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ESCUELA POLITÉCNICA NACIONAL
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y AGROINDUSTRIA
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDO ASCÓRBICO Y LA PRESENCIA DE TERPENOS EN UN GRUPO DE BRIÓFITAS,
PROPIAS DE LA ZONA AMAZÓNICA NORTE DEL ECUADOR, EXPUESTAS A LA ACCIÓN DE UNA DOSIS DE GLIFOSATO
PROYECTO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENI ERA AGROINDUSTRIAL
EVELYN NATALIA PACHECO JIMÉNEZ evelyn.pacheco.jimenez@gmail.com
DIRECTORA: ING. FLORINELLA MUÑOZ BISESTI, PhD. florinella.munoz@epn.edu.ec
Quito, junio 2012
© Escuela Politécnica Nacional (2012)
Reservados todos los derechos de reproducción
DECLARACIÓN
Yo, Evelyn Natalia Pacheco Jiménez, declaro que el trabajo aquí descrito es de mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se incluyen en este documento.
La Escuela Politécnica Nacional puede hacer uso de los derechos correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional vigente.
__________________________
Evelyn Natalia Pacheco Jiménez
CERTIFICACIÓN
Certifico que el presente trabajo fue desarrollado por Evelyn Natalia Pacheco Jiménez, bajo mi supervisión.
_________________________ Ing. Florinella Muñoz B. PhD. DIRECTOR DE PROYECTO
AUSPICIO
La presente investigación contó con el auspicio financiero del proyecto PIS-022-2009 “Estudios preliminares sobre la acción del glifosato en plantas briófitas”, que se ejecuta en el Departamento de Ciencias Nucleares, Laboratorio de Investigaciones Aplicadas.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a mis padres Huguito y Marthita por su apoyo incondicional, por todos
los esfuerzos que han realizado día a día, por sus abrazos calurosos y sus sabios
consejos.
A mis hermanas Yessy, Churitos y Mary que han sido, junto a mis padres los
mejores ejemplos de mi vida, gracias por su apoyo, por ser mis grandes amigas
incondicionales que me han escuchado y aconsejado siempre.
A mis queridos cuñados Marito, Richi y Dave, que se han convertido en mis
hermanos gracias por siempre estar pendientes de mi.
A Gabrielito Alejandro, Ismael Arturito, Miguelito Emilio y Camilita Victoria, mis
amados sobrinitos, gracias por existir, llenar de alegría mi vida y ayudarme a
llegar a culminar esta meta alentándome a no desfallecer.
Agradezco a Santi por su apoyo, comprensión y la fortaleza que me entrega día a
día para seguir adelante superando cada obstáculo, gracias por ser parte de mi
vida y hacer que cada día sea especial para mí.
Jime te agradezco por tu amistad sincera, por estar allí en los buenos y malos
momentos, por tu apoyo incondicional durante estos seis años; Marit te agradezco
por tu amistad, sinceridad, cariño, hospitalidad y por todo el apoyo que me has
brindado.
Agradezco a Cata por haberme brindado además de sus conocimientos su gran
amistad y confianza.
A Paito, Mari, Roque, Glorita, Mercedes y Jenny gracias por brindarme su apoyo y
amistad en estos dos años. A la Doctora Florinella Muñoz gracias por permitirme
formar parte del laboratorio y desarrollar este proyecto de titulación, gracias por
brindarme su tiempo y conocimiento.
Agradezco a la Ingeniera Lucía Toledo por su apoyo incondicional, por sus
palabras de fortaleza y cariño que me han enseñado mucho.
Gracias también a mis amigos de la Dirección de Relaciones Institucionales y del
Departamento de Servicios Generales de la EPN, que han estado pendientes de
mi siempre, me han aconsejado y me han brindado un espacio de trabajo muy
acogedor; gracias Ivo, Pathito, Luchito, Loly, Marthita, Gonza, Elsita, Wily, Ela,
Vero y Antoñito. Además agradezco al Ingeniero Pablo Angulo por su
comprensión, consejos y apoyo.
