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7/26/2019 Entwicklung und Validierung einer Multimethode zur Bestimmung von Antibiotikarckstnden in Milch und Wasser
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Entwicklung und Validierung einer Multimethode zurBestimmung von Antibiotikarckstnden in Milch und
Wasser mittels LC-MS/MS
Masterarbeitim Master-Studiengang Lebensmitteltechnologie/Food Science and
Technology der Beuth Hochschule fr Technik Berlin- University of Applied Sciences -
zur Erlangung des akademischen Grades einesMaster of Science (M. Sc.)
vorgelegt von
Shafira Nur Octavia, B. Sc.
im September 2014
angefertigt imInstitut fr Getreideverarbeitung GmbH
Abteilung Analytik/Testlabor
1. Gutachter: Prof. Dr. Monika Springer2. Gutachter: Dr. Gerd Huschek
Projektbetreuerin: Silvia Aguil-Losa
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7/26/2019 Entwicklung und Validierung einer Multimethode zur Bestimmung von Antibiotikarckstnden in Milch und Wasser
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Eidesstattliche Erklrung
i
Eidesstattliche Erklrung
Ich versichere, dass ich diese Arbeit selbststndig verfasst und keine anderen als dieangegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Berlin, den 1. September 2014
Shafira Nur Octavia
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7/26/2019 Entwicklung und Validierung einer Multimethode zur Bestimmung von Antibiotikarckstnden in Milch und Wasser
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Danksagung
ii
Danksagung
Diese Arbeit mchte ich zum Anlass nehmen, einigen Personen meinen Dank
auszusprechen, die mich bei dieser Masterarbeit untersttzt und begleitet haben. In
erste Linie danke ich Frau Prof. Dr. Monika Springer sowie Herrn Dr. Gerd Huschek
von der Firma IGV (Institut fr Getreideverarbeitung) GmbH fr dieses interessante
Thema sowie fr die Untersttzung und Hilfe bei der Erstellung der vorliegenden
Masterarbeit. Von ihnen erhielt ich Anregungen und sie waren immer bereit,
umgehend auf meine Fragen einzugehen.
Speziell bei Frau Silvia Aguil-Losa von der Firma IGV GmbH mchte ich fr dievielen gemeinsamen Stunden im Bro und im Labor sowie fr die tatkrftige
Untersttzung, zahlreiche Anregungen und Hilfe bei den praktischen Versuchen
insbesondere beim Erfahren der LC-MS/MS bedanken.
Ein herzliches Dankeschn auch an Olga Worster und Jurgenal Fatichin, die mir bei
der schriftlichen Korrektur dieser Arbeit geholfen haben.
Des Weiteren danke ich den Mitarbeitern des Prflabors des IGV GmbH fr IhreUntersttzung und gute Zusammenarbeit whrend der praktischen Versuche.
Zu guter Letzt mchte ich meinen lieben Eltern in Indonesien, meiner Schwester
Shofiana Octari und Hariz Adenan fr ihre unendliche Motivation und Untersttzung
danken.
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Abstract
iii
Abstract
Many classes of antibiotics are widely administrated to food-producing animals for
the purpose of prevention and treatment of several diseases. This can result in
residues in several dairy products such as milk, which is highly consumed over the
world. Additionally, the residual antibiotics from both human and animal uses can
also enter the environment via various pathways, including wastewater effluent
discharge, runoff from land to which agricultural or human waste has been applied,
and leaching. Furthermore, antibiotics in the aquatic environment may persist and be
transported to reservoirs supplying source water to drinking water treatment plants.
Those described situations can be problematic because antibiotics residues can
provoke allergic reactions in some hypersensitive individuals. Different studies also
indicate that low-level doses of antibiotics for long periods could result in bacteria
resistance. On the other hand, the residues in milk can also slow or destroy the
growth of the fermentation of bacteria during the production of milk products.
In order to ensure human food safety, the European Union has set maximum residue
limits (MRLs) in milk for some antibiotics, although for some antibiotics it is indicated
that they cannot be used in animals from which milk is produced for human
consumption. For water, there are no national as well as international regulations but
its necessary to distill the existing health information such as ADI etc.
In this masters thesis, a selective method was developed to analyze several
antibiotics in milk and drinking water by high pressure liquid chromatography coupled
to mass spectrometry in a single analytical run after a solid phase extraction. The
selected antibiotics include two beta-lactames, four macrolides, one sulphonamide,
one diamino-pyrimidine derivate, two tetracyclines and one amphenicol.
The extraction procedure for milk, consisting of an extraction of the sample with
acetonitrile:water:acetic acid (10:90:0,1, v/v) with supernatant clean-up using polymer
SPE-cartridge BEKOlut LEOX was performed. Using the same SPE-cartridge,
another SPE method for drinking water sample preparation was also developed prior
to chromatographic analysis.
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Abstract
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Chromatographic conditions were developed in order to obtain a fast separation in 13
minutes by use of HPLC column Kinetex-C18. The antibiotics were detected by
electrospray ionization in positive as well as in negative ion mode with multiple
reactions monitoring (MRM).
The developed method for milk was validated by adapting the Commission Decision
2002/EC/657 in terms of linearity, trueness, precision and stability with the exception
for CC and CC, which were replaced by LOD and LOQ in this thesis. With the
exception of recoveries to determine trueness, all parameters have acceptable
values and are in agreement with the criteria of Commission Decision 2002/657/EG.
Six of the analyzed antibiotics in milk did not reach the recovery criteria of the
Commission Decision (the criteria depends on concentration), but the recovery
criteria of IGV test lab between 70 120 % is fulfilled from all analytes in both low
and high concentration levels except azithromycin (55,5 % and 60,5 %) and
chloramphenicol (129 % and 145 %).
The developed method for drinking water could not deliver any recovery of
tetracyclines group (tetracycline and doxycycline). However, the recoveries of other
antibiotics groups, except sulfamethoxazole (recovery of 123 %), lied in acceptablerange between 70120 %.
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Inhaltsverzeichnis
v
Inhaltsverzeichnis
Eidesstattliche Erklrung ......................................................................................................... i
Danksagung ........................................................................................................................... iiAbstract ................................................................................................................................. iii
Abbildungsverzeichnis .......................................................................................................... vii
Tabellenverzeichnis ............................................................................................................... ix
Abkrzungsverzeichnis ........................................................................................................... x
1. Einleitung ....................................................................................................................... 1
1.1 Problemstellung ...................................................................................................... 1
1.2 Zielsetzung .............................................................................................................. 2
2. Theoretischer Teil ........................................................................................................... 42.1 Antibiotika ............................................................................................................... 4
2.1.1 Einleitung ......................................................................................................... 4
2.1.2 Untersuchte Antibiotika .................................................................................... 5
2.1.3 Chemische Eigenschaften und Stabilitt untersuchter Antibiotika..................... 9
2.2 Antibiotikarckstnde .............................................................................................12
2.2.1 Antibiotikarckstnde in Milch .........................................................................12
2.2.2 Antibiotikarckstnde in Wasser .....................................................................13
2.2.3 Risiken und Auswirkungen ..............................................................................14
2.3 Rechtliche Rahmenbedingungen ............................................................................15
2.3.1 Gesetzlich festgelegte Rckstandshchstmengen ..........................................15
2.3.2 ADI-Werte (Acceptable Daily Intake) ...............................................................17
2.3.3 Kriterien der analytischen Methoden ...............................................................18
2.4 Analytik von Antibiotika ..........................................................................................18
2.4.1 Solid-Phase-Extraktion ....................................................................................19
2.4.2 LC-MS/MS-Technik .........................................................................................21
2.5 Methodenvalidierung ..............................................................................................24
3. Material und Methoden ..................................................................................................293.1 Gerte und sonstige Materialien .............................................................................29
3.2 Chemikalien und Reagenzien .................................................................................29
3.2.1 Lsungsmittel ..................................................................................................29
3.2.2 Chemikalien und Reagenzien ..........................................................................29
3.2.3 Lsungen ........................................................................................................30
3.2.4 Standardlsungen ...........................................................................................30
3.2.5 Kalibrierreihe ...................................................................................................32
3.3 Extraktion und Aufreinigung mittels SPE ................................................................33
3.3.1 Milchprobe ......................................................................................................33
3.3.2 Wasserprobe ...................................................................................................34
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Inhaltsverzeichnis
vi
3.4 LC-MS/MS Parameter ............................................................................................35
3.5 Validierung der Methode ........................................................................................36
3.5.1 Selektivitt und Spezifitt ................................................................................36
3.5.2 Arbeitsbereich .................................................................................................373.5.3 Linearitt .........................................................................................................37
3.5.4 Nachweis- und Bestimmungsgrenze ...............................................................37
3.5.5 Przision .........................................................................................................38
3.5.6 Richtigkeit/Wiederfindung ................................................................................39
3.5.7 Stabilitt ..........................................................................................................39
3.5.8 Matrix-Effekte ..................................................................................................39
4. Ergebnisse und Diskussion ...........................................................................................40
4.1 Entwicklung von LC-MS/MS-Methode ....................................................................40
4.2 Betimmung der Arbeitsbereiche .............................................................................43
4.3 Entwicklung der Extraktionsmethode fr Milch .......................................................46
4.3.1 Methodenauswahl und Optimierung ................................................................46
4.3.2 Vergleich der SPE-Sule .................................................................................49
4.4 Entwicklung der Extraktionsmethode fr Wasser ....................................................51
4.5 Validierung der Methode ........................................................................................53
4.5.1 Selektivitt (Spezifizitt) ..................................................................................53
4.5.2 Kalibrierbereich ...............................................................................................55
4.5.3 Linearitt .........................................................................................................564.5.4 Nachweis- und Bestimmungsgrenze ...............................................................57
4.5.5 Przision .........................................................................................................58
4.5.6 Richtigkeit/Wiederfindung ................................................................................61
4.5.7 Stabilitt ..........................................................................................................64
4.5.8 Matrix-Effekte ..................................................................................................65
5. Zusammenfassung ........................................................................................................67
6. Literaturverzeichnis .......................................................................................................69
7. Anhang ..........................................................................................................................75
7.1 Formeln ..................................................................................................................75
7.2 Chromatogramme ..................................................................................................78
7.3 Kalibriergeraden (Milch) .........................................................................................84
7.4 Kalibriergeraden (Wasser) ......................................................................................87
7.5 Matrix-Effekte (Milch) .............................................................................................90
7.6 Ergebnisse der Methodenentwicklung ....................................................................92
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Abbildungsverzeichnis
