAS POR HEMOPLASMAS EN CÁNIDOSMycoplasma haemocanis
ANEMIAS POR HEMOPLASMAS EN PORCINOS
Mycoplasma suis
ANEMIAS POR HEMOPLASMAS EN OVINOS
Mycoplasma ovis
LAS DIFICULTADES DE CULTIVO DE ESTOS MICROORGANISMOS ES UN GRAN OBSTÁCULO
PARA LA INVESTIGACIÓN Y PARA EL DIGNÓSTICO
LAS DIFICULTADES DE CULTIVO DE ESTOS MICROORGANISMOS ES UN GRAN OBSTÁCULO
PARA LA INVESTIGACIÓN Y PARA EL DIGNÓSTICO
Mycoplasma bovis
MUCHAS ESPECIES CONTINÚAN SIENDO INCULTIVABLES A PESAR DE LOS GRANDES
ESFUERZOS QUE SE HAN REALIZADO EN LOS ÚLTIMOS AÑOS
MUCHAS ESPECIES CONTINÚAN SIENDO INCULTIVABLES A PESAR DE LOS GRANDES
ESFUERZOS QUE SE HAN REALIZADO EN LOS ÚLTIMOS AÑOS
Mycoplasma haemofelis
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mbp
Clostridia
Mollicutes
Bacilli
Spirochaetes
Bacteroidetes
Chlamydiae
delta proteobacteria
epsilon proteobacteria
beta proteobacteria
gamma proteobacteria
Firmicutes con
bajo contenidoG+C
(0.58 a 1.38 Mbps )
LOS MICOPLASMAS TIENEN UNA LIMITADA CAPACIDAD PARA SINTETIZAR MACROMOLÉCULAS ESENCIALES PARA SU CRECIMIENTO POR SU PEQUEÑO GENOMA
LOS MICOPLASMAS TIENEN UNA LIMITADA CAPACIDAD PARA SINTETIZAR MACROMOLÉCULAS ESENCIALES PARA SU CRECIMIENTO POR SU PEQUEÑO GENOMA
INFUSIÓN CEREBRO-CORAZÓN PEPTONAS
EXTRACTO DE LEVADURA
SUERO
SUPLEMENTOS
PARA SUPERAR ESTAS DEFICIENCIAS SE EMPLEAN PARA SU CULTIVO MEDIOS MUY RICOS.
PARA SUPERAR ESTAS DEFICIENCIAS SE EMPLEAN PARA SU CULTIVO MEDIOS MUY RICOS.
LOS MICOPLASMAS SON COMPLETAMENTE DEPENDIENTES DE LOS ÁCIDOS GRASOS QUE OBTIENEN DE LOS HOSPEDADORES. LOS MICOPLASMAS SON COMPLETAMENTE DEPENDIENTES DE LOS ÁCIDOS GRASOS QUE OBTIENEN DE LOS HOSPEDADORES.