DEDICATORIA
A Dios, a mi hermosa familia y a Santi
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS
PÁGINA
NOMENCLATURA XI GLOSARIO XII RESUMEN XIII INTRODUCCIÓN XV
1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1
1.1. Plantas briófitas 1
1.1.1. Taxonomía y distribución 1
1.1.2. Morfología general 2
1.1.3. Importancia de las briófitas 3
1.1.3.1. Importancia ecológica 3
1.1.3.2. Importancia cultural 4
1.1.3.3. Importancia fitoquímica 5
1.1.4. Usos de las plantas briófitas 5
1.2. Terpenos 6
1.2.1. Descripción 6
1.2.2. Clasificación de los terpenos 7
1.2.2.1. Monoterpenos 8
1.2.2.2. Sesquiterpenos 8
1.2.2.3. Diterpenos 9
1.2.2.4. Triterpenos 10
1.2.2.5. Tetraterpenos 10
1.2.3. Biosíntesis de terpenos 11
1.2.4. Identificación y extracción de terpenos 13
1.3. Antioxidantes 14
1.3.1. Generalidades 14
1.3.2. El Ácido ascórbico 15
1.3.2.1. Estructura 16
1.3.2.2. Propiedades 16
ii
1.3.2.3. Determinación 17
1.3.2.4. Usos del ácido ascórbico 17
1.4. Glifosato 18
1.4.1. Características generales 18
1.4.2. Mecanismo de acción del glifosato 19
1.4.3. Comportamiento del glifosato en el suelo 21
1.4.4. Efectos del glifosato sobre el medio ambiente y la salud humana 21
2. PARTE EXPERIMENTAL 23
2.1. Obtención de extractos vegetales 24
2.1.1. Recolección y acondicionamiento de plantas briófitas 24
2.1.2. Métodos utilizados para la obtención de extractos de plantas briófitas
para la determinación de la presencia de terpenos 25
2.1.2.1. Método de extracción soxhlet con metanol 26
2.1.2.2. Método de extracción con metanol asistida con ultrasonido 27
2.1.2.3. Método de extracción y maceración con metanol 30
2.2. Determinación de la presencia de terpenos en extractos vegetales 32
2.3. Determinación del contenido de ácido ascórbico en extractos vegetales 33
2.4. Evaluación del contenido de ácido ascórbico en briófitas expuestas a una
dosis de glifosato 34
2.4.1. Aplicación de una dosis de glifosato a las plantas briófitas 34
2.4.2. Distribución de las muestras de plantas briófitas para la evaluación del
contenido de ácido ascórbico 35
2.5. Evaluación de la presencia de terpenos en briófitas expuestas a una dosis de
glifosato 36
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 39
3.1. Establecimiento de un método de obtención de extractos orgánicos de plantas
briófitas para la determinación de la presencia de terpenos 39
3.1.1. Obtención de extractos de plantas briófitas por el método de extracción
soxhlet con metanol 39
3.1.2. Obtención de extractos de plantas briófitas por el método de extracción
con metanol asistida con ultrasonido 41
iii
3.1.3. Obtención de extractos de plantas briófitas por el método de extracción y
maceración con metanol 43
3.2. Determinación de la presencia de terpenos en los extractos orgánicos de plantas
briófitas 46
3.3. Presencia de terpenos en los extractos orgánicos de plantas briófitas expuestas
a la acción de una dosis de glifosato 49
3.4. Contenido de ácido ascórbico en las plantas briófitas expuestas a la acción de
una dosis de glifosato 60
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 63
4.1. Conclusiones 63
4.2. Recomendaciones 64
BIBLIOGRAFÍA 65
ANEXOS 73
iv
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1.1. Propiedades físico-químicas del ácido ascórbico 16
Tabla 1.2. Propiedades físico-químicas del glifosato 19
Tabla 2.1. Enumeración de los métodos utilizados para la obtención de
extractos de plantas briófitas y la codificación de cada extracto 25
Tabla 2.2. Condiciones del CG CLARUS 500 para la determinación de
terpenos 32
Tabla 2.3. Condiciones que se utilizaron en el HPLC para la
determinación del contenido de ácido ascórbico en las
muestra de plantas briófitas 34
Tabla 2.4. Codificación y tiempo de recolección de los extractos
expuestos a la acción de una dosis glifosato, para la
evaluación del contenido de ácido ascórbico 35
Tabla 2.5. Codificación de los extractos de las tres muestras sin la
exposición a la acción del glifosato 36
Tabla 2.6. Codificación de las muestras testigo y las tres repeticiones
expuestas a la acción del glifosato 37
Tabla 2.7. Codificación de los valores promedios de áreas calculados
de los extractos para la evaluación de terpenos 38
Tabla 3.1. Identificación de los picos enumerados en el cromatograma
del extracto M2c 44
