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Die Parochipanalyse
Institut für orale MikrobiologieUnivers.-Prof. Dr. rer. nat. G. Conrads
c.m.d. Wiebke Schulthoff
Das Verfahren zur Auswertung der Genchipanalyse
• Der ParoChip1 ist ein Glasobjektträger, der eine Patientenprobe aufnehmen kann. Er umfasst auf einer Fläche von 24 mm² 86 Messpunkte, die einen Durchmesser von ca. 200 µm und einen Abstand von ca. 300 µm haben. Für jedes Bakterium liegen drei Messpunkte vor. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei dem neueren ParoChip2 um einen Plexiglasobjektträger, der 12 Patientenproben in 6x6mm großen Vertiefungen aufnehmen kann. In jeder dieser Vertiefungen liegen auf 8 mm² 120 Messpunkte, die einen Durchmesser von 150 µm und einen Abstand von 275 µm haben. Für jedes Bakterium liegen fünf Messpunkte vor.
• Für beide Chips wurden Fluorophor markierte Primer für die PCR (cy5 markiert) und Fluorophor markierte Sonden für interne Kontrollsysteme (cy3 markiert) verwendet.
• Für die Auswertung wird der Chip im Microarray Scanner (GenePix Personal 4100A von Axon) bei den Wellenlängen λ1=532 nm (Cy3) und λ2=635 nm (Cy5) eingelesen. Durch die Anregung mit monochromatischem Licht werden die gebundenen und markierten Sonden detektiert.
• D.h.: Grün=Cy3 gebundene Sonden Rot=Cy5 gebundene Sonden
Zur Erläuterung der Begriffe:
feature :Jeder Punkt dieses Bildes ist ein
feature. Sie werden über die in der Datenliste enthaltenen feature-indicator definiert.
Das Bild: ParoChip1 1 Block mit:
Die Datenliste (array-list): Gitter, das über den Block
gelegt wird und alle Informationen enthält:
Position und Größe der feature-indicators, sowie die
Identifizierung dieser.
8 R
eih
en =
„ro
ws“
12 Säulen = „columns“
feature-indicator: Er kann jedem feature individuell angepasst
werden und ist die Einheit, der die Analyse
zu Grunde liegt
Unserer Auswertung liegt die GenePix Array List ( =Datenliste ) zu Grunde.Sie ist ein Gitter, das die Größe und Position des Blocks, sowie das Layout der feature-indicator darin umfasst. Jedem feature-indicator ist dabei eine eindeutige Identifizierung sowie ein Name zugeordnet.
Das Bild: ParoChip2 1 Block
mit10 Säulen
12 R
eih
en
Mit bereits darüber gelegten
Datenliste
Im Vergleich zu ParoChip1 hat ParoChip2 insgesamt 12 Blocks. D.h. es können auf
diesem Chip 12 Proben gleichzeitig ausgewertet
werden.
Der gesamte ParoChip2: Hier sind 9 Blocks zu sehen, d.h. es wurden 9
Proben aufgebracht. E2, F1 und F2 sind
noch frei und können noch genutzt
werden.
Bei unserer Auswertung handelt es sich um eine Bildanalyse, bei der Pixelintensitäten gemessen werden.
Für die gesamte Messung der Pixelintensitäten
gelten folgende Messbereiche:
• Schwarzer Bereich:
• Messbereich der Hintergrund- Pixelintensitäten,
• Der Durchmesser des Messkreises ist dreimal so groß wie der des zugehörigen feature-indicators
• Dunkelgrauer Bereich:
• Messbereich der feature- Pixelintensitäten,
• Pixel, die den feature- indicator berühren, jedoch nicht vollständig darin liegen, werden nicht berücksichtigt
• Hellgrauer Bereich:
• Bereich nicht berücksichtigter Pixel
Die Ergebnisse der Bildanalyse
Durchmesser des feature-
indicators in µmAngabe der feature-
Position im BlockName und eindeutige
Identifikation des jeweiligen feature in Anlehnung an die
Datenliste (array list)
X- bzw. Y- Koordinate in µm
ausgehend von der Mitte eines jeden feature-indicators.
