elisabeth huguet institut de recherche sur la biologie de l’insecte
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Elisabeth HuguetInstitut de Recherche sur la Biologie de l’Insecte
Cours M2 Recherche Infectiologie cellulaire et moléculaire, Vaccinologie UES3-1 Santé Publique
Septembre 2008
Université F. Rabelais, ToursUMR CNRS 6035
France
La double vie d’un virus fascinant impliqué dans des interactions
hôtes-parasites chez les insectes
Cotesia congregata parasite la chenille Manduca sexta
Cotesia congregata
(Guêpe Braconidae)
QuickTime™ et undécompresseur TIFF (non compressé)
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Conséquences du parasitisme
X
X
XX
Arrêt du développementImmunosuppression
XX
Manduca sexta
Cotesia congregata
(Guêpe Braconidae)
Implication d’un troisième partenaire ?
X
X
XX
Arrêt du développementImmunosuppression
Manduca sexta
Cotesia congregatabracovirus
Oeufs de guêpe + Virus
(Beckage et al,1994) (Edson et al, 1981)
Le virus est indispensable à la réussite parasitaire
Oeufs de guêpe lavés
(sans virus)
Oeufs de guêpe + Virus +
psoralène
Blocage expression virus
Le virus existe sous deux formes …
1. Une forme virale « libre » constituée de multiples cercles d’ADN double brin
Virus DNAMW
FIGE
2.5 kb
7.5 kb
5 kb
10 kb
25 kb
20 kb
15 kb
40 kb 35 kb 30 kb
45 kb
Cette forme est présente en large excès dans les ovaires des femelles guêpes
Le virus existe sous deux formes …
Sonde ADN viral « EP1 »Signal non attendu !
5 kb
QuickTime™ and aTIFF (Uncompressed) decompressor
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Sonde ADN viral « EP1 »Taille attendue 5 kb
ADN guêpe
Le virus existe sous deux formes …
1. Une forme virale linéaire intégrée au génome de la guêpe
PV4 PV10EP1
1 2 3 4 55 7 8 106 9
Belle et al., 2002
Expériences d’hybridations in situ sur chromosomes de guêpes
Le virus existe sous deux formes …
Transmission verticale à la descendance
Réplication
Peu d’expression des gènes viraux
Pas d’intégration dans le génome
PAS de réplication
Expression forte des gènes viraux
Dans la guêpe :
Dans la chenille :
Réplication virale
55
Expression des gènes virauxProduction de protéines virales
Oviposition
Injection de virus
Dérégulation de la physiologie de l’hôteSuccès parasitaire de la guêpe
Cotesia congregata bracovirus est indispensable à la réussite parasitaire de la guêpe
Cellules ovariennes de C. congregata
Production des cercles viraux
Manduca sexta
Injection des particules
virales
Succès du parasitisme
Expression des gènes viraux
Alteration du developpement Alteration de l’immunité
Protéines de capsides
Formation virales
Génome intégré(chromosome 5)
REPLICATION
& MORPHOGENESE
VIRALES EXPRESSION
DES GENES
DE VIRULENCE
Cycle du bracovirus de Cotesia congregata
Symbioses : mutualisme/parasitisme
Virus qui joue un rôle central
Association mutualiste Avec une guêpe
Association parasitaire Avec une chenille
Sans le virus la guêpe ne peut pas assurer sa descendance
Sans la guêpe le virus ne peut pas se répliquer et se transmettre : virus ayant perdu son autonomie
Associations virus-guêpes
Bracovirus
Ichnovirus
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> 17000 espèces de guêpes Braconidae
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> 14000 espèces de guêpes Ichneumonidae
Ichneumonoidae
Ichneumonidae
Braconidae
35 sous familles qui ne possèdent
pas de PDV
34 sous familles qui ne possèdent pas de PDV
Campopleginae
Banchinae
14000 espèces
Ichnovirus
Complexe Microgastroïde
(7 sous familles)
17000 espèces Bracovirus
Origine indépendante de l’association virus-guêpe chez les guêpes Braconidae et Ichneumonidae
Deux familles de virus associées à deux familles de guêpes
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Origine des associations guêpes braconidae-virus
>17000 espèces
MeteorinaeMacrocentrinae
AphidiinaeOpiinae
Alysiinae
DoryctinaeBraconinae
BRACONIDAE
MICROGASTRINAEMiracinae
Cheloninae
CardiochilinaeMICROGASTRINAE-CotesiaMiracinae
Cheloninae
Cardiochilinae
Virus ancêtre
Guêpe ancêtre (70 millions d’années)
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Les questions scientifiques
Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ?