Tabla 3.2. Identificación de los picos presentes en el cromatograma
del extracto M1 46
Tabla 3.3. Áreas de los picos correspondientes a los terpenos encontrados
en los extractos de plantas briófitas expuestas a la acción de
una dosis de glifosato 58
Tabla 3.4. Contenido de ácido ascórbico en muestras de plantas briófitas
expuestas a la aplicación de 20,2 % de glifosato 61
Tabla A.1. Usos registrados de glifosato en SENASA 74
v
Tabla B.1. Reporte de la librería NIST del espectrograma de masas
indicado en la Figura B.1 75
Tabla B.2. Nombre del compuesto correspondiente al pico del
cromatograma del extracto obtenido con 57 g de plantas
briófitas y 1 h en el ultrasonido (extracto U5) 76
Tabla C.1. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los
20,39 min en el cromatograma del extracto 1MT0 77
Tabla C.2. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los
20,41 min en el cromatograma del extracto 2MT0 77
Tabla C.3. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los
20,40 min en el cromatograma del extracto 3MT0 77
Tabla D.1. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los
20,33 min en el cromatograma del extracto 1MT1 78
Tabla D.2. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los
20,34 min en el cromatograma del extracto 2MT1 78
Tabla D.3. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los
20,36 min en el cromatograma del extracto 1MT2 78
Tabla D.4. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los
20,35 min en el cromatograma del extracto 2MT2 79
Tabla D.5. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los
20,35 min en el cromatograma del extracto 3MT2 79
Tabla D.6. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los
20,36 min en el cromatograma del extracto 1MT3 79
Tabla D.7. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los
20,38 min en el cromatograma del extracto 2MT3 79
Tabla D.8. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los
20,36 min en el cromatograma del extracto 3MT3 80
vi
ÍNDICE DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 1.1. División de briófitas: a) Musgos, b) Antoceros, c) Hepáticas 1
Figura 1.2. Esquema de las partes de un musgo 3
Figura 1.3. Musgo Sphagnum sp. también llamado musgo de turbera 4
Figura 1.4. Estructura del isopreno 7
Figura 1.5. Estructuras químicas de tres monoterpenos: a) Mentol,
b) Geraniol, c) Limoneno 8
Figura 1.6. Estructuras químicas de dos sesquiterpenos: a) Farnesol,
b) Ácido abscísico 9
Figura 1.7. Estructuras químicas de dos diterpenos: a)Ácido abiético,
b) Retinol 9
Figura 1.8. Estructuras químicas de dos triterpenos: a) Escualeno,
b) Lanosterol 10
Figura 1.9. Estructura química del licopeno 10
Figura 1.10. Origen de algunos metabolitos secundarios en el
metabolismo primario de las plantas 11
Figura 1.11. Síntesis de terpenos y su clasificación según las unidades de
isopreno que contienen 13
Figura 1.12. Estructura del ácido ascórbico 16
Figura 1.13. Estructura química del glifosato 18
Figura 1.14. Mecanismo de inhibición de la ruta metabólica del ácido
shiquímico por el glifosato 20
Figura 2.1. Diagrama del proceso para la obtención de extractos de plantas
briófitas en un equipo soxhlet con metanol 27
Figura 2.2. Diagrama del proceso para la obtención de extractos de plantas
briófitas con metanol y ultrasonido 28
Figura 2.3. Diagrama del proceso para la obtención de extractos de plantas
briófitas mediante maceración con metanol, grado HPLC 30
Figura 2.4. Perfil de temperatura del horno utilizado para el análisis de
terpenos en el GC/MS Claurus 500 33
vii
Figura 3.1. Cromatograma del extracto obtenido con metanol, 5,0 g
de plantas briófitas y 5 h en el soxhlet (extracto S1c) 39
Figura 3.2. Cromatograma del extracto obtenido con metanol, 5,0 g
de plantas briófitas y 10 h en el soxhlet (extracto S2c) 40
Figura 3.3. Cromatograma del extracto obtenido con metanol, 57 g de
plantas briófitas y 1 h en el ultrasonido (extracto U3) 42
Figura 3.4. Cromatograma del extracto M1c 43
Figura 3.5. Cromatograma del extracto M1 45
Figura 3.6. Cromatograma del extracto 1MT0 47
Figura 3.7. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los
20,39 min, identificado como gama-muuroleno del extracto
1MT0 47
Figura 3.8. Cromatograma del extracto 2MT0 48
Figura 3.9. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los