Der 0I0 – Punkt des Bildes ist dabei oben
links
Das Programm kann selbständig einzelne features durch „flags“ bewerten. Dabei wird
„good“, „bad“, „absent“ und „not found“ unterschieden.
Es ist auch möglich, die Flaggen selber zu setzen
Die Normalisierung wird zur Standardisierung der Werte
benutzt. Dabei wird der höchste Wert gleich eins
gesetzt und der niedrigste gleich null. Sie ist eine Art
Kalibrierung und ein typisches statistische Verfahren.
Medianwert der feature-
Pixelintensität der Wellenlänge #2, λ= 635 nm (rot)
Medianwert = Bezeichnung für ein Messergebnis, dessen
zugrundeliegende Messwerte mit gleicher Häufigkeit Unter- und
Überschreitungen aufweisen; er entspricht daher nicht dem
arithmetischen Mittelwert (=„mean“). Von extremen Abweichungen nach
oben und unten wird er nicht beeinflusst und deshalb für das Gesamtergebnis herangezogen.
Medianwert der Hintergrund-
Pixelintensität bei λ= 635 nm
Arithmetischer Mittelwert der Hintergrund- Pixelintensität
beiλ= 635 nm
Standardabweichung der Hintergrund- Pixelintensität
bei λ= 635 nm
Prozent der feature- Pixel mit Intensitäten, die eine
Standardabweichung größer sind als die Hintergrund-
Pixelintensität bei λ= 635 nm
Prozent der gesättigten
feature- Pixel bei λ= 635 nm
„standard deviation“: Standardabweichung
der feature- Pixelintensität bei
λ= 635 nm
Arithmetisches Mittel = Durchschnittswert, der aus der
Summe einer Anzahl von Zahlen, dividiert durch ihre Anzahl, entsteht; das arithmetische Mittel von 5, 8 und
11 z. B. ist (5 + 8 + 11): 3 = 8.Dieser Wert wird von extremen
Abweichungen nach oben und unten sehr beeinflusst und wird zur
Beurteilung der Streuung herangezogen.
Die Messung der feature- und Hintergrund- Pixelintensitäten für die Wellenlänge #1, λ= 532 nm
(grün) ist analog
Arithmetischer Mittelwert der
feature- Pixelintensität bei
λ= 635 nm
Medianwert der feature-
Pixelintensität bei λ= 635 nm
D.h.: Der Wert gibt an, wieviel Prozent der Pixel außerhalb der Standardabweichung
liegen und somit statistisch interessant werden. Noch signifikanter für die Statistik sind die
Werte mit zweifach abgezogener Standardabweichung.
Prozent der feature- Pixel mit Intensitäten, die zwei
Standardabweichung größer sind als die
Hintergrund- Pixelintensität bei λ= 635
nm
Dies ist ein Wert zur Fehleranalyse. Er muss null
sein.
Das Verhältnis der Mittelwerte:Hier werden die arithmetischen Mittel ins
Verhältnis gesetzt.Dazu wird von jeder einzelnen feature-
Pixelintensität der Medianwert der Hintergrund- Pixelintensität abgezogen. Von den gesamten
Pixelintensitäten eines features wird der Mittelwert genommen und ins Verhältnis zum Mittelwert der anderen Wellenlänge gesetzt.
Es gilt also:
Die Summe aller feature-
Pixelintensitäten bei λ= 635 nm
Die Summe aller feature-
Pixelintensitäten bei λ= 532 nm
Signal to Noise Ratio bei λ= 635 nm
Signal to Noise Ratio ist definiert als das Verhältnis zwischen der Intensität des Signals eines features und
der Abweichung im Hintergrund (= „Hintergrundgeräusch“ = the „noise“). Letzteres entspricht der
Standardabweichung der Hintergrund- Pixelintensität. Für die Intensität des Signals wird der Medianwert der
Hintergrund- Pixelintensität von dem Medianwert der feature- Pixelintensität abgezogen.Für λ= 635 nm (als Bsp.) gilt also:
SNR635 = (F635 Median – B635 Median) / B635 SDJe kleiner die Standardabweichung, desto glaubhafter die
Beurteilung des Signals!
