dna的电泳检测 - sciencenet.cnimage.sciencenet.cn/olddata/kexue.com.cn/upload/blog/... · 2018....

实 验 四、

核酸浓度、纯度的检测

DNA的电泳检测

实 验 目 的

原理： 掌握紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度的原理。

掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理

技术技能 掌握紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度的步骤和计算方

法。

掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的操作

1、DNA分子的琼脂糖凝胶电泳检测

实验原理

在中性或偏碱性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。

DNA电泳速率与电荷效应无关（随着碱基数的增加，DNA

分子量增加，电荷数也增加，这样荷质比基本维持一个常

数）。

琼脂糖凝胶作为一种固体支持基质,主要利用DNA分子在

电场中的泳动时的分子筛效应来达到分离混合物的目的。

在恒电场的一定电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于

由DNA分子的大小与构型。

DNA分子迁移速率与其相对分子量成反比。

700bp900bp

电泳方向

相同分子量但不同构型的DNA分子迁移速率不同。

质粒DNA的分子构型(a)松弛线性的DNA（L）(b)松弛开环（OC）(c)超螺旋（cccDNA）

三种构型的质粒的电泳模式图谱

影响电泳速率的因素

1.DNA分子量的大小

2. 琼脂糖凝胶的浓度

3. DNA的分子构象

4. 电压

5. 电泳缓冲液的离子强度

1、琼脂糖

2、TBE缓冲液: 临用时用水稀至0.5×TBE( pH8.0～8.2)

3、核酸电泳的指示剂

溴酚兰：在碱性液体中呈紫蓝色

二甲苯青：在碱性液体中呈蓝色

琼脂糖凝胶浓度 0.6% 1% 1.4% 2%

溴酚兰的迁移率：与之相当的DNA大小

1Kb 0.6Kb 0.2Kb 0.15Kb

琼脂糖凝胶浓度 1% 1.4%

二甲苯青迁移率：与之相当的DNA大小

2Kb 1.6Kb

在电泳中，溴酚兰和二甲苯青的迁移率与下列双链线性DNA片段相当：

试 剂

4、载样缓冲液(Loading Buffer)

注：指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液，

其作用是：

增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加

样孔内

在电泳中形成肉眼可见的指示带,可预测核酸电泳的速度

和位置

使样品呈色，使加样操作更方便

5、荧光染料(GoldView，GV)

GoldView (GV) 是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核

酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在

100ml琼脂糖胶溶液中加入5µl GoldView即可。在紫外透射光

下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈现红色荧光。GoldView

不仅能染DNA，也可用于染RNA。

PCR扩增产物的检测

1. 琼脂糖凝胶的制备

①根据样品DNA片段大小确定琼脂糖凝胶浓度；

② 胶板的制备：胶槽置于水平支持物上（两侧封口）,

插上样品梳子, 注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保

持1mm左右的间隙；

③ 胶液的制备：称取0.2g琼脂糖,置于100ml锥形瓶中,加入

20ml 0.5×TBE稀释缓冲液,用保鲜膜封口（避免水蒸气

过度散失），然后在上面用枪头扎个小孔（加热过程中

可以放出少量水汽，以免瓶内压力过大）， 放入微波炉

里加热至琼脂糖全部熔化（1-2min, 液体变透明）,取出

摇匀（烫手！）,此为1%琼脂糖凝胶液。待胶冷却到60

度左右，加入DNA染料Goldview 2 ul，混匀；

④倒胶：将胶液缓慢倒入胶板内，注意：倒胶时的温度不

可太低,否则凝固不均匀；速度也不可太快,否则容易出现

气泡。

⑤待胶完全凝固后（10min）,拨出梳子,注意不要损伤凝胶,

然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过凝

胶的上表面。

2. 加样：将下列样品在洁净的保鲜膜或一次性手套表面混匀，

用微量移液枪小心加入凝胶的样品孔中。

① 8μl PCR产物 + 2μl 6×载样液

② 8μl 质粒提取物 + 2μl 6×载样液

③ 8μl pUC19 质粒 + 2μl 6×载样液(阳性对照)

④ 5 μl DL2000 Ladder Marker (DNA marker)

⑤ 5 μl λEcoR T14 Marker (阳性对照)

注：注意点样品要放阴极端！

每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染；

注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

加样顺序

3. 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压

最高不超过5V/cm（按两极间距离计算出总电压） 。当

溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。

(125V, 30min)