20,41 min, identificado como gama-muuroleno del extracto
2MT0 48
Figura 3.10. Cromatograma del extracto 3MT0 49
Figura 3.11. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los
20,40 min, identificado como gama-muuroleno del extracto
3MT0 49
Figura 3.12. Cromatograma del extracto 1MT1 50
Figura 3.13. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los
20,33 min, identificado como copaeno del extracto 1MT1 50
Figura 3.14. Cromatograma del extracto 2MT1 51
Figura 3.15. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los
20,34 min, identificado como alfa cubebeno del extracto
2MT1 51
Figura 3.16. Cromatograma del extracto 1MT2 52
Figura 3.17. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los
20,36 min, identificado como muurolanodieno del extracto
1MT2 53
Figura 3.18. Cromatograma del extracto 2MT2 53
Figura 3.19. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los
viii
20,35 min, identificado como muurolanodieno del extracto
2MT2 53
Figura 3.20. Cromatograma del extracto 3MT2 54
Figura 3.21. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los
20,36 min, identificado como muurolanodieno del extracto
3MT2 54
Figura 3.22. Cromatograma del extracto 1MT3 55
Figura 3.23. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los
20,36 min, identificado como muurolanodieno del extracto
1MT3 55
Figura 3.24. Cromatograma del extracto 2MT3 56
Figura 3.25. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los
20,38 min, identificado como copaeno del extracto 2MT3 56
Figura 3.26. Cromatograma del extracto 3MT3 57
Figura 3.27. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los
20,36 min, identificado como alfa cubebeno del extracto
3MT3 57
Figura 3.28. Valores promedios de las áreas teóricas de los extractos
de plantas briófitas expuestos a una dosis de glifosato,
evaluados según la semana de análisis 60
Figura 3.29. Contenido de ácido ascórbico en las muestras de
plantas briófitas expuestas a la acción del glifosato
durante tres semanas 61
Figura B.1. Espectrograma de masas del cromatograma de los extractos
S1c, S2c, U1, U2c, U3, U4c, U6c, M3, M4c 75
Figura B.2. Espectrograma de masas del cromatograma del extracto U5 75
Figura E.1. Informe del contenido de ácido ascórbico de la muestra de
plantas briófitas sin la exposición a la acción del glifosato
(TAA0) 81
Figura E.2. Informe del contenido de ácido ascórbico de la muestra de
plantas briófitas expuesta a la acción del glifosato después
de una semana de la fumigación (MAA1) 82
ix
Figura E.3. Informe del contenido de ácido ascórbico de la muestra de
plantas briófitas expuesta a la acción del glifosato después
de dos semanas de la fumigación (MAA2) 83
Figura E.4. Informe del contenido de ácido ascórbico de la muestra de
plantas briófitas expuesta a la acción del glifosato después
de tres semanas de la fumigación (MAA3) 84
x
ÍNDICE DE ANEXOS
PÁGINA
ANEXO A
Datos de dosis de fumigación con glifosato en cultivos lícitos 73
ANEXO B
Reportes de la librería de espectros de masas NIST, registrados en aaaaaaaaa aaaaaaaaa aaaaaaaa
los métodos de obtención de extractos vegetales de plantas briófitas aaaaaaaaa aaaaaaaaa aaaaa
para la determinación de la presencia de terpenos 74
ANEXO C
Reportes de la librería de espectros de masas NIST, registrados en la aaaaaaaaa aaaaaaaaa
determinación de la presencia de terpenos en extractos orgánicos de aaaaaaaaa aaaaaaaaa a
plantas briófitas. 76
ANEXO D
Reportes de la librería NIST de la sección Evaluación de la presencia aaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaa
de terpenos en los extractos orgánicos de plantas briófitas expuestas a a a aa a a aa aaa a a a aaaaa
a la acción de una dosis de glifosato 77
ANEXO E
Informes del contenido de ácido ascórbico en las muestras de plantas aa aa aaa aa aa aa
briófitas, realizado en el laboratorio Labolab 80
xi
NOMENCLATURA
EPSP: 5-enolpiruvil shiquimato-3 fosfato
EPSPS: 5-enolpiruvil shiquimato-3 fosfato sintetasa
GC/MS: Cromatografía de gases – espectrometría de masas; Cromatógrafo
de gases- espectrómetro de masas
HPLC: Cromatografía líquida de alta eficiencia
HR: Humedad relativa
PEP: Fosfoenolpiruvato
S3P: Shiquimato-3-fosfato
T: Temperatura
xii
GLOSARIO
Ácidos resínicos: Compuestos diterpenóicos propios de las resinas provenientes
de los árboles de la familia Pinácea (Samuelsson y Bohlin, 2009).
