efeitos do dimetilsulfÓxido (dmso) sobre os prejuÍzos …
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UNIVERSIDADE POSITIVO
VALTER MALAGUIDO CLÍMACO
EFEITOS DO DIMETILSULFÓXIDO (DMSO) SOBRE OS PREJUÍZOS DE MEMÓRIA INDUZIDOS PELA ESTREPTOZOTOCINA EM RATOS WISTAR
CURITIBA
2019
VALTER MALAGUIDO CLÍMACO
EFEITOS DO DIMETILSULFÓXIDO (DMSO) SOBRE OS PREJUÍZOS DE MEMÓRIA INDUZIDOS PELA ESTREPTOZOTOCINA EM RATOS WISTAR
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Profissional em Biotecnologia Industrial da Universidade Positivo como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Biotecnologia Industrial. Orientador: Prof. Dr. Ilton Santos da Silva Co-orientadora: Prof. Dra.Marcia Regina Pincerati
CURITIBA
2019
Ficha Catalográfica
Climaco, Valter Malaguido. Efeitos do dimetilsulfóxido (DMSO) sobre os prejuízos de
memória induzidos pela estreptozotocina em ratos wistar / Valter Malaguido Climaco. – –Curitiba, 2019.
XVI, 107f. :14 il. ; 29 cm. Dissertação ( Mestrado ) – Universidade Positivo, Campus
Curitiba, Curitiba-PR, 2019. Orientador: Prof. Dr. Ilton Santos da Silva.
Co-orientadora : Prof. Dra. Marcia Regina Pincerati
1. Efeitos do dimetilsulfóxido (DMSO) sobre os prejuízos de memória induzidos pela estreptozotocina em ratos wistar
Comissão Julgadora:
________________________ Prof. Dr. Marcelo de Paula Loureiro
________________________ Prof. Dr. Luiz Fernando Pereira
________________________ Profa. Dra. Eliane Carvalho de
Vasconcelos
________________________ Profa. Dra. Márcia Regina Pincerati
Co-orientadora
________________________ Prof.Dr. Ilton Santos da Silva
Orientador
À minha família:
Valter e Palmira;
Ariadne, Samuel e Davi.
AGRADECIMENTOS
Eu agradeço a Deus de todo o coração... Que grandiosas são as obras do
Senhor... O Temor do Senhor é o começo da Sabedoria (Sl 110 - 111). Celebrar a
vida, a diversidade, os desafios e sua superação. Assim consolidamos projetos,
enriquecemos nosso verdadeiro capital, o intelectual. A Ciência e a Sabedoria são
dons do Espírito de Deus, e devemos, para sua contemplação, focar em um plano
além do mundo atual através de outro dom: o Temor de Deus. Superamos
transformações desde a vida uterina, partilhamos o tempo vivido na Terra como um
Gerador que nos alimenta e esperamos sempre por novas transformações. Estamos
sempre, e necessitamos de mudanças.
Como disse Albert Einstein: “O mais belo que podemos vivenciar, é o
mistério. Ele é fonte de verdadeira arte e ciência”. Graças a pessoas que se
esvaziam no compartilhamento de conhecimentos, expandem-se, de forma
incomensurável, Graças e Dons que se tornam plenos no conhecimento que liberta
o Homem. A Universidade compõe, etimologicamente, o Universo em um só lugar e
o; “Saber, Ética, Trabalho e Progresso” consolidam-se através de Equipes de
trabalho fantásticas e fascinantes, personificadas em grupos que tivemos contato ao
longo desse tempo. O carinho, atenção, disponibilidade dessas pessoas não
contempla uma moeda de pagamento, e, indiscutivelmente, profissionais que se
desprendem de suas vidas privadas por um bem maior coletivo, como nominamos o
Prof Dr Ilton Santos da Silva, Profa Dra Marcia Regina Pincerati são exemplos de
honra, amizade e agradecimentos incontáveis. A disciplina e a opção pelo correto,
traduzidos na Profa Dra Leila Maranho, toda equipe docente e de apoio, nos mostra
o caminho de precisão e valor.
Somos todos muito preciosos, e temos a gratidão e o presente de poder
trabalhar com o maior produto da criação... o ser humano, auxiliando e buscando
recursos para capacitações. Em suas enfermidades, vemos muito comprometidos os
prejuízos de habilidades em um período da vida em que se poderia dividir
conhecimentos e experiências, e, a opção pela neurdegeneração e seu potencial
terapêutico, vem da simplicidade do compartilhamento molecular. Somos gratos pelo
conhecimento.
Agradecemos a nossas famílias, co-criadoras, enraizadas fortemente na
árvore da vida, cuidadoras de bens preciosos, e produzindo com carinho, respeito e
amor, frutos abençoados. Inicialmente a nossos pais, Valter e Palmira, exemplos de
força, sabedoria, condução e doação. À nossa esposa Ariadne, sua paciência,
cumplicidade, maternidade santificadora, revestida na vida de nossos filhos, Samuel
e Davi, fontes inspiradoras do poder do amor alimentador da vida. A nossos amigos,
Luis Fernando Silva, Jhonatan Domingues Basso, as acadêmicas Rebecca Marty
Pimentel e Athyna França Silva, pela alegria de compartilhar o crescimento e força
de trabalho. Incontáveis agradecimentos. Somos gratos pela vida e os presentes
dela constituídos, e... aprendendo a aprender.
“Eu Te louvo Pai Celeste, Rei do Céu e da Terra, porque quisestes revelar coisas
grandes aos pequeninos e escondestes dos sábios e entendidos. Sim Senhor, pois
assim foi do Teu agrado”. Mt – 11; 25
“O primeiro passo para a cura, é ir ao encontro da enfermidade.” Provérbio latino
RESUMO
As doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, comprometem
diversos aspectos comportamentais, metabólicos e celulares sem tratamento
curativo. O Dimetilsulfóxido (DMSO) possui uma ampla versatilidade molecular, com
diversas ações bioquímicas e terapêuticas como base molecular ainda não
explorada. O objetivo do presente trabalho é investigar o potencial efeito
neuroprotetor do Dimetilsulfóxido (DMSO) sobre os prejuízos de memória espacial
induzidos pela estreptozotocina (STZ) em ratos. Foram utilizados 42 ratos wistar
machos divididos em 4 grupos distintos, sendo grupo controle (veículo tampão
citrato via intracereboventricular, (icv) e salina 0,9% intraperitoneal (ip) (n=11), grupo
STZ 3mg/kg via icv e salina ip (n=10), grupo STZ icv+ DMSO 0,75 g/kg a 40%
diluído em solução salina 0,9%ip (n=11) e grupo STZ icv+ DMSO 1,5 g/kg a 40%
diluído em solução salina 0,9%ip (n=10). Foram 5 dias de tratamentos com início 24
hs após a administração icv de STZ e/ou veículos. Também vinte e quatro horas
após o último tratamento, os animais foram submetidos aos testes de memória
espacial no labirinto aquático de Morris, onde foram avaliadas memória de referência
e memória operacional, ambas espaciais. Ao fim dos testes, os animais foram
eutanasiados e os encéfalos dissecados bilateralmente para retirada do hipocampo.
Análises moleculares por meio de qPCR foram realizadas para investigar o perfil de
expressão de genes relacionados à inflamação, interleucina 1-beta (IL-1β), fator de
necrose tumoral α (TNFα), espécies reativas de estresse oxidativo mitocondrial
(catalase; CAT), e ativador da neurogênese adulta (fator neurotrófico derivado do
cérebro; BDNF). Os resultados comportamentais de memória de referência e
operacional, não mostraram melhora significativa de estratégias e aprendizagem
espacial dos grupos tratados com DMSO, o que pode ter relação com o tempo curto
de tratamento e, em virtude de lesão direta em hipocampo pela STZ. As análises
moleculares de expressão dos genes envolvidos na neuroinflamação (IL -1β, TNF-
α), e estresse oxidativo mitocondrial (CAT) não mostraram diferenças estatísticas
entre os grupos experimentais. No entanto, nota-se tendências de queda na
expressão de IL1-β, TNFα, CAT, e elevação de BDNF em grupo tratado com DMSO
à 1,5 g/ kg, sugerem o ambiente celular mais favorável em nível molecular contra a
neurodegeneração e facilitação da neuroproteção via BDNF em vias de
sobrevivência celular, plasticidade sináptica e brotamento axonal.
Palavras-chave: Dimetilsulfóxido. Estreptozotocina. Memória. Neurodegeneração.
Doença de Alzheimer. Labirinto aquatico de Morris.
ABSTRACT
Neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease, irreversibly impair cell
dynamics without curative treatment. Dimethylsulfoxide (DMSO) has a wide molecular
versatility, with several neurochemical and therapeutic actions not exploited. The aim
of the present paper is to investigate the potential neuroprotective effect of Dimethyl
sulfoxide (DMSO) on Streptozotocin (STZ) induced spatial memory impairment in rats.
We used fourty-two male wistar rats divided into four groups: Control Group (icv)
vehicle and intraperitoneal saline (ip) (n = 11); STZ 3mg/kg group, via icv and ip saline
= 10); SZT group, icv + DMSO 0.75 g/kg to 40% diluted in saline solution 0.9% ip (n =
11); and STZ group, icv + DMSO 1.5 g / kg to 40% diluted in saline 0 , 9% ip (n = 10).
It took five days of treatment starting 24 hours after vehicle or STZ administration. Also
twenty-four hours after the last treatment, the animals were submitted to spatial
memory tests in the Morris water maze, in which spatial memory and reference
memory were evaluated. At the end of the tests, the animals were euthanized and the
brains dissected bilaterally for the hippocampus removal. Molecular analyzes were
performed by means of qPCR to investigate the expression profile of genes related to
inflammation (interleukin 1-beta, IL-1β, tumor necrosis factor α, TNF-α), reactive
species of mitochondrial oxidative stress (catalase; CAT) and activator of adult
neurogenesis (brain-derived neurotrophic factor; BDNF). Behavioral results of
reference and working memory, there was no significant improvement of spatial
learning strategies in the treatment groups with DMSO, which included the acute injury
time induced directly on the hippocampal target and a short treatment of 5 days
following literature models. Molecular analyzes of expression of genes involved in
neuroinflammation (IL-1β, TNF-α) and oxidative stress (CAT) did not show statistical
differences between the experimental groups, however reduction trends in IL1-β,
TNFα, CAT expression and BDNF elevation in the DMSO treated group, at a dose of
1,5 g/kg suggest the most favorable cellular environment at the molecular level against
neurodegeneration and the facilitation of neuroprotection throught BDNF in the
pathways of cellular survival, synaptic plasticity and axonal budding.
Key words: Dimethylsulfoxide. Streptozotocin. Memory. Neurodegeneration.
Alzheimer’s disease. Morris water Maze
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Representação esquemática do labirinto aquático de Morris. .................. 43
Figura 2 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse, por grupo, em função
da sessão (valor médio das duas tentativas), respectivas ao experimento de
memória de referência (latência, trajeto e velocidade). ............................................. 48
Figura 3 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse, por grupo, em função
da sessão (valor médio das duas tentativas), respectivas ao experimento de
memória de referência (entrada e tempo no quadrante de plataforma, entrada e
tempo no contador da plataforma, entrada e tempo no anel externo). ...................... 49
Figura 4 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse, por grupo e fase e
tentativa, respectivas ao Probe Test. ......................................................................... 53
Figura 5 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse, por grupo, em função
da tentativa (valor médio das 5 sessões) e fase, respectivas ao experimento de
Memória Operacional. ................................................................................................ 57
Figura 6 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse, por grupo, em função
da tentativa (valor médio das 5 sessões) e fase, respectivas ao experimento de
Memória Operacional. ................................................................................................ 58
Figura 7 – Boxplots da variável de interesse IL1β, por grupo. .................................. 64
Figura 8 – Gráfico de barras da média (e erro padrão) da variável de interesse IL1-β,
por grupo. ................................................................................................................... 64
Figura 9 – Boxplots da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular
TNF ............................................................................................................................ 67
Figura 10 – Gráfico de barras da média ( e erro padrão ) da quantificação relativa,
por grupo, para a análise molecular TNF ................................................................... 67
Figura 11 – Boxplots da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular
CAT ............................................................................................................................ 70
Figura 12 – Gráfico de barras da média ( e erro padrão ) da quantificação relativa,
por grupo, para a análise molecular CAT ................................................................... 70
Figura 13 – Boxplots da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular
BDNF .......................................................................................................................... 73
Figura 14 – Gráfico de barras da média ( e erro padrão ) da quantificação relativa,
por grupo, para a análise molecular BDNF ................................................................ 73
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Eventos históricos de aplicações biológicas e farmacológicas do
DMSO ......................................................................................................................... 26
Tabela 2 – Resultados da ANOVA para as quatro variáveis de interesse em
memória de referência ............................................................................................... 50
Tabela 3 – Médias das variáveis de interesse e resultados do teste de Tukey entre
os grupos (memória de referência) ............................................................................ 52
Tabela 4 – Medidas descritivas das variáveis de interesse, por grupo, respectivas
ao experimento Probe Test ....................................................................................... 54
Tabela 5 – Resultados da ANOVA – F (valor p) - para as variáveis de interesse,
respectivas ao experimento Probe Test ..................................................................... 55
Tabela 6 – Médias das variáveis de interesse e resultados do teste de Tukey entre
os grupos, respectivas ao experimento Probe Test ................................................... 56
Tabela 7 – Medidas descritivas das variáveis de interesse, por grupo, respectivas ao
experimento de Memória Operacional ....................................................................... 59
Tabela 8 – Resultados da ANOVA – F (valor p) - para as variáveis de interesse,
respectivas ao experimento de Memória Operacional ............................................... 61
Tabela 9 – Médias das variáveis de interesse e resultados do teste de Tukey entre
os grupos, respectivas ao experimento de Memória Operacional ............................. 62
Tabela 10 – Medidas descritivas da variável de interesse IL1-β ............................... 63
Tabela 11 – Resultados da ANOVA para a variável de interesse IL1-β .................... 65
Tabela 12 – Médias das variáveis de interesse e resultados do teste de Tukey entre
os grupos IL1-β .......................................................................................................... 65
Tabela 13 – Medidas descritivas da quantificação relativa, por grupo, para a análise
molecular TNFα .......................................................................................................... 66
Tabela 14 – Resultados da ANOVA da quantificação relativa, para a análise
molecular TNFα .......................................................................................................... 68
Tabela 15 – Médias da quantificação relativa e resultados do teste de Tukey entre
os grupos para análise molecular TNFα .................................................................... 68
Tabela 16 – Medidas descritivas da quantificação relativa, por grupo, para a análise
molecular CAT ............................................................................................................ 69
Tabela 17 – Resultados da ANOVA da quantificação relativa, para a análise
molecular CAT ............................................................................................................ 71
Tabela 18 – Médias da quantificação relativa e resultados do teste de Tukey entre
os grupos para análise molecular CAT ...................................................................... 71
Tabela 19 – Medidas descritivas da quantificação relativa, por grupo, para a análise
molecular de BDNF .................................................................................................... 72
Tabela 20 – Resultados da ANOVA da quantificação relativa, para a análise
molecular BDNF ......................................................................................................... 74
Tabela 21 – Médias da quantificação relativa e resultados do teste de Tukey entre
os grupos para análise molecular BDNF .................................................................... 74
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Aβ Proteína Amilóide Beta (Aβ-42)
AGE Produtos de Glicação Avançada
ANOVA Análise de Variância e Medidas Repetidas
APOE Apolipoproteina E
APP Proteína Precursora Amiloide
BACE Beta secretase-1
BDNF Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro
BHE Barreira Hematoencefálica
CA1 Camada Hipocampal CA1
CA3 Camada Hipocampal CA3
CAT Catalase
C-MYC Gene de Mielocitomatose
CREB Elementos de ligação ao AMP ciclico
CYS Cisteina
DA Doença de Alzheimer
DMSO Dimetilsulfóxido
GLU Glutamina
GLUT Receptor de Transporte de Glicose (1/2/3)
GSH-PX Glutationa Peroxidase
GSK-3β Glicogênio Sintase Kinase 3β
ICV Intracerebroventricular
IGE Genes de resposta imediata
IL-1β Interleucina 1-Beta
LTP Potenciais de Longa Duração
LYS Lisina
MAPT Proteína Tau associada à microtúbulos
MET Metionina
MHC II Complexo maior de histocompatibilidade tipo II
miRNA Micro RNA
NADH - Adenina Dinucleotídeo Nicotinamida (reduzido)
NFKB Fator Nuclear Kappa Beta
NMDA N Metil D-Aspartato
NRF2 Fator Nuclear eritroide 2
OH Hidroxila
PAMPs Padrões moleculares de patógenos
PEPS Potencial Excitatório Pós Sináptico
PHE Fenilalanina
PSEN1 Presenilina-1
PSEN2 Presenilina-2
RNA Ácido ribonucleico
SOD Superóxido Dismutase
STZ Estreptozotocina
SVZ Zona Subventricular
TAU Proteína TAU
Thr 231 Treonina 231
TNF α Fator de Necrose Tumoral α
TYR Tirosina
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 16
2 CAPÍTULO 1: REVISÃO DE LITERATURA ............................................................ 18
RESUMO ............................................................................................................... 18
Doença de Alzheimer ............................................................................................. 18 Sinalização metabólica .......................................................................................... 20
Dobramento proteico disfuncional ......................................................................... 21
Neuroinflamação .................................................................................................... 21
Sistema energético mitocondrial ............................................................................ 22
Sinalização neurotrófica ......................................................................................... 22
Neurobiologia dos sistemas de memória e Doença de Alzheimer ......................... 22
Bases moleculares e estruturais – o papel hipocampal ......................................... 23
Estreptozotocina como modelo indutor de neurodegeneração em roedores ......... 24
Potêncial efeito neuroprotetor do Dimetilsulfóxido (DMSO) ................................... 25
CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 28
REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 29
3 CAPÍTULO 2: ARTIGO EXPERIMENTAL ............................................................... 38
RESUMO ............................................................................................................... 38
INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 39
MATERIAL E MÉTODO ......................................................................................... 40
Animais - Acondicionamento ................................................................................. 40 Cirurgia estereotáxica para administração de STZ e tratamento com o DMSO 41
Labirinto aquático de Morris e Testes de Memória espacial ................................. 42
Procedimentos e testes ......................................................................................... 43
Testes de memória de referência .......................................................................... 44
Probetest – extinção da resposta adquirida .......................................................... 44
Testes de memória operacional ............................................................................ 45
Extração de RNA e análise de expressão de genes interleucina 1β (IL-1β), fator
de necrose tumoral α (TNF-α), catalase (CAT) e fator neurotrófico derivado
cerebral (BDNF) ..................................................................................................... 45
Análise de dados .................................................................................................... 46
Resultados ............................................................................................................. 47
Memória de referência .......................................................................................... 47
Análise descritiva da memória de referência ......................................................... 47
Comparações da memória de referência ............................................................... 50
Avaliação de extinção da memória adquirida (Probe Test) ................................... 53
Análise descritiva do Probe Test ............................................................................ 53
Comparações do Probe Test ................................................................................. 55
Memória operacional .............................................................................................. 57
Análise descritiva da memória operacional ............................................................ 57
Comparações da memória operacional ................................................................. 60
Avaliação de expressão gênica ............................................................................. 63
Analise descritiva da expressão da IL-1β ............................................................... 63
Comparações na expressão da IL-1β .................................................................... 65
Avaliação da expressão gênica do fator de necrose tumoral α ( TNFα) ................ 66
Análise descritiva do TNFα .................................................................................... 66
Comparações da expressão do TNFα ................................................................... 68
Avaliação da expressão gênica da Catalase ( CAT ) ............................................. 69
Análise descritiva da expressão da Catalase ( CAT ) ............................................ 69
Comparações da expressão da Catalase ( CAT ) ................................................. 71
Avaliação da expressão do Fator neurotrófico derivado cerebral (BDNF) ............. 72
Análise descritiva do BDNF ................................................................................... 72
Comparações da expressão do BDNF .................................................................. 74
Discussões ............................................................................................................. 75
Conclusões ............................................................................................................ 79
REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 81
Conclusões Gerais ................................................................................................. 86
REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 87
ARTIGO PARA SUBMISSÃO ................................................................................ 98
PREPARAÇÃO DE MANUSCRITOS ................................................................... 126
ANEXOS .............................................................................................................. 133
16
1 INTRODUÇÃO
A neurodegeneração afeta progressivamente populações celulares com
características clínicas e patológicas relacionados à perda tecidual [1] e atualmente
sem tratamentos neuroprotetores efetivos, como no caso da doença de Alzheimer
[2]. Diversas alterações compõem o quadro fisipatológico e molecular da doença
como no metabolismo neuronal da glicose [3], o processamento do RNA [4],
dobramento anormal de proteínas celulares [5,6], e os prejuízos sinápticos e
lisossomais [7]. Os fenômenos que ocorrem com maior destaque são a ativação pró-
inflamatória com permeabilização de barreira hemato-encefálica, que contribui para
a manutenção do estresse energético mitocondrial e a produção de espécies
reativas de oxigênio, além do bloqueio neurotrófico e a renovação celular [8,9].