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Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Chemische Struktur von Penicillin G und Ceftiofur ............................................ 5
Abbildung 2: Chemische Struktur von Tetracyclin und Doxycyclin ......................................... 6
Abbildung 3: Chemische Struktur von Azithromycin, Clarithromycin, Erythromycin, Tylosin .. 7
Abbildung 4: Chemische Struktur von Trimethoprim .............................................................. 8
Abbildung 5: Chemische Struktur von Sulfamethoxazol ......................................................... 9
Abbildung 6: Chemische Struktur von Chloramphenicol ........................................................ 9
Abbildung 7: Eintragspfade fr Arzneimittel in die aquatische Umwelt ..................................13
Abbildung 8: SPE-Gert mit Vakuum und SPE-Kartuschen unterschiedlicher Formate ........20
Abbildung 9: Prinzip der SPE-Methode ................................................................................21
Abbildung 10: Aufbauprinzip eines HPLC-Systems ..............................................................22
Abbildung 11: Octadecylsilan (ODS, C18) ............................................................................23
Abbildung 12: Schematische Darstellung der ESI-Ionisierung ..............................................24
Abbildung 13 XIC aller Analyten mit Fusion-RP in positivem Ionisierungsmodus..................41
Abbildung 14: XIC von Trimethoprim und Tetracyclin mit Fusion-RP ....................................42
Abbildung 15: XIC aller Analyten mit KinetexC18 in positivem Ionisierungsmodus ............42
Abbildung 16: XIC von Trimethoprim und Tetracyclin mit Kinetex C18 ...............................42
Abbildung 17: Vergleich verschiedener Methoden ................................................................47
Abbildung 18: Wiederfindung untersuchter Antibiotika mit verschiedenen SPE-Sulen ........50
Abbildung 19: Vergleich der SPE-Sulen LEOX und LEOX Plus fr Wasserextraktion.........52
Abbildung 20: TIC Blank-Probe in positiver Ionisierung ........................................................53
Abbildung 21: TIC Blank-Probe in negativer Ionisierung .......................................................54
Abbildung 22: XIC Tetracyclin in Blank-Probe (a), dotierter Milchprobe 1*MRL (b) und imLsemittelstandard 1*MRL (c) ..............................................................................................54
Abbildung 23: XIC Penicillin G in Blank-Probe (a), dotierter Milchprobe 1*MRL (b) und imLsemittelstandard 1*MRL (c) ..............................................................................................55
Abbildung 24: RSDrund RSDwRbei niedrigem Konzentrationniveau ....................................60
Abbildung 25: RSDrund RSDwRbei mittlerem Konzentrationniveau .....................................61Abbildung 26: RSDrund RSDwRbei hohem Konzentrationniveau .........................................61
Abbildung 27: Stabilittstest der Wirkstoffe in Milchmatrix mittels LC-MS/MS .......................64
Abbildung 28: Messwerte von Trimethoprim in Matrix- und Lsemittel .................................65
Abbildung 29: Messwerte von Tetracyclin in Matrix und Lsemittel ......................................65
Abbildung 30: Messwerte von Tylosin in Matrix- und Lsemittel ...........................................65
Abbildung 31: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Azithromycin K5 (20 g/L) ................................78
Abbildung 32: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Ceftiofur K4 (100 g/L) .....................................78
Abbildung 33: XIC ISTD_neg (15 g/L) und Chloramphenicol K5 (4,5 g/L) .........................79Abbildung 34: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Clarithromycin K4 (15 g/L) ..............................79
Abbildung 35: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Doxycyclin K5 (20 g/L)...................................80
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Abbildungsverzeichnis
viii
Abbildung 36: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Erythromycin K4 (40 g/L) ................................80
Abbildung 37: XIC ISTD_neg (15 g/L) und Penicillin G K4 (4 g/L)....................................81
Abbildung 38: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Sulfamethoxazol K5 (20 g/L)..........................81
Abbildung 39: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Tetracyclin K4 (100 g/L).................................82
Abbildung 40: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Trimethoprim K4 (50 g/L) ................................82
Abbildung 41: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Tylosin K5 (75 g/L) .........................................83
Abbildung 42: Kalibriergerade von Azithromycin (Milch) .......................................................84
Abbildung 43: Kalibriergerade von Ceftiofur (Milch) ..............................................................84
Abbildung 44: Kalibriergerade von Chloramphenicol (Milch) .................................................84
Abbildung 45: Kalibriergerade von Clarithromycin (Milch) .....................................................84
Abbildung 46: Kalibriergerade von Doxycyclin (Milch) ..........................................................85
Abbildung 47: Kalibriergerade von Erythromycin (Milch) .......................................................85
Abbildung 48: Kalibriergerade von Penicillin G (Milch) ..........................................................85
Abbildung 49: Kalibriergerade von Sulfamethoxazol (Milch) .................................................85
Abbildung 50: Kalibriergerade von Tetracyclin (Milch) ..........................................................86
Abbildung 51: Kalibriergerade von Trimethoprim (Milch) ......................................................86
Abbildung 52: Kalibriergerade von Tylosin (Milch) ................................................................86
Abbildung 53: Kalibriergerade von Azithromycin (Wasser) ...................................................87
Abbildung 54: Kalibriergerade von Ceftiofur (Wasser) ..........................................................87
Abbildung 55: Kalibriergerade von Chloramphenicol (Wasser) .............................................87
Abbildung 56: Kalibriergerade von Clarithromycin (Wasser) .................................................88
Abbildung 57: Kalibriergerade von Erythromycin (Wasser) ...................................................88
Abbildung 58: Kalibriergerade von Penicillin G (Wasser) ......................................................88
Abbildung 59: Kalibriergerade von Sulfamethoxazol (Wasser) .............................................88
Abbildung 60: Kalibriergerade von Trimethoprim (Wasser) ...................................................89
Abbildung 61: Kalibriergerade von Tylosin (Wasser) ............................................................89
Abbildung 62: Vergleich der Messwerte von Azithromycin in Lsemittel- und in Matrix.........90
Abbildung 63: Vergleich der Messwerte von Ceftiofur in Lsemittel- und in Matrix ...............90
Abbildung 64: Vergleich der Messwerte von Chloramphenicol in Lsemittel- und in Matrix ..90
Abbildung 65: Vergleich der Messwerte von Clarithromycin in Lsemittel- und in Matrix ......90
Abbildung 66: Vergleich der Messwerte von Doxycylin in Lsemittel- und in Matrix ..............90
Abbildung 67: Vergleich der Messwerte von Erythromycin in Lsemittel- und in Matrix ........90
Abbildung 68: Vergleich der Messwerte von Penicillin G in Lsemittel- und in Matrix ...........91
Abbildung 69: Vergleich der Messwerte von Sulfamethoxazol in Lsemittel- und in Matrix ...91
Abbildung 70: Vergleich der Messwerte von Tetracyclin in Lsemittel- und in Matrix ............91
Abbildung 71: Vergleich der Messwerte von Trimethoprim in Lsemittel- und in Matrix ........91Abbildung 72: Vergleich der Messwerte von Tylosin in Lsemittel- und in Matrix ..................91
Abbildung 73: Double-Peak bei Makroliden mit PSM-Gradient .............................................92
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Tabellenverzeichnis
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Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: pK-Werte untersuchter Antibiotika ........................................................................11
Tabelle 2: Festgelegte Rckstandshchstmengen in Milch in g/kg nach der Verordnung
(EG) Nr. 37/2010 ..................................................................................................................16Tabelle 3: Aktuelle vorhandene ADI-Werte verschiedener Antibiotika nach JECFA sowienach CVMP/EMEA in g/kg KG ............................................................................................17
Tabelle 4: Standardsubstanzen fr die Validierung ..............................................................31
Tabelle 5: Herstellung der Standardmix fr Milch .................................................................32
Tabelle 6: Herstellung der Standardmix fr Wasser ..............................................................32
Tabelle 7: Herstellung der Kalibrierreihe fr Milch ................................................................32
Tabelle 8: Herstellung der Kalibrierreihe fr Wasser .............................................................33
Tabelle 9: LC-Konfiguration ..................................................................................................35Tabelle 10: Gradientzusammensetzung fr die LC ...............................................................35
Tabelle 11: MS/MS-Konfiguration .........................................................................................36
Tabelle 12: MRM-bergange der einzelnen Analyten...........................................................36
Tabelle 13: Zudotiertes Volumina der Antibiotikastandard-Mix und Analyt-Endkonzentrationin den Proben .......................................................................................................................38
Tabelle 14: Arbeitsbereich fr Milch in g/kg und Relationskoeffizient jeweiligerKalibriergeraden ...................................................................................................................45
Tabelle 15: Arbeitsbereich fr Wasser in ng/L und Relationskoeffizient jeweiliger
Kalibriergeraden ...................................................................................................................45Tabelle 16: Vergleich verschiedener Extraktionsmethoden zur Antibiotikauntersuchungmittels SPE ...........................................................................................................................48
Tabelle 17: Linearitt der Kalibrierfunktionen einzelner Wirkstoffe nach Mandel F-Test undBestimmtheitsma R2 ...........................................................................................................56
Tabelle 18: Nachweis- und Bestimmungsgrenze nach DIN 32645 .......................................57
Tabelle 19: Wiederholprzision RSDrund Laborprzision RSDwR in % .................................59
Tabelle 20: Wiederfindungsrate in % bei niedrigen Konzentrationen ....................................62
Tabelle 21: Wiederfindungsrate in % bei hohen Konzentrationen .........................................62
Tabelle 22: WFR Milchextraktion in % - Methodenvergleich (n=3) ........................................92Tabelle 23: WFR Milchextraktion in % - Vergleich SPE-Sulen (n=3) ...................................93
Tabelle 24: WFR Wasserextraktion in % - Vergleich SPE-Sulen (n=3) ...............................93
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Abkrzungsverzeichnis
x
Abkrzungsverzeichnis
a Achsenabschnitt
Irrtumwahrscheinlichkeit
ACN Acetonitril
AM Azithromycin
amu Atomare Masseneinheit (atomic mass unit)
APCI Chemische Ionisation unter Atmosphrendruck (atmospheric pressure
chemical ionization)
API Ionisation unter Atmosphrendruck (atmospheric pressure ionization)
b Steigung
Massenkonzentration
BG Bestimmungsgrenze
c Konzentration
CAP Chloramphenicol
CC Entscheidungsgrenze (decision limit)
CC Nachweisvermgen (detection capability)
CE Kollisionsenergie (collision energy)
CEFT Ceftiofur
CM Clarithromycin
CV Cone Voltage
CVMP Committee for Veterinary Medicinal Products
CXP Zellausgangsspannung (cell exit potential)
DC Doxycyclin
EG Europische Gemeinschaft
EI ElektronenstoionisationEM Erythromycin
EMEA Europische Arzneimittelagentur (European Agency for the Evaluation
of Medicinal Products)
ESI Elektrospray-Ionisation
EU Europische Union
EWG Europische Wirtschaftsgemeinschaft
Extr. ExtraktF Faktor
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Abkrzungsverzeichnis
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FAO Food and Agriculture Organization
GefstoffV Gefahrstoffverordnung
HPLC Hochleistungsflssigkeitschromatographie
ISTD Interner StandardJECFA Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives
kg Kilogramm
Konz. Konzentration
L Liter
LC Flssigchromatographie(liquid chromatography)
g Mikrogramm
m Masseml Milliliter
m/z Masse zu Ladung - Verhltnis
max. maximal
MeOH Methanol
min Minute
MRL maximale Rckstandshchstmengen (maximum residue limits)
MRM multiple reaction monitoring
MS Massenspektrometrie / Massenspektrometer
MS/MS Tandem-Massenspektrometrie / -Massenspektrometer
MW Mittelwert
ni Anzahl Bestimmungen an einer Probe, Anzahl der Proben
NWG Nachweisgrenze
n.n. nicht nachweisbar
p.a. zur Analyse (pro analysis)
ng Nanogramm
P Wahrscheinlichkeit
PE Polyethylen
Pen G Penicillin G
ppm parts per million (1:106)
ppb parts per billion (1:109)
ppt parts per trillion (1:1012)
Q1 Quadrupol 1
q2 Quadrupol 2 (Kollisionszelle)
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Abkrzungsverzeichnis
xii
Q3 Quadrupol 3
R2 Bestimmtheitsma
RL Richtlinie
RP Umkehrphase (reversed phase)rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)
RSD relative Standardabweichung (relative standard deviation)
RSDr Wiederholprzision (repeatability)
RSDwR Laborprzision (within-laboratory reproducibility)
RT Retentionszeit (retention time)
SD Standardabweichung (standard deviation)
SMTX SulfamethoxazolSPE Festphasenextraktion (solid phase extraction)
STD Standard
t Zeit (time)
TC Tetracyclin
TCA Trichloressigsure
TIC total ion current chromatogram
TMP Trimethoprim
TYL Tylosin
U Umdrehung
UV ultraviolet
V Volumen
v/v Volumen pro Volumen (volume per volume)
VE voll entsalzt
VK Variationskoeffizient
WFR Wiederfindungsrate
WHO World Health Organization
XIC Extracted-ion chromatogram
z Ladung eines Ions
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Einleitung
1
1. Einleitung
1.1 Problemstellung
Im Vergleich zu den anderen pharmazeutischen Wirkstoffgruppen wie Hormone,
Analgetika, Vitamine u. v. m. werden Antibiotika mit 70 % am hufigsten in der
Veterinrmedizin eingesetzt, um Krankheiten vorzubeugen und kranke Tiere zu
behandeln. Vor allem werden Antibiotika der Klassen Tetracycline, Sulfonamide,
Aminoglykoside, -Lactame sowie Makrolide verschrieben [RDER, 2007].