Adyuvantes: Compuestos químicos que optimizan el efecto de un herbicida
(Eslava et al., 2007).
Caulidios : Estructuras presentes en las plantas briófitas que son similares a tallos
(Cubas, 2008).
Clado: Conjunto de especies que tienen un antepasado común (De Haro, 2005).
Ectohídricas: Briófitas que son capaces de absorber agua por toda su superficie
(Delgadillo y Cárdenas, 1990).
Epífitas: Plantas que viven una sobre la otra sin afectar su alimentación (RAE,
2011).
Filoide: Órgano similar a una hoja, presente en las briófitas (Cubas, 2008).
Phylum: (plural phyla), categoría taxonómica ubicada entre el Reino y la Clase
(Martínez et al., 2007).
Poiquilohídrico: Planta que puede resistir a temporadas de sequía, sin alterar su
metabolismo (Cubas, 2008).
Surfactantes: Sustancias que modifican la tensión superficial y que pueden
actuar como humectantes o detergentes y en aplicaciones específicas mejorar la
acción de ciertos químicos, como los herbicidas en plantas (Eslava et al., 2007).
xiii
RESUMEN
En la frontera norte de Ecuador con Colombia, especialmente hacia la región
amazónica, se han dado grandes fumigaciones con glifosato para el control de
los cultivos ilícitos de coca. En esta región crecen plantas únicas del
ecosistema, como son las briófitas. En este estudio se espera determinar los
cambios producidos por la acción del glifosato sobre la presencia de terpenos y
ácido ascórbico en estas plantas
Las plantas briófitas fueron recogidas de una colección de cacao ubicada en la
Estación Central de la Amazonía del INIAP de forma manual. Estas plantas
fueron trasladadas a la ciudad de Quito y ubicadas en invernaderos, bajo
condiciones controladas de temperatura y humedad (25 ºC y una HR de 75 %).
Se probaron varios métodos para la obtención de extractos vegetales de las
plantas briófitas con el objeto de identificar aquel que permitiera la
determinación de la presencia de terpenos. De los métodos utilizados se
encontró que el único que permitió observar la presencia de terpenos en las
plantas briófitas de estudio fue un método de extracción y maceración, en el
cual se utilizaron 220 g de plantas briófitas, metanol grado HPLC como
solvente y un tiempo de maceración de cuatro semanas.
En los extractos vegetales de las plantas briófitas se identificó la presencia de
algunos sesquiterpenos como copaeno, gama muuroleno y alfa cubebeno.
Además de la identificación de terpenos se encontraron algunos ácidos grasos
y cumarinas.
Se realizaron fumigaciones en las plantas briófitas recolectadas y
acondicionadas, con una dosis del 20,2 % de glifosato, marca Ranger 480. Se
hizo una sola aplicación de la dosis de glifosato y se realizaron evaluaciones
semanales durante tres semanas. Los parámetros analizados para esta
evaluación fueron la presencia de terpenos y el contenido de ácido ascórbico.
xiv
La presencia de terpenos disminuyó respecto a la réplica sin aplicación de
glifosato (MT0p), durante las 3 semanas de evaluación. Después de la primera
semana de fumigación el contenido disminuye un 29,3 %, transcurrida la
segunda semana de fumigación, disminuye en un 64,9 % y finalmente, a la
tercera semana de fumigación, disminuye un 70,3 %
El contenido de ácido ascórbico muestra una disminución respecto a la muestra
sin aplicación de glifosato (TAA0), durante las tres semanas de evaluación.