O dimetilsulfóxido (DMSO) possui diversas aplicações por sua versatilidade
molecular, oriunda de sua estrutura compacta, capacidade elevada de penetração e
transporte através da barreira hemato-encefálica [10]. Além disso, possui funções
imunomoduladoras no bloqueio de citocinas pró-inflamatórias [11] e renovação
mitocondrial na captura de radicais livres [12]. Facilita o processo autofágico no
dobramento proteico conformacional [13]. Pela associação com a molécula de água,
forma um complexo de compartilhamento água-DMSO, onde modifica pontes de
hidrogênio das proteínas amiloidogênicas [14,15] que têm papel importante na
etiologia da doença de Alzheimer.
Dentre os modelos neurodegenerativos experimentais, a estreptozotocina
(STZ) administrada intracerebroventricular (ICV) mimetiza características clínicas
agudas comportamentais, relacionados com a memória espacial e aprendizagem da
formação hipocampal [16]. A STZ é tóxica para receptores de insulina via sinalização
da enzima glicogênio-sintase-kinase 3β (GSK 3β) [17], regulando tráfego da proteína
precursora amilóide (APP) e fosforilação de proteína TAU, além de modular
negativamente vias de sobrevivência celular [18,19,20,21] e formação e fusão de
vesículas sinápticas [22].
O presente trabalho está dividido em 2 capítulos, ambos redigidos de acordo
com as normas da revista Journal of Alzheimer’s Disease. O primeiro capítulo traz
uma revisão sobre os eventos patológicos associados à neurodegeneção na doença
de Alzheimer. O capítulo 2 trata do artigo experimental descrevendo os
experimentos envolvendo o tratamento com DMSO em ratos expostos aos prejuízos
17
de memória induzidos pela administração intracerebroventricular de estreptozotocina
(STZ).
18
CAPíTULO 1: REVISÃO DE LITERATURA
Neurodegeneração induzida pela estreptozotocina (STZ) em modelo animal e
viabilidade terapêutica neuroprotetora com o Dimetilsulfóxido (DMSO). Valter Malaguido Climaco; Marcia Regina Pincerati; Ilton Santos da Silva
Universidade Positivo: Rua Professor Pedro Viriato Parigot de Souza, 5300 – Campo Comprido,
Curitiba - Paraná, Brasil CEP 81280-330 Telefone +55 (41) 33173000 Email: ilton.silva@up.edu.br
RESUMO
A neurodegeneração induzida pela estreptozotocina via
intracérebroventricular (STZ-icv) em roedores possui similaridades com a doença de
Alzheimer do tipo esporádica. Entre as similaridades, é possível observar prejuízos
metabólicos no transporte de glicose neuronal, e a ativação de cascatas de
proteínas amiloidogênicas neurotóxicas. Adicionalmente, a STZ promove a
neuroinflamação com a permeabilização da barreira hemato-encefálica, ativação
microglial e astrocitária, e estresse oxidativo mitocondrial. O substrato anatômico e
funcional da lesão induzida corresponde à formação hipocampal, estrutura
fundamental no processo cognitivo de aprendizagem e memória. A ação do DMSO
em etapas metabólicas e inflamatórias, na captura de espécies reativas de oxigênio,
e associação molecular com a água, modifica pontes de hidrogênio no dobramento
conformacional neurotóxico amilóide, e facilita o processo autofágico como
chaperona química. Desta forma, o presente artigo discute a utilização do DMSO
como elemento neuroprotetor, por suas características versáteis e modulatórias na
degeneração induzida.
Palavras chave: Estreptozotocina. Dimetilsulfóxido. Doença de Alzheimer
Doença de Alzheimer
O envelhecimento populacional é o maior fator de risco para o
desenvolvimento de doenças neurodegenerativas.
Dados da Word Alzheimer Report projetam 46 milhões de afetados
mundialmente e comprometem 6% das pessoas com 65 anos ou mais, chegando a
19
25% das pessoas acima de 80 anos, sendo 480.000 mortes por ano e gastos anuais
da ordem de U$$ 1 trilhão [23]. No Brasil, é estimada a população de 25 milhões de
idosos em 2025 (IBGE-2015).
Desde sua descrição inicial em 1907 por Alois Alzheimer, a principal
característica clínica da doença é o comprometimento da memória explícita,
dependente de estruturas do lobo temporal medial, além dos córtices póstero-
mediais e cíngulo. Os prejuízos cognitivos se estendem no campo semântico,
executivo, associativo e comportamental [24,25].
O substrato neuropatológico molecular corresponde à deposição de proteína
β-amilóide extracelular e hiperfosforilação da proteína Tau neurofibrilar [26]. A
maioria dos casos, cerca de 75%, são do tipo Alzheimer esporádico. O polimorfismo
no gene APP, codificador da proteína precursora amilóide resulta na formação da
proteína β-amilóide neurotóxica de 42 aminoácidos. Além disso, outros genes
possuem papel importante no desencadeamento da doença: gene apo E
(apolipoproteína E) (alelo apoE4); genes PSEN (presenilina) 1 e 2, formando
proteína precursora amiloide (APP) via β e γ secretases; e o gene MAPT,
relacionado à hiperfosforilação da proteína Tau [27].
No envelhecimento e na neurodegeneração da doença de Alzheimer, os
tecidos (líquor, sangue, substância cinzenta e branca) são desiguais em
concentrações de água [28].
Estudos de Dawe RJ e colaboradores de 2014 [28], demonstram relação
linear de prejuízo cognitivo na doença de Alzheimer e imagens ponderadas de
ressonância magnética nuclear em áreas hipocampais e temporais, relacionados ao
conteúdo de água livre tecidual e sua homeostase, prejudicada através de canais de
aquaporina (1 e 4) dos astrócitos por precipitação de proteínas em conformação β-
amilóide na neurodegeneração [29].
Recentemente, foi demonstrado um sistema de recolhimento do líquido
intersticial e liquórico sinalizado via receptores de aquaporina 4 nos espaços
perivasculares (sistema glia-linfa). Disfunções nesse sistema podem dar início ao
processo neurodegenerativo com acúmulo neurotóxico de solutos β-amilóide
segundo revisão de Verheggen ICM e colaboradores em 2018 [30].
Elos fisiopatológicos reverberantes incluem o comprometimento metabólico
neuronal no transporte de glicose e internalização insulínica [31,32,33], em ações
pró-inflamatórias de abertura da barreira hematoencefálica, na ativação mitocondrial,
20
com aumento da predução de espécies reativas de oxigênio, e no processamento de
RNA [34][35], projetando acúmulos tóxicos amilóides.
As mudanças no dobramento de proteínas celulares em relação à massa de
água superficial (capa de hidratação) [36], impedem a autofagia assim como a
formação espinhas dendríticas e plasticidade sináptica com insuficiente sinalização
neurotrófica via BDNF e circuitos neuroquímicos colinérgicos. [37,38].
Os tratamentos clínicos recomendados pelas agências reguladoras: nacional
e internacionais, contemplam drogas isoladas ou combinadas. Estas atuam no
sistema colinérgico por meio da inibição enzimática da colinesterase (e.g:
rivastigmina, donepezila, galantamina) ou pela inibição de receptores NMDA (e.g:
memantina) [39] com resultados clínicos limitados, mesmo com o desenvolvimento
de anticorpos monoclonais contra a proteína amilóide neurotóxica ou proteína Tau
hiperfosforilada que também se mostraram ineficazes [40,41].
Recentes revisões [42,43] utilizam moléculas com ligantes multifuncionais,
abrindo caminho para estratégias terapêuticas inovadoras.
Sinalização metabólica
Atualmente, diversos estudos têm mostrado a importância do metabolismo
da glicose no sistema nervoso como componente das alterações neuroquímicas
envolvidas na doença de Alzheimer. Existe a denominação do distúrbio metabólico
tipo “diabético” do neurônio em degeneração quanto à sinalização insulínica [44],
sendo a relação conhecida como Diabetes tipo III [45]. A resistência à ação da
insulina e sua não internalização celular via receptor, ativa a enzima GSK-3β,
comprometendo síntese de glicogênio e regulação glicêmica de transportadores
GLUT (1-2-3). Consequentemente, elevam-se níveis de produtos de glicação
avançada (AGE) não se expressando vias de sobrevivência neuronais (PI3K/AKT)
com hiperfosfolilação Tau e acúmulos de proteína amilóide Aβ-42 neurotóxicas [46].
Promovem-se alterações em nível transcricional e proteico em paralelo a processos
neuroinflamatórios [31]. O conjunto dessas alterações amplifica os processos
neuropatológicos e resultam em perdas cognitivas progressivas [47].
O comprometimento energético neuronal ativa a enzima beta-secretase-1
(BACE 1) e a proteína precursora amilóide (APP) [48], asism como vias gliais-
linfáticas perivasculares, o que facilita a rotura da barreira hematoencefálica por
21
hiperexpressão de aquaporina 4, como elo fisiopatológico adicional na
neurodegeneração específica [49].
Dobramento proteico disfuncional
O papel biológico de proteínas celulares depende da estrutura de
dobramento funcional com o auxílo de moléculas auxiliadoras – chaperonas [3].
Estados intermediários no processo promovem agregação e relativa insolubilidade
protéica [50]. Na doença de Alzheimer, a transição conformacional de α-hélice para
β-pregueada recruta depósitos amilóides progressivamente, com consequente
disfunção pró-inflamatória, do sistema de transporte celular e autofágico [36].
Perde-se estabilidade estrutural comprometendo dobramento e arranjo
intermolecular, onde se modificam relações de solubilidade com a água [51].
A dinâmica da massa de água envolvida na estrutura superficial proteica
principalmente nos resíduos de aminoácidos específicos (Met, Lys, Cys, Glu),
instabiliza pontes de hidrogênio, e indisponibiliza energia livre [52], sendo o acúmulo
progressivo neurotóxico, fator de perda tecidual e apoptose [53].
Neuroinflamação
Depósitos amilóides e o estado hiperfosforilado de proteína Tau são fatores
que desencadeiam a neuroinflamação na neurodegeneração da doença de
Alzheimer [54]. Disfunções combinadas de permeabilização da integridade da
barreira hematoencefálica, ativação microglial e astrocitária, promovem a secreção
de citocinas pró-inflamatórias do tipo IL- 1β, TNFα, IL-6, Infγ, metaloproteases de
membrana, e do fator transcricional nuclear NFK-β contribuindo no processo de
recrutamento de linfócitos sistêmicos via complexo de histocompatibilidade tipo II
(MHC II) assim como o processamento anormal de micro-RNAs (mir155; mir 204)
[55,56].
A ativação inflamatória evolui sobre os constituintes imunológicos com o
bloqueio de enzimas glicolíticas, comprometimento mitocondrial, sobre a sinalização
de vias de sobrevivência celular onde perde-se adensamento axonal em sinapses
químicas e imunológicas [56,57,58].
22
Sistema energético mitocondrial
As alterações neurotóxicas, metabólicas e inflamatórias convergem para a
permeabilização de membranas mitocondriais, associados ao influxo de cálcio
intracelular, com comprometimento da fosforilação oxidativa na cadeia respiratória e
superexpressão de espécies reativas do oxigênio e nitrogênio [59].
Esses elementos favorecem que o fluxo de elétrons do NADH ao oxigênio
molecular na produção de ATP, reduzam elementos antioxidantes e neuroprotetores
como glutationa peroxidase (GSH-PX), catalase (CAT), e superóxido dismutase
(SOD) [60] e consome-se a reserva energética celular com insuficiente transdução
de vias em plasticidade, polarização e imunomodulação.
Sinalização neurotrófica O Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é um importante membro
da família de neurotrofinas (fatores de crescimento) ativadas via receptores
específicos, tropomiosinaquinase (TrkB) e p75.
A redução da sinalização do BDNF compromete a memória espacial,
plasticidade e maturação sináptica hipocampal, neurogênese, e potenciação de
longo prazo (LTP) na formação de espinhas dendríticas [61], fatores essenciais para
a consolidação da memória explícita.
Os oligômeros amilóides agregados na doença de Alzheimer, modulam
negativamente receptores p75 e TrkB, onde reduz-se vias de sinalização PI3K-
GSK3β-AKT de sobrevivência neuronal, ruptura de microtúbulos com
hiperfosforilação da proteína Tau (Thr 231) e comprometem a expressão proteica
em plasticidade sináptica [62,63,64]
Neurobiologia dos sistemas de memória e Doença de Alzheimer
Memória e aprendizado são componentes essenciais da existência humana:
fornecem subsídio para atividades do cotidiano e dão significado dos eventos ao
longo da vida, formando a personalidade do indivíduo e compondo sua história [65].
A memória consiste em capacidades multimodais de aquisição,
armazenamento e evocação de informações, habilidades ou experiências [66]. Os
23
processos de formação e consolidação são dinâmicos e complexos, necessitando
estabilização e reconsolidação de conteúdos [67]. Distúrbios de memória podem
afetar todas essas capacidades cognitivas como ocorre na doença de Alzheimer
[68.69]
Bases moleculares e anatômicas – o papel hipocampal.
A formação hipocampal tem sido associada a uma ampla variedade de
funções, incluindo navegação, planejamento espacial, codificação e recuperação de
memória, processamento relacional e detecção de novidades. Essas funções são
diferentes em relação à modalidades comportamentais e sua representação
topográfica [70].
Scoville e Milner em 1957 [71], descreveram a função do hipocampo em
relação à memória no caso do paciente amnéstico (Henry Molaison – “HM”) após
remoção cirúrgica da porção do lobo temporal medial para o tratamento de epilepsia.
Desde então, o papel hipocampal foi considerado como conversor de memórias;
uma estrutura chave para a formação de novas memórias de longo prazo.
A memória pode ser dividida em categorias funcionais: memória “elétrica” e
sensorial, memória de curto prazo (memória operacional) e memória de longo prazo.
A memória de longo prazo, por sua vez, pode ser dividida em explícita (declarativa)
do tipo episódica (eventos), semântica (fatos) Esse tipo de memória envolve o
hipocampo e áreas corticais adjacentes. A memória do tipo implícita/não declarativa
(de referência) é necessária para habilidades perceptivas e motoras
desempenhadas sem o pensamento consciente [72] envolvendo o cerebelo e
gânglios basais.
O recrutamento sensorial de entrada envolve informações de construção
cognitiva, sistemas temporais com apoio atencional, alça fonológica e codificação de
dimensões espaciais [73]. O processamento de memória operacional compreende
um sistema multicomponente de aferências hipocampais, principalmente em região
CA1 - piramidal, núcleos talâmicos ventrais de linha média (romboides e reunens),
em sincronia de conectividade ao córtex pré-frontal medial e sensorial posterior [74].
Esse processamento permite a transferência de informações no processo cognitivo
de aprendizagem [75]. Como o hipocampo é uma das primeiras estruturas a sofrer
com os eventos neurodegenerativos, o processo de informações é intensamente
24
prejudicado na doença de Alzheimer. A memória de referência integra informações
recentes e remotas obtidas por experiências prévias, sem a necessidade cognitiva
de aprendizado na execução [76].
Distintas estruturas encefálicas participam da integração das memórias,
sendo o lobo temporal medial – (incluíndo hipocampo e córtex entorrinal) - córtex
pré-frontal e sensorial posterior, importantes na memória explicita/declarativa. Já os
gânglios basais e cerebelo são as estruturas participantes na memória implícita/não
declarativa [75,77]. Vias moleculares e bioquímicas RAS-MAPK-PKA ativam a
fixação de conteúdos [78] e, genes de resposta imediata (IGE) e proteínas CREB,
transformam potenciais excitatórios de curto para longo prazo (STM/LTM). Além
disso, a consolidação permanente de informações requer a expressão
glutamatérgica, remodelação e facilitação sináptica com síntese de neurotrofinas
(BDNF), e ativação dopaminérgica [79].
O papel hipocampal relaciona ainda interações inconscientes e conscientes
na consolidação da memória [80]. Compreende aferências de potenciais pós-
sinápticos excitatórios (PEPS) para células granulares do giro dentado em um
sistema de codificação associativa a neurônios do tipo multipolares do córtex
entorrinal denominada via perfurante. Projeta-se para células piramidais do Corno de
Amon (CA) (fibras musgosas -CA3 -CA1 - complexo subicular) na chamada Via
colateral de Shaffer, formando um sistema de seleção de contextos e conclusão de
padrões de informações/tarefas.
O hipocampo é importante na construção de memórias espaciais. Nessa
estrutura se forma o chamado mapa cognitivo proposto por O`keefe e Nadel (1978)
[81] inicialmente, e reforçadas por técnicas de ressonância funcional magnética [82].
No hipocampo, estão localizadas as chamadas “Placecells”, que são células
que disparam em padrões em padrões contínuos conforme o indivíduo explora o
ambiente, formando um mapa neural da sua localização [65,83,84].
Estreptozotocina (STZ) como modelo indutor de neurodegeneração em roedores
A estreptozotocina (STZ) é uma droga do grupo nitrosamida isolada pela
primeira vez em 1950 de bactérias do solo do gênero Streptomyces sp. Possui
propriedades quimioterápicas metilando bases nitrogenadas na síntese de DNA [85].
25
Atua ainda na permeabilidade mitocondrial e formação de espécies reativas do
oxigênio, [86] efeito diabetogênico se injetada por via sistêmica em roedores [87].
O mecanismo é tóxico por ação em células beta pancreáticas, anti-neoplásico em
tumores pancreáticos neuroendócrinos. O bloqueio de sinalização da insulina afeta
receptores no tráfego da proteína precursora amilóide (APP), regulando estado de
fosforilação da proteína Tau através da ação sobre enzima Glicogênio- sintase-
kinase-3β (GSK-3β) [88]. Normalmente a insulina internalizada via receptor, ativa
PI3K, AKT, MAPK, inibindo GSK3-β, e modulando receptores GLUT do tipo 1, 2 e 3
[89].
A adminstração da droga intracerebroventricular (icv) inicialmente utilizada
por Sigfield Hoyer em 1994, ocasiona efeitos patológicos da sinalização insulínica
cerebral, sendo considerada modelo equivalente à doença de Alzheimer do tipo
esporádica [17].
A injeção de 3 mg/kg em dose isolada da STZ-icv induz a formação da
proteína beta-amilóide e hiperfosforilação da proteína Tau em preparos histológicos
de córtex e hipocampo de roedores [90]. Os efeitos clínicos são imediatos e duram
por tempo indeterminado [87].
Demonstrando os efeitos da STZ, Chen [91] demonstra a expressão
aumentada de genes APP, redução de acetilcolinesterase hipocampal e receptores
de glicose em modelos transgênicos para Alzheimer sob a ação indutora da STZ –
icv [91].
Roedores que recebem STZ-icv desenvolvem alterações cognitivas de curto
e longo prazo sobre memória e comportamento. Há ainda maior vulnerabilidade de
perda celular celular hipocampal grave e aguda segundo Zappa e colaboradores
[92].
Kamat e colaboradores [93] propuseram a dessensibilização de receptores
insulínicos em roedores que receberam STZ-icv, colocando como eventual proposta
terapêutica, intervenções de ações metabólicas na doença degenerativa [93].
Potencial efeito neuroprotetor do Dimetilsulfóxido (DMSO)
O Dimetilsulfóxido (DMSO) é um produto ligno-celulósico sintetizado na
Alemanha em 1867, pelo químico russo Alexander Saytzeff, possuíndo propriedades
biológicas e terapêuticas diversas [94] conforme sumarizado na Tabela 1.