AMINOÁCIDOSPRECURSORES DE LOS ÁCIDOS NUCLEIDOS
PRECURSORES DE LOS LÍPIDOS VITAMINAS
MEDIO HAYFLICK (HAYFLICK 1965)MEDIO HAYFLICK (HAYFLICK 1965)
Extracto de levadura 19.6 gInfusión de cerebro 17.7 gSuero de caballo 157.0 mlRojo fenol 24.0 mg Penicilina 40.0 IkUDNA 19.0 mg
pH 7.8
Mycoplasma spp
MEDIO PH (KIRCHHOFF Y ROSENGARTEN 1984)MEDIO PH (KIRCHHOFF Y ROSENGARTEN 1984)
Extracto fresco de levadura 16.8 gAgua bidestilada 700.0 ml
Extracto fresco de levadura 18.0 mlPenicilina G (100.000 UI/ml) 6.0 mlDNA (0.4%) 4.4 mlB-NAD 0.10 gL-cisteína hcl 0.10 gAgua bidestilada 91.0 ml
Suero de caballo 178.0 mlpH 7.4
Mycoplasma mycoides capri
MEDIO SP4 (WHITCOMB 1983)MEDIO SP4 (WHITCOMB 1983)
Bacto PPLO broth 4.2 gBacto peptona 6.4 gBacto triptona 12.0 g Agua bidestilada 535.0 ml
pH 7.8RPMI 1640 60.0 mlExtracto fresco de levadura 42.0 mlYeastolate (5g/250 ml) 120.0 mlGlucosa (solución al 50%) 12.0 mlPenicilina G (1.000.000 UI/ml) 6.0 mlRojo fenol (0.1%) 24.0 mlAgua bidestilada 200.0 ml
pH 7.2Suero de caballo 251.0 ml
Mycoplasma fermentans
MEDIO SP4II (RAMIREZ Y COLS 1997)MEDIO SP4II (RAMIREZ Y COLS 1997)
Bacto PPLO broth 4.2 gBacto peptona 6.4 gBacto triptona 12.0 g Agua bidestilada 535.0 ml
pH 7.8Extracto fresco de levadura 42.0 mlAmpicilina (100 mg/ml) 2.5 mlExtracto de levadura (5g/250 ml)120.0 mlDNA (0.4%) 5.5 mlPiruvato sódico 2.5 mlB-NAD 0.125 gL-cisteína hcl 0.125 g CMRL 1066 (10X) 60.0 mlRojo fenol (0.1%) 24.0 mlAgua bidestilada 207.5 ml
pH 7.2Suero de caballo 251.0 ml
Mycoplasma hyorhinis
MEDIO DE FRIIS (FRIIS 1975)MEDIO DE FRIIS (FRIIS 1975)
Mycoplasma hyopneumoniae
Solución balanceada de Hanks 500.0 ml Brain Heart Infusion (BHI) 8.2 gBacto PPLO Broth 8.7 gAgua bidestilada 650.0 ml
pH 7.4Extracto fresco de levadura (25%) 34.0 mlRojo Fenol solución al 1% 100.0 mlPenicilina G solución (200.000 UI/ml) 3.5 ml
pH 7.4Suero de caballo 220 .0 mlSuero de cerdo 220 .0 ml
MEDIO DE FRIIS MEDIO DE FRIIS
TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO
TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO
TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO
TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO
TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO
TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO
TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO
TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO
Mycoplasma hyopneumoniae
Mycoplasma flocculare
Mycoplasma hyorhinis
Mycoplasma hyosynoviae
10T3
13 CL
34 CL
11 CL2
15 CL2
39 CL
10 T4
72 CL
51 CL
TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO
98 CL1
18 CL
20 CL
54 CL
98 CL2
98 CL3 13 CL3
20CL2
13 T2
TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO
J.B. PovedaBIOCHEMICAL CHARACTERISTICS IN
MYCOPLASMA IDENTIFICATIONMYCOPLASMA PROTOCOLS
Editores R. Nicholas and R.J. MilesHumana Press. Totowa New York. 1998
Glucose Mannose Arginine Tetrazolium Urea Films&Spot
10T3 NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE WEAK
34CL NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE WEAK
18CL NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE WEAK
72CL NEGARIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE WEAK
98CL1 NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE WEAK
98CL3 NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE WEAK
10T4 POSITIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE NEGATIVE NEGATIVE
98CL2 POSITIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE NEGATIVE NEGATIVE
11CL2 NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE
13T2 NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE
51CL NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE
54CL NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE
58CL NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE
13CL NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE NEGATIVE
15CL NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE POSITIVE NEGATIVE WEAK
39CL POSITIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE NEGATIVE
MYCOPLASMAS FERMENTATIVOSMYCOPLASMAS FERMENTATIVOS
MYCOPLASMAS QUE HIDROLIZAN LA ARGININA
MYCOPLASMAS QUE HIDROLIZAN LA ARGININA
MYCOPLASMAS QUE NO FERMENTAN LA GLUCOSA NI HIDROLIZAN LA ARGININA
MYCOPLASMAS QUE NO FERMENTAN LA GLUCOSA NI HIDROLIZAN LA ARGININA
MYCOPLASMAS QUE PRODUCEN PELÍCULAS Y CRISTALES EN EL MEDIO
MYCOPLASMAS QUE PRODUCEN PELÍCULAS Y CRISTALES EN EL MEDIO
J.B. Poveda and R. NicholasSEROLOGICAL IDENTIFICATION OF
MYCOPLASMAS BY GROWTH AND METABOLISM INHIBITION TEST .MYCOPLASMA PROTOCOLS
Editores R. Nicholas and R.J. MilesHumana Press. Totowa New York. 1998
LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTOLA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO
LA INHIBICIÓN DEL METABOLISMOLA INHIBICIÓN DEL METABOLISMO
ELISAELISA
Mycoplasma bovis Mycoplasma gallisepticum
Mycoplasma hyopneumoniae
Mycoplasma synoviaeMycoplasma agalactiae
Mycoplasma mycoides
Estudiamos la distribución de la agalaxiacontagiosa caprina en las Islas Canarias
mediante un ELISA indirecto
Serological study of contagious agalactia in herds of goa ts in theCanary Islands.Assunção P, De la Fe C, Ramirez AS, Andrada M, Poveda JB.Unit of Epidemiology and Preventive Medicine, Veterinary Faculty, University of Las Palmas, Transmontaña s/n 35416 Arucas, Las Palmas de Gran Canaria, Spain.
Estudiamos 3890 muestras deun total de 204 explotaciones
Los resultados indican que la seroprevalencia es alt a
Mycoplasma agalactiae55%
Mycoplasma mycoides LC67%
PCR PARA DETECTAR MOLLICUTESPCR PARA DETECTAR MOLLICUTES
van Kuppeveld et al.1992
5’-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT- 3’
5’ -TGCACCATCTGTCACTCTGTT AACCTC- 3’
GPO-3
MGS-O
PRODUCTO: 270 pb
16S rRNA
PCR PARA DETECTAR Mycoplasma agalactiaePCR PARA DETECTAR Mycoplasma agalactiae
5´-AAAGGTGCTTGAGAAATGGC-3´
5´-GTTGCAGAAGAAAGTCCAATCA-3´
Ciclo Repeticiones Temperatura Tiempo
1 1 94ºC 300 seg
2 35
94ºC 60 seg.
55ºC 60 seg.
72ºC 60 seg.
3 1 72ºC 600 seg.
4 1 4ºC Hold
Tola et al.1997
FS1
FS2
PRODUCTO 375 pb
16S rRNA
PCR PARA DETECTAR GRUPO MYCOIDESPCR PARA DETECTAR GRUPO MYCOIDES
Ciclo Repeticiones Temperatura Tiempo
1 1 94ºC 120 seg
2 30
94ºC 15 seg.
50ºC 15 seg.
72ºC 15 seg.
3 1 72ºC 300 seg.
4 1 4ºC Hold
5´-TGCACTTGGTGAATATARAAAAGG-3´
5´-GGATCTAAAGCRTGTATTARTAATG-3´
glk-myc-2F
glk-myc-2R
Woubit et al. 2007
PRODUCTO 428 pb
Mycoplasma mycoides mycoidesMycoplasma mycoides capriMycoplasma capricolum capricolumMycoplasma capricolum capripneumoniae
PCR PARA DETECTAR GRUPO MYCOIDESPCR PARA DETECTAR GRUPO MYCOIDES
Manso-Silvan et al. 2007
PRODUCTO 781 pb
FusA-F 5´-TGAAATTTTTAGATGGTGGAGAA-3´
5´-GGTAATTTAATAGTTTCACGATATGAA -3´FusA-R
fusA
PCR PARA DETECTAR GRUPO MYCOIDESPCR PARA DETECTAR GRUPO MYCOIDES
Manso-Silvan et al. 2007
PRODUCTO 695 pb
GlpQ-L-F 5´-GTGAATATAATGATCTTAGTAGC-3´
5´-TCAGGATAATCTGAAATATAACC -3´GlpQ-L-R
glpQ
PCR PARA DETECTAR GRUPO CAPRICOLUMPCR PARA DETECTAR GRUPO CAPRICOLUM
Laure Maigre et al. 2007
ShA51-F 5´-TAATAATAAAAGCGAAGAAAC -3´
ShA51-R 5´-CAGAAATCTGCTTAGTTAAAC -3´
Ciclo Repeticiones Temperatura Tiempo
1 1 94ºC 120 seg
2 35
94ºC 30 seg.