Signal to Noise Ratio bei λ= 532 nm
„Ratio“ = Verhältnis: Jedes feature eines Bildes setzt sich aus vielen Pixeln
zusammen. Es wird eine Methode benötigt, um eine repräsentative Intensität für jedes
feature anzugeben. Dafür wird das Verhältnis berechnet: es werden die Pixelintensitäten
der beiden Wellenlängen ins Verhältnis gesetzt. Dabei wird jeweils die Hintergrund-
Pixelintensität von der feature- Pixelintensität einer Wellenlänge abgezogen.
In GenePix Pro wird angenommen bzw. festgelegt, dass bei diesen Berechnungen die
Wellenlänge #2 (635 nm) immer im Zähler steht; Wellenlänge #1 (532 nm) steht im
Nenner.
Das Verhältnis der Medianwerte:
Von dem Medianwert der feature- Pixelintensität ist
jeweils der Medianwert der Hintergrund- Pixelintensität für jede Wellenlänge abgezogen.
Es gilt also:
I P, λk = Intensität eines einzelnen feature- Pixels bei der Wellenlänge kI B, λk = Intensität eines einzelnen Hintergrund- Pixels bei der Wellenlänge kn = Anzahl der feature- Pixelm = Anzahl der Pixel Hintergrund- Pixel
II
II
medmB,λmednP,λ
medmB,λmednP,λ
11
22
Obwohl hier das arithmetische Mittel berechnet wird, wird der
Medianwert der Hintergrundpixel benutzt, da
dieser nicht durch extrem abweichende Werte verfälscht
wird.
n
1iimedmλ,Bλ,P
n
1iimedmλ,Bλ,P
11
22
II
II
Bei „Median of Ratios“ wird jedes einzelne Pixel der beiden
Wellenlängen ins Verhältnis gesetzt. Dabei wird wie immer jeweils die
mediane Hintergrund- Pixelintensität abgezogen. Erst am Ende wird der Medianwert genommen. Das heißt,
tendenzielle Abweichungen einzelner Pixel sowohl bei roter als
auch bei grüner Wellenlänge mitteln sich raus und fallen somit nicht ins
Gewicht.Es gilt:
Für „Mean of Ratios“ gilt dasselbe wie für „Median of Ratios“.Im Unterschied wird hier zum Schluss der
Mittelwert gezogen. Es gilt also:
mednmedmλ,Bλ,P
medmλ,Bλ,P
11
22
II
II
n
1iimedmλ,Bλ,P
medmλ,Bλ,P
11
22
II
II
n
1
Standardabweichung der ratio- PixelintensitätRegression Ratio: Die Werte geben
die Steigung einer Ausgleichsgerade an, die zu allen Pixeln den
minimalsten Abstand aufweist. Für jedes feature werden die Pixel in
einem zweimal so großen Kreis wie das feature selber um dieses herum
berückichtigt.
Regression R²: Es ist ein Wert für die Güte der
Ausgleichsgerade, ein sogenanntes
Bestimmtheitsmaß. Er gibt an wie stark die Pixel um die
Gerade herum gestreut sind.Bei Rgn R²=0 liegen alle Pixel
auf der Geraden.
Der Logarithmus der Ratio wird berechnet, um aus
exponentiellen Funktionen lineare zu machen
Der Medianwert der Hintergrund- Pixelintensität wird vom Medianwert der
feature- Pixelintensität abgezogen. Der Wert gibt die Leuchtintesität der Probe für die jeweilige Wellenlänge
wider.
Der Medianwert der Hintergrund- Pixelintensität
wird vom Mittelwert der feature- Pixelintensität
abgezogen. Der Wert gibt die Leuchtintesität der Probe für die jeweilige Wellenlänge
wider, wobei hier auch einzelne leuchtintensivere Pixel
herausstechen.
Hier werden der Median- bzw. der Mittelwert mit den
abgezogenen Hintergrund- Pixelintensitäten beider
Wellenlängen addiert. Werden in dem Bild beide
Wellenlängen übereinander gelegt, gibt uns dieser Wert die Lichtintensität der Probe
wider.
Summe aller gemessenen Pixel des Hintergrundes bzw. des features in dem jeweiligen
Meßbereich
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