epigenetika - rna interference
Post on 11-Jan-2016
85 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
Epigenetika- RNA interference
Cenorhabditis elegans
Objev RNA interference (1998)- umlčování exprese genů dvojvláknovou RNA
Antisense RNA (= RNA komplementární k mRNA) umlčuje expresi
(již počátek 80. let 20. století)
určitý gen je možné umlčet vnesením antisense RNA(nebo přepisem genu v opačné orientaci)
- na základě komplementarity docházíke spojení mRNA a antisense RNA,
k tvorbě dsRNA
Jak antisense RNA umlčuje expresi?Původní (!) hypotézy: - antisense RNA mechanicky brání translaci- dsRNA (vč. mRNA) je degradována (RNázami)
Kosuprese u Petůnie
Výsledek: ztráta pigmentace v částech květu
Napoli et al. 1990 Plant Cell 2:279–289
Cíl: zvýšení exprese genu pro enzym syntézy pigmentu
Exprese antisense RNA méně účinná
Kosuprese u Petůnie
Napoli et al. 1990 Plant Cell 2:279–289
Mechanismus kosuprese?
Za co tedy dostali Nobelovku? - dělat kontroly se vyplatí!
vnesení i velmi malého množství dsRNA vede ke specifickému umlčení exprese (antisence RNA není zdaleka tak účinná!)
dsRNA tedy musí být signálem k umlčování!
Andrew J. Hamilton, David C. Baulcombe*(1999): A Species of Small Antisense RNA in Posttran-scriptional Gene Silencing in Plants
RNA interference (RNAi)= umlčování exprese genů prostřednictvím dsRNA, resp. malých RNA (small RNA, sRNA: 21-24(25)nt)
+ ochrana proti invazním nukleovým kyselinám+ role v udržování struktury chromatinu (metylace DNA)
„The precise role of 25-nt RNA in PTGS remains to be determined. However, because they are long enough to convey sequence specificity yet small enough to move through plasmodesmata, it is possible that they are components of the systemic signal and specificity determinants of PTGS.“
(Hamilton and Baulcombe 1999)
Univerzální kroky RNAi
dsRNA v buňce je štěpena enzymem Dicer(-like)na krátké dsRNA fragmenty – malé RNA (sRNA 21-24 nt)
protein Argonaut s jedním z vláken malé RNA (RISC: RNA induced silencing complex)
zprostředkovává rozpoznání komplementárních (cílových) sekvencí
Mechanismus účinku malých RNA
PTGS (posttranscriptional gene silencing ): - specifická degradace transkriptu nebo blokování translace
TGS (transcriptional gene silencing ):- metylace cytosinů v promotoru (RdDM), heterochromatinizace , bránění vazbě transkripčních faktorů
Pol V
Malé RNA- u rostlin je 3’ konec sRNA metylovaný (HEN1)• miRNA (micro) – z transkriptů RNA Pol II (pre-miRNA) – stovky MIR genů (působení in trans)
• siRNA (small interfering) – z dsRNA různého externího i interního původu - tisíce typů (působení in cis i in trans)
pre-miRNA
Wang et al. 2004
Enzymy RNAi dráhy: Dicer-like
- štěpení dsRNA (21-24nt)- v Arabidopsis 4 paralogy (různé funkce)
DCL1 – pre-miRNA (21,22 nt miRNA), siRNA z vlásenek
DCL3 – tvorba 24 nt siRNA pro TGS (RdDM)
DCL2, 4 – protivirová obrana a sekundární siRNA (21-22 nt)
ArgonauteRNA binding protein (20-26 nt RNA)- výběr vlákna (vliv 5’ nt, účast HSP90)
- u Arabidopsis 10 genů
- součást RISC (účast při PTGS): blokování translace nebo slicer (RNAse H-like endonuclease – PIWI doména)
- účast při TGS (RdDM)(RNA directed DNA methylation)
Mechanismus účinku malých RNAzávisí mj.(!) na míře komplementarity
- nekomplementarita v místě štěpení brání RNázové aktivitě
RNA polymerázy v RNAiDNA dependentní RNA polymerázy (Pol IV a Pol V) - příbuzné RNA polymeráze II (sdílejí řadu podjednotek) - rostlinně specifické
RNA polymeráza IV - transkripce oblastí s H3K9me2 a nemetyl. H3K4 (SHH1) - krátké transkripty (stovky nt), s čepičkou, bez polyA
- z nich se tvoří siRNA řídící de novo metylaci DNA
RNA polymeráza V - transkripce nutná pro metylaci DNA řízenou malými RNA
(RdDM); přepisuje metylovanou DNA (?) - vazba AGO4(2,6,9) pro rozpoznání cíl. sekvence
RNA polymeráza II – mechanismus nejasný
RNA polymerázy v RNAiRNA dependentní RNA polymerázy (RdRP, RDR)
- nutné pro tvorbu většiny siRNA v rostlinách
RDR2:- tvorba dsRNA na transkriptech RNA polymerázy IV dsRNA DCL3 siRNA RdDM
RDR6: - homolog RDR1 – role především v protivirové obraně - tvorba dsRNA na „divných“ RNA (bez polyA, bez čepičky) - tvorba dsRNA z produktů štěpení Ago = sekundární siRNA
(primární siRNA = na jejich vzniku se neúčastní sRNA)
Tvorba sekundárních siRNA
- cílová RNA (mRNA, virová RNA, TAS transkript) štěpena za účasti primární sRNA (miRNA či siRNA)
- RDR6 – syntéza komplementárního vlákna k rozštěpené RNA:dsRNA DCL2(4) sekundární siRNA
- sekundární siRNA- amplifikace signálu- tvorba siRNA z přilehlých sekvencí (transitivita)- jiné cílové molekuly – př. ta-siRNA (miRNA na TAS transkript) (trans-acting siRNA – rozšíření záběru miRNA)
Přehled - jak vzniká dsRNA?