26
Tabela 1 - Eventos históricos de aplicações biológicas e farmacológicas
Penetração de membranas Brayton, 1986; Rose e Hodgson, 1993
Interação molecular versátil Sojkaetal, 1990
Compartilhamento de prótons Szmant HH, 1971
Anti – inflamatória/imunomodulação Brayton, 1986; Soyka, 1990
Analgesia Stone, 1993; Brayton, 1986
Hipertensão intracraniana Soyka, 1990; Rose e Hodgson, 1993
Diferenciação celular Ross DW, 1985
Vasodilatação Brayton, 1986; Stone, 1993
Antiagreganteplaquetário Deutch, 1966; Goroc e Kovacs, 1968
Remoção de radicais livres Ardenetal, 1989; Speirs, 1994
Amiloidose Senior, 2001; Grant; Forrester, 2008
Radioproteção/ Crioproteção Brayton, 1986
Chaperona química Caputo, 1989; Pruisner SB, 1996:
Chaudhuri, Paul, 2006
Cistite intersticial Biggers RD, 1986
Doenças reumatológicas Swanson BN, 1985
Metabolismo lipídico – processamento
anormal de LDL
Mackie JB, 1989
Ciclo celular – Inibe c –myc (genes
reguladores de fatores transcricionais)
Darling D, 1989
Apoptose Liu J et al, 2001
Inibidor de proteína priônicascrapie Shaked GM, (2003)
Anticolinesterásico central Kumar A, Darreh-Shori T, 2017
Modulador de funções do SNC em
ensaio de Alzheimer pré- clínico
LorènePenazzi et al, 2016
Proteção neuronal em modelo de
oclusão vascular
Bardulzky J et al, 2005
Proteção cardíaca e neuronal Jacob, S, de la Torre JC, 2009
Sendo uma molécula compacta relativamente polar, o DMSO possui
propriedades de interconversão e hibridização na transformação do composto em
equilíbrio com a água [95]. Constitui-se como receptor de prótons em ligações com
27
hidrogênio devido a elétrons disponíveis nos terminais S e O [96] interagindo na
capa de hidratação de moléculas proteicas [97], onde modula o arranjo molecular
das pontes de hidrogênio, ângulos de hidrofobicidade e restaura o dobramento
proteico conformacional para ação de chaperonas e sistema autofágico [98].
Sirotikin e Kushierskaya [99], demonstraram que a capacidade de aceitação
da ligação de hidrogênio, e o nível de hidratação de proteína, constituem fatores–
chave na estabilidade de sistema de solventes orgânicos (Água-DMSO).
Nandi e colaboradores [100] também demonstraram o papel estabilizador de
proteínas pela associação Água-DMSO quanto a ações dos componentes do
sistema binário.
Suas ações farmacológicas primárias são imunomoduladoras e anti-
inflamatórias, inibindo quimiotaxia de polimorfonucleares e de citocinas pró-
inflamatórias, além de remover espécies reativas do oxigênio, principalmente
radicais hidroxila (OH). [101,102].
Promove disponibilidade de energia celular, termoestabilidade e redução de
insolubilidade, [103,13] facilitando recrutamento em nichos germinativos
regenerativos [104]. As doses em ensaios terapêuticos em roedores variam
conforme o tipo lesional temporal.
Jacob e de la Torre [105], propuseram o uso do DMSO em doses de 1-2
g/kg sob infusão salina venosa à concentração de 28%-40% por 7 dias em casos de
lesão traumática espinhal e oclusão vascular carotídea agudas. Lorène Penazzi e
colaboradores [15] administraram baixas doses de DMSO em roedores transgênicos
para o modelo de Alzheimer. Os resultados mostraram que o DMSO atua
modulando positivamente a densidade de espinhas dendríticas hipocampais
piramidais (CA1-CA3) em doses orais de 1% misturadas à água (v/v). Kumar [106]
demonstrou a inibição competitiva in vitro da enzima acetilcolinesterase sob
concentrações de 1-4%, com eficácia de 37 a 80%, sendo importante como agente
neuroprotetor em potencial.
Lu e Mark [107] mostraram o papel supressor do influxo de cálcio neuronal
hipocampal via NMDA e resposta neuroprotetora na condição excitatória
degenerativa. Desta forma, os estudos mencionados sugerem que o DMSO pode
ser utilizado como uma potencial fonte de terapia neuroprotetora devido às suas
características moleculares.
28
Considerações finais
As doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer esporádica,
possuem fisiopatogenia ampla e sem propostas terapêuticas curativas. Intensas
alterações celulares amplificam o processo neuropatológico na forma de expressão
gênica, alterações metabólicas, proteicas conformacionais, pró-inflamatórios,
geração mitocondrial de radicais livres, e diminuição de plasticidade sináptica.
Clinicamente apresenta-se com declínio progressivo em diversas funções cognitivas,
principalmente na formação e evocação de memórias do tipo explícita.
O DMSO possui mecanismos moleculares que podem envolver o
compartilhamento em sistema líquido com a água, atuando na capa de hidratação
superficial de proteínas, no resgate do dobramento conformacional e a autofagia.
Além disso, o DMSO bloqueia a sinalização metabólica de resistência insulínica, a
ativação pró-inflamatória, promovendo captura de radicais livres de espécies
reativas de oxigênio, e ativação vias de sobrevivência celular. Tais características
podem contribuir como elemento terapêutico no processo neurodegenerativo
induzido pela estreptozotocina.
29
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38
3 CAPÍTULO 2: ARTIGO EXPERIMENTAL
Efeitos do Dimetilsulfóxido (DMSO) sobre os prejuízos de memória induzidos pela
Estreptozotocina (STZ) em ratos Wistar. Valter Malaguido Climaco; Rebecca Marty Pimentel Machado; Marcia Regina Pincerati; Ilton
Santos da Silva. Universidade Positivo: Rua Professor Pedro Viriato Parigot de Souza, 5300 – Campo Comprido –
Curitiba - Paraná – Brasil CEP 81280-330 Telefone +55 (41)33173000 Email: ilton.silva@up.edu.br
RESUMO
A doença de Alzheimer atinge parcela atual de 6% da população idosa
mundial, havendo mais de 46 milhões de afetados mundialmente. Desta forma é
importante a busca por propostas terapêuticas que minimizem ou mesmo
interrompam os processos neurodegenerativos comuns da doença. O
dimetilsulfóxido (DMSO) possui grande versatilidade molecular por isso, um
potencial efeito neuroprotetor. A neurodegeneração induzida pela estreptozotocina
intracerebroventricular (STZ-icv) em roedores conduz a fenótipo neuropatológico
semelhante à doença de Alzheimer esporádica. O objetivo do presente estudo é
investigar o potencial efeito neuroprotetor do DMSO sobre os prejuízos de memória
induzidos pela STZ em ratos. Foram utilizados 42 ratos Wistar machos, divididos em
4 grupos, com grupo controle recebendo veículo de volume (tampão citrato) via
intracérebroventricular (icv) e salina 0,9% intraperitoneal (ip) (n=11), grupo STZ 3
mg/kg icv e salina ip (n=10), grupo STZ 3mg/kg icv e DMSO 0,75 g/kg a 40% ip,
diluído em salina a 0.9% (n=11), e grupo STZ 3 mg/kg icv e DMSO 1,5 g/kg a 40% ip
diluído em salina 0,9% (n=10). Foram 5 dias consecutivos de tratamento com inínio
24h após a administração icv de STZ e/ou veículo. Também vinte e quatro horas
após o último tratamento, os animais foram submentidos aos testes de memória
espacial no labitrinto aquático de Morris, onde foram avaliados memória de
referência e memória operacional, ambas espaciais. Ao fim dos testes, os animais
foram eutanasiados e os encéfalos dissecados bilateralmente para a retirada do
hipocampo. Análises moleculares realizadas por meio de qPCR investigando-se
perfil de expressão de genes relacionados à neuroinflamação (interleucina 1β; IL 1-
β), fator de necrose tumoral α (TNF-α), espécies reativas do estresse oxidativo
39
mitocondrial (catalase; CAT), e ativador da neurogênse adulta (fator neurotrófico
derivado do cérebro; BDNF). Os resultados comportamentais, de memória de
referência e operacional não mostraram melhora significativa de estratégias e
aprendizagem espacial dos grupos tratados com o DMSO, o que pode ter relação
com o tempo curto de tratamento e em virtude da lesão direta no hipocampo
induzida pela STZ. As análises moleculares na expressão gênica neuroinflamatória e
oxidativa mitocondrial não mostraram diferenças estatísticas nos grupos
experimentais, havendo porém, tendências de redução da neuroinflamação através
da minimização da expressão de IL1-β, TNFα, do estresse oxidativo mitocondrial
com consumo da CAT na captura de espécies reativas de oxigênio, e incremento na
expressão de BDNF à dosagem de 1,5 g/kg no grupo tratamento com DMSO,
demonstrando ambiente celular mais favorável à neuroproteção e sobrevivência
celulares frente a indução neurodegenerativa.
Palavras-chave: Doença de Alzheimer. Dimetilsulfóxido. Estreptozocina. Labirinto
aquático de Morris.
INTRODUÇÃO
A doença de Alzheimer é o mais frequente e prevalente processo
neurodegenerativo comum ao envelhecimento, acomentendo 6% da população
acima de 65 anos e não possui tratamento curativo [1]. Clinicamente, compromete
funções de memória explícita dependente da formação hipocampal, além de outros
prejuízos cognitivos [2]. Estende-se ao córtex temporal medial, pré-frontal e parietal com a deposição
de proteína amilóide neurotóxica citoplasmática em beta-conformação (Aβ 42), e
acúmulo intracelular neuronal de proteína associada a microtúbulos (Tau) em estado
hiperfosforilado [3,4,5]. Existe o comprometimento no metabolismo da glicose e
sinalização da insulina, onde ativa a enzima GSK-3β, aumento na produção de
citocinas pró-inflamatórias, abertura da barreira hemato-encefálica e estresse
oxidativo mitocondrial [6]. A irregularidade da conformação proteica promove
insolubilidade e agregação, com consequente perda de sinalização do sistema
autofágico, de proteínas auxiliadoras de dobramento proteico, as chaperonas [7] e
expressão de neurotrofinas [8].
40
A estreptozotocina (STZ) intracerebroventricular (icv) induz a um estado
neuronal equivalente à doença de Alzheimer. Seu mecanismo de ação envolve o
bloqueio metabólico insulínico e transporte de glicose via receptores GLUT 1 2 3.
Além disso, facilita bioquimicamente a formação amilóide (Aβ 42) e hiperfosforilação
da proteína TAU [9] o que contribui para a reprodução das características
anatomopatológicas da doença. Experimentalmente, é possível observar prejuízos
de memória em animais que receberam STZ-icv em tarefas do labirinto aquático de
Morris, pois para cumprir tarefas de memórias de referência e operacional, é
necessário a integridade da formação hipocampal [10]. Análises moleculares da expressão de genes dos ciclos ativadores
patológicos de neuroinflamação (Il-1β, TNF-α), estresse oxidativo mitocondrial
(CAT), fator neurotrófico derivado do encéfálo (BDNF) [11,5] são importantes para se
entender os processos desencadeadores da doença. A terapia com o DMSO
demonstra versatilidade em interação ao compartilhamento molecular com a água
[12] e interconversão do composto (Água-DMSO) em equilíbrio [7]. Atua na
hidratação superficial de proteínas, modificando pontes de H+, e facilita ação de
proteínas auxiliadoras de dobramento, as chaperonas. Além disso, reduz a ativação
inflamatória e promove a captura de espécies reativas do ciclo mitocondrial
possuíndo ação antioxidante [13][14].
Estudos em roedores de Jacob e de la Torre demonstraram eficácia do uso
venoso do DMSO à concentração de 40% em lesão traumática medular e oclusão
vascular carotídea aguda, asism como Penazzi e colaboradores, em estudo com o
uso crônico e oral a 1% do DMSO, modulando positivamente brotamento de
espinhas dendríticas hipocampais piramidais. Outro estudo retrata a inibição
competitiva da enzima colinesterase in vitro por Kumar com resultados satisfatórios.
O objetivo do presente estudo foi investigar o potencial efeito neuroprotetor do
DMSO sobre prejuízos de memória induzidos pela STZ em ratos wistar. MATERIAL E MÉTODOS
Animais – acondicionamento
A metodologia experimental foi aprovada previamente pelo Comitê de Ética
em Pesquisa de Uso de Animais da instituição (CEUA), de protocolo número 399, no
41
dia 15/04/2017. Também houve aprovação ao adendo para adequação de doses
terapêuticas em 17/08/2017. Foram utilizados 42 ratos machos da linhagem Wistar
com 90 dias de idade, provenientes do biotério da Universidade Positivo. Os animais
tiveram livre acesso à comida e água. As condições ambientais incluem um ciclo
claro/escuro de 12h cada e temperatura de 21°C.
Cirurgia estereotáxica para administração de STZ e tratamento com o DMSO
Para a administração ICV bilateral de 3mg/kg de STZ, os animais são
submetidos à cirurgia estereotáxica. Anestesia-se com uma combinação de
ketamina (90 mg/kg de peso corporal) e xilazina (12 mg/kg de peso corporal) e
posiciona-se ao aparelho estereotáxico com realização de tricotomia local e pequena
incisão sagital feita na pele sobre o crânio para exposição do escalpo.
Dois pequenos orifícios, um em cada hemisfério foram realizados com a
ajuda de uma broca odontológica esférica, suficiente para a entrada de uma
micropipeta de vidro estirado, com diâmetro externo entre 10 e 30 μm, acoplada a
uma microseringa preenchida com a STZ dissolvida em solução tamponada, numa
região a partir do bregma, estabelecida com base em coordenadas estereotáxicas
específicas para atingir os ventrículos laterais: -0,96 mm no eixo ântero-posterior,
1,8 mm no eixo médio-lateral e 3,6 mm no eixo dorso-ventral. Todas estas
coordenadas foram obtidas de acordo com Paxinos e Watson [15]. Logo após a
administração da droga (3 mg/kg de peso corporal em cada hemisfério), sutura-se a
pele sobre o crânio com fio cirúrgico mononylon e acondiciona-se individualmente os
animais em suas gaiolas para recuperação. Na analgesia pós-cirúrgica, os animais
recebem tramadol via subcutânea (5mg/Kg) de 12 em 12 horas durante 3 dias. Para
o grupo 1 (controle), os animais passam para o mesmo procedimento, porém ao
invés de administrar a STZ, injeta-se solução tamponada no mesmo volume utilizado
para administração da STZ.
Após a administração da STZ (24h), os animais dos grupos 3 e 4 recebem
doses do DMSO por via intraperitoneal durante 5 dias consecutivos. O grupo
controle recebe as mesmas doses e volumes de solução de salina a 0,9% via i.p.
Vinte e quatro horas após fim do tratamento com o DMSO, iniciaram-se os testes de
memória espacial no labirinto aquático de Morris. Assim, formaram- se quatro grupos
distintos:
42
- Grupo (1) controle salina: Animais que receberam a solução tampão citrato (a
mesma utilizada para diluir a STZ) via icv e solução salina 0,9% por via
intraperitoneal;
- Grupo (2) STZ: animais que receberam STZ via icv e salina 0,9% i.p;
- Grupo (3) STZ + DMSO 0,75g/Kg: grupo que recebeu STZ via icv e DMSO via i.p.
na concentração de 0,75g/Kg a 40%, diluído em salina 0.9%;
- Grupo (4) STZ + DMSO 1,5g/Kg: grupo que recebeu STZ via icv e DMSO via i.p. na
concentração de 1,5g/Kg a 40%, diluído em salina 0.9%.
A escolha das doses e procedimentos foram baseados na descrição de
Bardutzky J et al (2005) e Jacob SW, dela Torre JC (2009).
Labirinto aquático de Morris e Testes de Memória espacial
O labirinto aquático é um teste comportamental para avaliação de memória e
aprendizagem motivacional descrito em 1981 por Morris e utilizado por diversos
pesquisadores desde então. A tarefa permite através de manipulações relativamente
simples, avaliação de diferentes sistemas de memória, com desempenho baseado
na construção de um mapa cognitivo do ambiente [16]. Os ratos são bons nadadores e o procedimento não exige restrições hídrica
e/ou alimentar. Adicionalmente, animais saudáveis aprendem tarefas em navegação
espacial, encontrando a plataforma praticamente em linha reta quando liberados de
qualquer ponto da piscina dentro de cerca de quatro dias de treino [17,18]. Além
disso, o labirinto aquático fornece parâmetros que possibilitam análises robustas
sobre as estratégias que os animais utilizam para completar a tarefa [19]. O
equipamento consiste de uma piscina circular, com diâmetro de 180 cm e altura de
40 cm, construída em fibra de vidro. Para o experimento, a piscina é preenchida com
água até 25,5 cm e uma plataforma de acrílico com 9 cm de diâmetro e 24 cm de
altura é posicionada a 1,5 cm abaixo do nível da água servindo como ponto de
escape para os animais. A temperatura da água é mantida em 26º C por sistema de
aquecimento.
No registro do comportamento dos animais, uma câmera de vídeo conectada
a um computador é posicionada acima da piscina e as informações são enviadas ao
computador e processadas por um software que registra e calcula parâmetros
relacionados ao deslocamento dos animais na arena, dividida em quadrantes a partir
43
de pontos cardeais, e 3 “contadores” em cada quadrante com 27 cm de diâmetro,
auxiliando como possíveis locais para a plataforma móvel nos testes de memória
operacional, definindo-se parâmetros como velocidade de deslocamento, trajeto
percorrido e latência até encontrar a plataforma (Figura 1).
Figura 1 – Representacao esquemática do ambiente do labirinto aquático de Morris
Fonte: Methods of Behavior Analysis in Neuroscience - 2nd Edition – 2009.
Procedimentos
Neste estudo, os testes no labirinto aquático duraram 15 dias para avaliação
da memória de referência, 2 dias para avaliação da extinção da resposta aprendida
e 10 dias para avaliação da memória operacional. A cada dia, os animais foram
expostos a duas tentativas, com duração de 120 segundos cada. No início do
experimento, o pesquisador posiciona o animal na piscina, permitindo que ele a
explore livremente por 120 segundos. Caso o animal encontre a plataforma antes, a
tentativa é finalizada e o registro é interrompido. O animal então é retirado da
piscina, colocado em uma gaiola-espera sem maravalha e o experimentador o
enxuga com uma toalha. Após 10 minutos de intervalo, tempo para consolidação do
executado - intervalo intertentativas - “ITI” (intertrial interval), o animal é colocado
novamente na piscina para a segunda tentativa de encontrar a plataforma. Caso o
animal não encontre a plataforma dentro do tempo estabelecido, o experimentador o
44
conduz até a mesma, onde ele permanece durante 30 segundos para o
mapeamento espacial do ambiente. Ao fim das duas exposições e após os animais
estarem com a pelagem completamente enxuta, os animais são devolvidos à gaiola
moradia [19,16].
A utilização do labirinto aquático viabiliza informações a respeito de
mapeamento espacial via sequenciamento de repetições dos testes diários, e
envolve diretamente a formação hipocampal, que é uma estrutura de interesse do
presente estudo.
Testes de memória de referência Para o teste de memória de referência, a plataforma permanece fixa durante
todo período, sendo os animais liberados de pontos distintos de partida, com focinho
direcionado para a piscina, porém equidistantes à mesma, a fim de criar
deslocamento espacial sem estratégias fixas Os parâmetros analisados, são a
latência para encontro da plataforma submersa (tempo da liberação do animal na
piscina até o encontro da plataforma ou ao fim do tempo máximo de 120 segundos),
trajeto percorrido (distância navegada na tentativa em centímetros), tempo de
permanência em cada quadrante (tempo dispendido no quadrante imaginário da
plataforma quanto ao tempo total na piscina) e velocidade de nado (estado
motivacional e atividade motora em cm/s).
“Probe Test”- extinção da memória adquirida
No dia seguinte ao último treino do teste de memória de referência, os
animais foram submetidos ao ‘Probe Test”, que consiste duas exposições
consecutivas, sendo uma por dia, em uma prova única de 180 segundos em cada
dia, em avaliações divididas em 60 segundos (3 blocos de 60 segundos cada).
Nesse teste, a plataforma é retirada da piscina e avalia-se a quantidade de tempo
que os animais despendem procurando a plataforma em sua localização prévia, e o
número de cruzamentos no contador crítico (área circundante à plataforma
equivalente à três vezes o seu tamanho). Num primeiro momento, relacionam
medidas de precisão de busca da plataforma no seu local dos dias anteriores. Com
o tempo, os animais abandonam essa estratégia e buscam a plataforma nos outros
45
setores da piscina, caracterizando a extinção do comportamento adquirido
anteriormente.