Lebensmittel, die von behandelten Tieren stammen wie z. B. Milch, knnen daher
Antibiotikarckstnde enthalten. Laut BVL Jahresbericht zum NationalenRckstandskontrollplan im Jahr 2012 wurde Penicillin G (Benzylpenicillin) in einer
von 404 untersuchten Milchproben mit einem Gehalt von 10,9 g/kg nachgewiesen,
wobei der zugelassene Rckstandshchstgehalt 4 g/kg betrgt [BVL, 2012].
Auch in den Ausscheidungen behandelter Tiere sind Antibiotikarckstnde
nachweisbar. Durch das Ausbringen von Glle und Mist knnen diese Rckstnde
auf Oberflchengewsser gelangen, welche fr die Herstellung von Trinkwasser
verwendet und/oder von den Pflanzen aufgenommen werden. Es ist somit
auszuschlieen, dass der Transfer dieser Wirkstoffe in pflanzliche Lebensmittel
generell mglich ist. Nach einer Literaturstudie des Bundesinstitutes fr
Risikobewertung (BfR) wurden in 13 verschiedenen pflanzlichen Matrizen positive
Befunde von 22 pharmakologischen Wirkstoffen oberhalb der jeweiligen analytischen
Bestimmungsgrenzen nachgewiesen, wobei es sich bei dem Groteil der Wirkstoffe
um Antibiotika handelt [BFR, 2011].
Antibiotikarckstnde knnen problematisch sein, da diese das
Fermentationswachstum von Mikroorganismen verlangsamen oder zerstren sowie
allergische Reaktionen bei berempfindlichen Menschen hervorrufen knnen.
Verschiedene Studien haben auch gezeigt, dass diese Low-Level-Dosen von
Antibiotika ber lngere Zeit zu Bakterienresistenzen fhren [MARTNEZ-HUELAMO et
al., 2009].
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Einleitung
2
Aus der tierischen und menschlichen Sicht sind eine verantwortungsvolle
Verwendung von Antibiotika in Tieren sowie die dafr innerhalb der Europischen
Union durchgefhrten berwachungsprogramme von groer Bedeutung. Im Hinblick
auf den Nachweis von Antibiotika in Milch und Milchprodukten sowohl fr die
Qualittskontrolle als auch fr regulatorische Zwecke, kommt ein umfangreiches Feld
von Analysenmethoden mit mikrobiologischen Testverfahren, (schnellen)
immunchemischen Tests oder instrumentellen Methoden (d. h. LC-MS/MS) zum
Einsatz. Jede Analysenmethode hat ihre eigene Strke und Einschrnkungen.
Im nchsten Kapitel wird der Einsatz von Antibiotika in Tieren, gefolgt mit einer
Vorstellung der geregelten Rckstandshchstmengen gem der Verordnung (EG)
Nr. 37/2010, sowie die fr die Antibiotikaanalyse verwendete Methode mit denAnforderungen der EU bezglich der Analyse von Tierarzneimittelrckstnden
gem der Kommissionsentscheidung Nr. 2002/657/EG, die die Kriterien fr die
Durchfhrung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen zur
Umsetzung der Richtlinie 96/23/EC ber Manahmen zur Kontrolle bestimmter Stoffe
und ihrer Rckstnde in lebenden Tieren und tierischen Erzeugnissen definiert,
beschrieben.
1.2 Zielsetzung
In der Verordnung (EG) Nr. 37/2010 sind fr Antibiotika Hchstmengen (MRLs)
festgesetzt. Somit sollte eine sichere Kontrolle fr diese Wirkstoffe durch eine
validierte, leistungsfhige analytische Methode gewhrleistet werden.
Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, eine LC-MS/MS-Multimethode fr die
Bestimmung von elf Antibiotika aus sechs verschiedenen Wirkstoff-Gruppen: -
Lactame (Penicillin G und Ceftiofur), Makrolide (Azithromycin, Clarithromycin,
Erythromycin und Tylosin), Tetracyline (Tetracyclin, Doxycyclin), Sulfamethoxazol,
Trimethoprim und Chloramphenicol in Milch sowie in Trinkwasser zu entwickeln.
Diese Multimethode soll in der Lage sein, diese Wirkstoffe gleichzeitig zu extrahieren
und dann simultan in einem chromatographischen Lauf massenspektrometrisch zu
besttigen und zu quantifizieren.
-
7/26/2019 Entwicklung und Validierung einer Multimethode zur Bestimmung von Antibiotikarckstnden in Milch und Wasser
16/106
Einleitung
3
Ein weiteres Ziel war, die entwickelte Methode fr Milch zu validieren. Die
Validierung sollte den gesetzlichen Anforderungen der Kommissionsentscheidung
2002/657/EG entsprechen. Die Umsetzung erfolgte mit dem Programm VALISTAT,
angepasst durch GTFCh. Als Validierungsparameter werden Selektivitt (Spezifitt),
Arbeitsbereich, Linearitt, Nachweis- und Bestimmungsgrenze, Przision, Richtigkeit,
Stabilitt und Matrix-Effekte untersucht.
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17/106
Theoretischer Teil
4
2. Theoretischer Teil
2.1 Antibiotika
2.1.1 Einleitung
Antibiotika werden von Pilzen oder Bakterien produziert. Durch seine
bakteriostatische oder bakterizide Wirkung kann Antibiotika das Wachstum von
Bakterien hemmen oder diese abtten [LSCHER, 2010].
Nach GRFE werden Antibiotika nach Herkunft, biologischer Wirkung, chemischer
Struktur, Biosyntheseweg sowie Wirkmechanismus klassifiziert [GRFE,1992]. In der
vorliegenden Arbeit ist zur Entwicklung einer analytischen Methode zur
Untersuchung von Antibiotika die Klassifizierung nach chemischer Struktur von
groer Bedeutung. Von KROKER et al. (Veterinrmedizinische Fakultt, Freie
Universitt Berlin) wird eine Klassifizierung nach chemischer Struktur in 13 Gruppen
genannt [KROKERet al., 2002]:
1. Beta-Lactame2. Aminoglykoside
3. Tetracycline
4. Makrolide
5. Lincosamide
6. Polypeptidantibiotika
7. Amphenicole
8. Pleuromutiline9. Sulfonamide
10. Trimethoprim
11. Nitrofurane
12. Nitroimidazole
13. 4-Chinolone (Gyrasehemmer)
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Theoretischer Teil
5
Die meisten Antibiotika sind amphotere und polare Substanzen [RDER, 2007]. In
dieser Arbeit werden jedoch nur die sechs zu untersuchenden Antibiotikagruppen
ber ihre chemischen Strukturen und Eigenschaften diskutiert.
2.1.2 Untersuchte Antibiotika
2.1.2.1 -Lactame
Charakteristisch fr alle -Lactam-Antibiotika ist der viergliedrige -Lactam-Ring
[CLARK,2006]. Zu -Lactam-Antibiotika gehren zwei Untergruppen Penicilline (aus
6-Aminopenicillansure) und Cephalosporine (aus 7-Aminocephalosporansure),
[MARTNEZ-HUELAMO et al., 2009], die in der Veterinrmedizin hauptschlich
eingesetzt werden [QUANDT, 2006].
In dieser Arbeit werden zwei Wirkstoffe dieser Familie untersucht, und zwar Penicillin
G (Benzylpenicillin) als Vertreter der Penicilline und Ceftiofur aus der Untergruppe
Cephalosporine.