48ºC 15 seg.
72ºC 15 seg.
3 1 72ºC 300 seg.
4 1 4ºC Hold
PRODUCTO 560 pb
PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA CAPRICOLUM CAPRIPNEUMONIAE
PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA CAPRICOLUM CAPRIPNEUMONIAE
Woubit et al. 2004
Mccp-spe-F 5´-ATCATTTTTAATCCCTTCAAG -3´
Mccp-spe-R 5´-TACTATGAGTAATTATAATATATGCAA -3´
Ciclo Repeticiones Temperatura Tiempo
1 1 94ºC 120 seg
2 35
94ºC 30 seg.
47ºC 15 seg.
72ºC 15 seg.
3 1 72ºC 300 seg.
4 1 4ºC Hold
PRODUCTO 316 pb
PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA PUTREFACIENS
PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA PUTREFACIENS
Peyraud et al. 2003
Mput1 5´-AAATTGTTGAAAAATTAGCGCGAC -3´
Mput2 5´-CATATCATCAACTAGATTAATAGTAGCACC -3´
Ciclo Repeticiones Temperatura Tiempo
1 1 95ºC 600 seg
2 35
94ºC 15 seg.
52ºC 15 seg.
72ºC 15 seg.
3 1 72ºC 60 seg.
4 1 4ºC Hold
PRODUCTO 316 pb
Cooperamos con otros laboratorios parala puesta a punto de técnicas de diagnóstico de biología molecular
A specific PCR for the detection of Mycoplasma putrefacie ns, one of the agents of the contagious agalactia syndrome ofgoats.Peyraud A, Woubit S, Poveda JB, De la Fe C, Mercier P, Thiaucourt F.CIRAD EMVT Sante Animale, Animal Health Program, TA30/G Campus International de Baillarguet, 34398 Montpellier, France.
Mol Cell Probes. 2003 Dec;17(6):289-94 .
NESTED PCR
Calsamiglia y cols., 1999
PRIMERS DESCRITOS PORMattson y cols., 1995
PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE
PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE
PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA HYORHINIS
PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA HYORHINIS
PCR
Caron y cols., 2000
PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA FLOCCULARE
PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA FLOCCULARE
PCR
Stenke y cols., 1994
PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA HYOSYNOVIAE
PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA HYOSYNOVIAE
PCRArehns y cols., 1996
PCR
Kokotovic y cols., 2002
Cebador Especificidad Secuencia (5́ -3´)Tamaño del fragmento
amplificado
Mhyo 1M. hyopneumoniae
GAC CCT TCA AGC TTC ACC AAG A649 pb
Mhyo 2 TGT GTT AGT GAC TTT TGC CAC C
Mfloc 1M. flocculare
ACG GGA TAG TAT TTT AGT TTT ACT A400 pb
Mfloc 2 TCT TCC CTT ACA ACA GCA GTT TAC A
Mhyos 1M. hyosynoviae
CAG TTG AGG AAA TGC AAC TG398 pb
Mhyos 2TAG CTG CGT CAG TGA TTG G
Sp37M. hyorhinis
GTA GTC AAG CAA GAG GAT GT346 pb
Asp37 GCT GGA GTT ATT ATA CCA GGA
PRIMERS PARA LA PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMAS PORCINOS
PRIMERS PARA LA PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMAS PORCINOS
PROTOCOLO DE PCR EN TIEMPO REAL PARA DETECTAR MYCOPLASMAS PORCINOS
PROTOCOLO DE PCR EN TIEMPO REAL PARA DETECTAR MYCOPLASMAS PORCINOS
Ciclo Repeticiones Temperatura Tiempo
1 1 95ºC 120 seg.
2 35
95ºC 45 seg.
60ºC 45 seg.
72ºC 60 seg.
3 1 95ºC 60 seg.
4 1 55ºC 60 seg.