Testes de memória operacional
Ao final do “Probe Test”, seguiu-se à avaliação de memória operacional, a
plataforma submersa é modificada diariamente de posição, exigindo a aquisição de
novas informações diárias ao animal experimentado. Em outras palavras, na
primeira tentativa de cada dia, há uma nova informação e o animal pode utilizar as
informações da primeira tentativa para cumprir a tarefa nas demais tentativas
somente daquele dia. Para isso, é necessária a integridade da formação
hipocampal.
Os parâmetros mensurados envolvem a latência para encontrar a
plataforma, trajeto percorrido, porcentagem de tempo e frequência de cruzamentos
na área do contador crítico da plataforma no dia em questão, e dia anterior onde
define-se um padrão de navegação dos animais quanto à busca e extinção de
resposta na memória operacional armazenada nas 24 horas.
O teste de memória operacional foi dividido em duas fases consecutivas,
cinco dias com o ITI (intertrialinterval) de 5 minutos e posteriormente, mais cinco dias
com o ITI de 15 minutos. A cada dia, foram realizadas três tentativas.
Extração de RNA e análise de expressão dos genes interleucina 1-β (IL -1β), catalase (CAT), fator de necrose tumoral alfa (TNFα) e fator neurotrófico derivado cerebral (BDNF)
Ao fim dos testes comportamentais, os animais foram eutanaziados por
inalação constante de isoflurano e os encéfalos dissecados para a retirada bilateral
do hipocampo. Logo após, as amostras foram armazenados em solução
conservante (RNA later – Thermo Scientific) em temperatura de -20º C. Para a
extração de RNA foi utilizado o kit extrator – SV total RNA Isolation Kit (Promega),
conforme instruções de fabricante. Após a extração, o RNA foi quantificado e sua
pureza avaliada por espectrofotometria.
A extração de 1 micrograma de RNA total foi utilizada para a síntese de
cDNA, com a enzima transcriptase reversa com Kit High Capacity cDNA Reverse
46
Transcription Kit (Applied biosystems). Logo após, o cDNA foi submetido à reação
em cadeia de polimerase quantitativa (RT-qPCR) para a avaliação do perfil de
expressão dos genes CAT, IL – 1β, TNFα e BDNF no hipocampo dos animais dos
diferentes grupos.
O sistema de fluorescência utilizado para a amplificação foi o fluoróforo
Power Up SYBR-Green qPCR Master mix (Thermofisher) segundo instruções do
fabricante. As reações no termociclador Step One Plus (Life Technologies), para
determinação dos níveis de expressão do mRNA nos distintos grupos.
Esquema representando a sequencia do desenho experimental.
Análise de dados
Os valores obtidos nos parâmetros comportamentais e na quantificação
relativa dos genes em estudo foram submetidos a testes de normalidade e, atingido
os requisitos de homogeneidade, empregados testes de Análise de Variância para
Medidas Repetidas (ANOVA). Os parâmetros moleculares e comportamentais foram
considerados como variáveis dependentes e os grupos experimentais como
variáveis independentes. Todos os testes foram realizados com auxílio do ambiente
estatístico R (R Development Core Team, 2016) com nível de significância fixado em
5% e, quando necessário, teste de comparações múltiplas post hoc de Tukey, para
identificação das origens das possíveis diferenças.
No teste de memória de referência, foi realizada uma ANOVA separada para
cada parâmetro (latência, trajeto, tempo no quadrante da plataforma e velocidade de
nado) considerando-se os grupos experimentais como fatores entre-sujeitos e
“Sessão” e “Tentativa” como fatores intra-sujeitos, sendo realizadas médias dos
Indução STZ-icv
Inícios de tratamento (D1-D5)
Testes de memória no labirinto aquático
Análise de expressão de genes (IL-1β, TNFα, CAT, BDNF)
47
escores por tentativas por sessão para a confecção gráfica temporal da
apresentação dos resultados.
No teste de avaliação e extinção da resposta adquirida, cada tentativa diária
de 180 segundos foi dividivda em Blocos de 60 segundos cada consecutivamente,
sendo fatores entre-sujeitos os grupos experimentais e fatores intra-sujeitos
“Sessão” e “Bloco” (3 de 60 segundos cada)
Quanto aos resultados de memória operacional, “Tentativa e Fase” são
considerados fatores intra-sujeitos e os grupos experimentais, como fatores entre-
sujeitos, e, para comparação de desempenho dos animais ao longo das tentativas,
dividiu-se 02 fases quanto ao ITI: 5 e 15 minutos em 3 tentativas.
Resultados Memória de referência Análise descritiva da memória de referência
Os resultados do teste de memória de referência foram expressos por meio
dos parâmetros: latência, trajeto percorrido e velocidade de nado (Figura 2).
48
Sessão ( dias )
Figura 2 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse, por grupo, em função da sessão (valor médio das duas tentativas), respectivas ao experimento de memória de referência. (G1- controle salina; tampão icv e salina 0,9% ip,/ G2-STZ-icv e salina 0,9% ip, / G3-STZ-icv e DMSO a 40% 0,75 g/kg ip, G4-STZ-icv e DMSO a 40% 1,5 g/kg ip) – Nota-se redução progressiva dos parâmetros de latência, trajeto e velocidade principalmente no grupo G1.
A Figura 2 apresenta graficamente as médias das variáveis de latência,
trajeto e velocidade por grupo, ao longo dos momentos avaliados, sendo
considerados os valores médios das duas tentativas realizadas em cada sessão.
Nota-se que independentemente do grupo, a média da latência para encontro da
plataforma tente a diminuir ao longo das sessões realizadas no experimento, o que
também acontece com o trajeto e a velocidade, sendo que a partir da segunda
sessão, as médias das três variáveis obtidas pelos ratos do grupo controle (G1) são
inferiores às observadas para os demais grupos, mostrando prejuízo de memória
espacial em todos os grupos em relação ao grupo Controle.
49
Sessão ( dias )
Figura 3 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse, por grupo, (Entrada e Tempo no Quadrante da Plataforma, Entrada e Tempo no Contador da Plataforma, Entrada e Tempo no Anel Externo) em função da sessão (valor médio das duas tentativas), respectivas ao experimento de memória de referência – Nota-se diferenças entre grupo G1 e grupos STZ (G2, G3, G4) predominantemente na Entrada e Tempo no Quadrante da Plataforma, assim como na Entrada e Tempo no Anel Externo.
Na Figura 3, observam-se as médias das variáveis de entrada e tempo por
grupo, ao longo dos momentos avaliados, sendo considerados os valores médios
das duas tentativas realizadas em cada sessão. É notável que os ratos do grupo
Controle (G1) tem menores médias na maior parte dos períodos, quando
consideradas as variáveis de número de entradas e tempo tanto no quadrante da
plataforma, quanto no anel externo, enquanto que o contrário ocorre com a variável
referente ao tempo no contador da plataforma, para o qual, as médias do grupo G1
são maiores em geral.
50
Ainda, é nítido que para os quatro grupos, o tempo no anel externo tende a
diminuir ao longo das sessões, assim como as entradas no anel externo e no
quadrante da plataforma, embora as tendências para essas duas últimas variáveis
sejam mais sutis, sobretudo para o grupo G4. Por outro lado, embora apresente
grande oscilação, tanto o número de entradas quanto o tempo no contador da
plataforma apresentam uma tendência suave de aumento ao longo das sessões
realizadas.
Comparações da memória de referência Na Tabela 2 são apresentados os resultados dos testes para comparação
das variáveis de interesse entre os grupos obtidos por meio da ANOVA. Foram
consideradas como variáveis dependentes: latência, a trajetória, a velocidade e as
variáveis de entrada e tempo, obtidas entre todas em relação às 30 tentativas
realizadas ao longo das 15 sessões do experimento, enquanto que as variáveis:
grupo, tentativa e sessão foram consideradas independentes. Tabela 2 – Resultados da ANOVA para as quatro variáveis de interesse.
Variável Grupo (3, 1243)
Tentativa (1, 1243)
Sessão (1, 1243)
Grupo x Tentativa (3, 1243)
Grupo x Sessão (3, 1243)
Tentativa x Sessão (1, 1243)
Grupo x Tentativa x Sessão (3, 1243)
Latência 23,221 (<0,001)
9,285 (0,002)
211,916 (<0,001)
0,035 (0,991)
3,947 (0,008)
0,809 (0,369)
1,283 (0,279)
Trajetória 13,753 (<0,001)
4,086 (0,043)
168,234 (<0,001)
0,265 (0,851)
4,263 (0,005)
0,013 (0,908)
0,927 (0,427)
Velocidade 7,31 (<0,001)
0,126 (0,723)
68,442 (<0,001)
0,815 (0,486)
7,182 (<0,001)
1,835 (0,176)
0,209 (0,890)
Entrada no Quadrante da Plataforma (n)
11,015 (<0,001)
1,593 (0,207)
51,71 (<0,001)
0,129 (0,943)
3,163 (0,024)
0,000 (0,983)
0,954 (0,414)
Tempo no Quadrante da Plataforma (s)
7,139 (<0,001)
6,577 (0,010)
19,014 (<0,001)
0,040 (0,989)
2,245 (0,081)
0,033 (0,856)
1,358 (0,254)
Entrada no Contador da Plataforma (n)
3,592 (0,013)
4,707 (0,030)
29,021 (<0,001)
0,258 (0,856)
2,388 (0,067)
0,132 (0,717)
0,173 (0,915)
Tempo no Contador da Plataforma (s)
3,669 (0,012)
1,075 (0,300)
58,045 (<0,001)
0,773 (0,509)
1,316 (0,268)
0,008 (0,930)
0,482 (0,695)
Entrada no Anel Externo (n)
12,953 (<0,001)
0,018 (0,892)
25,467 (<0,001)
0,388 (0,762)
8,329 (<0,001)
2,763 (0,097)
1,166 (0,322)
Tempo no Anel Externo (s)
17,399 (<0,001)
18,946 (<0,001)
372,901 (<0,001)
0,192 (0,902)
8,614 (<0,001)
0,203 (0,653)
1,325 (0,265)
GL n : Graus de liberdade dos numerados; GL d : Graus de liberdade do denominador; P < 0,05
51
De acordo com os resultados expostos na Tabela 2, vê-se que o efeito
principal dos grupos se mostrou significativo para todas as variáveis sob estudo ao
nível de 5% de significância, indicando que as médias dessas variáveis diferem
significativamente para ao menos um par de grupos (F3,1243 = 3,669 – 23,221, p <
0,001). Pode-se ver ainda que o efeito principal das sessões também foi significativo
em todos os casos, apresentando valores p inferiores a 0,001 para todas as
variáveis resposta, indicando assim que há um deslocamento na média das
variáveis ao passar das sessões (F1,1243 = 25,467 – 372,901, p < 0,001). É possível
perceber ainda que o efeito principal de tentativa foi significativo, a 5% de
significância, para as variáveis: latência, trajetória, entrada no contador da
plataforma, tempo no quadrante da plataforma e tempo no anel externo (F1,1243 =
4,086 – 18,946, p < 0,043).
Desta forma, há indicações de diferenças nas médias dessas variáveis
conforme a tentativa de observação, ao passo que não foram encontradas
evidências amostrais suficientes de que a velocidade, a entrada no quadrante da
plataforma, o tempo no contador da plataforma e a entrada no anel externo diferem
significativamente entre as tentativas (F1,1243 = 0,018 – 1,593, p > 0,207).
Considerando as interações, nota-se que a interação entre grupo e sessão foi a
única significativa em pelo menos algum caso. Destaca-se que essa interação se
demonstrou estatisticamente significante para as variáveis de latência, trajetória,
velocidade, entrada no quadrante da plataforma entrada no anel externo e tempo no
anel externo (F3,1243= 3,163 - 8,614, p< 0,024).
É importante frisar que os graus de liberdade de resíduos utilizados no
denominador da estatística F foram todos constantes e iguais a 1243. Avaliando em
quais grupos as variáveis de interesse diferem significativamente, o teste de
comparações múltiplas de Tukey foi aplicado.
52
Tabela 3 – Médias das variáveis de interesse e resultados do teste de Tukey entre os grupos.
Variável G1 G2 G3 G4 Latência 60,46 (c) 80,45 (b) 90,11 (a) 90,05 (a)
Trajetória 889,65 (c) 1662,79 (b) 1860,83 (b) 2150,96 (a)
Velocidade 14,98 (c) 19,14 (b) 19,68 (b) 22,63 (a) Entrada no Quadrante da Plataforma (n) 2,8 (c) 4,5 (b) 4,79 (b) 5,47 (a) Tempo no Quadrante da Plataforma (s) 16,45 (b) 20,45 (a) 21,27 (a) 21,47 (a) Entrada no Contador da Plataforma (n) 1,66 (a) 1,47 (ab) 1,35 (b) 1,34 (b) Tempo no Contador da Plataforma (s) 4,74 (a) 3,35 (b) 2,71 (bc) 2,53 (c)
Entrada no Anel Externo (n) 4,91 (b) 7,84 (a) 7,44 (a) 8,44 (a) Tempo no Anel Externo (s) 30,94 (c) 50,07 (b) 62,63 (a) 61,82 (a)
Vê-se na Tabela 3 que a latência média do grupo G1, de 60,46 s, difere
significativamente das médias dos grupos G2 (80,45 s), G3 (90,11 s) e G4 (90,05 s),
assim como a média da trajetória do grupo G1 (889,65 cm) difere de todos os
grupos, enquanto que a média dos grupos G2 (1662,79 cm) e G3 (1860,83 cm) não
diferem entre si, mas diferem da média do grupo G4 (2150,96 cm). Da mesma
forma, para a variável velocidade, a média do grupo G1, de 14,98 cm/s difere
significativamente das médias dos grupos G2 (19,14 cm/s), G3 (19,68 cm/s) e G4
(22,63 cm/s).
Similarmente à variável de trajetória, a média da variável entrada no
quadrante da plataforma do grupo G1 é significativamente diferente de todas (2,8),
enquanto que as médias dos grupos G2 (4,5) e G3 (4,79) não diferem entre si, mas
diferem do último grupo (5,47).
Em relação à variável entrada no anel externo, nota-se que apenas o grupo
G1 possui média destoante dos demais (4,91), enquanto que para a entrada no
contador da plataforma há divergência da média desse mesmo grupo (1,66) para a
média do grupo G3 (1,35) e G4 (1,34).
Quanto às médias da variável tempo no anel externo, nota-se novamente
uma diferença significativa entre o grupo G1 (30,94 s) em relação a todos os outros,
o que também aconteceu com as médias da variável tempo no quadrante da
plataforma, que só apresentou diferença significativa na média do grupo G1
comparado aos demais.
Por fim, em relação as médias do variável tempo no contador da plataforma,
nota-se que não houve diferença entre os grupos G4 e G3 (2,53 s versus 2,71 s), G3
e G2 (2,71 sversus 3,35 s), sendo a medida do grupo G1 (4,74 s) significativamente
53
maior do que as demais. Portanto, é possível concluir que o DMSO não gerou
efeitos significativos nos grupos tratados e os prejuízos de memória de referência
foram observados de forma similar em todos os grupos, exceto o Controle.
Avaliação de extinção da memória adquirida (Probe Test) Análise descritiva do Probe Test
Figura 4 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse (Entrada e Tempo no Quadrante da Plataforma, Entrada e Tempo no Contador da Plataforma), por grupo e fase e tentativa (Bloco de 3 tentativas de 60 segundos cada), respectivas ao experimento Probe Test – Nota-se maior permanência no lugar prévio da plataforma na primeira fase no G1 em Entrada e Tempo no Quadrante da Plataforma por habituação, mostrando-se tendência de extinção do aprendido na Fase 2, não havendo diferenças entre os grupos STZ (G2,G3,G4)
A partir da Figura 4 são expostos os perfis médios dos grupos do estudo
conforme as fases consideradas. Pode-se notar que para a variável entrada no
contador da plataforma há um comportamento diferente nas médias dos grupos
entre as fases, sendo que na primeira fase há uma disparidade entre os grupos em
54
todas as tentativas, enquanto que na segunda fase, os quatro grupos parecem
convergir para uma mesma média após a última tentativa.
Considerando a variável entrada no quadrante da plataforma, pode-se
destacar que a medida média do grupo G4 foi superior em todos os casos, sendo a
maior diferença aparente na primeira fase. Além disso, nota-se que na segunda
fase, a média desse grupo foi constante nas três tentativas, enquanto que as médias
dos outros grupos diminuíram conforme o passar das tentativas.
Ao se olhar para o tempo no contador da plataforma, nota-se uma
superioridade na média do grupo G1 em todas as tentativas e em ambas as fases,
caracterizando um comportamento diferente dos demais grupos para essa variável.
Por fim, vê-se na primeira fase que o comportamento médio dos grupos para
a variável tempo no contador da plataforma se demonstrou próximo, o que não
aconteceu na segunda fase do experimento, com uma média muito superior do
grupo G1 nas duas primeiras tentativas e um comportamento de decaimento muito
mais acentuado conforme o passar das tentativas para esse mesmo grupo.
Tabela 4 – Medidas descritivas das variáveis de interesse, por grupo, respectivas ao experimento Probe Test.
Variável Grupo Média DP CV Mínimo Máximo
Entrada no Quadrante da Plataforma (n)
G1 3,42 1,62 47,25% 0,00 6,00 G2 3,68 1,50 40,76% 1,00 7,00 G3 3,50 1,35 38,48% 1,00 6,00 G4 4,08 1,22 29,91% 1,00 7,00
Tempo no Quadrante da Plataforma (s)
G1 19,97 10,36 51,86% 0,00 60,00 G2 16,60 8,08 48,65% 2,00 42,00 G3 15,60 6,85 43,93% 2,00 34,00 G4 17,45 5,68 32,57% 5,00 31,00
Entrada no Contador da Plataforma (n)
G1 2,67 1,60 60,05% 0,00 8,00 G2 1,80 1,36 75,72% 0,00 6,00 G3 2,10 2,55 121,39% 0,00 12,00 G4 1,30 1,23 94,20% 0,00 4,00
Tempo no Contador da Plataforma (s)
G1 4,02 3,61 89,90% 0,00 21,00 G2 2,23 2,04 91,19% 0,00 9,00 G3 2,22 2,91 131,09% 0,00 11,00 G4 1,47 1,88 128,11% 0,00 8,00
DP: desvio padrão; CV: coeficiente de variação.
Na Tabela 4 são apresentadas as medidas descritivas das variáveis do
experimento, considerando as observações de ambas as fases e todas as tentativas
55
realizadas. O grupo G1 apresenta as maiores médias gerais para as variáveis
entrada no contador da plataforma (2,67), tempo no contador da plataforma (4,02 s),
e tempo no contador da plataforma (19,97 s), enquanto que teve a menor medida
média para entrada no quadrante da plataforma, sendo igual a 3,42. Apesar da
maior média para entrada no contador da plataforma pertencer ao primeiro grupo, o
maior valor observado (12) é referente a um rato do grupo G3, grupo esse que
apresentou maior variação entre os valores observados em torno da média dessa
variável (CV = 121%).
Pode-se ver também que o grupo G4 apresentou a maior média observada
para entrada no quadrante da plataforma (4,08) e as menores médias para entrada
no contador da plataforma (1,30) e tempo no contador da plataforma (1,47 s). Além
disso, vê-se que o grupo G3 apresentou a menor média geral de tempo no contador
da plataforma, sendo essa medida igual a 3,50 s.
Comparações do Probe Test
Nos testes de comparação entre os grupos por meio da ANOVA, considera-
se como variáveis dependentes, a entrada e tempo no quadrante e contador da
plataforma, em relação às 3 tentativas realizadas ao longo das 2 fases do
experimento, enquanto que as variáveis grupo, tentativa e fase foram consideradas
como independentes.
Tabela 5 – Resultados da ANOVA – F (valor p) - para as variáveis de interesse, respectivas ao experimento Probe Test.
Variável Grupo (3, 235)
Bloco (1, 235)
Sessão (1, 235)
Grupo x Bloco
(3, 235)
Grupo x Sessão (3, 235)
Bloco x Sessão (1, 235)
Grupo x Bloco x Sessão (3, 235)
Entrada no Quadrante da Plataforma (n)
2,076 (0,104)
1,964 (0,162)
0,031 (0,860)
0,148 (0,931)
0,697 (0,555)
0,105 (0,747)
0,475 (0,700)
Tempo no Quadrante da Plataforma (s)
3,381 (0,019)*
1,678 (0,196)
2,478 (0,117)
2,376 (0,071)
3,262 (0,022)*
6,052 (0,015)*
0,719 (0,541)
Entrada no Contador da
Plataforma (n)
2,648 (0,049)*
3,938 (0,048)*
4,562 (0,034)*
1,961 (0,121)
2,411 (0,068)
0,033 (0,857)
0,608 (0,610)
Tempo no Contador da
Plataforma (s)
2,753 (0,043)*
1,328 (0,250)
0,232 (0,630)
0,845 (0,470)
0,517 (0,671)
0,096 (0,757)
0,113 (0,952)
* Valor p < 0,05.