(MIR gen)
?
• RdRP = RNA dependentní RNA polymeráza - syntéza komplement. vlákna k templátové ssRNA - transkripty přestřižené RISC (pak sekundární siRNA)
- poškozené mRNA (bez polyA či čepičky) - transkripty RNA polymerázy IV
Sekundární struktury virových RNA
Štěpení RISC (sekundární siRNA )
RNA-directed DNA methylation
- metylace (aktivitou DRM2) podmíněna interakcí AGO-siRNA s RNA Pol V (C-terminální doména velké podjednotky)
Pol IV a V – RNA polymerázyRDR2 - RNA dep.RNA polymerázaDCL3 – Dicer-like proteinAGO4 – Argonaute
DRM2 – de novo metyltransferaseDRD1 – chromatin remodelling proteinSHH1 – dual histon-code reading
(H3K9me2, H3K4)
SHH1
SHH1
Zhang et al. 2013
RNA directed DNA metylation- de novo metylace transpozónů v nových místech inzerce- teoreticky i v případech, kdy přenos informace (CMT2/3) z metylace histonu nemusí být spolehlivý (málo nukleozómů?)
SHH1
Zhang et al. 2013
Zemach et al. 2013
Dráhy RNAi u rostlin - přehledNatural antisense+ Inverted repeat
Molnár et al. 2011
(DNA methylation)
a b c d
+ sekundární siRNA (z jakéhokoli transkriptu štěpeného primární sRNA)
Tvorba siRNA z dsRNA není rovnoměrná - liší se místem, velikostí, výběrem vlákna, …
- převaha sense-spec. siRNA
- závisí na primárním spouštěči
sekundární siRNA (vzniklé transitivitou): štěpení mRNA - AGO1-siRNA, RDR6, DCL(4)
Roub s primárnítvorbou siRNA
Podnož(netransformovaná)
Šíření sRNA- plasmodesmy- floémem (= pasivně ve směru toku)- siRNA, částečně i miRNA
Systémová rezistencevůči virové infekci
- nově se tvořící listy jsou odolné vůči virové infekci (1928)
Vizualizace šíření umlčování- umlčování GFP mobilním signálem (od cévních svazků)
umlčování exprese GFP - zelená fl., červená = autofluorescence chlorofylu
- zvýšení exprese genu pro enzym syntézy pigmentu nečekaně způsobilo ztrátu pigmentace v částech květu
Kosuprese u Petůnie
K aberantním („podezřelým“) transkriptům vytváří RdRP (RDR6;= RNA dependentní RNA polymeráza) komplementární vlákno
- ze vzniklé dsRNA se tvoří malé RNA, které blokují expresi příslušného genu (transgenu in cis a interního rostlinného genu in trans)
Praktické využití při funkčních analýzách genů (modulaci exprese) – overexprese i knock-out jedním konstruktem!
dsRNA
Paramutaceinterakce (in trans) mezi homologními alelami (epialelami), která vede k dědičné změně v genové expresi jedné z alel
(epimutaci)
paramutagenní a paramutovatelná
alela
Mechanismus?