5 66 65ºC 10 seg.
6 1 4ºC Hold
Especies/cepa Temperatura de “melting”
Cepa J (M. hyopneumoniae) 86 ºC
Cepa MS42 (M. flocculare) 87ºC
Cepa S16 (M. hyosinoviae) 87ºC
Cepa BTS-7 (M. hyorhinis) 80ºC
TEMPERATURAS DE MELTING PARA CADA UNA DE LAS ESPECIES DE REFERENCIA DE LAS ESPECIES
ANALIZADAS
TEMPERATURAS DE MELTING PARA CADA UNA DE LAS ESPECIES DE REFERENCIA DE LAS ESPECIES
ANALIZADAS
PRODUCTOS AMPLIFICADOS DE LAS CEPAS DE MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE AISLADAS EN
NUESTRO LABORATORIO
PRODUCTOS AMPLIFICADOS DE LAS CEPAS DE MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE AISLADAS EN
NUESTRO LABORATORIO
ANALISIS MOLECULAR DEL GEN ARNr 16SANALISIS MOLECULAR DEL GEN ARNr 16S
LA UTILIDAD DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S COMO HERRAMIENTA TAXONÓMICA HA SIDO
AMPLIAMENTE DEMOSTRADA EN PROCARIOTAS
LA UTILIDAD DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S COMO HERRAMIENTA TAXONÓMICA HA SIDO
AMPLIAMENTE DEMOSTRADA EN PROCARIOTAS
16 S - start pos 5´-GAGAGTTTG ATCCTGCGTCAGG -3´16 S - 550 neg 5´-CCCAATAAATCCGGATAACGCTTGC-3´
16 S - 510 pos 5´-CTGACGCGTAACTATGTCCCAGCAG-3´
16 S - 1050 5´-GCTGACGACAACCATGCAGC-3´16 S - 980 pos 5´-CGAAGAACCTTACCC ACT CTTGACATC-3´
16 S – end neg 5´-GGT AAT CCA TCC CCA CGT TCT CG -3´
SECUENCIACION DEL PRODUCTO AMPLIFICADO DEL GEN ARNr 16S
SECUENCIACION DEL PRODUCTO AMPLIFICADO DEL GEN ARNr 16S
SERVICIO DE GENÉTICA FORENSE DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN
CANARIA
SERVICIO DE GENÉTICA FORENSE DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN
CANARIA
ANALISIS DE LA SECUENCIA Y COMPARACIÓN CON LAS SECUENCIAS DEPOSITADAS EN EL GENE BANK
Mycoplasma neophronis sp. nov., isolated from upper resp iratorytract of Canarian Egyptian Vulture (Neophron percnopterusmajorensis).Suárez-Pérez A, Ramírez AS, Rosales RS, Calabuig P, Poveda C, Rosselló-Móra R, Nicholas RA, Poveda JB.SourceInstituto Universitario de Sanidad Animal de la Universidad de Las Palmas de Gran CanariaInt J Syst Evol Microbiol. 2011 Aug 5. [Epub ahead of print]
ANALISIS MOLECULAR DE LA REGIÓN INTERGÉNICA ARNr 16S - 23S (ISR)
ANALISIS MOLECULAR DE LA REGIÓN INTERGÉNICA ARNr 16S - 23S (ISR)
LA REGIÓN INTERGÉNICA rrs-rrl (ITS) ES LA MÁS VARIABLE, AL MENOS DOS VECES QUE LA DEL GEN
rrl (23S) Y CUATRO VECES QUE LA DEL GEN rrs(16S)
LA REGIÓN INTERGÉNICA rrs-rrl (ITS) ES LA MÁS VARIABLE, AL MENOS DOS VECES QUE LA DEL GEN
rrl (23S) Y CUATRO VECES QUE LA DEL GEN rrs(16S)
Secuencia objetivo
Cebadores Secuencia de los Cebadores
Región Intergénica 16S-23S
16S+C 5’-CGT TCT CGG GTC TTG TAC AC-3’
23S-B 5’-CGC AGG TTT GCA CGT CCT TCA TCG-3’
RAMIREZ Y COLS. 2008
ANALISIS MOLECULAR DE LA REGIÓN INTERGÉNICA ARNr 16S - 23S (ISR)
ANALISIS MOLECULAR DE LA REGIÓN INTERGÉNICA ARNr 16S - 23S (ISR)