56
De acordo com os resultados expostos na Tabela 5, vê-se que o efeito
principal dos grupos se mostrou significativo, com exceção a variável entrada no
quadrante da plataforma, para todas as variáveis sob estudo ao nível de 5% de
significância, indicando que as médias dessas variáveis diferem significativamente
para ao menos um par de grupos (F3,235 = 2,648 – 3,381, p < 0,049).
Pode-se ver ainda que os efeitos principais das tentativas e das fases só
foram significativos para a variável entrada no contador da plataforma (F1,235 = 3,938
– 4,562, p < 0,048). Desta forma, há indicações de diferenças significantes nas
médias de entrada no contador da plataforma conforme as tentativas e fases. É
possível perceber ainda que a interação entre grupo e fase foi significante apenas
para a variável tempo no quadrante da plataforma (F3,235= 3,262, p = 0,022),
indicando que dependendo da fase, há diferenças nas médias de tempo no
quadrante da plataforma (F3,235= 3,262, p = 0,022), indicando que dependendo da
fase, há diferenças nas médias de tempo no quadrante da plataforma entre os
grupos. Por outro lado, vê-se que essa variável também foi exclusiva quanto a
significância da interação entre tentativa e fase (F1,235 = 6,052, p = 0,015), levando a
entender que as médias de tempo no quadrante da plataforma têm comportamento
dependente da relação entre tentativa e fase.
Para avaliar entre quais grupos as variáveis de interesse diferem
significativamente, o teste de comparações múltiplas de Tukey foi aplicado.
Tabela 6 – Médias das variáveis de interesse e resultados do teste de Tukey entre os grupos, respectivas ao experimento Probe Test.
Variável G1 G2 G3 G4 Entrada no Quadrante da Plataforma (n) 3,42 (a) 3,68 (a) 3,50 (a) 4,08 (a) Tempo no Quadrante da Plataforma (s) 19,97 (a) 16,60 (ab) 15,60 (b) 17,45 (ab) Entrada no Contador da Plataforma (n) 2,67 (a) 1,80 (bc) 2,10 (ab) 1,30 (c) Tempo no Contador da Plataforma (s) 4,02 (a) 2,23 (b) 2,22 (b) 1,47 (b)
Letras diferentes em uma mesma linha indicam diferenças significativas entre os grupos.
Concordante com a ANOVA, os resultados do teste de Tukey pela Tabela 6
indicam que não há diferença nas médias de entrada no quadrante da plataforma
entre os grupos estudados. No entanto, percebe-se significância na diferença entre
as médias de entrada no contador da plataforma dos grupos G1 (2,67) com G2
(1,80) e G4 (1,30).
57
Em relação à variável tempo no contador da plataforma, nota-se que apenas
o grupo G1 possui média destoante dos demais (4,02 s), enquanto que para tempo
no quadrante da plataforma há divergência da média desse mesmo grupo (19,97 s)
apenas para a média do grupo G3 (15,60 s). Portanto, confirmando os resultados
obtidos no teste de memória de referência, o Probe Test mostrou prejuízos de
memória e extinção da resposta adquirida em todos os grupos, exceto o grupo
Controle (G1).
Memória operacional
Análise descritiva da memória operacional
Figura 5 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse, por grupo, em função da tentativa (valor médio das 5 sessões) e fase, respectivas ao experimento de memória operacional. – Nota-se redução progressiva de parâmetros de latência, trajeto e velocidade principalmente no G1, e manutenção de velocidade de nado elevada em grupos STZ (G2.G3,G4)
A Figura 5 apresenta graficamente as médias das variáveis de latência,
trajeto e velocidade por grupo, ao longo dos momentos avaliados, sendo
58
considerados os valores médios das três tentativas realizadas em cada fase. Pode-
se ver a diferença clara nas médias do grupo G1 nas duas fases para as variáveis
de trajeto e velocidade, tendo médias inferiores às demais em todas tentativas,
inclusive.
Percebe-se que, independentemente do grupo, a média da latência para
encontro da plataforma tende a diminuir ao longo das tentativas, sendo esse
comportamento acentuado na segunda fase, o que também acontece com o trajeto.
Já para a velocidade, nota-se esse comportamento geral de médias decrescentes ao
passar das tentativas apenas na segunda fase.
Figura 6 – Gráfico de perfis médios das variáveis de interesse (Entrada e Tempo no Quadrante da Plataforma, Entrada e Tempo no Contador da Plataforma, Entrada e Tempo no Anel Externo), por grupo, em função da tentativa (valor médio das 5 sessões) e fase, respectivas ao experimento de memória operacional. – Nota-se quantitativamente menor: Entrada e Tempo no Quadrante da
59
Plataforma, asism como em Entrada e Tempo no Anel Externo no grupo G1 comparativamente aos grupos STZ (G2, G3, G4).
Pela Figura 6, observam-se as médias das variáveis de entrada e tempo por
grupo, ao longo dos momentos avaliados, sendo considerados os valores médios
dentre cada fase proposta. Os ratos do grupo Controle têm menores medidas
médias na maior parte das fases quando consideradas as variáveis de entrada e
tempo no quadrante da plataforma e no anel externo, não sendo a menor média
apenas na primeira tentativa da fase 1 para as entradas no anel externo e tempo no
quadrante da plataforma e no anel externo. Por outro lado, as médias do grupo G4
parecem superiores, no geral, para a entrada no quadrante e tempo no anel externo,
sendo essa superioridade numérica acentuada na segunda fase do experimento.
Ainda nos quatro grupos, a entrada e tempo no quadrante da plataforma,
além da entrada e tempo no anel externo tendem a diminuir ao longo das tentativas,
embora as tendências sejam mais sutis na primeira fase e mais acentuadas na
segunda fase. Por outro lado, embora apresente grande oscilação, tanto o número
de entradas quanto o tempo no contador da plataforma apresentam uma tendência
de aumento ao longo das tentativas realizadas.
Complementando as figuras 4 e 5, a Tabela 7 apresenta medidas
considerando as três tentativas nas duas fases do processo experimental. O grupo
G1 apresentou a maior média geral apenas para a variável de tempo no contador da
plataforma (4,49 s), no entanto teve as menores medidas médias para todas as
outras variáveis do estudo.
Em contraste, vê-se que o grupo G4 apresentou as maiores médias na
trajetória (1684,74 cm), velocidade (21,45 cm/s), tempo no quadrante da plataforma
(18,59 s) e no anel externo (36,46 s), além da entrada no contador da plataforma,
que teve média 1,73 e a entrada no quadrante da plataforma, cuja média foi igual a
4,83. Por outro lado, pode-se ver também que o grupo G3 apresentou a maior
latência média, sendo essa quantia igual a 74 s.
60
Tabela 7 – Medidas descritivas das variáveis de interesse, por grupo, respectivas ao experimento operacional.
Variável Grupo Média DP CV Mínimo Máximo
Latência (s)
G1 64,82 28,62 0,44 17,80 120,00
G2 66,77 23,54 0,35 18,00 109,40
G3 74,00 26,05 0,35 18,60 120,00
G4 73,40 26,12 0,36 15,00 120,00
Trajetória (cm)
G1 858,82 453,05 0,53 136,80 1945,40
G2 1332,95 587,58 0,44 193,00 2814,80
G3 1481,78 680,66 0,46 199,60 3248,80 G4 1684,74 708,41 0,42 230,40 3368,80
Velocidade (cm/s)
G1 13,26 4,26 0,32 1,30 19,28 G2 18,39 3,54 0,19 10,52 25,68 G3 19,03 4,83 0,25 10,32 29,20
G4 21,45 4,44 0,21 11,68 30,84
Entrada no Quadrante da Plataforma (n)
G1 2,69 1,12 0,42 0,40 5,00
G2 4,06 1,39 0,34 1,20 7,00
G3 4,25 1,60 0,38 1,40 8,60
G4 4,83 1,81 0,37 1,60 8,60
Tempo no Quadrante da Plataforma (s)
G1 15,23 5,01 0,33 4,40 24,80
G2 17,94 6,17 0,34 7,00 36,00
G3 17,85 4,66 0,26 10,00 30,80 G4 18,59 5,33 0,29 6,80 31,80
Entrada no Contador da Plataforma (n)
G1 1,64 0,67 0,41 0,20 3,00 G2 1,67 0,51 0,31 0,80 3,00 G3 1,67 0,62 0,37 0,40 3,60
G4 1,73 0,67 0,39 0,00 3,20
Tempo no Contador da Plataforma (s)
G1 4,49 1,60 0,36 1,00 9,80
G2 4,23 1,52 0,36 2,20 8,60
G3 3,75 1,69 0,45 0,00 8,20
G4 3,69 1,51 0,41 0,00 10,00
Entrada no Anel Externo (n)
G1 4,92 2,44 0,50 1,28 12,00
G2 6,60 2,92 0,44 1,00 14,20
G3 7,96 3,31 0,42 1,40 15,80 G4 7,52 2,99 0,40 1,20 14,60
Tempo no Anel Externo (s)
G1 23,41 15,55 0,66 2,00 72,40 G2 27,58 18,12 0,66 2,40 82,20 G3 32,36 18,36 0,57 3,00 78,80
G4 36,46 21,43 0,59 4,00 110,20 DP: desvio padrão; CV: coeficiente de variação.
.
61
Comparações da memória operacional
A comparação das variáveis entre os grupos por meio da ANOVA,
consideram como variáveis dependentes: resposta a latência, trajetória e velocidade,
além das variáveis de entrada e tempo no quadrante, anel externo e contador da
plataforma, sendo todas relativas às 3 tentativas realizadas ao longo das 2 fases do
experimento. Enquanto isso, as variáveis: grupo, tentativa e fase foram consideradas
como independentes. Tabela 8 – Resultados da ANOVA – F (valor p) - para as variáveis de interesse, respectivas ao experimento de memória operacional.
Variável Grupo (3, 235)
Tentativa (1, 235)
Fase (1, 235)
Grupo x Tentativa (3, 235)
Grupo x Fase
(3, 235)
Tentativa x Fase
(1, 235)
Grupo x Tentativa
x Fase (3, 235)
Latência (s) 3,565
(0,015)* 46,014
(<0,001)* 4,163
(0,042)* 2,243
(0,084) 2,42
(0,067) 1,312
(0,253) 0,028
(0,994)
Trajetória (cm) 5,094
(0,002)* 20,672
(<0,001)* 0,614
(0,434) 0,453
(0,716) 0,705
(0,550) 2,015
(0,157) 0,098
(0,961)
Velocidade (cm/s) 5,673
(0,001)* 1,392
(0,239) 0,503
(0,479) 0,057
(0,982) 1,238
(0,297) 0,835
(0,362) 0,067
(0,978)
Entrada no Quadrante da Plataforma (n)
5,609 (0,001)*
10,97 (0,001)*
0,226 (0,635)
0,248 (0,863)
0,289 (0,833)
1,149 (0,285)
0,071 (0,976)
Tempo no Quadrante da Plataforma (s)
2,039 (0,109)
7,935 (0,005)*
0,546 (0,461)
0,276 (0,843)
0,276 (0,843)
0,294 (0,588)
0,156 (0,926)
Entrada no Contador da Plataforma (n)
0,747 (0,525)
2,463 (0,118)
0,845 (0,359)
0,409 (0,747)
1,695 (0,169)
0,063 (0,802)
1,322 (0,268)
Tempo no Contador da Plataforma (s)
1,287 (0,280)
19,192 (<0,001)*
0,001 (0,984)
1,044 (0,374)
5,171 (0,002)*
4,956 (0,027)*
0,767 (0,514)
Entrada no Anel Externo (n)
4,872 (0,003)*
20,374 (<0,001)*
3,69 (0,056)
1,083 (0,357)
0,973 (0,406)
0,512 (0,475)
0,153 (0,928)
Tempo no Anel Externo (s) 2,245
(0,084) 16,327
(<0,001)* 5,059
(0,025)* 0,462
(0,709) 1,471
(0,223) 0,923
(0,338) 0,259
(0,855) * Valor p < 0,05.
A partir da Tabela 8, o efeito principal dos grupos se mostrou significativo, ao
nível de 5% de significância, para as variáveis relativas à latência, trajetória,
velocidade, entrada no quadrante da plataforma e entrada no anel externo,
indicando que as médias dessas variáveis diferem significativamente para ao menos
um par de grupos (F3,235 = 3,565 – 5,673, p < 0,015).
Os efeitos principais das tentativas só não foram significativos para as
variáveis de velocidade e entrada no contador da plataforma (F1,235 = 1,392 – 2,463,
62
p > 0,118), havendo indicações de diferenças significantes nas médias conforme as
tentativas para todas as outras variáveis em estudo.
Observando o efeito principal da fase, houve significância estatística para as
variáveis de latência e tempo no anel externo (F1,235 = 4,163 – 5,059, p < 0,042),
havendo diferenças significativas nas médias dessas variáveis quando as fases são
contrastadas.
É possível perceber que a interação entre grupo e fase foi significante
apenas para a variável de tempo no contador da plataforma (F3,235 = 5,171, p =
0,002), indicando que dependendo da fase, há diferenças nas médias de tempo no
contador da plataforma entre os grupos. Além disso, nota-se a exclusividade dessa
mesma variável quanto a significância da interação entre tentativa e fase (F1,235 =
4,956, p = 0,027), levando a entender que as médias de tempo no contador da
plataforma têm comportamento dependente da relação entre tentativa e fase.
Na definição de quais grupos as variáveis de interesse diferem
significativamente, o teste de comparações múltiplas de Tukey foi aplicado.
Tabela 9 – Médias das variáveis de interesse e resultados do teste de Tukey entre os grupos, respectivas ao experimento de memória operacional.
Variável G1 G2 G3 G4 Latência (s) 64,82 (a) 66,77 (a) 74 (a) 73,4 (a)
Trajetória (cm) 858,82 (c) 1332,95 (b) 1481,78 (ab) 1684,74 (a) Velocidade (cm/s) 13,26 (c) 18,39 (b) 19,03 (b) 21,45 (a)
Entrada no Quadrante da Plataforma (n) 2,69 (c) 4,06 (b) 4,25 (ab) 4,83 (a) Tempo no Quadrante da Plataforma (s) 15,23 (b) 17,94 (a) 17,85 (a) 18,59 (a) Entrada no Contador da Plataforma (n) 1,64 (a) 1,67 (a) 1,67 (a) 1,73 (a) Tempo no Contador da Plataforma (s) 4,49 (a) 4,23 (ab) 3,75 (b) 3,69 (b)
Entrada no Anel Externo (n) 4,92 (c) 6,6 (b) 7,96 (a) 7,52 (ab) Tempo no Anel Externo (s) 23,41 (c) 27,58 (bc) 32,36 (ab) 36,46 (a)
É possível observar na Tabela 9 que, apesar do resultado da ANOVA
apresentado anteriormente, não houve evidência de diferenças entre os grupos em
relação à latência média pelo teste de Tukey. No entanto, a trajetória média do
grupo G1, igual a 858,82 cm, difere significativamente de todos os outros grupos,
enquanto que a média do grupo G2 (1332,95 cm) difere também da média do grupo
G4 (1684,74 cm).
Quanto a velocidade média, para o grupo G1 foi significantemente menor
que os demais grupos, com média de 13,26 cm/s, enquanto que o grupo G4 foi o
63
mais veloz, tendo uma velocidade média de 21,45 cm/s e diferindo dos demais
grupos.
O número médio de entrada na plataforma do grupo G1 foi diferente de
todos (2,69), sendo que o grupo G2 (4,06) também diferiu do G4 (4,83) para essa
variável, enquanto que para a variável relativa ao tempo no quadrante da plataforma,
vê-se que o grupo G1 foi o único que obteve uma medida média diferente dos
demais (15,23 s).
No tempo no contador da plataforma, observa-se que não houve diferença
significativa entre as médias dos grupos G1 e G2, iguais a 4,49 s e 4,23 s,
respectivamente. Porém, há evidências de diferença nas médias entre o primeiro
grupo e os grupos G3 (3,75 s) e G4 (3,69 s). O tempo no anel externo médio do
grupo G1 (23,41 s) foi significativamente menor que as médias dos grupos G3 e G4,
sendo essas últimas iguais a 32,36 s e 36,46 s, respectivamente.
Já em relação as médias da variável entrada no anel externo, vê-se que não
houve diferença entre os grupos G4 e G3 (7,52 versus 7,96), G4 e G2 (7,52 versus
6,6), sendo a medida do grupo G1 (4,92) significativamente maior do que as demais.
Portanto, é possível concluir que o DMSO não exerceu efeito neuroprotetor
me relação aos prejuízos de memória operacional observados em todos os grupos,
exceto o grupo Controle (G1).
Avaliação de expressâo gênica. Análise descritiva da expressão de IL-1β
Descreve-se o comportamento da variável de interesse com os resultados
da análise molecular de interleucina 1 beta (IL-1β).
Tabela 10 – Medidas descritivas da variável de interesse, por grupo.
Grupo Média DP EPM CV Mínimo Máximo Controle 0,70 0,35 0,15 49,36% 0,28 1,11
STZ 1,14 0,54 0,24 47,31% 0,50 1,66 STZ + DMSO 0,75 g/kg 1,27 0,32 0,14 25,07% 0,75 1,55 STZ + DMSO 1,5 g/kg 0,97 0,28 0,13 29,19% 0,57 1,31
DP: desvio padrão; EPM: erro padrão da média; CV: coeficiente de variação.
64
Pela Tabela 10, nota-se que para a Quantificação Relativa, obtida por meio
da análise molecular de IL-1β, os animais do grupo controle apresentaram a menor
média geral (0,70), assim como a maior dispersão em torno da média, com
coeficiente de variação de 49,36%. O grupo STZ + DMSO 1,5 g/kg apresentou a
segunda menor média de 0,97,ao passo que os grupos STZ e STZ + DMSO 0,75
g/kg apresentaram as maiores médias entre os demais grupos, de 1,14 e 1,27,
respectivamente, sendo que a dispersão entre as observações foi maior para o
grupo STZ (coeficiente de variação de 47,31%), em relação ao grupo STZ + DMSO
0,75 g/kg (coeficiente de variação de 25,07%, menor entre todos os grupos).
Figura 7 – Boxplots das da variável de interesse IL1-β, por grupo. – Nota-se tendência de redução na expressão de IL1-β no grupo G4 quantitativa e relativamente comparado aos grupos STZ (G2, G3, e G4)
A Figura 7 apresenta graficamente os resultados das médias das variáveis
de interesse para cada grupo em relação às análises moleculares de IL1-β. Como já
descrito anteriormente, os animais do grupo controle e STZ + DMSO 1,5 g/kg
apresentam, em geral, menores valores da quantificação relativa em relação aos
outros grupos avaliados, enquanto que os grupos STZ e STZ + DMSO 0,75 g/kg
apresentam os maiores valores, sendo que para esse último grupo, os valores
encontram-se menos dispersos.
65
Figura 8 – Gráfico de barras da média (e erro padrão) da variável de interesse IL1-β, por grupo. – Nota-se tendência de redução da expressão gênica da IL1-β em G4.
A Figura 8 apresenta graficamente as médias da variável de interesse por
grupo, e respectivos erros padrões, relatadas na Tabela.
Comparação da expressão de IL1-β
A seguir, são apresentados os resultados dos testes para comparação das
variáveis de interesse entre os grupos, por meio na ANOVA. A quantificação relativa
e o grupo foram considerados como variáveis resposta e independente,
respectivamente. Tabela 11 – Resultados da ANOVA para a variável de interesse.
GLn GLd F Valor p 3 16 2,039 0,149*
GLn: Graus de liberdade do numerados; GLd: Graus de liberdade do numerador; * Valor es
significativos quando p <= 0,05.
De acordo com os resultados expostos na Tabela 11, vê-se que o efeito
principal dos grupos não se mostrou significativo para RQ (F3,16 = 2,039, p = 0,149),
66
ao nível de 5% de significância, indicando que as médias da variável não diferem
significativamente entre os grupos.