Abbildung 1: Chemische Struktur von Penicillin G und Ceftiofur nach KROKERet al.[2002]
2.1.2.2 Tetracycline
Das fr alle Tetracycline charakteristische viergliedrige Ringsystem (sog. Tetracen)
hat zur Namensgebung dieser Antibiotikagruppe gefhrt [ALTHAUSet al., 2013]. An
die vier linear kondensierten 6er-Ringe sind verschiedene funktionelle Gruppen
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7/26/2019 Entwicklung und Validierung einer Multimethode zur Bestimmung von Antibiotikarckstnden in Milch und Wasser
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Theoretischer Teil
6
angehngt. Fr Tetracycline gilt eine hohe Affinitt zu zwei- und dreiwertigen
Kationen (Ca2+, Mg2+, Fe3+) unter der Bildung von nicht resorbierbaren
Chelatkomplexen. Tetracycline sind typische Vertreter von Breitbandantibiotika
[SATTELBERGERet al., 2005]. Nach einer Studie der FEDESA (European Federation
of Animal Health) in 1997 waren Tetracycline in der EU mit 66 % die am hufigsten
eingesetzten Veterinrantibiotika [STEINBERG et al., 2003]. In dieser Arbeit werden
zwei Mitglieder dieser Gruppe untersucht, und zwar Tetracyclin und Doxycyclin. Ihre
chemischen Strukturen werden nach KROKER et al. in der folgenden Abbildung
dargestellt.
Abbildung 2: Chemische Struktur von Tetracyclin und Doxycyclin nach KROKERet al.[2002]
2.1.2.3 Makrolide
Nach der Studie der FEDESA im Jahr 1997 stellen die Makrolide mit 12 % die nach
den Tetracyclinen am hufigsten genutzte Antibiotika-Gruppe in der
Veterinrmedizin dar [STEINBERG et al., 2003].
Makrolide bestehen aus einem 14- bis 16-gliedrigen Laktonring, wonach diese
Klasse in drei Untergruppen unterteilt wird. An ein bis drei Stellen ist der Laktonring
an glykosidisch gebundenen Amino- oder Neutralzuckern gebunden. Dadurch
erhalten Makrolide einen basischen Charakter und sind im sauren Milieu sehr
instabil. [FREY, 2007]
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Theoretischer Teil
7
Erythromycin ist der erste Vertreter der Makrolid-Antibiotika und wurde 1952 aus
Streptomyces erythreus isoliert [QUANDT, 2006]. Mittlerweile werden Makrolide
ausgehend von dieser Grundstruktur halb- oder vollsynthetisch hergestellt.
Zustzlich ist Ester- und Salzbildung mglich [KROKER et al., 2002].
In der Veterinrmedizin werden Makrolide wie Erythromycin und Tylosin
beispielsweise zur Therapie von Atemwegserkrankungen angewendet, wobei
Azithromycin und Clarithromycin in der Humanmedizin zum Einsatz kommen [FREY,
2007].
In der folgenden Abbildung werden die chemischen Strukturen der in dieser Arbeit
vier zu untersuchenden Makrolid-Antibiotika gezeigt.
Abbildung 3: Chemische Struktur von Azithromycin, Clarithromycin, Erythromycin,Tylosin nach KROKERet al. [2002] und OGACH [2006]
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Theoretischer Teil
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2.1.2.4 Trimethoprim
Trimethoprim ist ein Derivat des 2,4-Diaminopyrimidins. Es handelt sich hierbei um
einen Antimetaboliten des Folsurestoffwechsels [QUANDT, 2006].
In der Veterinrmedizin wird Trimethoprim hufig in Kombination mit Sulfonamiden
eingesetzt [QUANDT, 2006]. Durch die Kombination verschiedener Sulfonamide mit
Trimethoprim kann eine Potenzierung der Solfonamideffekte und damit eine
Steigerung der antimikrobiellen Wirksamkeit dieser Substanzen erreicht werden
[KROKERet al., 2002].
Abbildung 4: Chemische Struktur von Trimethoprim [www.sigmaaldrich.com]
2.1.2.5 Sulfonamide
Damals waren Sulfonamide die wichtigsten Antibiotika, bevor Penicillin eingefhrt
wurde. Die Bezeichnung Sulfonamid wird in der organischen Chemie fr alle Amide
aromatischer Sulfonsuren verwendet. Sie werden rein synthetisch aus dem
Grundgerst Sulfanilamid hergestellt. [QUANDT, 2006]
Laut der FEDESA-Studie im Jahr 1997 kamen in der Veterinrmedizin europaweit
nur 2,1 % Sulfonamide einschlielich Trimethoprim zum Einsatz. Zu den in derVeterinrmedizin hufig eingesetzten Sulfonamiden gehrt auch der Wirkstoff
Sulfamethoxazol, welcher in der vorliegenden Arbeit untersucht werden soll.
Die chemische Struktur von Sulfamethoxazol wird in der folgenden Abbildung
dargestellt.
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Theoretischer Teil
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Abbildung 5: Chemische Struktur von Sulfamethoxazol nach KROKERet al. [2002]
2.1.2.6 Amphenicole
Amphenicole ist eine Antibiotikagruppe mit einer Phenylpropanoide-Struktur. Der
bekannteste Stoff dieser Gruppe ist Chloramphenicol [STEINBERGet al., 2003]. ImMolekl findet man zwei fr Naturstoffe ungewhnliche Gruppen: eine aromatische
Nitrogruppe und einen Dichloroacetamido-Rest. Innerhalb der EU ist seit 1994 die
Anwendung von Chloramphenicol bei lebensmittelliefernden Tieren verboten
[BALTES UND MATISSEK, 2011]. Jedoch gab es trotz des Verbots noch ein Zeichen,
dass dieser Stoff immer noch eingesetzt wurde. Nach der Durchfhrung des
nationalen Rckstandskontrollplans im Erzeugerbetrieb wurden im Jahr 1999
positive Befunde in vier von 878 Proben beim Kalb, zwei von 1215 Proben beimMastrind und einer von 181 Proben bei Khen nachgewiesen [STEINBERG et al.,
2003].
Abbildung 6: Chemische Struktur von Chloramphenicol [www.gbiosciences.com]
2.1.3 Chemische Eigenschaften und Stabilitt untersuchter Antibiotika
Die Entwicklung einer praktikablen Analysenmethode, welche gleichzeitig
verschiedene Antibiotika analysieren kann, ist durch unterschiedliche physikalische
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Theoretischer Teil
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und chemische Eigenschaften einzelner Antibiotika eine groe Herausforderung.
Beispielsweise haben Antibiotika einen breiten Umfang von pKs-Werten, z. B. 7,59
bei Makroliden, 3 4, 7 8 und 9 10 bei Tetracyclinen. Daher ist es wichtig, ein
richtiges Gleichgewicht von analytischen Bedingungen, insbesondere der
physikalisch-chemischen Eigenschaften zu bercksichtigen und zu definieren. Dazu
zhlen die Lslichkeit, pK-Werte, chemische und thermische Stabilitt sowie die
Polaritt. [WANG et al., 2012]
-Lactamesind empfindlich gegenber Suren und Basen und diese Empfindlichkeit
variiert je nach Seitenkette. Im sauren Milieu des Magens sind sie stabil [ALTHAUSet
al., 2005]. Bei einer monobasischen Verbindung wie Penicillin G liegt die maximale
Stabilitt im pH-Bereich 67 [WANGet al., 2012].
Makroliden sind einfache und lipophile makrocyclischen Lactone, die in Wasser
wenig lslich, aber in organischen Lsungsmitteln gut lslich sind. Im Allgemeinen
sind neutrale oder leicht basische Bedingungen gewhlt, um Makrolide zu
extrahieren. Somit wird der Abbau von einigen Mitgliedern dieser Gruppe, wie
Erythromycin, das in einer sauren Umgebung abgebaut werden kann, vermieden.
[WANGet al., 2012]
Tetracycline knnen unter extremen pH-Werten mit starken Suren sowie Basen
durch Epimerisierung (im Bereich pH 2 6), Dehydrierung, Isomerisierung und
andere Prozesse abgebaut werden [HU Berlin].
Ein pH-Wert von 4 wurde am hufigsten fr die Extraktion von Tetracyclinen aus
verschiedenen Matrizen gewhlt. Es gibt eine Tendenz der Tetracycline zur Bildung
von Chelatkomplexen mit Metallionen, welche mit Matrixkompenenten binden und zu
Problemen bei der Analyse fhren knnen. [WANGet al., 2012]
Chloramphenicolist eine hochpolare, stabile Verbindung, welche in der Regel sich
unter neutralen Bedingungen in wssrigen Pufferlsungen und/oder polaren
organischen Lsungsmitteln extrahieren lsst [WANGet al., 2012].
Die genaueren pK-Werte der untersuchten Antibiotika sind in der Tabelle 1 zu finden.
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Theoretischer Teil
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Tabelle 1: pK-Werte untersuchter Antibiotika [WANGet al., 2012]
Antibiotika-
klasseWirkstoff pK-Werte
Beta-Lactame Penicillin G 2,7Ceftiofur n/a
Makroliden
Azithromycin8,7
9,5
Clarithromycin 8,99
Erythromycin 8,6
Tylosin 7,7
Tetracyclinen
Tetracyclin
3,3
7,7
9,7
Doxycyclin
3,2
7,6
8,9
11,5
Sulfonamide Sulfamethoxazol 5,6
Diaminopyrimidin-
derivate Trimethoprim 6,6
Amphenicol Chloramphenicol n/a
-
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2.2 Antibiotikarckstnde
2.2.1 Antibiotikarckstnde in Milch
Milchproduzierende Khe, die mit Antibiotika behandelt werden, produzieren Milch,
die Antibiotikarckstnde enthlt. Daher sollten behandelte Khe fr einen
bestimmten Zeitraum von der Milchversorgung ausgeschlossen werden, um
sicherzustellen, dass die Antibiotikarckstnde in ihrer Milch nicht mehr bleiben.
Management-Fehler nach medikamentser Behandlung von Khen sind also der
Hauptgrund, der Antibiotikarckstnde in Milch verursacht [KNAPPSTEIN et. al.,2004].
Es gibt viele Wege fr das Entstehen von Antibiotikarckstnden in Milch. Dabei wird
zwischen sekretorischer und postsekretorischer Kontamination der Milch
unterschieden.
Unter sekretorischer Kontamination wird das Gelangen von Antibiotika ber den
Stoffwechsel des Tieres in die Milch verstanden. Sie ist u. a. abhngig von der
Resorption, Fettlslichkeit und Persistenz in den verschiedenen Organsystemen
[TPEL, 2004]. Als die hufigste Ursache ist es, dass die Wartezeit nachAntibiotikabehandlung unabsichtlich nicht eingehalten wurde: z. B. keine richtige
Kennzeichnung, so dass dies zu Verwechslungen fhrt [BAUMGARTNER, 2008]. Bei
unsachgemer Anwendung von Arzneimitteln, wie z. B. berdosierung kann es
ebenfalls zu einer Kontamination kommen, da Wartezeiten nur fr die jeweilige
zugelassene Anwendungsart und Dosierung gelten.