Paramutaceinterakce (in trans) mezi homologními alelami (epialelami), která vede k
dědičné změně v genové expresi paramutovatelné alely
- metylovaná, transkripčně neaktivní alela je přepisována Pol IV - z jejích transkriptů vznikají siRNA, které mohou in trans měnit epigenetický stav (metylaci) u homologních sekvencí
paramutagenní alela
paramutovatelná alela
MOP1 = homolog RDR2MOP2 = podj. Pol IV a V(mediator of paramutation)
Funkce RNAi a šíření sRNAna dlouhé vzdálenosti
- protivirová obrana - bránění nové infekci či šíření infekce
- obrana proti transpozónům – udržování heterochromatinu
- regulace vývojových procesů - prakticky všech
- regulace exprese v odpovědi na stres- regulace získávání živin - regulace příjmu (např. fosfor)
- epigenetická modulace genetické informace v meristému (zřejmě i dědičné změny)
- role v environmentálních dědičných (?) adaptacích (Lamarckismus)
Epigenetická regulace genové expreseve vývoji rostlin
- regulace především prostřednictvím miRNA (21 nt) (kódované jako pri-miRNA - štěpeny DCL1)
- u Arabidopsis stovky MIR genů
- někdy zprostředkováno ta-siRNA - nekódující TAS transkript (štěpený v důsledku nasednutí RISC s miRNA, RDR6, …)
- často šíření mezi sousedícími buňkami (non-cell autonomous)
- cílem jsou zpravidla geny pro regulační proteinynapř. transkripční faktory, komponenty ubiquitinační dráhy, … (omezená spolehlivost výsledků z promotorových fúzí bez transkriptu zkoumaného genu!)
př. úloha miRNA a ta-siRNA ve vývoji listu Arabidopsis
Pulido A , Laufs P J. Exp. Bot. 2010;61:1277-1291
př. ustavení polarity listu – gradient ta-siRNA
Pulido A , Laufs P J. Exp. Bot. 2010;61:1277-1291
Dvojí řešení se stejným výsledkem:
Arabidopsis:
- gradient dán místem expreseTAS3 a AGO7
Kukuřice:
- gradient dán místem expresemiR390
Epigenetická regulace genové expreseve vývoji rostlin
Fenotypové změny navozenépotlačením exprese určité miRNA
Fenotypové změny navozené expresí miRNA-resistentních variant cílových genů (stejný protein, jiná nukleotidová
sekvence)
Parentální imprinting- odlišná epigenetická modifikace (rodičovský vtisk) alel děděných od jednotlivých rodičů (vede k jejich odlišné expresi po splynutí gamet) = alela určitého genu je u jedné z gamet metylována
- paralelně vytvořeno u savců a krytosemenných rostlinPROČ – co mají společného
- vyvolává „hemizygotní“ stav a může sloužit pro zajištění přiměřené a vyrovnané výživy embryí, které se vyvíjejí v rámci mateřského organismu (= obrana proti vzniku paternálních alel vedoucích k nadměrné výživě embrya)- u krytosemenných rostlin význam v determinaci velikosti endospermu
Parentální imprintingimprint se ustavuje v průběhu meiozy (savci) či při vývoji gametofytu (rostliny)
u savců v průběhu gametogeneze dochází k celkové demetylaci (resetu) a následné metylaci vybraných genů v závislosti na pohlaví
u rostlin dochází k (rozsáhlejší) demetylaci jen v části gametofytu – v jeho „geneticky terminálních buň. liniích“:
- v centrální buňce zárodečného vaku (DME - DEMETER)- ve vegetativním jádře pylové láčky (blokování DDM1, DME)
Funkce: regulace velikosti endospermu (vlastní imprinting) spolehlivé umlčení TE v gametách (paralelní
epigenetický proces)
Epigenetické změny při vývoji pylu
Primární účel: zřejmě pojištění správné metylace TE v generativních buňkách (spermatických buňkách):
Demetylace ve vegetativním jádře – reaktivace TE – tvorba siRNA – transport do spermatických buněk – podpoření správné metylace TE
inhibici metylace (represe DDM1) ve vegetativním jádře pylové láčky, i aktivně DME
Epigenetické změny při vývoji zárodečného vaku
Primární účel: - blokování TE (a endospermově spec. genů)- regulace velikosti endospermu- blokování gametofytického vývojového programu? – umožnění vývoje embrya?
Prokázané formy mobilního umlčujícího signálu- na dlouhé vzdálenosti zatím 21nt miRNA a 24nt siRNA
?
Overview of miRNA-Mediated Gene Silencing.Pri-miRNAs are processed in the nucleus and mature miRNAs are exported to the cytoplasm. miRNAs are incorporated into AGO proteins and mediate posttranscriptional gene silencing
through slicing or translational inhibition or alternatively through DNA methylation....
Rogers and Chen 2013
- nutná k metylaci některých sekvencí
- napomáhá funkci Pol V (nebo jí nahrazuje)?- navádí Pol IV? - tvoří nekódující transkripty pro amplifikaci siRNA
RdDM – role Polymerázy II
top related