ARBOL FILOGENÉTICO BASADO EN EL ESTUDIO DE LA REGIÓN INTERGÉNICA (ISR) DE TODOS LOS
MICOPLASMAS AVIARES
ARBOL FILOGENÉTICO BASADO EN EL ESTUDIO DE LA REGIÓN INTERGÉNICA (ISR) DE TODOS LOS
MICOPLASMAS AVIARES
RAMIREZ Y COLS. 2008
MATRIZ DE PORCENTAJES DE SIMILITUDES DE LAS REGIONES INTERGÉNICAS (ISR) DE MICOPLASMAS
AISLADOS DE AVES RAPACES
MATRIZ DE PORCENTAJES DE SIMILITUDES DE LAS REGIONES INTERGÉNICAS (ISR) DE MICOPLASMAS
AISLADOS DE AVES RAPACES
ELECTROFORESIS DE DOS GELES DE AGAROSA YUXTAPUESTOS CON LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS DE LA REGION
INTERGÉNICA (ISR) DE CEPAS DE CAMPO DE M. HYOPNEUMO NIAE
ELECTROFORESIS DE DOS GELES DE AGAROSA YUXTAPUESTOS CON LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS DE LA REGION
INTERGÉNICA (ISR) DE CEPAS DE CAMPO DE M. HYOPNEUMO NIAE
-Huella genética-No previa información genética-Cebadores 10 nucleótidos-Baja temperatura de “annealing”
RAPD RANDOM AMPLIFICATION OF POLYMORPHIC DNA
RAPD RANDOM AMPLIFICATION OF POLYMORPHIC DNA
Strain Origin Year of isolation Strain Origin Year of isolation
Rmr 3 Spain 2005 8 Spain (Canary Islands) 2002
Rmr 7 Spain 2005 22 Spain (Canary Islands) 2002
Rmr 8 Spain 2005 25 Spain (Canary Islands) 2002
Rmr 9 Spain 2005 36 Spain (Canary Islands) 2002
Rmr 12 Spain 2005 46 Spain (Canary Islands) 2002
Rmr 14 Spain 2005 54 Spain (Canary Islands) 2002
Rmr 15 Spain 2005 62 Spain (Canary Islands) 2002
Rmr 16 Spain 2006 65 Spain (Canary Islands) 2002
Rmr 17 Spain 2006 76 Spain (Canary Islands) 2002
Rmr 19 Spain 2006 90p03 United Kingdom 2003
Rmr 21 Spain 2006 112p03 United Kingdom 2003
Ove 1 Spain (Canary Islands) 2007 10p04 United Kingdom 2004
GC 37 Spain (Canary Islands) 2007 58p04 United Kingdom 2004
GC 91 Spain (Canary Islands) 2007 64p04 United Kingdom 2004
D Spain (Canary Islands) 2002 80p04 United Kingdom 2004
P Spain (Canary Islands) 2002 57p05 United Kingdom 2005
U Spain (Canary Islands) 2002 35p06 United Kingdom 2006
Z Spain (Canary Islands) 2002 35p07 United Kingdom 2007
8B1 Spain (Canary Islands) 2002 61p07 United Kingdom 2007
4 Spain (Canary Islands) 2002 67p07 United Kingdom 2007
APLICACION DE LA TÉCNICA DE RAPD EN EL ESTUDIO DE CEPAS DE CAMPO DE MYCOPLASMA HYORHINIS
APLICACION DE LA TÉCNICA DE RAPD EN EL ESTUDIO DE CEPAS DE CAMPO DE MYCOPLASMA HYORHINIS
5´- GTCCACACGG- 3´OPB-10
(Artiushin et al. 1996)
- Se observó una alta variabilidad
- Las cepas se agruparon de acuerdo al origen del aislamiento
- No se observó influencia en el año del aislamiento
RESULTADOSRESULTADOS
DGGE DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS
DGGE DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS
LA ELECTROFORESIS EN GEL CON GRADIENTE DE DESNATURALIZACIÓN SE DESARROLLÓ EN PRINCIPIO PARA
DETECTAR MUTACIONES PUNTUALES EN LAS SECUENCIAS EN EL ADN
LA ELECTROFORESIS EN GEL CON GRADIENTE DE DESNATURALIZACIÓN SE DESARROLLÓ EN PRINCIPIO PARA