Auch die Ftterung von Antibiotika-haltigem Futter fhrt zu Antibiotikarckstnden in
Milch [TPEL,2004].
Jedoch erfolgt die Kontamination der Tankmilch in ber 50 % der Flle erst nach
dem Melken (postsekretorische Kontamination). Als Ursache dafr sind u. a. falsche
Melkreihenfolge (d. h. die behandelten Khe werden nicht zuerst gemolken),
kontaminiertes Melkgeschirr, ungengende Zwischenreinigung von Leitungen bzw.
Oberflche oder Kontamination von Antibiotika ber Melkpersonal (kontaminierte
Hnde). [BREMUS, 2012]
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2.2.2 Antibiotikarckstnde in Wasser
Veterinrantibiotika knnen in erster Linie auf landwirtschaftlich genutzte Bden
gelangen [RDER, 2007], whrend Humanpharmazeutika im Gegensatz dazu nach
therapeutischer Anwendung von Medikamenten, aber auch durch unsachgeme
Entsorgung unverbrauchter Arzneimittel ber die Toilette in kommunale Abwsser
gelangen knnen [RNNEFAHRTet al., 2012].
Wirkstoffe, die in der Klranlage ungengend zurckgehalten oder abgebaut werden,
knnen in Oberflchengewsser, vor allem in Flsse, bergehen.
Trinkwasserbrunnen, die sich in unmittelbarer Nhe zu Flssen befinden, knnen
einen erheblichen Anteil von Wasser aus diesen Gewssern frdern (sogenanntes
Uferfiltrat). Das Wasser wird zwar filtriert und biologisch gereinigt, aber es ist
mglich, dass Wirkstoffe aus den Oberflchengewssern bis in die
Trinkwasserbrunnen gelangen. [LFUBAYERN, 2010]
Abbildung 7: Eintragspfade fr Arzneimittel in die aquatische Umwelt [TRK, 2007]
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Laut der Publikation des Umweltbundesamtes aus dem Jahr 2011 wurden
deutschlandweit 51 Einzelwirkstoffe im Trinkwasser untersucht, wobei 23 davon
positiv waren [BERGMANNet al., 2011]. In einem Risiko-Untersuchungsprogramm des
bayerischen Landesamtes fr Gesundheit und Lebensmittelsicherheit (LGL) im Jahr
2007 waren in fnf der insgesamt 84 untersuchten Trinkwasserproben, die aus
oberflchenwasserbeeinflussten Wasserversorgungsanlagen in Bayern stammen,
Rckstnde von Sulfamethoxazol mit Konzentrationen zwischen 0,019 und 0,056
g/L feststellbar. [LFUBAYERN, 2010]
Jedoch gibt es fr Arzneimittel weder national noch international gesetzlich
festgelegte Trinkwasser-Grenzwerte. Gem 6 Abs. 1 TrinkwV 2001 drfen im
Wasser fr den menschlichen Gebrauch chemische Stoffe, also auch Arzneistoffe,nicht in gesundheitsschdlichen Konzentrationen enthalten sein [TRINKWV, 2001].
Deshalb ist es notwendig, eine Aussage ber gesundheitliche Wirkung mit Hilfe der
ADI-Werte oder anderer gesundheitlicher Leitwerte z. B. aus anderen Institutionen zu
bilden.
2.2.3 Risiken und Auswirkungen
Durch die Konsumption von Milch und Milchprodukten sowie anderen
Lebensmittelprodukten, die mit Antibiotikarckstnden kontaminiert sind, ist
insbesondere bei berempfindlichen Menschen die Auslsung von Allergien als
bedeutsames toxikologisches Risiko anzusehen. Bis heute gelten noch die -
Lactam-Antibiotika, vor allem Penicilline, als die Hauptursache fr die allergischen
Reaktionen [TORRES et. al., 2003]. Darber hinaus werden allergische Reaktionen
auf Tetracyclinen und Makroliden nach dem Konsum von Lebensmitteln, die mit
Antibiotikarckstnden belastet sind, berichtet [WOODWARD, 1991].
Reaktionen auf die Aufnahme von Antibiotika knnen sofort oder spter kommen,
wobei als mgliche klinische Symptome z. B. mehr oder weniger schwere
Hautreaktionen, aber auch anaphylaktischer Schock sein knnen [WOODWARD, 1991;
BLANCAet. al. 2002].
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Ein weiteres Risiko ist das zunehmende Auftreten bakterieller Resistenzen.So wird
eine Therapie von Patienten, die mit antibiotikaresistenten Bakterien infiziert worden
sind, sehr schwierig und sogar unmglich. Laut Schtzungen der
Weltgesundheitsorganisation (WHO) ist jhrlich etwa ein Drittel aller Todesflle auf
Infektionen zurckzufhren. Die Aufnahme von bereits resistenten Bakterien ber
tierische Lebensmittel oder der Austausch von Resistenzgenen zwischen nicht
pathogenen Bakterien und Krankheitserreger stellen groe Risiken dar. Die zwischen
Mensch und Tier bertragbaren Krankheiten (Zoonosen) sind wegen ihrer schlechten
Therapierbarkeit ein besonderes Risiko, wie zum Beispiel Darminfektionen durch
Salmonellen. [MICHEL, 2010]
Hinsichtlich der Milchverarbeitungsbetriebe gibt es technologische Probleme bzw.Risiken, die durch kontaminierte Milch hervorgerufen werden knnen. Die
Rckstnde in der kontaminierten Milch knnen die fr Fermentation bentigten
Milchsurebakterien abtten, so dass dies zu Verlusten bei der Herstellung von
fermentierten Milchprodukten wie Joghurt, Kse, Butter und Sauermilcherzeugnissen
fhren kann [QUANDT,2006].
2.3 Rechtliche Rahmenbedingungen
2.3.1 Gesetzlich festgelegte Rckstandshchstmengen
Die Rckstandsfreiheit von Milch wird schon seit langem gefordert. Im LMBG
(Lebensmittel- und Bedarfsgegenstndegesetz) in der Fassung von 1974, wird aus
Grnden des Verbraucherschutzes die weitgehende Rckstandsfreiheit von
Lebensmitteln gefordert. Da eine absolute Rckstandsfreiheit unter Bercksichtigung
der Mglichkeiten der modernen Rckstandsanalytik bei behandelten Tieren kaumerreicht werden kann, muss bei der Beurteilung zwischen akzeptablen und nicht
akzeptablen Rckstnden unterschieden werden.
Im Jahr 1990 wurden in der Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 sog. MRL-Werte
(Maximum Residue Limit bzw. Rckstandshchstmengen) definiert [HEESCHEN,
2010]. Nach ber 20 Jahren wurde diese Verordnung 2009 durch die EU -
Rckstandshchstmengen-Verordnung VO (EG) Nr. 470/2009 ersetzt, die seit
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Februar 2010 durch die Verordnung (EU) Nr. 37/2010 ergnzt wird. In dieser
Verordnung sind alle MRL-Werte pharmazeutisch wirksamer Substanzen, welche in
der Verordnung (EG) Nr. 470/2009 zugelassen sind, je nach Art der tierischen
Lebensmittelprodukte geregelt.
Tabelle 2: Festgelegte Rckstandshchstmengen in Milch in g/kg nach derVerordnung (EG) Nr. 37/2010
Antibiotikaklasse WirkstoffMRL in Milch
[g/kg]
Beta-LactameBenzylpenicillin (Penicillin G) 4
Ceftiofur 100
Makroliden
Azithromycin -
Clarithromycin -
Erythromycin 40
Tylosin 50
TetracyclinenTetracyclin 100
Doxycyclin -
Sulfonamide Sulfamethoxazol -
Diaminopyrimidin Trimethoprim 50
Amphenicol Chloramphenicol nicht zugelassen
Die MRL-Werte sind aus den Anhngen der ehemaligen VO 2377/90 beibehalten,
jedoch in neuer Sortierung aufgefhrt. Unterschieden wird in zulssige Stoffe
(Tabelle 1 der Verordnung) und verboteneStoffe (Tabelle 2 der Verordnung).
Diese Regelungen werden auch im LFGB (Lebensmittel- und
Futtermittelgesetzbuch), 10, aufgegriffen. Demnach ist es verboten, tierische
Lebensmittel in den Verkehr zu bringen, wenn Tierarzneimittel mit
Anwendungsverbot eingesetzt wurden, Hchstmengen berschritten wurden oder
festgelegte Wartezeiten nicht eingehalten wurden.
Demzufolge wird ein Antibiotika-haltiges Produkt bei berschreitung des jeweiligen
MRL-Werts (also konzentrationsabhngig) unter lebensmittelrechtlichen Aspekten als
nicht verkehrsfhig beurteilt.
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2.3.2 ADI-Werte (Acceptable Daily Intake)
Bei der Festlegung von Rckstandshchstmengen bzw. MRL fr Antibiotika wird sog.
mikrobiologischer ADI-Wert (Acceptable Daily Intake) verwendet [EMEA/CVMP,
2002]. Zum Beispiel fr Trinkwasserprobe, wobei keine festgelegten
Rckstandshchstmengen vorhanden sind, knnen zur Beurteilung des
regelmigen tglichen Trinkwassergebrauchs ADI-Werte verwendet werden. Der
ADI-Wert wird in der Einheit mg pro Kilogramm Krpergewicht [mg/kg KG]
angegeben.
In der folgenden Tabelle werden vorhandene ADI-Werte in g/kg KG/Tag fr die
untersuchten Wirkstoffe nach dem Expertengremium der JECFA (Joint FAO/WHO
Expert Committee of Food Additives) sowie nach CVMP (Committee for Medicinal
Products for Veterinary Use)/EMEA (European Medicines Agency) dargestellt.