Quel est la nature du virus ancêtre ?
BRACONIDAE
Virus ancêtre
Les stratégies utilisées
Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ?
Quel est la nature du virus ancêtre ?
Séquençage du génome viral libre
Analyse d’une banque d’ADNc à partir de chenilles parasitées
Reverse Northern en utilisant comme sonde de l’ADNc de chenilles parasitées
Génome de C. congregata Bracovirus (CcBV)• 30 cercles d’ADN db• 567 kb• 27 % de régions codantes• 156 gènes potentiels• Organisation en familles multigéniques
Séquençage de la forme libre du virus
Espagne et al. Science 2004
Contenu du génome de CcBV
Cotesia spécifiques
17%
Motifs conservés
26%
Viraux9%
Hypothétiques48%
Contenu du génome de CcBVNature du virus ancêtre ?
Cotesia spécifiques
17%
Motifs conservés
26%
Viraux9%
Hypothétiques48%
Très peu de gènes « viraux »• 1 gène de baculovirus• 1 gène d’ascovirus• gènes de rétroéléments DIRS et Dong• gènes de polintons
Ne renseignent pas sur la nature du virus ancêtre
Contenu du génome de CcBVNature du virus ancêtre ?
Cotesia spécifiques
17%
Motifs conservés
26%
Viraux9%
Hypothétiques48%
Familles multigéniques à motifs conservés:
• Protéines-Tyrosine-Phosphatases• Inhibiteurs NFKB : IKB• Cystatines• Protéines riches en cystéines
Potentiellement de nombreux facteurs de virulenceimpliqués dans dérégulation de la physiologie de la chenille
Analyse des gènes exprimés par reverse northern.
ADN viral
Digestion enzymatiq
ue
Sonde P32 d’ADNc chenilles parasitées
Sonde P32 d’ADNc chenilles non parasitées
•ProtéinesTyrosines Phosphatases• Inhibiteurs NFKB• Cystatines
DécoupageClonageséquençage
Gènes de la famille des IκB
• Gènes codant pour protéines IκB interviennent dans la régulation de la réponse immunitaire innée chez les mammifères et les insectes (voies Toll)
• Interaction avec le facteur de transcription NF- κB
• Motif présent dans toutes les protéines IκB : domaine de répétitions ankyrines
Gènes IκB-like chez les bracovirus et ichnovirus
9 gènes IkB chez CcBV
Voie Toll chez la Drosophile
Toll
QuickTime™ et undécompresseur TIFF (non compressé)
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Tube
Pelle
NFkB (Dorsal)
IkB (Cactus)
Activation de peptides antimicrobiens
BacteriesGram+
Champignons
noyau
Modèle du mode d’action des IkB virauxsur l’immunité chez Manduca
Toll-like
NFkB
IkB
Activation de la réponse antiparasitaires
Reconnaissance guêpe parasite
noyau
Modèle du mode d’action des IkB virauxsur l’immunité chez Manduca
Toll-like
NFkB
IkB
Reconnaissance guêpe parasite
noyau
Injection de CcBV IkB viraux
X
Pas d’activation de gènes de l’immunité
Contenu du génome de CcBVNature du virus ancêtre ?
Cotesia spécifiques
17%
Motifs conservés
26%
Viraux9%
Hypothétiques48%
Familles multigéniques à motifs conservés:
• Protéines-Tyrosine-Phosphatases• Inhibiteurs NFKB : IKB• Cystatines• Protéines riches en cystéines
Implication des cystatines virales dans l’interaction hôte-parasite ?
1
3
2
Cercle 19
3 Cystatines
Cystatines ?• Cystatines = inhibiteur de protéases à cystéine
• Cystatines de type 2
• Première description de cystatines virales
• Chez les nématodes parasites les cystatines sont des facteurs de virulence
G
QxVxG P
W• Cibles des cystatines :
protéases à cystéine de la famille C1
Ex : papaine et cathepsine
Protéases à cystéine (type C1) des insectes :
• Digestion
• Développement (métamorphose et mue)
• Immunité ?
Cystéine protéases ciblées chez les insectes ?
26/29 kDa C1 cysteine protease
CathepsinBCathepsin L
Cathepsin L
LibérationDe protéase
Surexpression(ARNm)
Surexpression(ARNm)
Sarcophaga Mouche tsetse Drosophile
Quel est le rôle des cystatines virales dans l’interaction hôte-parasite ?