Para avaliar entre quais grupos a variável difere significativamente, o teste
de comparações múltiplas de Tukey foi aplicado, cujos resultados são apresentados
a seguir.
Tabela 12 – Médias (das variáveis de interesse e resultados do teste de Tukey entre os grupos.
Controle STZ STZ + DMSO 0,75
g/kg STZ + DMSO 1,5
g/kg 0,70 a 1,14ª 1,27 a 0,97 a
Como descrito anteriormente, o efeito principal do grupo não foi significativo
para a variável quantificação relativa, sendo que os resultados do teste de Tukey
apresentados na Tabela 3 corroboram esta informação, uma vez que a média de
nenhum dos grupos difere significativamente em relação aos demais. Portanto, não
houve diferenças na expressão do gene IL1-β no hipocampo dos diferentes grupos
experimentais.
Avaliação da expressão gênica do fator de necrose tumoral α (TNFα) Análise descritiva do TNFα
Tabela 13 – Medidas descritivas da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular TNF.
Grupo Média DP EPM CV Mínimo Máximo Controle 0,66 0,25 0,11 37,45% 0,36 1,00
STZ 1,22 0,49 0,22 39,90% 0,50 1,76 STZ + DMSO 0,75 g/kg 1,23 0,39 0,17 31,80% 0,77 1,83 STZ + DMSO 1,5 g/kg 1,10 0,39 0,18 35,83% 0,62 1,58
DP: desvio padrão; EPM: erro padrão da média; CV: coeficiente de variação.
Pela Tabela 13, nota-se que para a quantificação relativa obtida por meio da
análise molecular do TNF, os animais do grupo controle apresentaram a menor
média geral (0,66), enquanto que os animais do grupo STZ apresentaram a maior
dispersão em torno da média, com coeficiente de variação de 39,90%. O grupo STZ
67
+ DMSO 1,5 g/kg apresentou a segunda menor média de RQ, de 1,10, ao passo que
os grupos STZ e STZ + DMSO 0,75 g/kg apresentaram as maiores médias entre os
demais grupos, sendo ambas próximas (1,22 e 1,23, respectivamente).
Figura 9 – Boxplotsda quantificação relativa,por grupo, para a análise molecular TNFα. – Nota-se tendência de redução da expressão de TNFα no G4 comparativo aos grupos STZ (G2, G3, G4).
A Figura 9 apresenta graficamente os resultados da quantificação relativa
para cada grupo em relação às análises moleculares de TNF. Os animais do grupo
controle apresentam, em geral, menores valores de quantificação relativa em
relação aos outros grupos avaliados, enquanto que os grupos STZ e STZ + DMSO
0,75 g/kg apresentam os maiores valores, sendo que para esse último grupo, os
valores encontram-se menos dispersos.
68
Figura 10 – Gráfico de barras da média (e erro padrão) da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular TNFα.- Nota-se tendência de redução comparativa aos grupos STZ na expressão de TNFα no G4.
A Figura 10 apresenta graficamente as médias da variável de interesse por
grupo, e respectivos erros padrões, relatadas na Tabela 13.
Comparações da expressão do TNFα
Os resultados dos testes para comparação da quantificação relativa
(variáveis resposta) entre os grupos (variável independente) foi executado por meio
da ANOVA.
Tabela 14 - Resultados da ANOVA da quantificação relativa, para a análise molecular TNF.
GLn GLd F Valor p 3 16 2,366 0,109
GLn: Graus de liberdade do numerados; GLd: Graus de liberdade do numerador; * Valor p < 0,05.
De acordo com os resultados expostos na Tabela 14, vê-se que o efeito
principal dos grupos não se mostrou significativo para a variável RQ (F3,16 = 2,366, p
= 0,109), ao nível de 5% de significância, indicando que as médias da quantificação
relativa não diferem significativamente entre os grupos.
69
Para avaliar entre quais grupos a variável difere significativamente, o teste
de comparações múltiplas de Tukey foi aplicado.
Tabela 15 – Médias da quantificação relativa e resultados do teste de Tukey entre os grupos para a análise molecular TNF.
Controle STZ STZ + DMSO 0,75 g/kg
STZ + DMSO 1,5 g/kg
0,66ª 1,22ª 1,23 a 1,10 a
Como descrito anteriormente, o efeito principal do grupo não foi significativo
para a quantificação relativa da variával TNFα, sendo que os resultados do teste de
Tukey apresentados na Tabela 15 corroboram esta informação, uma vez que a
média de nenhum dos grupos difere significativamente em relação aos demais.
Portanto, não houve diferença na expressão de TNFα entre os grupos
experimentais.
Avaliação da expressão gênica da Catalase (CAT)
Análise descritiva da expressão da Catalase (CAT)
O comportamento da variável de interesse, por grupo, é descrito de acordo com os
resultados da análise molecular de catálise (CAT).
Tabela 16 – Medidas descritivas da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular CAT.
Grupo Média DP EPM CV Mínimo Máximo Controle 1,18 0,29 0,13 24,27% 0,86 1,51
STZ 1,36 0,36 0,16 26,45% 1,01 1,76 STZ + DMSO 0,75 g/kg 1,13 0,04 0,02 3,69% 1,08 1,17 STZ + DMSO 1,5 g/kg 1,06 0,1 0,04 8,96% 0,91 1,17
DP: desvio padrão; EPM: erro padrão da média; CV: coeficiente de variação.
A Tabela 16 para a variável quantificação relativa, obtida por meio da análise
molecular de CAT, os animais do grupo controle apresentaram a segunda maior
média geral (1,18), enquanto que os animais do grupo STZ apresentaram a maior
média (1,36) além da maior dispersão em torno da média, com coeficiente de
variação de 26,45%. O grupo STZ + DMSO 0,75 g/kg apresentou a segunda menor
70
média de 1,13, enquanto que o STZ + DMSO 1,5 g/kg apresentou a menor média
entre os demais grupos, sendo esta quantia igual a 1,06.
Figura 11 – Boxplots da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular CAT. – Nota-se tendência de redução da expressão gênica da CAT nos grupos tratamento com DMSO (G3 e G4).
A Figura 11 demonstra graficamente os resultados da quantificação relativa
para cada grupo em relação às análises moleculares de CAT. Como já descrito
anteriormente, os animais do grupo STZ + DMSO 1,5 g/kg apresentam, em geral,
menores valores em relação aos outros grupos avaliados, seguidos dos animais do
grupo STZ + DMSO 0,75 g/kg. Por outro lado, confirma-se visualmente que os
grupos STZ e controle apresentam os maiores valores, sendo que para esses
grupos, os valores se encontram de forma mais dispersa.
71
Figura 12 – Gráfico de barras da média (e erro padrão) da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular CAT.- Nota-se tendência de redução da expressão gênica da CAT nos grupos tratamento com DMSO (G3 e G4).
As médias da variável de interesse, separadas por grupo, são apresentadas
graficamente pela Figura 12 , além dos seus respectivos erros padrões, relatados na
Tabela .
Comparações da expressão da catalase (CAT)
A seguir, são apresentados os resultados dos testes para comparação da
quantificação relativa (variáveis resposta) entre os grupos (variável independente),
por meio na ANOVA.
Tabela 17 – Resultados da ANOVA da quantificação relativa, para a análise molecular CAT.
GLn GLd F Valor p 3 15 1,361 0,293
GLn: Graus de liberdade do numerados; GLd: Graus de liberdade do numerador; * Valor p < 0,05.
A partir do que é exposto na Tabela 8, vê-se que o efeito principal dos
grupos não se mostrou significativo para a variável RQ (𝐹3,15 = 1,361, p = 0,293), ao
nível de 5% de significância, indicando que as médias da quantificação relativa não
diferem significativamente entre os grupos.
72
Para avaliar entre quais grupos difere significativamente, o teste de
comparações múltiplas de Tukey foi aplicado
Tabela 18 – Médias da quantificação relativa e resultados do teste de Tukey entre os grupos para a análise molecular CAT.
Controle STZ STZ + DMSO 0,75 g/kg
STZ + DMSO 1,5 g/kg
1,18 a 1,36 a 1,13 a 1,06 a
Concordando com o resultado da ANOVA visto anteriormente, vê-se na
Tabela 18 que na quantificação relativa, a média de nenhum dos grupos difere
significativamente em relação aos demais, considerando um nível de 5% de
significância. Portanto, não hove diferença na expressão de CAT nos grupos
experimeitais.
Avaliação da expressão do Fator neurotrófico derivado cerebral (BDNF)
Análise descritiva do BDNF
O comportamento da variável de interesse, por grupo, é descrito de acordo
com os resultados da análise molecular do fator neurotrófico derivado do cérebro
(BDNF).
Tabela 19 – Medidas descritivas da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular de BDNF.
Grupo Média DP EPM CV Mínimo Máximo Controle 1,11 0,3 0,13 27,11% 0,82 1,62
STZ 0,67 0,08 0,04 12,66% 0,54 0,77 STZ + DMSO 0,75 g/kg 0,64 0,41 0,18 63,73% 0,26 1,23 STZ + DMSO 1,5 g/kg 0,93 0,17 0,08 18,04% 0,7 1,16
DP: desvio padrão; EPM: erro padrão da média; CV: coeficiente de variação.
Nota-se que para a quantificação relativa, obtida por meio da análise
molecular de BDNF na Tabela 19 , os animais do grupo controle apresentaram a
maior média geral (1,11), enquanto que os animais do grupo STZ + DMSO 0,75
g/kg apresentaram a menor média geral (0,64) além da maior dispersão em torno da
73
média, com coeficiente de variação de aproximadamente 63,73%. O grupo STZ +
DMSO 1,5 g/kg apresentou a segunda maior média de 0,93, ao passo que s grupo
STZ teve a segunda menor medida média (0,67), tendo o menor coeficiente de
variação entre os grupos (13%).
Figura 13 – Boxplots da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular BDNF. – Nota-se tendência de aumento da expressão de BDNF em grupo tratamento com DMSO (G4)
A Figura 13 apresenta graficamente os resultados da quantificação relativa
para cada grupo em relação às análises moleculares de BDNF. De forma análoga ao
que foi visto anteriormente, os animais do grupo controle apresentam, em geral,
maiores valores em relação aos outros grupos avaliados, enquanto que os grupos
STZ e STZ + DMSO 0,75 g/kg apresentam os menores valores, sendo que para
esse último grupo, os valores encontram-se mais dispersos.
74
Figura 14 – Gráfico de barras da média (e erro padrão) da quantificação relativa, por grupo, para a análise molecular BDNF. – Nota-se tendência de aumento na expressão gênica de BDNF no grupo tratamento com DMSO (G4).
As médias da variável de interesse, por grupo, são apresentadas
graficamente na Figura 14 , além dos seus respectivos erros padrões.
Comparações da expressão do BDNF
Apresentamos os resultados dos testes para comparação da quantificação
relativa (variáveis resposta) entre os grupos (variável independente), por meio na
ANOVA.
Tabela 20 – Resultados da ANOVA da quantificação relativa, para a análise molecular BDNF.
GLn GLd F Valor p 3 16 3,477 0,041*
GLn: Graus de liberdade do numerados; GLd: Graus de liberdade do numerador; * Valor p < 0,05.
De acordo com o que é exposto por meio da Tabela 20, vê-se que o efeito
principal dos grupos se mostrou significativo para a variável RQ (F3,16 = 3,477, p =
0,041), ao nível de 5% de significância, indicando que as médias da quantificação
relativa diferem significativamente entre ao menos um par de grupos.
75
Para avaliar entre quais grupos a variável difere significativamente, o teste
de comparações múltiplas de Tukey foi aplicado.
Tabela 21 – Médias da quantificação relativa e resultados do teste de Tukey entre os grupos para a análise molecular BDNF.
Controle STZ STZ + DMSO 0,75 g/kg
STZ + DMSO 1,5 g/kg
1,11 a 0,67 ab 0,64 b 0,93 ab
A partir da Tabela 21 são expostos os resultados do teste de Tukey para as
médias da quantificação relativa considerando os grupos do estudo. Vê-se que a
média da quantificação relativa do grupo controle, de 1,11, difere significativamente
da média do grupo STZ + DMSO 0,75 g/kg (0,64), enquanto não há evidências
amostrais de diferenças significativas entre os demais grupos. Portanto, as análises
de expressão de BDNF mostraram diferença significativa para o grupo STZ-icv +
DMSO 0,75 g/kg isoladamente, e sem diferenças nos demais grupos experimentais.
Discussão
Nos experimentos do estudo em questão, buscou-se avaliar um tratamento
direcionado ao modelo animal representativo da doença de Alzheimer do tipo
esporádica. Apesar da complexidade da doença, motiva-se um tratamento eficaz
que possa minimizar efeitos da degeneração hipocampal.
A análise de memória de referência em ratos que receberam STZ-icv
refletem o funcionamento de habilidades perceptivas e motoras sem o pensamento
consciente e dependente de áreas motoras (cerebelo e gânglios basais), discutindo-
se real envolvimento do hipocampo nessa tarefa.
A caracterização da memória operacional (de curto prazo), sua conversão
em longo prazo como explícita (não declarativa na espécie animal) tem papel nas
respostas de navegação espacial, e dependente da formação hipocampal e
conexões corticais adjacentes.
Morris em 2013 [20] demostra a codificação conjunta de informações onde
se integra o objeto visual (piscina) ao ambiente espacial para criar uma memória de
representação espacial total e separação de contextos em padrões: semelhantes ou
76
distintos, assim como a conclusão do mesmo padrão associado ao estímulo inicial.
Tal informação segue via específica no hipocampo, iniciada no giro dentado, CA1-
CA3 - place cells, e retornando à CA3.
A capacidade de aprender a antecipar eventos em tarefas repetitivas é
chamada de aprendizagem associativa permitindo flexibilizar estratégias e
sugestões executivas [21]. Dessa forma, os métodos de pesquisa em análise
comportamental experimental apoiam que suas variáveis são buscadas no ambiente
em que o indivíduo se comporta (por exemplo, na busca da plataforma submersa)
[22] modificando o ambiente ou estímulo sobre o comportamento, (por exemplo, na
mudança de pontos de saída do animal testado, ou a mudança do local da
plataforma submersa) e com isso definir o Padrão de Procedimento Operante Livre,
onde o sujeito pode responder livremente sem restrições do experimentador [23].
Os animais de estudo não possuem experiências externas. Estudos de
perspectiva de tempo para comportamento coletivo, segundo Biro e colaboradores
[24] demonstram a tendência coletiva comportamental, com padrões em nível de
grupo, onde pode se definir capacidades adaptativas e cumulativas em inúmeras
espécies vivas, desde microorganismos, plantas, invertebrados e vertebrados
sociais. Denomina-se inteligência de enxame – swarm intelligence, sugerindo redes
de conectividade funcional intrínsecas.
Knezovic e colaboradores [25] estudaram marcadores temporais estruturais
e neuropatológicos do modelo da STZ-icv em roedores por 9 meses. Os resultados
mostraram prejuízo cognitivo predominante no domínio da memória, caracterizados
por perda de neurônios hipocampais CA1-CA3 e, alterações neurofibrilares,
afilamento cortical parietal e de corpo caloso, mais evidentes aos 3 meses da
exposição, com extensão progressiva.
De forma semelhante, em pacientes com demência tipo Alzheimer
prodômica, o comprometimento de redes em conectividade modificam
processamento de funções específicas como atenção e memória episódica.
Também são observados tardiamente o comprometimento motor e memória espacial
segundo Koch e colaboradores [26].
Os resultados dos experimentos do labirinto aquático de Morris para as
avaliações de tarefas de memória de referência, extinção da memória aprendida e
operacional não demonstraram desempenhos mais robustos com a proposta
terapêutica do DMSO. Possivelmente esse resultado seja devido ao período de
77
tempo de tratamento, dose e intervalo de evolução da administração da STZ-icv e
início dos testes comportamentais.
Vale lembrar que roedores podem se deslocar em labirintos de diversas
formas, sem utilizar a memória para o cumprimento das tarefas [27], ou seja,
processos não cognitivos, sendo igualmente importante destacar a janela de tempo
entre a administração da STZ, tratamento com DMSO, e início dos testes
comportamentais.
Nos resultados da memória de referência, os efeitos de interações de grupo,
sessões e tentativas expressam a precisão espacial ao longo do tempo, uma vez
que os animais podem aprender a tarefa mesmo com extensas lesões hipocampais,
porém em uma taxa relativamente menor que animais Controle.
Foi possível observar prejuízos de memória nos grupos STZ, ao passo que o
Controle obteve os melhores desempenhos. Além disso, a STZ induziu
comportamentos relacionados à ansiedade, como a maior velocidade de nado,
sugerindo hiperatividade motora. O DMSO não exerceu nenhum efeito positivo sobre
tais prejuizos.
Estudos de Singh, Kaur, e Sandhir [28] relacionam um novo paradigma na
avaliação da memória espacial e aprendizagem no labirinto aquático: a Dimensão
fractal do caminho aleatório seguido pelos animais, como parâmetro independente e
mais preciso na avaliação de déficits cognitivos em comparação à latência de
escape, trajeto e velocidade.
É possível ainda, relacionar o condicionamento clássico de reflexos
relacionados à estímulos e respostas. Ivan Pavlov, na “psicologia da aprendizagem”,
a define: “conforme o estado do meio ambiente, gerando adaptações do organismo
e exigindo modificações comportamentais” [29].
Davis e colaboradores relacionam que fatores estressantes nos protocolos
de treinamento do labirinto aquático (medo, procedimentos cirúrgico-terapêuticos)
que podem mascarar a verdadeira capacidade cognitiva dos animais [30].
Outro processo amplificado na doença de Alzheimer, a neuroinflamação, foi
caracterizada pela expressão gênica de IL1-β e TNFα como citocinas pró-
inflamatórias.
De Lucca e colaboradores [31] compartilham o papel de neurônios, células
gliais (astrócitos e micróglia) e matriz extra-celular na homeostase da unidade
neurovascular, implicando que, a rotura da barreira hematoencefálica projeta a
78
progressão neuropatológica [32,33]. Ainda assim, limita-se a produção de anticorpos
anti-Aβ na eliminação de oligômeros amilóides [34] e sustenta-se a neuroinflamação
crônica segundo Shaftel e colaboradores [35], associado a recente papel de canais
de aquaporina 4 no trafego glial-linfático comprometido [37,14].
A análise de expressão de genes inflamatórios IL1-β e TNFα no trabalho
presente não se mostraram diferenças estatísticas entre grupos experimentais, mas
nota-se tendências de redução na expressão gênica de IL1-β, TNFα, no grupo
tratamento com DMSO à dose de 1,5 g/kg, podendo se relacionar papel citoprotetor
no ambiente inflamatório induzido da STZ.
Estudos de Mao e colaboradores, [36] demonstram que o acúmulo anormal
de oligômeros amilóides foi reduzido pela ativação de enzimas antioxidantes
mitocondriais (catalase).
O modelo indutor da STZ-icv promove elevações significativas da atividade
específica da catalase (CAT) expressa no tecido hipocampal, conforme estudos de
Sofic [38]. A geração expansiva de peróxido de hidrogênio (H2O2) ativa a
neutralização pela CAT, com capacidade de degradação de até 42.000 moléculas do
substrato por segundo. Nossos resultados não demonstraram variação significativa
da expressão gênica da catalase nos grupos experimentais, observando-se
tendências de neutralização da atividade enzimática na captura de espécies reativas
do estresse oxidativo nos grupos tratamento com DMSO (G3 e G4) através da
menor expressão gênica da CAT.
Na doença de Alzheimer, ocorre também redução dos níveis de BDNF com
modificação de seus transcritos e expressão proteômica afetando plasticidade
sináptica, brotamento dendrítico-axonal e sobrevivência neuronal [39].
A expressão de BDNF em hipocampos de ratos induzidos quimicamente,
melhora o comprometimento cognitivo em aprendizagem e memória, envolvendo via
PI3K – AKT- GSK3β, destacando-se seu potencial efeito protetor na
neuroregeneração da doença de Alzheimer [40]. Sua regulação positiva melhora
plasticidade sináptica e colinérgica, facilitando amadurecimento de brotamento
neuronal, principalmente em estágios iniciais da neurodegeneração [39]. O presente
estudo demonstrou aumento na expressão gênica do BDNF em doses de 1,5 g/kg
(G4) relacionando-se papel neuroprotetor em potencial .