Tabelle 3: Aktuelle vorhandene ADI-Werte verschiedener Antibiotika nach JECFAsowie nach CVMP/EMEA in g/kg KG [http://www.ema.europa.eu/ema/],[http://apps.who.int/food-additives-contaminants-jecfa-database/]
WirkstoffADI [g/kg KG/Tag]
nach JECFA
ADI [g/kg KG/Tag]
nach CVMP/EMEA
Ceftiofur 50 2
Penicillin G 30 /
Erythromycin 0,7 5
Tylosin 30 6
Tetracyclin 30 3
Doxycyclin / 3
Trimethoprim / 4,2
http://www.ema.europa.eu/ema/http://apps.who.int/food-additives-contaminants-jecfa-database/search.aspxhttp://apps.who.int/food-additives-contaminants-jecfa-database/search.aspxhttp://www.ema.europa.eu/ema/ -
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Sollte kein ADI-Wert fr den untersuchten Wirkstoff vorhanden sein, kann aus den
verfgbaren toxikologischen Daten von verschiedenen Institutionen ein
gesundheitlicher Leitwert fr Trinkwasser abgeleitet werden. Wenn die gefundenen
Konzentrationen unter dem Leitwert liegen, kann ausgeschlossen werden, dass vom
lebenslangen tglichen Gebrauch des Trinkwassers eine Gesundheitsschdigung
ausgeht. Die Anforderung des 6 Abs. 1 der TrinkwV 2001 ist dann erfllt. [LFU
BAYERN, 2010 ]
2.3.3 Kriterien der analytischen Methoden
Die Kommissionsentscheidung 2002/657/EG definiert die Kriterien fr die
Durchfhrung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen sowie dieallgemeinen Anforderungen hinsichtlich Probenbehandlung, Analysendurchfhrung
sowie Interpretation der Ergebnisse. Das Dokument legt zudem Leistungskriterien fr
Screening- und Besttigungsmethoden fr alle Tierarzneimittelrckstnde gem
Richtlinie 96/23/EG. Fr die quantitative Bestimmung werden in diesem Dokument
die Durchfhrung der Validierung sowie die Anforderungen an die Validierung
beschrieben.
In der Komissionsentscheidung 2003/181/EG werden die gefrderten
Mindestleistungsgrenzen (Minimum Required Performance Limit, MRPL) fr
verbotene Stoffe bzw. Stoffe, fr die keine zulssigen Grenzwerte festgesetzt worden
sind, fr einige Wirkstoffe definiert. Zum Beispiel wird fr Chloramphenicol ein MRPL-
Wert von 0,3 g/kg festgelegt.
2.4 Analytik von Antibiotika
In der modernen instrumentellen Analytik kommt die Kopplung von
Hochleistungsflssigkeitschromatographie an einen Massenspektometer immer
strker zum Einsatz. Diese Methode ist besonders durch die Empfindlichkeit und den
geringen Zeitaufwand fr die Routineanalytik sehr gut geeignet. Auch die Analytik
von Antibiotikarckstnden in Lebensmitteln wurde in den letzten Jahren in sehr
vielen Untersuchungen fast ausschlielich mit LC-MS/MS-Technik durchgefhrt. In
dieser Masterarbeit wurde eine LC-MS/MS-Multimethode mit
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Elektronensprayionisierung (ESI) fr die quantitative Bestimmung von elf
verschiedenen Antibiotika aus sechs verschiedenen Familien entwickelt und validiert.
Neben der LC-Trennung, der ESI-Ionisierung und der massenspektrometrischen
Detektion hat vor allem auch die Probenaufbereitung einen entscheidenden Einfluss
auf die Leistung der Gesamtmethode. In diesem Fall bietet sich die
Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction, SPE) als zuverlssige
Extraktionsmethode an, wobei in der Regel organische Stoffe auf polymeren
funktionalisierten Adsorbermaterialien bis in den tiefen ng/l-Bereich quantifiziert
werden knnen [SINGERet al., 2009].
Eine Analysenmethode bestehend aus SPE, LC und MS/MS bietet damit im Prinzip
die Mglichkeit, sowohl eine Identifizierung als auch Quantifizierung von Antibiotika
im tiefen Spurenbereich durchzufhren.
2.4.1 Solid-Phase-Extraktion
Die Probenvorbereitung beeinflusst den spteren Analysenschritt mittels LC-MS/MS
und ist daher sehr wichtig fr eindeutige Identifikation und Quantifizierung von
untersuchten Analyten.
Wegen der Komplexitt von Lebensmittelmatrizen sowie der in Lebensmitteln
vorhandenen Kontaminanten ist eine Analyse von Analytverbindungen in sehr
geringem Konzentrationsbereich (ppb bis ppt) fast nur nach Pre-Konzentrierung- und
Aufreinigungsschritten mglich. Somit sind die Analyten besser fr Trennung und
Detektion geeignet. In bioanalytischen Methoden werden oft Flssig-Flssig-
Extraktion (Liquid-Liquid Extraction, LLE) und Festphasenextraktion (Solid Phase
Extraction, SPE) zur Probenvorbereitung verwendet [TRK, 2007, WANGet al., 2012].
In der vorliegenden Arbeit wird die letztere Methode angewendet.
SPE ist derzeit die wichtigste Methode zur Probenaufreinigung und hat langsam LLE
ersetzt. Die Vorteile liegen im Vergleich zur Flssig-Flssig-Extraktionen u. a. in dem
geringeren Lsemittelverbrauch, der geringen Probenmenge, den hheren
Anreicherungsfaktoren und dem geringeren Zeitaufwand [FRITZ UND MACKA,2000].
-
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Theoretischer Teil
20
Abbildung 8: SPE-Gert mit Vakuum und SPE-Kartuschen unterschiedlicher Formate
[UNIVERSITAT JAUME I,2013/2014]
SPE wird vor allem zur Aufreinigung flssiger Proben verwendet und kann halb-
flchtige oder nicht-flchtige Analyte extrahieren. Zudem dient SPE auch zur
Probenkonzentrierung, z. B. von festen Proben zu Lsungen.
Die Auswahl an Sorbentien ist der wichtigste Faktor in SPE, da dies wichtige
Parameter wie Selektivitt, Affinitt und Kapazitt beeinflussen kann. Die Auswahl
hngt vor allem von den Analyten und ihren physikalisch-chemischen Eigenschaftenab, welche deren Wechselwirkung mit dem verwendeten Sorbent definieren. Die
Arten von SPE-Sorbentien variieren von chemisch gebundenen Kieselsuren, z. B.
C8 und C18 organische Gruppen, bis graphitisiertem Karbon, Ionenaustauscher und
polymeren Verbindungen. [WANGet al., 2012]
In der SPE kommen ausschlielich Sorbentien aus Silika und Polymer oft zum
Einsatz. Fr die Anreicherung verschiedener Antibiotika aus verschiedenen
biologischen Matrices werden meistens Polymermaterialien oder hnliche Ko-
Polymere verwendet [TRK, 2007]. In der vorliegenden Arbeit wird Sorbent aus
Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymere (PS-DVB) verwendet.
Polymeres Sorbent ist im Vergleich zu Silika-Sorbent in breitem pH-Bereich stabiler.
Auerdem enthlt Silika-Sorbent Silanol, welches an einigen Verbindungen, z. B.
Tetracycline, irreversibel binden kann. [WANGet al., 2012]
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SPE besteht normalerweise aus drei Schritten, und zwar Konditionieren,
Probenladung und Elution. Ein Aufreinigungsschritt resultiert so, indem strende
bzw. nicht relevante Matrixkomponente wie z. B. Salze nicht extrahiert, und/oder
diese vor dem Elution bei dem Waschschritt von dem Sorbent entfernt werden
knnen.
Abbildung 9: Prinzip der SPE-Methode [UNIVERSITAT JAUME I,2013/2014]
2.4.2 LC-MS/MS-Technik
In verschiedenen Literaturen hat sich die Kopplung der Flssigchromatographie aneinen Massenspektrometer (LC-MS/MS) aufgrund der guten Selektivitt,
Schnelligkeit und Nachweisempfindlichkeit sowie der breiten Erfassbarkeit von
polaren und unpolaren Analyten bei Analysen von verschiedenen Antibiotika als
zuverlssige Methode herausgestellt. Fr die Kopplung kommt ausschlielich die
Ionisierung bei Atmosphrendruck (Atmospheric Pressure Ionization, API)
einschlielich der Elektrospray Ionisation (ESI) und der Ionisierung unter
atmosphrischem Druck (APCI), die sich fr die Analyse vieler umweltrelevanter
Verbindungen bis zu einem m/z-Verhltnis von 4000 amu, von ionischen
Verbindungen bis hin zu PAKs eignet [LBCKE, 2004].
2.4.2.1 Flssigchromatographie
Die Flssigchromatographie (Liquid Chromatography, LC) dient zur Auftrennung von
Stoffen aufgrund ihrer chemischen Struktur. Dabei wird die untersuchende Substanz
zusammen mit dem Laufmittel oder sogenanntes Eluent durch die Trennsule
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gepumpt, welche die stationre Phase enthlt. Die heutzutage am hufigste, auch in
der vorliegenden Arbeit eingesetzte Art der LC ist die
Hochleistungsflssigkeitschromatographie (High Performance Liquid
Chromatography, HPLC).
Abbildung 10: Aufbauprinzip eines HPLC-Systems [UNIVERSITAT JAUME I,2013/2014]
Es gibt auch viele Varianten der LC, welche von dem Trennprinzip zu unterscheiden
sind.
In den Literaturen bestehen die meisten Methoden zur Untersuchung vonAntibiotika aus flssigkeitschromatographischen Trennungen mit RP-18-Phasen.
In der vorliegenden Arbeit wird daher nur auf die Umkehrphasen-HPLC (Reversed
Phase Liquid Chromatography, RP-LC) eingegangen, wobei das Trennprinzip in
der Verteilung (und Adsorption) liegt. Hierbei sind organische stationre Phasen (z.
B. Alkylketten) an Kieselgelpartikel oder an ein Polymer gebunden, weshalb die
stationre Phase sich im Gegensatz zu den Normalphasen-HPLC (Normal Phase
Liquid Chromatography, NP-LC) unpolar bzw. hydrophob verhlt [ETHZRICH]. Der
Trennmechanismus basiert auf Van-der-Waals-Krften. Je hnlicher der Analyt der
Kohlenwasserstoffkette der Phase ist, umso grer sind seine Wechselwirkungen mit
der Sule [UNIVERSITT WIEN]. Mit zunehmender Kettenlnge werden die Phasen
unpolarer. Fr die LC-MS/MS von Antiobiotikaanalytik werden Octadecyl- bzw. C18-
Ketten als Trgermaterial eingesetzt.
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Abbildung 11: Octadecylsilan (ODS, C18) [CHEMGAPEDIA]
Die meistgeigneten Lsungsmittel fr die RP-LC sind polare Lsungsmittel wie
Wasser, Methanol und Acetonitril, die sich aufgrund ihrer Oberflchenspannung und
Dielektrizittskonstanten gut fr die Elektronensprayionisierung eignen [CACH ET AL.,
2001]. So lassen sich in polaren Lsungsmitteln lsliche Substanzen trennen, was
auf die meisten fr biologische, medizinische, pharmazeutische und
umweltanalytische anwendungsrelevanten Molekle zutrifft [MATISSEK et al., 1992].