• Evolution moléculaire des cystatines virales
• Est-ce que les cystatines virales sont exprimées ?
• Les cystatines virales sont-elles des protéines inhibitrices
fonctionnelles ?
•Quelles sont les cibles des cystatines virales chez Manduca ?
Les cystatines sont fortement exprimées pendant l’interaction hôte-parasite
25
20
15
10
5
0
NP24 H48 H
cystatin/actin
NP 24h 48h NP 24h 48h NP 24h 48h NP 24h 48h
Nerve
Chain
MidgutMalpighian
tubules
Haemocytes
cystatin actin NP 24h 48h NP 24h 48h NP 24h 48h
0
10
2030
4050
NP 40min 2h 12h 24h 48h 3d 5d 8d
NP 40min 2h 12h 24h 48h 3d 5d 8d
cystatin/actin
cystatin actin
ARNm cystatines
ARNm actine
Analyse par Northern
Corps gras Hémocytes
Les cystatines sont fortement exprimées pendant l’interaction hôte-parasite
Analyse par Western
Hemolymphe P NP
16,5
32,5
25
KDa
Cystatines
(13 kDa)
AnticorpsAnti-Cystatine1
Expression et purification d’une protéine recombinante Cystatine 1
MW(kDa)
47,5
32,5
25
16,5
6,5
Culture
supernatant
flowthrough
wash eluate
fractionsFractionsélution
• Expression de CcBV cystatine1 dans des cellules d’insectes Hi5
• Purification sur colonne de papaïne
Cystatine 1
CcBV Cystatine 1 recombinante est un inhibiteur de protéases à cystéine actif
0 1 10 100
RelativeActivity (%)Papain
Cystatin (nM)
0
20
40
60
80
100
PapainRelativ
e Activity
(%)
Cystatine 1 (nM)
0
20
40
60
80
100 Relative
Activity (%)
0 16 83Cystatin (nM)
Cathepsin BCathepsin LS.peregrina 29 kDacysteine protease
Cystatine 1 (nM)
Relative Activity (%)
Cathepsin BCathepsin L
S. peregrina 29 kDa cysteine protease
Espagne et al. Journal of Virology 2005
Modèle de travail _ Perspectives
ParasitismeŒufs de guêpe + bracovirus
Production de protéases àCystéine
Nouvelle composante de la réponse immunitaire des insectes ?
Inhibition par les cystatines de CcBV ?
Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ?
Quel est la nature du virus ancêtre ?
Séquençage du génome viral libre
Analyse d’une banque d’ADNc à partir de chenilles parasitées
Reverse Northern en utilisant comme sonde de l’ADNc de chenilles parasitées
Les questions scientifiques
?
Réplication virale: massive dans les ovaires de guêpes
Nature du virus ancêtre ?
Pas de réplication dans la chenille hôteLes gènes viraux n’ont pas besoin d’être codés par les cercles
Les gènes viraux sont exprimés massivement dans les ovaires
Les gènes viraux sont dans le génome de la guêpe ?
Chromosome 5guêpe
Réplication virale: massive dans les ovaires de guêpes
1. Recherches de protéines virales (capside, polymérase, enveloppes)
Par une approche transcriptomique et protéomique sur les ovaires
-banque EST d’ovaires de guêpes
-analyse des protéines à partir de virus purifiés des ovaires
Nature du virus ancêtre ?
Nouvelle stratégie
2. Analyse de la forme intégrée du virus
Analyse du transcriptome d’ovaires répliquant le virus:
6000 EST d’ovaires de Cotesia congregata
Comparaison dans les banques de données
Identification des protéines de structure des virions:
Séquençage des protéines constitutives
des particules purifiées
Comparaison dans les banques de données et les banques d’EST
44 gènes viraux potentiels (origine virus d’insecte)
Gènes impliqués dans • la transcription • La constitution des nucléocapsides • La constitution des enveloppes des particules
Gènes viraux sont intégrés au génome de la guêpe
Le génome du virus reflète les contraintes évolutives différentes :mutualisme/parasitisme
1. Intégration du virus ancêtre
3. « Acquisition de gènes de virulence» Transfert du génome de la guêpe vers le virus
2. « Perte de gènes viraux » Transfert vers le génome de la guêpe
Encore beaucoup de questions
Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ?
Mécanismes ?
Quel est la nature du virus ancêtre ?
Comment s’effectue la réplication ?
Virus comme vecteur de
transfert de gènes ?
Capture des gènes et évolution ?
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