Después de la primera semana de fumigación el contenido de ácido ascórbico
disminuye en un 7,5 %, transcurrida la segunda semana de evaluación se
evidencia una disminución del 35,6 %; y finalizada la tercera semana el
contenido de ácido ascórbico disminuye en un 36,5 %.
xv
INTRODUCCIÓN
Las plantas briófitas son plantas primitivas que han habitado el planeta desde
el período Devónico (Camacho, 2007; Ramírez, 2007) En general, son plantas
pequeñas y pueden habitar en variados ambientes y poseen una particularidad
única del Reino vegetal, ya que en su ciclo de vida la generación dominante es
el gametofito (Gradstein et al., 2001).
La importancia de estas plantas está relacionada con sus usos en diferentes
aplicaciones, los mismos que aprovechan ciertas características químicas
como la presencia de flavonoides, aminoácidos, terpenos, entre otros
(Morantes et al., 2007; Glime, 2007). Por tradición, algunas de estas plantas se
han utilizado para el tratamiento de ciertas afecciones. Sus características
químicas permiten su uso como bioindicadores ambientales de contaminación
de metales pesados y, además, se aprovechan en usos hortícolas para
producir fertilizantes naturales (Glime, 2007)
En la región amazónica del Ecuador existe gran cantidad de plantas briófitas,
puesto que las condiciones climáticas de la zona son óptimas para el
crecimiento y desarrollo de las mismas (León-Yánez y Gradstein, 2006).
La zona amazónica norte del Ecuador ha sido afectada por las fumigaciones
aéreas de glifosato, puesto que en la frontera colombo-ecuatoriana, desde el
año 2000, se han realizado controles constantes sobre los cultivos ilícitos de
coca. Debido a la ubicación de la zona seleccionada para la fumigación, parte
del herbicida ha afectado a la zona fronteriza del Ecuador con Colombia y ha
provocado la pérdida de cultivos agrícolas y de la flora nativa del lugar.
La presencia de glifosato podría haber afectado también a las plantas briófitas
que crecen en la zona y que forman parte del ecosistema amazónico y además
producido cambios en el metabolismo y composición de estas plantas que
redunden en cambios en el delicado equilibrio, que se establece entre las
especies en la zona (Ávila et al., 2007).
xvi
Hasta la fecha no se han realizado en Ecuador, estudios sobre los efectos
metabólicos de la acción de glifosato sobre plantas briófitas. Por esta razón, se
formuló el Proyecto Semilla PIS-022: “Estudios preliminares sobre la acción del
glifosato en plantas briófitas”, el cual, en su primera etapa, estuvo enfocada al
análisis de los efectos del glifosato sobre la morfología y la actividad
peroxidásica en las plantas briófitas (Sánchez, 2011).
El presente trabajo constituye una segunda etapa del proyecto, en el cual se
propone establecer los efectos de la acción de una dosis de 20,2% de glifosato
sobre el contenido de ácido ascórbico y la presencia de terpenos en un grupo
de briófitas que crecen en la zona amazónica norte del Ecuador.
1
1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1. PLANTAS BRIÓFITAS
1.1.1. TAXONOMÍA Y DISTRIBUCIÓN
La división briófita del reino vegetal corresponde a la denominación de tres clases
de plantas, los musgos (Phylum Briophyta), las hepáticas (Phylum Hepatophyta) y
los antoceros (Phylum Anthocerotophyta) (Ramírez, 2007). Estas tres clases de
plantas, a pesar de no formar un clado, comparten entre ellas la presencia de un
ciclo de vida, en el cual el gametofito es la generación dominante (Cubas, 2008).
Algunos ejemplos de cada uno de estos phyla se muestran en la Figura 1.1.
Figura 1.1. División de briófitas: a) Musgos, b) Antoceros, c) Hepáticas (Ardiles et al., 2008)
Existen aproximadamente 15 000 especies de plantas briófitas en el mundo, de
las cuales los musgos se encuentran en mayor proporción, con alrededor de
12 800 especies; las hepáticas son aproximadamente 5 000 especies; y, en
menor cantidad, los antoceros con 100 especies (Gradstein et al., 2001).