2.4.2.2 Tandenmassensp ektrom etrie (MS/MS)
Die Massenspektrometrie ist ein Verfahren, welches Ionen aufgrund ihres
unterschiedlichen Masse-zu-Ladungs-Verhltnis (m/z) trennt [OHLS, 2010]. Ein
Massenspektrometer besteht im Prinzip aus einem Interface zur Ionenerzeugung,
einem Analysator zur Ionenauftrennung und einem Detektor.
Es gibt verschiedene Ionisierungstechniken, die zum Einsatz finden:
Elektrospray-Ionisation (Electrospray Ionization, ESI)
Ionisierung unter atmosphrischem Druck (Atmospheric Pressure Chemical
Ionization, APCI)
Matrix-untersttzte Laser-Desorption/Ionisation (Matrix-Assisted Laser
Desorption Ionization, MALDI)
Chemische Ionisierung (Chemical Ionization, CI)
Elektronenstoionisation (Electrion Ionization, EI)
Die in dieser Arbeit verwendete Ionisierungstechnik ESI ist eine schonende, sanfte
Ionisierungsmethode, wobei nur geringe bis keine Fragmentierungen entstehen
[GALENSAet al., 1995].
ESI ist eine Zerstubungsmethode, bei der Ionen unter Verwendung von
Hochspannung und bei atmosphrischem Druck direkt aus der flssigen Phase in die
Gasphase berfhrt werden [HO et al., 2003]. Hierbei werden Ionen durch eine
Coulomb-Explosion (Zerfall) erzeugt [MEYER, 2009].
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Abbildung 12: Schematische Darstellung der ESI-Ionisierung[http://penyfan.ugent.be/labo/joelv/Esquire.html]
Zum Auftrennen der Ionen knnen verschiedene Massenanalysatoren eingesetzt
werden. Heute finden z. B. Quadrupole, Ion Trap, Orbitrap und Time-of-Flight
Analysatoren breite Anwendung. In der vorliegenden Arbeit wurden
Massenanalysatoren mit Triple-Quadrupolen verwendet.
Ein Triple-Quadrupol besteht aus vier gleich groen Metallstben, die in einemQuadrat angeordnet sind. An die jeweiligen Stbe werden eine positive bzw.
negative Gleichspannung und gleichzeitig Wechselspannung angelegt, so dass die
jeweils gegenberliegenden Stbe die gleiche Polaritt der Gleichspannung und die
gleiche Phase der Wechselspannung haben [LEHMANN, 1996]. Dadurch knnen nur
Ionen mit einem bestimmten m/z-Verhltnis auf einer stabilen Flugbahn den
Quadrupol passieren und den Detektor erreichen [BUDZIKIEWICZet al., 2003]. Ionen
mit einem anderen m/z-Verhltnis haben somit nicht stabile Flugbahnen und werdenauf die Stbe prallen, so dass sie nicht mit detektiert werden.
2.5 Methodenvalidierung
Fr eine zuverlssige quantitative Bestimmung ist es sehr wichtig, eine geeignete
Prfmethode zu verwenden. Diese Eignung ist im Rahmen einer
Methodenvalidierung zu verifizieren und zu dokumentieren.
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Fr die Validierung von quantitativen Besttigungsmethoden sollten die EU-weit
geltenden Anforderungen im Sinne der Kommissionsentscheidung 2002/657/EG
umgesetzt werden. Entsprechend der Entscheidung kann in dieser Arbeit die
Validierung nach dem herkmmlichen Validierungsansatz durchgefhrt werden.
Die gem der Kommissionsentscheidung zu validierten Prfparameter wie
Spezifitt, Kalibrierkurve (einschlielich Arbeitsbereich und Linearitt), Przision,
laborinterne Reproduzierbarkeit, Richtigkeit (Wiederfindung), Nachweis- und
Bestimmungsgrenze, sowie Stabilitt wurden mit VALISTAT (Prfkriterien nach
GTFCh, Gesellschaft fr Toxikologische und Forensische Chemie) ausgewertet.
Zustzlich werden in dieser Arbeit noch die Matrix-Effekte geprft.
Selektivitt (Spezifizitt)
Eine selektive Methode erfasst direkt interpretierbare Ergebnisse fr alle
interessierenden Wirkstoffe, wohingegen eine spezifische Methode direkt
interpretierbare Ergebnisse fr einen Wirkstoffe erfasst, whrend andere Wirkstoffe
sich gegenseitig stren knnen. Die Selektivitt kann geprft werden, indem die
Richtigkeit der Methode mit einem Standard, der alle denkbaren Matrixkomponente
enthlt, geprft und vergleicht wird und/oder die Analysen- und Messbedingungen
systematisch variiert werden. [KROMIDAS, 2011]
Arbeitsbereich
Zur Festlegung des Arbeits- bzw. Kalibrierbereiches werden die
Rckstandshchstmengen bercksichtigt, um zu schtzen, wie hoch der Analytgehalt
in der Probe sein knnte. Auerdem sollten auch die angeforderten
Mindestleistungsgrenzen (MRPL) nach 2003/181/EG bercksichtigt werden (s.2.3.3). Die intern festgelegte MRPL liegen bei IGV Prflabor bei 0,1*MRL, wobei alle
Kalibrierpunkte quidistant verteilt werden sollen.
Die Anzahl der Konzentrationsniveaus und der Messungen pro Konzentration sollte
sich auf die gesetzlichen Anforderungen beziehen. Im Dokument 2002/657/EG
werden mindestens fnf Konzentrationsniveaus einschlielich Nullpunkt empfohlen.
Fr jedes Niveau sollte nach Richtlinie der GTFCh der Messwert mindestens 6-mal
unter Wiederholbedingungen gemessen werden.
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Linearitt
Die Linearitt einer analytischen Methode ist ihre Fhigkeit, innerhalb eines
gegebenen Bereiches Testergebnisse zu liefern, die direkt proportional zur
Konzentration (Menge des Analyten in der Probe) sind. Mit dem Mandel-F-Test
(Signifikanzniveau: 99 %) wird berprft, ob quadratische Regression eine signifikant
bessere Anpassung als lineare hervorruft. Ist keine Signifikanz gegeben, kann eine
lineare Anpassung verwendet werden [GTFCh, 2009].
Nachweis- und Bestimmungsgrenze
Bei einer Validierung werden zwei unterschiedliche analytische Grenzen bestimmt.
Die Nachweisgrenze (Limit of Detection, LOD) wird fr die qualitative Bestimmung
benutzt, das heit es wird geprft, ob der Wirkstoff in der Probe berhaupt
vorhanden ist. Fr eine quantitative Bestimmung wurde die Bestimmungsgrenze
(Limit of Quantitation, LOQ) bentigt.
Wenn das Analyseergebnis unterhalb der Nachweisgrenze liegt, wird es als nicht
nachweisbar deklariert. Zwischen Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze ist eine
quantitative Aussage noch nicht mglich. Erst wenn die Analysenwerte grer als dieBestimmungsgrenze sind, darf eine quantitative Aussage getroffen werden.
In der Kommissionsentscheidung 2002/657/EG werden die LOD und LOQ mit
Entscheidungsgrenze CCund Nachweisvermgen CC ersetzt. In der vorliegenden
Arbeit werden jedoch lediglich LOD und LOQ bestimmt.
Przision
Unter Przision wird der Grad der Streuung der einzelnen Werte um den Mittelwertverstanden und ist somit ein Ma fr die zuflligen Fehler. Przision wird
normalerweise als Unprzision ausgedruckt und als Standardabweichung (SD)
bzw. relative Standardabweichung (RSD) berechnet. In der Praxis knnen
unterschiedliche Przisionsarten bestimmt werden. Unter Wiederholprzision wird
die Przision verstanden, welche unter Wiederholbedingungen innerhalb kurzer
Zeitabstnde erhalten wird, d. h. unabhngige Ergebnisse mit demselben Verfahren,
Material (Probe), Bearbeiter, Gerten und innerhalb desselben Labors werden
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erhalten. Zudem steht die Laborprzision, welche unabhngige Messergebnisse
desselben Materials, innerhalb eines Labors bei bewusster nderung eines
Parameters (z. B. Bearbeiter, Gert, Zeit) liefert. Eine bliche Variante ist die
Bestimmung der tagesverschiedenen Laborprzision, wobei eine Probe an mehreren
aufeinander folgenden Tagen untersucht wird. [KROMIDAS,2011]
Richtigkeit/Wiederfindung
Richtigkeit und Przision werden unter dem Oberbegriff Genauigkeit
zusammengefasst. Unter Richtigkeit wird der Ma fr die Abweichung des
Mittelwertes vom richtigen Wert, dem Soll- bzw. wahrer-Wert aufgrund eines
systematischen Fehlers (Bias), verstanden. [KROMIDAS,2011]
Die berprfung von Richtigkeit kann anhand von Referenzmaterialien erfolgen.
Sollte ein solches Referenzmaterial nicht vorhanden sein, kann die Richtigkeit mittels
Wiederfindung durch Aufstocken einer Leermatrix bestimmt werden [2002/657/EG].
Stabilitt/Robustheit
Die Untersuchung der Stabilitt von Probenlsungen hat einen Einfluss auf die
Verfahrensstabilitt und somit auch auf die Robustheit der Methode. Da die Stabilitt
eines Analyten vom Zeitpunkt der Probenahme bis zum Ende der Analyse
gewhrleistet sein sollte. Hier sind sowohl die Stabilitt von Standardlsungen als
auch von Probenlsungen z. B. durch lange Standzeiten auf dem Autosampler, von
Bedeutung.
Robustheit ist laut 2002/657/EG die Anflligkeit einer Methode gegenber
nderungen in den Versuchsbedingungen. Zur Untersuchung der Robustheit knnenauer der Prfung auf Stabilitt die Variationen der Versuchsbedingungen z. B. pH-
Wert, Temperatur sowie die berprfung der Anwendbarkeit (Wechsel von
Anwender, Gert) sein [KROMIDAS, 2011].