A expressão gênica envolvida com neuroinflamação, IL1-β e TNFα, estresse
oxidativo mitocondrial com CAT, e ativação neurotrófica com BDNF mostram que
79
não houve efeito estatístico no pareamento de grupos. Relacionam-se porém,
tendências de redução da neuroinflamação e neutralização de estresse oxidativo, o
que promove ambiente celular mais favorável em nível molecular, corroborando o
aumento da expressão comparativa do BDNF em animais tratados com o DMSO 1,5
g/kg, sendo estes, efeito parcial sobre a modulação pró-inflamatória, diminuição de
estresse oxidativo mitocondrial e ativação neurotrófica.
A biotecnologia contribui com a busca por moléculas biologicamente ativas,
como exemplo em novas aplicações de inibidores da enzima colinesterase central
[41], imunoterapia para peptídeo β-amilóide e proteína Tau [42], neuroinflamação
[43], aplicações nanotecnológicas [44], fatores neurotróficos [45] e modulação de
receptores de glicação avançada [46}. No entanto, os efeitos sobre a diminuição da
progressão neurodegenerativa ainda são pouco expressivos.
O presente estudo buscou avaliar o efeito do DMSO em nova base
molecular terapêutica no sistema nervoso central, uma vez que suas propriedades
químicas e moleculares podem resgatar funções celulares restritas pelo processo
neurodegenerativo.
Singh [47] define o termo farmacológico - híbrido - para ação compartilhada
molecular de funções, em alvos terapêuticos na doença de Alzheimer, corroborando
conteúdos de Weinreb e colaboradores [48], onde os efeitos neuroprotetores de
agentes híbridos em ações sobre mais de um alvo potencial terapêutico
neurodegenerativo. Farkas [49] propõe o DMSO com características moduladoras e
neuroprotetoras do sistema nervoso central e, em estudos da distribuição do DMSO
em animas de experimentação, Denko [50] demonstra a equivalente distribuição no
sistema nervoso central sem efeitos cumulativos e eliminação em 12 a 36 horas.
Ações na memória espacial, melhora de densidade e plasticidade sináptica
hipocampal, principalmente em estrato CA1 de células piramidais, são elementos da
relevância farmacológica do DMSO em estudos de Penazzi [51] assim como a
inibição da enzima GSK-3β e redução de acúmulos amilóides por Jiang [52].
Propriedades antioxidantes em estudos de Sanmartin-Suarez [53] demonstram a
versatilidade molecular do DMSO aplicada á neurodegeneração.
Dentre as doenças neurodegenerativas conformacionais do tipo
proteinopatias, é possível destacar estudo de Shaked e colaboradores [54],
demonstrando efeitos positivos no uso do DMSO em hamsters infectados com
proteína priônica scrapie (Prp sc) e atenuando os sintomas da doença nos animais
80
infectados [54], reforçando trabalhos de Pruisner [55], na modulação do
enovelamento proteico pelo DMSO.
O presente estudo demonstrou tendências de modulação pró-inflamtória e
do estresse oxidativo mitocondrial, modificando a ativação sequencial reverberativa
neurodegenerativa e promovendo tendências de resgate neurotrófico com o BDNF
através do tratamento com DMSO na dose 1,5 g/ kg.
Conclusões
A neurodegeneração representa um complexo de determinantes ativadores
em etapas de processo sustentado à morte celular irreversível.
O estudo da proposta terapêutica no uso do DMSO no modelo da STZ, não
revelou melhora significativa em testes comportamentais e de memória espacial.
A expressão gênica neuroinflamatória e oxidativa mitocondrial revelaram
tendências de elementos em neuroproteção com tratamento pelo DMSO à 1,5 g/ kg,
onde criou-se o ambiente celular favorável molecular e fisiologicamente,
corroborando com a expressão do BDNF por este mesmo grupo, sendo elemento
significativo na plasticidade sináptica hipocampal e sobrevivência neuronal.
São necessários estudos expandidos na corrente proposta neuroprotetora,
principalmente em doses, tempo e forma de administração, no uso extensivo do
produto, podendo-se assim, intensificar respostas terapêuticas mais robustas e
efetivas.
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CONCLUSÕES GERAIS
A neurodegeneração, representada na doença de Alzheimer, compromete
funções cognitivas principalmente relacionadas à memória explícita sem haver
tratamento curativo.
O modelo da estreptozotocina intracérebroventricular em roedores tem como
alvo direto, a formação hipocampal. Análises em parâmetros comportamentais e de
memória espacial, expressão gênica neuroinflamatória, oxidativa mitocondrial e
neurotrófica nos grupos submetidos a tratamento com o dimetilsulfóxido (DMSO)
desenham o experimento.
Através de características bioquímicas e moleculares versáteis, o DMSO
pode exercer papel neuroprotetor na neurodegeneração da doença de Alzheimer.
Os resultados do estudo não modificaram parâmetros comportamentais e de
memória espacial, e análises de expressão gênica demonstram tendências em
redução neuroinflamatória e de estresse oxidativo mitocondrial, com a minimização
de cascatas neurodegenerativas sustentadas, e proporcionando ambiente de
resgate neurotrófico potencial com o BDNF através do tratamento com DMSO (1,5
g/kg).
Novas inserções de dosagens, tempo e via de administração, podem
acrescentar em resultados favoráveis no tratamento da função neuroprotetora do
DMSO frente à doença progressiva e neurodegenerativa.
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MOLECULAR ANALYSIS OF GENE EXPRESSION IN WISTAR RATS
SUBMITTED TO STREPTZOTOCIN INTRACEREBROVENTRICULAR (STZ-ICV)
AND EXPERIMENTAL TREATMENT WITH DIMETHYLSULFOTOXIDE (DMSO)
Valter Malaguido Climaco; Rebecca Marty Pimentel Machado; Marcia Regina
Pincerati; Ilton Santos da Silva. Positivo University: 5300 Professor Pedro Viriato
Parigot de Souza Street – Campo Comprido – Curitiba - Paraná – Brazil zipcode
81280-330 Phone +55 (41)33173000 Email: ilton.silva@up.edu.br
ABSTRACT
Alzheimer's disease represents the most frequent and prevalent
neurodegenerative process in the adult population related to genetic and
environmental factors, without curative treatment even with current technological
innovations. In this way, it is important to search for therapeutic proposals that
minimize or even interrupt the common neurodegenerative processes of the disease.
Dimethylsulfoxide (DMSO) has great molecular versatility, therefore, a potential
neuroprotective effect. Intracerebroventricular streptozotocin (STZ-icv) induced
neurodegeneration in rodents leads to a neuropathological phenotype similar to
sporadic Alzheimer's disease. The objective of the present study is to investigate the
potential neuroprotective effect of DMSO on memory impairment induced by STZ in
Wistar rats, with molecular analyzes performed by hippocampal extraction through
qPCR investigating the expression profile of genes related to neuroinflammation
(interleukin 1β; IL 1-β, tumor necrosis factor α: TNF-α), reactive species of
mitochondrial oxidative stress (catalase; CAT), and activator of adult neurogenic
99
neurotrophic factor (BDNF), where reduction of neuroinflammation by minimizing the
expression of IL1-β, TNFα, of the mitochondrial oxidative stress with CAT
consumption in the capture of reactive oxygen species, and increased expression of
BDNF at the dose of 1.5 g / kg in the DMSO treatment group, related to cellular
environment favorable to cellular neuroprotection and survival against
neurodegenerative induction.
Keywords: Alzheimer's disease. Dimethylsulfoxide. Streptozocin.
INTRODUCTION
Alzheimer's disease is the most frequent and prevalent neurodegenerative
process common to aging, accounting for 6% of the population over 65 years and
has no curative treatment [1]. Clinically, it compromises explicit memory functions
dependent on hippocampal formation, in addition to other cognitive impairments [2].
It extends to the medial, prefrontal and parietal temporal cortex with the
deposition of cytoplasmic neurotoxic amyloid protein in beta-conformation (Aβ 42),
and neuronal accumulation of microtubule-associated protein (Tau) in the
hyperphosphorylated state [3-5]. There is impaired glucose metabolism and insulin
signaling, where it activates the enzyme GSK-3β, increased production of
proinflammatory cytokines, blood-brain barrier opening and mitochondrial oxidative
stress [6]. The irregularity of the protein conformation promotes insolubility and
aggregation, with consequent loss of signaling of the autophagic system, folding
proteins, chaperones [7] and expression of neurotrophins [8].
100
Intracerebroventricular (icv) streptozotocin (STZ) induces a neuronal state
equivalent to Alzheimer's disease. Its mechanism of action involves insulin metabolic
blockade and glucose transport via GLUT 1 2 3 receptors. In addition, biochemically
facilitates amyloid formation (Aβ 42) and hyperphosphorylation of the TAU protein [9],
which contributes to the reproduction of the anatomopathological characteristics of
the disease. Experimentally, it is possible to observe memory impairments in animals
that received STZ-icv in tasks of the Morris water maze, because to fulfill tasks of
spatial memory, the integrity of the hippocampal formation is necessary [10].
Molecular analyzes of the expression of genes of pathological activating
cycles of neuroinflammation (IL-1β, TNF-α), mitochondrial oxidative stress (CAT),
neurotrophic factor derived from encephalon (BDNF) [5,11] are elements of
reverberant and self-sustained processes of the disease. DMSO therapy
demonstrates versatility in interaction with molecular sharing with water [12] and
interconversion of the compound (Water-DMSO) in equilibrium [7]. It acts on the
surface hydration of proteins, modifying H + bridges, and facilitates action of folding
helper proteins, chaperones. In addition, it reduces inflammatory activation and
promotes the capture of reactive species of the mitochondrial cycle possessing
antioxidant action [13,14].
Studies in rodents of Jacob and de la Torre [15] have demonstrated efficacy
of venous DMSO use at 40% concentration in spinal cord injury and acute carotid
vascular occlusion, as well as Penazzi et al. [16], in a study with chronic and oral to
1% of DMSO, positively modulating budding of pyramidal hippocampal dendritic
spines. Another study depicts the competitive inhibition of the cholinesterase enzyme
in vitro by Kumar with satisfactory results [17].
101
The objective of the present study was to investigate the potential
neuroprotective effect of DMSO on memory impairment induced by STZ in wistar
rats.
MATERIAL AND METHODS
Animals
Thirty-two male Wistar rats aged 90 days old were used. The animals had free
access to food and water. Environmental conditions include a light/dark cycle of 12h
each and a temperature of 21° C (69,8° F).
Stereotactic surgery for administration of STZ and treatment with DMSO
STZ-icv (3 mg/kg) is administered through stereotactic surgery in coordinates
according to Paxinos and Watson [18]. For group 1 (control), buffered solution is
injected into the same volume used for STZ administration.
Following administration of STZ (24h), animals in groups 3 and 4 received
doses of DMSO intraperitoneally for 5 consecutive days. The control group received
the same doses and volumes of 0.9% saline solution via i.p. Thus, four distinct
groups were formed:
- Group (1) saline control: Animais that received a buffer solution citrate (at the same
time used to dilute to STZ) via icv e saline solution 0.9% by intraperitoneal route;
- Group (2) STZ: animals that receive STZ via icv and saline 0.9% i.p;
- Group (3) STZ + DMSO 0.75g/Kg: group that receives STZ via icv e DMSO via i.p.
Concentration from 0.75g/Kg to 40%, diluted in 0.9% saline;
102
- Group (4) STZ + DMSO 1,5g/Kg: group that receives STZ via icv e DMSO via i.p.
Concentration from 1.5g/Kg to 40%, diluted in 0.9% saline.
The choice of doses and procedures were based on the description of
Bardutzky J et al (2005) and Jacob SW, dela Torre JC (2009).
RNA extraction and expression analysis of interleukin 1-β (IL-1β), catalase
(CAT), tumor necrosis factor alpha (TNFα) and brain derived neurotrophic
factor (BDNF)
The animals were euthanized by constant inhalation of isoflurane and the
dissected brains for bilateral hippocampal withdrawal. Afterwards, the samples were
stored in a preservative solution (RNA later - Thermo Scientific) at a temperature of -
20º C (-4° F). For extraction of RNA the extractor kit - SV total RNA Isolation Kit
(Promega) was used, according to manufacturer's instructions. After extraction, the
RNA was quantified and its purity was evaluated by spectrophotometry.
The extraction of 1 microgram of total RNA was used for the cDNA synthesis,
with the enzyme reverse transcriptase with High Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit (Applied biosystems). Subsequently, the cDNA was submitted to the
quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) to evaluate the expression profile
of the CAT, IL-1β, TNFα and BDNF genes in the hippocampus of the different
groups.
The fluorescence system used for the amplification was the Power Up
SYBR-Green qPCR Master mix (Thermofisher) fluorophore according to the
manufacturer's instructions and reactions in the Step One Plus thermocycler (Life
Technologies) to determine the levels of mRNA expression in the different groups.
103
Data analysis
The values obtained in the relative quantification of the genes under study
were submitted to normality tests and Variance Analysis for Repeated Measurements
(ANOVA) tests were used. The molecular parameters were considered as dependent
variables and the experimental groups as independent variables with a significance
level set at 5% and Tukey's post hoc multiple comparison test to identify the origins
of the differences.
RESULTS
Evaluation of gene expression by real-time PCR
Specific gene signatures establish a self-sustaining system of
neurodegeneration. Hyperexpressed proinflammatory activation and oxidative stress,
hypoexpressed neurotrophic transcripts mark the disease at the molecular level.
Neutralizing process-defining steps is critical in curative therapy.
Analysis of IL-1β gene expression
104
Figure 1 - Boxplots of the variable of interest IL1-β, by group. - There is a tendency of reduction in the expression of IL1-β in the quantitative G4 group and relatively compared to the STZ groups (G2, G3,
and G4).
The results of the variables averages of interest for each group in relation to
the molecular analyzes of IL1-β demonstrate the animals of the control group and
STZ + DMSO 1.5 g/kg, presenting, in general, lower relative quantification values to
the other groups evaluated; whereas the STZ and STZ + DMSO groups of 0.75 g/kg
had the highest values, and for the latter group, the values were less dispersed.
105
Figure 2 – Mean (and standard error) bar chart of the IL1-β interest variable, per group. - There is a tendency to reduce the gene expression of IL1-β in G4.
The main effect of the groups was not significant (F3,16 = 2,039, p = 0,149),
at the 5% level of significance, indicating that the means of the variable did not differ
significantly between the groups.
106
Analysis of gene expression of tumor necrosis factor α (TNFα)
Figure 3 – Boxplots of relative quantification, per group, for molecular TNFα analysis. - There is a tendency to reduce TNFα expression in G4 compared to STZ groups (G2, G3, G4).
The graphical presentation of the relative quantification results for each group
in relation to the molecular analyzes of TNF demonstrates the animals of the control
group with lower values in relation to the other groups evaluated, whereas the groups
STZ and STZ + DMSO 0.75 g/kg present the highest values, and for the latter group,
the values are less dispersed.
107
Figure 4 – Average (and standard error) bar chart of the relative quantification, per group, for
molecular analysis TNFα.- There is a trend of comparative reduction to STZ groups in expression of
TNFα in G4.
The results of the tests to compare the relative quantification (response
variables) between the groups (independent variable) show that the main effect of
the groups was not significant (F3,16 = 2,366, p = 0,109), at the 5% level of
significance, indicating that the means do not differ significantly between the
experimental groups.
Analysis of Gene Expression of Catalase (CAT)
108
Figure 5 – Boxplots of relative quantification, per group, for CAT molecular analysis. - There is a tendency to reduce CAT gene expression in the DMSO treatment groups (G3 and G4).
The graphic demonstration of the results of the relative quantification for each
group in relation to the molecular analyzes of CAT relates the animals of the STZ +
DMSO group 1.5 g/kg, which generally have lower values in relation to the other
groups evaluated, followed by the animals of the STZ + DMSO group 0.75 g/kg. On
the other hand, it is visually confirmed that the STZ and control groups present the
highest values, and for these groups, the values are more dispersed.
109
Figure 6 – Average (and standard error) bar graph of relative quantification per group for CAT analysis. There is a tendency for CAT gene expression reduction in the DMSO (G3 and G4) treatment
groups.
It is seen that the main effect of the groups was not significant (𝐹3,15 = 1,361,
p = 0,293), at the 5% level of significance, indicating that the means of relative
quantification did not differ significantly between the experimental groups.
Analysis of Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF)
110
Figure 7 – Boxplots of relative quantification, per group, for molecular analysis BDNF. - There is a tendency for increased expression of BDNF in the treatment group with DMSO (G4)
The results of the relative quantification for each group in relation to the
molecular analyzes of BDNF graphically show, in the animals of the control group, in
general, higher values in relation to the other groups evaluated, whereas the groups
STZ and STZ + DMSO 0,75 g/kg had the lowest values, and for the latter group, the
values were more dispersed and the main effect of the groups was significant (F3,16 =
3,477, p = 0,041), at the 5% level of significance, indicating that the means differ
significantly in the STZ + DMSO group 0.75 g/kg (0.64), alone, and without
differences in the other experimental groups.
111
Figure 8 – Average (and standard error) bar graph of relative quantification, per group, for molecular BDNF analysis. - There is an upward trend in BDNF gene expression in the DMSO (G4) treatment
group.
It is noted that the experimental group DMSO 1.5 g/kg conducts gene
expression of BDNF equivalently to the control group, being thus an element of
interest in the therapeutic neuroprotective proposal.
DISCUSSION
Knezovic et al. [19] studied structural and neuropathological temporal
markers of the STZ-icv model in rodents for 9 months. The results showed a
predominant cognitive impairment in the memory domain, characterized by loss of
CA1-CA3 hippocampal neurons and neurofibrillary changes, parietal cortical and
corpus callosum, more evident at 3 months of exposure, with progressive extension.
Similarly, in patients with prodromal Alzheimer's dementia, compromised
connectivity networks modify processing of specific functions such as attention and
112
episodic memory. Motor impairment and spatial memory are also observed late
according to Koch and co-workers [20].
Neuroinflammation, as an amplified process in Alzheimer's disease, was
characterized by the gene expression of IL1-β and TNFα as proinflammatory
cytokines.
De Lucca et al. [21] share the role of neurons, glial cells (astrocytes and
microglia) and extracellular matrix in the homeostasis of the neurovascular unit,
implying that rupture of the blood-brain barrier projects neuropathological progression
[22] and [23]. Nevertheless, the production of anti-Aβ antibodies in the elimination of
amyloid oligomers [24] is limited, and chronic neuroinflammation is supported by
Shaftel et al. [25], associated with the recent role of aquaporin 4 channels in glial-
lymphatic traffic compromised [14,26].
Amyloid deposits and the hyperphosphorylated state of Tau protein are
factors of neuroinflammation in neurodegeneration [1] with microglial and astrocytic
activation, and promotion of secretion of proinflammatory cytokines type IL-1β, TNFα,
IL-6, Infγ, membrane metalloproteases, and NFK-β nuclear transcriptional factor
contributing to the systemic lymphocyte recruitment process via type II
histocompatibility complex (MHC II) as well as the abnormal processing of micro-
RNAs (mir155; mir 204) [1,27].
The inflammatory activation evolves over the immunological constituents with
glycolytic enzyme blockade, mitochondrial impairment, signaling of cell survival
pathways and loss of synaptic axonal accumulation [27-29].
Analysis of IL1-β and TNFα inflammatory gene expression in the present
study did not show statistical differences between experimental groups, but there
was a trend of reduction in the gene expression of IL1-β, TNFα, in the DMSO
113
treatment group at the dose of 1,5 g/kg, cytoprotective role may be related to the STZ
induced inflammatory environment..
Studies by Mao et al. [30] show that the abnormal accumulation of amyloid
oligomers was reduced by the activation of mitochondrial antioxidant enzymes
(catalase).
The inducer model of STZ-icv promotes significant elevations of specific
activity of catalase (CAT) expressed in hippocampal tissue, according to Sofic
studies [31]. The expansive generation of hydrogen peroxide (H2O2) activates the
neutralization by CAT, with the degradation capacity of up to 42,000 substrate
molecules per second.
Neurotoxic changes converge to the permeabilization of mitochondrial
membranes, associated with intracellular calcium influx, with involvement of oxidative
phosphorylation in the respiratory chain and overexpression of reactive oxygen and
nitrogen species [32].
These elements favor the flow of electrons from NADH to molecular oxygen in
the production of ATP, reducing antioxidant and neuroprotective elements such as
glutathione peroxidase (GSH-PX), catalase (CAT), and superoxide dismutase (SOD)
[33] and are consumed the cellular energy reserve with insufficient pathway
transduction in plasticity, polarization and immunomodulation.