Las investigaciones de campo realizadas por León-Yánez y Gradstein (2006), en
2
Ecuador, revelan que existen cerca de 900 especies que corresponden a musgos,
700 a hepáticas y 15 especies se han identificado como antoceros. Además, los
autores comentan que, debido a la poca explotación de los bosques de la región
amazónica, respecto a los bosques de la región costa y sierra del país, existe
mayor cantidad de especies de briófitas en la Amazonía, a lo que se añade
también, que las condiciones ambientales de la zona son propicias para el
desarrollo de estas especies (León-Yánez y Gradstein, 2006).
1.1.2. MORFOLOGÍA GENERAL
Las briófitas son consideradas como plantas primitivas que carecen de tejidos de
conducción, son fotoautótrofas y se dispersan por esporas (Ardiles et al., 2008).
Estas plantas han habitado el planeta durante 365 millones de años y su origen se
remonta al período Devónico, al igual que los primeros moluscos y algunos
artrópodos (Camacho, 2007; Ramírez, 2007).
En el ciclo de vida de las briófitas, el gametofito es la generación dominante y el
esporofito vive en dependencia del gametofito, a diferencia de las plantas
vasculares (Gradstein et al., 2001).
El gametofito de las plantas briófitas consta de rizoides, los cuales no son
verdaderas raíces y sirven para sujetarse al sustrato; lo que significa que, las
plantas briófitas no tienen un sistema radicular de absorción y almacenamiento de
agua desde el sustrato (Cubas, 2008). Los caulidios son las estructuras
equivalentes al tallo en las plantas vasculares, pero carecen de tejido vascular,
por lo que no cumplen la función de transporte de líquidos de una parte a otra
(Cubas, 2008). Los filoides u hojillas, al igual que los caulidios, no poseen cutícula
cerosa (Cubas, 2008). Debido a la carencia de cutícula, la absorción de nutrientes
se da en toda la superficie, por lo que se denominan plantas ectohídricas
(Delgadillo y Cárdenas, 1990). Las partes principales del esporofito son: el pie,
que es la conexión de las dos generaciones; y, la cápsula, que es el lugar donde
se producen las esporas (Gradstein et al., 2001).
3
En la Figura 1.2 se muestran las partes del gametofito y del esporofito.
Figura 1.2. Esquema de las partes de un musgo (Ardiles et al., 2008)
La mayoría de briófitas son organismos poiquilohídricos, por lo que pueden resistir
períodos prolongados de sequía y, una vez que terminan los períodos secos,
pueden regresar a su metabolismo normal (Gradstein et al., 2001).
1.1.3. IMPORTANCIA DE LAS BRIÓFITAS
Según Ardiles et al. (2008), las briófitas tienen importancia ecológica y cultural.
Además se conoce la importancia fitoquímica de estas plantas, debido a la
presencia de compuestos con actividad biológica (Asakawa, 2007).
1.1.3.1. Importancia ecológica
Las plantas briófitas se establecen sobre sustratos pobres, troncos caídos,
árboles e incluso sobre animales. Se convierten, así, en el hogar de animales
4
invertebrados (insectos, artrópodos, gusanos, etc.), vertebrados (aves y pequeños
mamíferos) y además actúan como sustrato para algunas plantas vasculares
(plantas epífitas) (Ardiles et al., 2008).
El musgo Sphagnum sp. forma parte del ecosistema llamado turbera, uno de
cuyos ejemplares se muestra en la Figura 1.3. Su principal característica es la
capacidad de reservar agua. Ardiles et al. escriben que: “… aproximadamente,
entre el 20 y el 30% de todo el carbono y nitrógeno orgánico de los suelos del
mundo está contenido en las enormes turberas árticas” (Ardiles et al., 2008).
Figura 1.3. Musgo Sphagnum sp. también llamado musgo de turbera (Ardiles et al., 2008)
Las briófitas son catalogadas como excelentes bioindicadores ambientales,
debido a que al carecer de tejidos de conducción, la absorción de nutrientes se
produce a través de toda la superficie de la planta y, a su vez, absorben los
contaminantes presentes en el ambiente (Ardiles et al., 2008).
Glime (2007), en su recopilación bibliográfica sobre la utilidad económica y étnica
de las briófitas, describe varios estudios en los cuales se han utilizado plantas
briófitas como bioindicadores ambientales, por ejemplo para evaluar la presencia
de dióxido de azufre y lluvia ácida; metales pesados en el aire; y, floruros y ozono,
en el aire.