Matrix-Effekte
In der Routineanalytik ist es blich mit einer Lsungsmittelkalibrierung zu arbeiten,
da die Matrixgewinnung zur Verwendung einer Matrixkalibrierung relativ aufwndig
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ist. Jedoch knnen das Vorhandensein von Matrix in der Probenmesslsung und
somit die darin enthaltenen nicht-Zielanalyten oder andere strende Substanzen zu
einer Vernderung des Messsignals fhren und damit die Quantifizierung
verflschen. Obwohl die LC-MS/MS Analyte trotz Anwesenheit von Matrix hoch
selektiv messen kann, knnen Matrixeffekte sowohl zu Signalschwankungen (ion
suppression) als auch zu Signalerhhungen (ion enhancement) fhren [BECKER,
2005]. Aus diesen Grnden ist es notwendig zu prfen, dass zwischen
Lsungsmittel- und Matrixkalibrierung keine signifikanten Unterschiede bestehen.
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Material und Methoden
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3. Material und Methoden
3.1 Gerte und sonstige Materialien
3.1.1 Kolbenhubpipetten mit Pipettenspitzen 1-10 l, 10-100 l, 100-1000 l und 2-2,5 ml
3.1.2 15-ml-Polypropylen-Einmal-Zentrifugenrhrchen, mit Schraubverschluss
3.1.3 Zentrifuge 5430R (Eppendorf)
3.1.4 Vortexmischer
3.1.5 pH-Meter
3.1.6 Vials (1,5 ml)
3.1.7 SPE-Gert Agilent Technologies mit Vakuum
3.1.8 SPE-Sule BEKOlutLEOX, 3 ml, 200 mg
3.1.9 LC-MS/MS Gert API 4000 QTRAP (Fa. Applied Biosystems mit HPLCAnlage der Fa. Dionex)
3.1.10 HPLC Sule KinetexC18 (Fa. Phenomenex)
3.2 Chemikalien und Reagenzien
Soweit nicht anders angegeben, wurden analysenreine Chemikalien verwendet. Die
Lsungsmittel waren von hoher Reinheit und fr das LC-MS/MS geeignet.
3.2.1 Lsungsmittel
3.2.1.1 Methanol LC-MS Chromasolv (Fa: Fluka, CAS: 47-56-1)
3.2.1.2 Acetonitril LC-MS Th.Geyer (Fa: J.T. Baker, CAS: 75-05-8)
3.2.1.3 3-fach destilliertes Wasser LC-MS
3.2.2 Chemikalien und Reagenzien
3.2.2.1 Isopropanol fr LC-MS (Fa: Chemsolute, CAS: 67-63-0)
3.2.2.2 Ameisensure 99100 % (Th.Geyer, Fa: Chemsolute, CAS: 64-18-6)
3.2.2.3 Essigsure 99100 %
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Material und Methoden
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3.2.3 Lsungen
3.2.3.1 Extraktionsmittel, Acetonitril:Wasser:Essigsure (10:90:0,1)
100 ml Acetonitril (4.2.1.2) werden mit 900 ml Wasser (3.2.1.3)
gemischt und anschlieend mit 1 ml Essigsure (99 100 %ig)
(3.2.2.3) versetzt.
3.2.3.2 Mobile-Phase-Lsung, Methanol:Wasser (90:10, v/v)
100 ml Wasser (3.2.1.3) werden mit 900 ml Methanol (3.2.1.1)
vermischt.
3.2.3.3 Laufmittel A, 0,1 % Ameisensure in Wasser:
1 ml Ameisensure (99 100 %ig) (3.2.2.2) werden mit Wasser
(3.2.1.3) auf 1000 ml verdnnt.
3.2.3.4 Laufmittel B, 0,1 % Ameisensure in Methanol
1 ml Ameisensure (99 100 %ig) (3.2.2.2) werden mit Methanol
(3.2.1.1) auf 1000 ml verdnnt.
3.2.3.5 Kolbensplung fr das LC-MS/MS-Gert10 ml Isopropanol (3.2.2.1) werden mit 190 ml Wasser (3.2.1.3)
vermischt.
3.2.4 Standardlsungen
Zur Herstellung von Standard- und Kalibrierlsungen wurden reine Standards der
Wirkstoffe von der Firma Neochema bezogen. Die Standards wurden in 5 ml
Flaschen geliefert und waren in Acetonitril (MeCN) gelst. Sie wurden bei -18C im
Tiefkhlschrank aufbewahrt. Als interner Standard (ISTD) wurden isotopenmarkierte
Standards Trimethoprim-13C3 (ISTD_pos) sowie Bezafibrate-D4 (ISTD_neg) aus
Universitt Bonn verwendet. Die verwendeten Standardsubstanzen sind in Tabelle 4
aufgelistet.
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Material und Methoden
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Tabelle 4: Standardsubstanzen fr die Validierung
Arzneistoff CAS-Nr. Konzentration [g/ml]
Azithromycin 83905-01-5 100,00
Chloramphenicol 56-75-7 100,00
Ceftiofur 80370-57-6 100,00
Ciproflaxacin 85721-33-1 100,00
Clarithromycin 81103-11-9 100,00
Doxycyclin-monohydrat 17086-28-1 100,00
Erythromycin 114-07-8 100,00
Penicillin G-Ka 113-98-4 100,00
Sulfamethoxazol 723-46-6 100,00Tetracyclin-HCl 64-75-5 100,00
Trimethoprim 738-70-5 100,00
Tylosin-tartrat 74610-55-2 100,00
Trimethoprim-13C3 1189970-95-3 100,00
Bezafibrate-D4 1189452-53-6 100,00
Fr die Matrix-basierte Kalibrierreihe fr Milch sowie zum Aufstocken der Milchprobe
fr Wiederfindungsexperimente wurde ein Mix aus allen Antibiotikastandards
hergestellt. Hierfr wurden die Standardsubstanzen mit MeOH, welches auch als
mobile Phase fr die sptere Messung mit LC-MS/MS diente, je nach Antibiotika auf
eine Endkonzentration von 0,06 g/ml 0,08 g/ml, 0,2 g/ml, 0,8 g/ml, 1 g/ml und 2
g/ml (siehe Tabelle 5) hergestellt. Fr Wasseranalyse wurde ein Mix mit einer
Endkonzentration von 25 g/L hergestellt (siehe Tabelle 6).
Von den internen Standards wurde jeweils eine Standardlsung hergestellt. Diese
Standardlsung wurde sowohl fr die Matrix-Kalibrierung (nur bei Milchanalyse) als
auch fr die Dotierung der Matrix am Beginn der Extraktion verwendet. Fr
Milchanalyse wurden 100 l des ISTD Trimethoprim-13C3 Standards (100 g/ml) bzw.
10 l des ISTD Bezafibrate-D4 Standards (100 g/ml) mit Methanol auf 10 ml
aufgefllt. Dies entspricht einer Konzentration von 1 g/ml (ISTD_pos) bzw. 0,1 g/ml
(ISTD_neg). Fr Wasseranalyse wurden jeweils 50 l des ISTD Standards mit
Methanol auf 10 ml aufgefllt. Dies entspricht einer Konzentration von je 50 g/L(siehe Tabelle 6).
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Material und Methoden
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Tabelle 5: Herstellung der Standardmix fr Milch
Endkonz.(g/ml)
Vol. aus 100 g/mlStandard (l)
Endvolumen(ml)
CEFT, TC 2 200 10TYL, TMP 1 100 10
EM 0,8 80 10
AZI, CM, DC, SMTX 0,2 20 10
PEN G 0,08 8 10
CAP 0,06 6 10
ISTD_pos 1 100 10
ISTD_neg 0,1 10 10
Tabelle 6: Herstellung der Standardmix fr Wasser
Endkonz.(g/L)
Vol. aus 100 g/mlStandard (l)
Endvolumen(ml)
Alle Analyten 25 2,5 10
ISTD_pos 50 5 10
ISTD_neg 50 5 10
3.2.5 Kalibrierreihe
In Tabelle 7 und 8 sind die Konzentrationen der einzelnen Kalibrierpunkte fr Milch-
bzw. Wasseranalyse aufgelistet. Als Lsemittel fr die Kalibrierlsungen fr
Wasseranalyse wurde eine Mischung von 90:10 Methanol:Wasser (3.2.3.2)
verwendet.
Tabelle 7: Herstellung der Kalibrierreihe fr Milch
K0 K1 K2 K3 K4 K5
- 0,1*MRL 0,5*MRL 0,75*MRL 1,0*MRL 1,5*MRL
V Standards-Mix in l 0 5 25 50 75 100
V ISTD pos (1 g/ml) inl
15 15 15 15 15 15
V ISTD neg (0,1 g/ml)
in l 20 20 20 20 20 20Matrix in l 965 960 940 915 890 865
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Endkonzentration ing/L:
CEFT, TC 0 10 50 75 100 150
TYL, TMP 0 5 25 37,5 50 75
EM 0 4 20 30 40 60
AZI*, CM*, DC*, SMTX* 0 1 5 10 15 20
PEN G 0 0,4 2 3 4 6
CAP* 0 0,3 1,5 2,25 3 4,5
ISTD_pos 15 15 15 15 15 15
ISTD_neg 2 2 2 2 2 2
*Wirkstoffe ohne MRL
Tabelle 8: Herstellung der Kalibrierreihe fr Wasser
K0 K1 K2 K3 K4 K5
V Standards-Mix in l 0 1 2 4 8 12
V ISTD pos (50 g/L) inl
2 2 2 2 2 2
V ISTD neg (50 g/L) inl
2 2 2 2 2 2
Lsemittel in l 996 995 994 992 988 984
Endkonzentration ing/L:
Alle Analyten 0 0,025 0,05 0,1 0,2 0,3
ISTD_pos und ISTD_neg 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
3.3 Extraktion und Aufreinigung mittels SPE
In den folgenden Punkten 3.3.1 und 3.3.2 werden die optimierten Methoden (End-
Methoden) fr die Analyse von Antibiotikarckstnden in Milch und Wasser
beschrieben. Die beiden Methoden basieren auf SPE-Applikationen der Firma
BEKOlut, die im Rahmen dieser Arbeit optimiert wurden.
3.3.1 Milchprobe
2,0 0,002 g Milch wurden in ein leeres 15 ml Falkon-Rhrchen eingewogen.
Danach wurden die ISTDs (bzw. auch der Antibiotikastandardmix zur Untersuchung
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Material und Methoden
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der Wiederfindung) zugegeben. Das Gemisch wurde 1 Minute mit Hilfe des
Vortexmischers homogenisiert und dann 10 Minuten stehen gelassen. 5 ml
Extraktionsmittel (3.2.3.1) wurden in die Milch zugegeben und das Gemisch wurde
15 Sekunden krftig von Hand geschttelt und dann wieder bei Raumtemperatur
stehen gelassen. In dieser Zeit erfolgte bereits eine Phasentrennung. Danach wurde
das Gemisch fr 15 Minuten bei 4000 g zentrifugiert. Der berstand wurde nach dem
Zentrifugieren in ein neue
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