DETECTAR MUTACIONES PUNTUALES EN LAS SECUENCIAS EN EL ADN
MAS TARDE SE UTILIZÓ PARA ANALIZAR POBLACIONES MICROBIANAS BASADAS EN AMPLIFICACIONES DE FRAGMENTO S DEL
GEN ARNR 16S
MAS TARDE SE UTILIZÓ PARA ANALIZAR POBLACIONES MICROBIANAS BASADAS EN AMPLIFICACIONES DE FRAGMENTO S DEL
GEN ARNR 16S
DGGE DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS
DGGE DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS
LA APLICACIÓN DE ESTA TÉCNICA EN LA IDENTIFICACIÓN DE MICOPLASMAS FUE LLEVADA A CABO POR MCAULIFFE Y COLS . 2003,2005
LA APLICACIÓN DE ESTA TÉCNICA EN LA IDENTIFICACIÓN DE MICOPLASMAS FUE LLEVADA A CABO POR MCAULIFFE Y COLS . 2003,2005
DGGE DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS
DGGE DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS
GC-341 5´-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGCCCACGGGGCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3´
LA AMPLIFICACION DE LA REGION V3 DEL GEN ARNr 16S S E REALIZA CONEL PRIMER UNIVERSAL PARA BACTERIAS GC-341 Y EL PRIM ER
ESPECÍFICO PARA MOLLICUTES R543
LA AMPLIFICACION DE LA REGION V3 DEL GEN ARNr 16S S E REALIZA CONEL PRIMER UNIVERSAL PARA BACTERIAS GC-341 Y EL PRIM ER
ESPECÍFICO PARA MOLLICUTES R543
R543 5´-ACCTATGTATTACCGCG-3´
DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN LAS ESPECIES BUSARD O RATONERO, ALIMOCHE CANARIO, BUITRE LEONADO, ALCARAV ÁN COMÚN
Y MYCOPLASMA GYPIS (POVEDA Y COLS. 1994 Y MYCOPLASM A NEOPHRONIS
DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN LAS ESPECIES BUSARD O RATONERO, ALIMOCHE CANARIO, BUITRE LEONADO, ALCARAV ÁN COMÚN
Y MYCOPLASMA GYPIS (POVEDA Y COLS. 1994 Y MYCOPLASM A NEOPHRONIS
DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN LA PALOMA TURQUÉ, P ALOMA RABICHE, TÓRTOLA TURCA Y GAVILÁN COMÚN
DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN LA PALOMA TURQUÉ, P ALOMA RABICHE, TÓRTOLA TURCA Y GAVILÁN COMÚN
DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN EL AGUILA IMPERIAL, AGUILUCHO LAGUNERO, AGUILA REAL, AGUILA CULEBRERA ) + control Mycoplasma sp.
1449 (Höfle et al., 2002)
DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN EL AGUILA IMPERIAL, AGUILUCHO LAGUNERO, AGUILA REAL, AGUILA CULEBRERA ) + control Mycoplasma sp.
1449 (Höfle et al., 2002)
DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN LA ESPECIE ALIMOCHE CANARIO (Neophron pernocterus majorensis) Y CONTROLES POSITIVOS
DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN LA ESPECIE ALIMOCHE CANARIO (Neophron pernocterus majorensis) Y CONTROLES POSITIVOS
Mycoplasma neophronis
AGRADECIMIENTOS
Alejandro Suarez Carlos Poveda
Dr. María del Mar Tavio Dr. Ana Ramírez
Unidad de Epidemiología y Medicina Preventiva, Veterinary Fac., ULPGC, Spain
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