4. 观察和拍照

(1)在透射仪的样品台上铺一张保鲜膜（全班共用一张保

鲜膜），赶去气泡，然后将胶槽内的胶块小心滑出至

样品台上面。

(2) 在300nm波长紫外透射仪下观察电泳胶板。DNA存

在处显示出肉眼可辨的绿色条带。紫光灯下观察时应

戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。 可拍

照记录实验结果。

本实验的预期结果

1: DNA Marker DL2,000

2、3: PCR扩增产物（500bp片段）

PCR产物电泳照片图 DL2000 DNA分子量标准１００bpDNA分子量标准

≈500bp

DL2000

PCR产物

质粒在正常情况下以cccDNA构型存在，在提取过程中由于机

械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发生断裂。所以，

多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状

DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA）；线形DNA(lDNA)

质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图

2、紫外分光光度法检测核酸的浓度、纯度

基本原理

DNA链上碱基的嘌呤环和嘧啶环结构具有吸收紫

外光的性质，其最大吸收峰在260nm处。单链核酸

（RNA）由于其碱基暴露，所以其吸光度较双链高。

浓度测定：在一定范围内，DNA或RNA的光密度OD260与其含量成正比。

当使用1cm比色杯，OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg /ml，RNA浓

度约为40μg/ml；寡核苷酸浓度约为30μg/ml。根据以下公式可

以计算DNA在溶液中的浓度：

质粒DNA浓度(μg / μl )=稀释倍数×OD260×50/(1000 ×L）

其中：L为比色杯的光程（杯的厚度）；“50”为DNA在OD260=1时的

浓度。

质粒DNA浓度(ng / μl )=稀释倍数×OD260×50

注：OD260 值应在0~1之间，以在0.5左右为好。这样读数比较准确。

纯度测定：当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会

影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、

OD280（280nm是蛋白质的吸收峰）和OD230（230nm是酚类等杂质的吸

收峰），计算其比值来衡量样品的纯度。

经验值：

纯DNA：OD260/OD280≈1.8

(＞1.9,表明有RNA污染或DNA降解；＜1.6，表明有蛋白质或酚污染）

纯RNA： OD260/OD280≈2.0 (1.8 ~2.2)

实 验 步 骤

1. 取10μ l自提的质粒DNA溶液用ddH2O稀释10倍（终体积：

100 μ l）。

2. 以蒸馏水作参比，对仪器进行调零等调整后，测定质粒样

品的OD260和OD280。

3. 计算OD260/OD280之比,判断其纯度。

4. 计算质粒样品的浓度：

DNA浓度(ng / ul )=稀释倍数×OD260×50

岛津UVmini-1240

紫外分光光度计的使用步骤

1. 打开电源，系统开始自检（6min）

2.取3个比色皿，各加入100ulddH2O,并放入样品室（最靠近我们的比色皿（1号）为对照）

3. 选择“1. 光度模式”

4. 设置波长（260nm）: go to WL

5. 调空白： 按“空白”键，调节不同比色皿透光值误差

6. 自动调零： Auto ZERO，空白样品透光值归零

7. 取出第二、三号比色皿，倒掉ddH2O，加入100ul预先混好的质粒DNA样品，关上盖，按“Start”，开始测量OD260,

记录结果

8.设置波长（280nm）: go to WL

9. 自动调零： Auto ZERO，空白样品透光值归零

10. 按“Start”，开始测量OD280，记录结果。

实 验 报 告 （一）

1、记录PCR扩增产物和质粒样品的电泳图谱，说明带型含义

（对结果和出现的问题进行分析，如若未获得单一的扩增带，

这是什么原因造成的？扩增带颜色深浅说明什么等；将质粒

样品与标准的pUC19质粒比较。）

2、记录质粒DNA的OD260、OD280等原始数据，计算比值和浓度，

并分析结果： OD260/OD280比值高或低各说明什么？

思考题

1. 恒定电场强度下，琼脂糖凝胶电泳只适于分离多大的DNA片

段？（20-50Kb）

2. 若有60kb～100kb大小的系列DNA片段要进行分离鉴定，问

应采取哪种类型的电泳方法才能进行有效分离？为什么？

(脉冲场电泳， 10-2000Kb)

3. 为什么说 DNA分子的迁移率主要取决于分子筛效应（与分子

量大小和构型有关）？

4. 影响DNA迁移率的主要因素有哪些？

小结与回顾

凝胶电泳的原理

质粒DNA的三种构型

影响电泳速率的因素

琼脂糖凝胶的制备

紫外分光光度法测DNA浓度的原理、步骤

OD260/280的含义

下次实验内容：