Our results did not show significant variation of the catalase gene expression
in the experimental groups, and it was observed tendencies of neutralization of the
enzymatic activity in the capture of reactive species of oxidative stress in the DMSO
treatment groups (G3 and G4) through the lower CAT expression.
114
In Alzheimer's disease, there is also a reduction of BDNF levels with
modification of their transcripts and proteomic expression affecting synaptic plasticity,
dendritic-axonal budding and neuronal survival [34].
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is an important member of the family
of neurotrophins (growth factors) activated via specific receptors, tropomyosin kinase
(TrkB) and p75.
The reduction of BDNF signaling compromises spatial memory, plasticity and
hippocampal synaptic maturation, neurogenesis, and long-term potentiation (LTP) in
the formation of dendritic spines [35], essential factors for the consolidation of explicit
memory.
The aggregated amyloid oligomers in Alzheimer's disease negatively
modulate p75 and TrkB receptors, where PI3K-GSK3β-AKT signaling pathways of
neuronal survival, microtubule rupture with Tau (Thr 231) hyperphosphorylation, and
compromise protein expression are reduced plasticity [36-38].
BDNF expression in chemically induced rat hippocampus improves cognitive
impairment in learning and memory, involving PI3K-AKT-GSK3β pathway, with a
potential protective effect on the neurooregeneration of Alzheimer's disease [36]. Its
positive regulation improves synaptic and cholinergic plasticity, facilitating maturation
of neuronal budding, especially in the early stages of neurodegeneration [34]. The
present study demonstrated an increase in the gene expression of BDNF in doses of
1.5 g/kg (G4) in relation to potential neuroprotective role.
Gene expression involved with neuroinflammation, IL1-β and TNFα,
mitochondrial oxidative stress with CAT, and neurotrophic activation with BDNF show
that there was no statistical effect on group pairing. Neuroinflammation reduction
tendencies and neutralization of oxidative stress, however, promotes a more
115
favorable cellular environment at the molecular level, corroborating the increase in
the comparative expression of BDNF in animals treated with DMSO 1.5 g/kg, partial
effect on proinflammatory modulation, reduction of mitochondrial oxidative stress and
neurotrophic activation.
Biotechnology contributes to the search for biologically active molecules, as
an example in new applications of central cholinesterase inhibitors [39],
immunotherapy for β-amyloid peptide and Tau protein [40], neuroinflammation [41],
nanotechnological applications [42], neurotrophic factors [43] and modulation of
advanced glycation receptors [44]. However, the effects on decreased
neurodegenerative progression are still not very expressive.
The present study aimed to evaluate the effect of DMSO on a new molecular
therapeutic base in the central nervous system, since its chemical and molecular
properties can rescue restricted cellular functions by the neurodegenerative process.
Singh [45] defines the pharmacological-hybrid term for shared molecular
action functions in therapeutic targets in Alzheimer's disease, corroborating content
of Weinreb et al. [46], where the neuroprotective effects of hybrid agents on actions
on more than one target neurodegenerative therapeutic potential. Farkas [47]
proposes DMSO with modulatory and neuroprotective characteristics of the central
nervous system and, in studies of the distribution of DMSO in experimental animals,
Denko [48] demonstrates the equivalent distribution in the central nervous system
without cumulative effects and elimination in 12 to 36 hours.
Actions in spatial memory, hippocampal synaptic density enhancement and
synaptic plasticity, especially in the CA1 stratum of pyramidal cells, are elements of
the pharmacological relevance of DMSO in Penazzi studies [16] as well as the
inhibition of the GSK-3β enzyme and reduction of amyloid accumulations by Jiang
116
[49]. Antioxidant properties in studies of Sanmartin-Suarez [50] demonstrate the
molecular versatility of DMSO applied to neurodegeneration.
Among the conformational neurodegenerative diseases of the proteinopathic
type, it is possible to highlight a study by Shaked et al. [51] demonstrating positive
effects on the use of DMSO in hamsters infected with prion protein scrapie (Prp sc)
and attenuating disease symptoms in infected animals [51] , reinforcing Pruisner's
work [52] in the modulation of protein folding by DMSO.
The present study demonstrated trends in pro-inflammatory modulation and
mitochondrial oxidative stress, modifying sequential neurodegenerative reverberation
activation and promoting neurotrophic rescue tendencies with BDNF by treatment
with DMSO at the dose of 1.5 g/kg.
Conclusions
Neurodegeneration represents a complex of activating determinants in
process stages sustained at irreversible cell death.
The study of the therapeutic proposal in the use of DMSO in the STZ model
did not reveal a significant improvement in behavioral and spatial memory tests.
The neuroinflammatory and oxidative mitochondrial gene expression
revealed tendencies of elements in neuroprotection with treatment by DMSO at 1.5
g/kg, where the molecular environment was created favorable and physiologically,
corroborating with the expression of BDNF by this same group, being element
significant effect on hippocampal synaptic plasticity and neuronal survival.
Further studies are needed in the current neuroprotective proposal,
especially in doses, time and administration, in the extensive use of the product, thus
being able to intensify more robust and effective therapeutic responses.
117
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124
FIGURES
Figure 1 – Boxplots of the variable of interest IL1β, per group. ................................. 07
Figure 2 – Average (and standard error) bar chart of the IL1-β variable of interest,
per group. ................................................................................................................... 08
Figure 3 – Boxplots of relative quantification, per group, for molecular TNF analysis09
Figure 4 – Average (and standard error) bar graph of relative quantification, per
group, for TNF molecular analysis ............................................................................. 10
Figure 5 – Boxplots of relative quantification, per group, for CAT molecular analysis11
Figure 6 – Average (and standard error) bar graph of relative quantification, per
group, for CAT molecular analysis ............................................................................. 12
Figure 7 – Boxplots of the relative quantification, per group, for molecular analysis
BDNF .......................................................................................................................... 13
Figure 8 – Average (and standard error) bar graph of the relative quantification, by
group, for molecular analysis BDNF ........................................................................... 14
125
GENERAL CONCLUSIONS
Neurodegeneration, represented in Alzheimer's disease, compromises
cognitive functions mainly related to explicit memory without curative treatment.
The intracereventricular streptozotocin model in rodents has a direct target,
hippocampal formation. Analyzes in behavioral and spatial memory parameters,
neuroinflammatory gene expression, mitochondrial oxidative and neurotrophic gene
in the groups submitted to treatment with dimethylsulfoxide (DMSO) design the
experiment.
Through versatile biochemical and molecular characteristics, DMSO may
play a neuroprotective role in the neurodegeneration of Alzheimer's disease.
The results of the study did not modify behavioral and spatial memory
parameters, and analyzes of gene expression demonstrate trends in
neuroinflammatory reduction and mitochondrial oxidative stress, with the
minimization of sustained neurodegenerative cascades, and providing potential
neurotrophic rescue environment with BDNF through treatment with DMSO (1.5
g/kg).
New dosage insertions, time and route of administration may add to
favorable results in the treatment of DMSO's neuroprotective function against
progressive and neurodegenerative disease.
126
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Organization and style of presentation
• Manuscripts must be written in US English. Authors whose native language is not English are recommended to seek the advice of a native English speaker or English language service before submitting their manuscripts. A language or editing service that we recommend is PeerWith. • Nomenclature for amyloids should follow the 2014 guidelines of the Nomenclature Committee of the International Society of Amyloidosis (Amyloid 21, 221–224, 2014), e.g., amyloid-β (Aβ) and amyloid-β protein precursor (AβPP). Also preferred is Aβ42and sAβPPα. • Manuscripts should be double spaced throughout with wide margins (2.5 cm or 1 in), including the abstract and references. Every page of the manuscript, including the title page, references, tables, etc., should include a page number centered at the bottom. Do not number headings or subheadings (use all caps, italics, then underline). Extensivefootnotesshouldbeavoided. • There are no page or word limits for Research Reports but manuscripts over 10,000 words (Introduction through Discussion) should be approved by the Editor-in-Chief before submission. • Manuscripts should be organized in the following order with headings and subheadings typed on a separate line, without indentation. Titlepage • Title (should be clear, descriptive, concise, and avoid the use of abbreviations) • Full name(s) of author(s) • Full affiliation(s). Delineate affiliations with lowercase letters. • Present address of author(s), if different from affiliation • Running title (45 characters or less, including spaces) • Complete correspondence address, including telephone number and e-mail address Authorship To be considered as an author of an article, the following criteria must be met:
• Substantial contributions to the conception or design of the work; or the acquisition, analysis, or interpretation of data for the work; AND • Drafting the work or revising it critically for important intellectual content; AND • Final approval of the version to be published; AND • Agreement to be accountable for all aspects of the work in ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.
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When submitting the manuscript, the author listing and order should be final. If any addition, deletion, or rearrangement of author names in the authorship list does need to be made after submission, this can be done only before acceptance and with the Editor’s approval. To request such a change, the Editor must receive the following from the corresponding author: (1) the reason for the change in author list and (2) written confirmation from all authors, including the affected author, that they agree with the addition, removal, or rearrangement. Only in exceptional circumstances will the Editor consider the addition, deletion, or rearrangement of authors after the manuscript has been accepted. While the Editor considers the request, publication of the manuscript will be suspended. If the manuscript has already been published in an issue, any requests approved by the Editor will result in an Erratum. Please contact the Managing Editor (editorial@j-alz.com) for more information. Abstract andKeywords • The abstract should be clear, descriptive, self-explanatory, and no longer than 250 words. • If a structured abstract is desired, the following must be included: Background, Objective, Methods, Results, and Conclusion. • Do not include references in the abstract. • Include a list of 4-10 keywords. These keywords should be terms from the MeSH database. • Note that ALL articles (except book reviews and letters to the editor) must include an abstract. Introduction Provide enough information to put your work into context. Be concise. Clearly address the following points:
• What information is already available? • What is the rationale or reason for your research? • What problem(s) does it address? Do not include a comprehensive literature review of your research. End the Introduction by clearly stating the aims of your study.
Materials and Methods This section should be well structured and detailed enough for others to be able to reproduce your experiments. Use clear sub-headings throughout. Start by describing the materials use, the supplier source, including any relevant catalog information, and supplier location. Use references appropriately to refer to published protocols or methodology. Do not repeat a detailed description of an already-published method or protocol.
Results
This section should present the results and summarize the findings of your study. Do not provide any data in great detail. If you need to include additional detailed data, do so in supplementary files submitted with the paper. Consider providing a one-
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sentence summary at the beginning of each paragraph in the Results section, if you think that this would help the reader in understanding your findings.
Discussion Begin this section with a brief summary of the main findings. Ensure that you answer all the questions posed in the Introduction. Mention both the strengths and the limitations for your study, as well as applications and implications of your findings. Compare these to other published findings.
Acknowledgments (including sources of support) Include individuals or companies which have assisted with your study, including advisors, funding sources, administrative support and suppliers who may have donated or given materials used in the study.
Conflict of Interest/Disclosure Statement If there is no conflict of interest to declare, do still include this section and insert "The authors have no conflict of interest to report". If the article is accepted, this section will be replaced by a link to the online disclosures which must be completed by all authors. See our policy on Financial Disclosure for more information. References (Download the EndNote style from EndNote (http://endnote.com/downloads/style/journal-alzheimers-disease). Reference Manager style is available here. A .csl file is available here.) 1. Place citations as numbers in square brackets in the text in order of appearance. Each citation should be to one manuscript only. All publications cited in the text should be presented in a list of references following the text of the manuscript. Only articles published or accepted for publication should be listed in the reference list. Submitted articles can be listed in the text as (Author(s), unpublished data). 2. All authors should be listed in the reference list. 3. Please include doi numbers for "in press" articles if available. 4. References should be listed in the order of appearance in the following style: [1] Alzheimer Research Forum, Drugs in Clinical Trials: AAB-001, http://www.alzforum.org/drg/drc/detail.asp?id=101, Last updated May 29, 2007, Accessed on January 29, 2008. [2] Smith MA (2006) Oxidative stress and iron imbalance in Alzheimer disease: how rust became the fuss! In Alzheimer's Disease: A Century of Scientific and Clinical Research, Perry G, Avila J, Kinoshita J, Smith MA, eds. IOS Press, Amsterdam, pp. 305-308. [3] Hara H, Monsonego A, Yuasa K, Adachi K, Xiao X, Takeda S, Takahashi K, Weiner HL, Tabira T (2004) Development of a safe oral Abeta vaccine using recombinant adeno-associated virus vector for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis 6, 483-488. [4] Paxinos G, Watson C (1986) The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press, Sydney. [5] Zhu X, Perry G, Smith MA (2004) Two hits and you're out? A novel mechanistic hypothesis of Alzheimer disease, Alzheimer Research
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Forum, http://www.alzforum.org/res/adh/cur/zhu/default.asp, Posted 23 October 2004, Accessed 29 January 2008. Datasetsand Data Articles • All datasets and data articles referenced in your manuscript should be cited in the main reference list of your article (not in a separate box or in the article text). Tables • Number according to their sequence in the text. The text should include references to all tables. • Provide each table on a separate page of the manuscript after the references. • Include a brief and self-explanatory title with any explanations essential to the understanding of the table given in footnotes at the bottom of the table. • Vertical lines should not be used to separate columns. Leave some extra space between the columns instead. • Citations in the tables should be numbered and included in the Reference list. Figure Legends/Figures • Number the figures according to their sequence in the text. The text should include references to all figures. • Each figure should be provided on a separate page, not included in the text. • Figures should preferably be formatted in TIF or EPS format. JPG isalsoacceptable. • Composite figures MUST be preassembled. • Figures should be designed with the format of JAD in mind. They should be of such a size as to allow a reduction of 50%. • Line art should have a minimum resolution of 1200 dpi and be saved as an EPS or TIF. • Do not use faint lines and/or lettering and check that all lines and lettering within the figures are legible at the final size. • All lines should be at least 0.1 mm (0.3 pt) wide. • Vector graphics containing fonts must have the fonts embedded in the files. • Grayscale figures (including photos) should have a minimum resolution of 300 dpi, or 600 dpi for combination art (lettering and images) and be saved as a TIF. • Figures should be cropped to include the figure only (no blank space). • Do not save figures as JPG; this format may lose information in the publishing process. • Do not use figures taken from the Internet; the resolution will be toco low for printing. • Do not use color in your figures if they are to be printed in black & white, as this will reduce the print quality (note that in software often the default is color; this can be changed in the settings). • For figures to be printed in color, please send a CMYK encoded EPS or TIF. • On figures where a scale is needed, use bar scales rather than numerical ones, i.e., do not use scales of the type 1:10,000. This avoids problems if the figure needs to be reduced. • Each figure should have a self-explanatory caption, which should be typed separately from the figure in the manuscript. • Photographs are only acceptable if they have good contrast and intensity. • Color figures will be published online at no charge.
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• Costs for color figures in the print version of the journal are as follows: 1 figure - 650 euro; 2 figures - 900 euro; 3 figures - 1050 euro; 4 figures - 1200 euro; 5 figures - 1350 euro. Cost for each additional color figure will be 150 euro. Unless the color printing charge is paid, color figures will be automatically adjusted to gray-scale in print. You may opt to send in both black/white figures for print, and color figures for the online PDF (please adjust the figure legend appropriately). Supplementary Material Supplementary material is peer-reviewed material directly relevant to the conclusion of a paper that cannot be included in the printed version for reasons of space or medium (for example, movie clips or sound files). The supplement will be available for download from the publisher's content library site at the time of publication and will be made available in the format in which it was provided.
Supplementary material should be included at the end of the main manuscript at the time of submission. In the case of sound/movie files, these can be submitted separately to the Managing Editor (editorial@j-alz.com) at the time of submission. Supplementary tables and figures must have a separate numbering system from that used for tables and figures that appear in the print version of the paper (the first figure displayed should be labeled "Supplementary Figure 1", the first table "Supplementary Table 1", and so on). References should also be cited in supplements started with [1] and listed separately. Supplementary files are limited to 10MB, except videos which can be up to 25MB.
Supplementary material for Short Communications is limited to 500 words and 1 table or figure.
Reviews Reviews should be authoritative and topical and provide comprehensive and balanced coverage of a timely and/or controversial issue. Reviews should be prepared as detailed above for a Research Report, omitting Introduction through Discussion, and include a conclusion. An abstract must also be included. The length of the review article is at the discretion of the author but should be within reasonable limits. The Editor-in-Chief can be consulted regarding reviews of unusual length. Revisions Revisions should be returned within two months of receiving a decision. Authors needing more time should email the Editor-in-Chief for an extension. When submitting a revised manuscript, please indicate your revisions in the text (either in revision mode or by highlighting) and provide a point-by-point response to the reviews at the beginning of your manuscript. Also include your previous manuscript number in your cover letter.
If you choose not to resubmit to JAD after receiving a decision, please inform the editorial office (editorial@j-alz.com) that you wish to withdrawn your manuscript from further consideration. Short Communications A short communication is an article of original scholarship of unusual interest of less than 2000 words (Introduction through Discussion). An abstract of 100 words or less should be included with no subdivison of the abstract into sections. References should be formatted as above. A total of three tables and/or
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figures are allowed. Submissions that exceed the word or figure/table limits will be considered a Research Report. Supplementary Material for Short Communications is limited to 500 words and 1 table or figure. Hypotheses A hypothesis article should be a balanced and insightful consideration of a topic with novel hypotheses well presented and supported. The article should be prepared as a Research Report but without Methods or Results sections. An abstract should also be included. Book Reviews Book reviews should be 750 words or less and without sections. While most reviews are commissioned, suggestions can be proposed to the Editor-in-Chief.
Letters to the Editor Authors can submit comments of 1000 words or less concerning prior articles published in JAD to the Editor-in-Chief through the Editorial Office (editorial@j-alz.com) for possible inclusion at our online site as a Letter to the Editor. Letters will be shared with the authors of the original article for possible response prior to posting. Letters are not included in the published version of JAD nor are indexed in PubMed. Commentaries Commentaries are usually commissioned and of at least 1000 words with a short abstract and no other subdivisions.
Ethics Review The goal of an Ethics Review is to address ethical issues that alter progress in Alzheimer’s disease research, clinical practice, and policy. Ultimately the aim is to highlight and target unresolved issues where failure to act or resolve disagreements leads to bottlenecks in productivity in research, policy, and clinical services. Ethics Review is slightly different from a JAD typical review in that that the topics and presentation are balanced but controversial so that they would likely elicit Ethics Responses. Ethics Responses from multiple disciplines and perspectives are encouraged. Whereas addressing controversial topics is encouraged, reviews should focus on constructively moving debates forward to accelerate progress.
Features of an effective an Ethics Review are as follows:
1. Clearly identify points of disagreement and agreement in the field noting where empirical data are lacking or present that could resolve disagreements. 2. Highlight current empirical findings that are relevant to resolving controversial topics in novel ways with productive cross disciplinary applications. 3. Identify novel applications from fields not typically related to Alzheimer’s research and care which could enhance implementation and ethics. The manuscripts should be consistent with the current standards for the Journal of Alzheimer’s Disease and the Neuroscience Peer Review Consortium. As with other JAD reviews, submissions should be authoritative and topical and provide comprehensive and balanced coverage of a timely and/or controversial issue. Reviews should be prepared as detailed above for a Research Report, omitting
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Introduction through Discussion, and include a conclusion. An abstract must also be included. Ethics Response The purpose of the Ethics Response is to engage interdisciplinary constructive interaction between the author(s) of the Ethics Review and an author who wishes to provide balance and perspective. Authors of an Ethics Response should provide substantive elaboration and references. There should be a title and the number of words can range between 750 to 1500, with no more than 10 citations (reference limit will be less strictly enforced). An abstract should also be included.
The Ethics Review will be distributed and responses will be requested. Potential authors should give a brief synopsis of their response in no more than 4 sentences by the target proposal date. These proposals will be reviewed and if accepted they will be allowed to write an Ethics Response in time for that second deadline. Acceptance of a proposal is no guarantee that the Ethics Response is accepted. The format of the Ethics Responses will be the same as for a Commentary. Kudos Authors of published articles (non-prepress, final articles) will be contacted by Kudos. Kudos is a service that helps researchers maximize the impact and visibility of their research. It allows authors to enrich their articles with lay metadata, add links to related materials and promote their articles through the Kudos system to a wider public. Authors will receive no more than three emails: one invitation and a maximum of two reminders to register for the service and link the published article to their profile. Using and registering for Kudos remains entirely optional. For more information, please have a look at our authors section.
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