1.1.3.2. Importancia cultural
En los países de la región Escandinava y España, las briófitas, junto con otras
5
plantas, son protegidas por la ley, puesto que forman parte de las leyendas y
tradiciones de sus pueblos. En Japón, son parte importante de la cultura
decorativa de jardines. Algunos pueblos de Chile utilizan las briófitas como
materia prima para cojines y colchones. En el Ecuador, existe la costumbre de
utilizar las plantas briófitas para decorar los pesebres y otros adornos en la
celebración de la Navidad (Ardiles et al., 2008; Larraín, 2010).
1.1.3.3. Importancia fitoquímica
Esta importancia fue investigada debido a la presencia de olores y sabores
fuertes, además que no es común que las briófitas sean atacadas por animales
menores, todas estas características despertaron el interés de estas plantas en el
ámbito fitoquímico (Asakawa, 2007).
Los compuestos ya identificados en las plantas briófitas son: monoterpenos,
sesquiterpenos, compuestos aromáticos, cinamatos, fenoles, naftalenos,
cumarinas, aminoácidos, ácidos grasos, etc. (Asakawa, 2007; Morantes et al.,
2007; Glime, 2007). Estos compuestos de las plantas briófitas se han aislado en
laboratorio y se determinaron algunas de sus características, por ejemplo la
acritud y amargura, la dermatitis de contacto que pueden producir, la acción
antimicrobiana, la actividad antifúngica, su actividad neurotrófica, entre otras
(Asakawa, 2007).
1.1.4. USOS DE LAS PLANTAS BRIÓFITAS
Las briófitas han sido poco estudiadas, si se comparan con las plantas
vasculares, debido a su tamaño y diversidad (Larraín, 2010). Las plantas briófitas
ofrecen varias utilidades, las cuales se describen a continuación:
• El musgo Sphagnum sp., antes mencionado, es el principal elemento utilizado
para la elaboración de pañales, toallas higiénicas, material de empaque, etc.
6
(Larraín, 2010).
• Las briófitas son utilizadas en horticultura para el mejoramiento de suelos, por
ejemplo para el cultivo de orquídeas, bromelias, helechos y champiñones.
Además, son utilizadas para la elaboración de semilleros para diversas plantas
vasculares y como principal componente de jardines orientales y arreglos de
floristería (Larraín, 2010; Glime, 2007).
• Los musgos tienen diversas aplicaciones farmacéuticas debido a la presencia
de flavonoides, terpenos, esteroides, compuestos fenólicos, cumarinas,
oligosacáridos, polisacáridos, polialcoholes, aminoácidos, ácidos grasos, entre
otros. Además, se utilizan algunas briófitas como pesticidas naturales
(Morantes et al., 2007; Glime, 2007).
1.2. TERPENOS
1.2.1. DESCRIPCIÓN
El término terpeno proviene de la palabra trementina, que corresponde a una
resina viscosa de aroma agradable, propia de los árboles de la familia de las
Pináceas. La trementina contiene ácidos resínicos y terpenos (Breitmaier, 2006).
Algunos terpenos son conocidos por ciertas propiedades como su olor agradable,
el sabor picante o definidas características farmacológicas. Se encuentran
presentes en partes específicas de las plantas; por ejemplo, en las frutas cítricas,
se mencionan al limón y la mandarina; en las hojas de especias, pueden
nombrarse al tomillo y el romero; y, en las flores se señalan a los claveles y las
violetas (Breitmaier, 2006).
La estructura básica de los terpenos sigue un principio general, que es la unión de
una o más unidades de isopreno, un hidrocarburo de 5 carbonos (C5H8), que se
ilustra en la Figura 1.4. Estas unidades se encuentran ensambladas y modificadas
7
de maneras diferentes. La mayoría de los terpenos tienen estructuras que difieren
entre sí, no solo en el grupo funcional sino, también, en su esqueleto básico de
carbono (Samuelsson y Bohlin, 2009).
C CH
CH2
CH3
H2C
ISOPRENO
Figura 1.4. Estructura del isopreno (Samuelsson y Bohlin, 2009)
Los terpenos son utilizados en varias industrias: la de perfumería, en la
fabricación de finos perfumes; en la industria alimenticia, para dar olor y sabor a
comidas y bebidas; en la industria farmacéutica, para mejorar las características
organolépticas de los medicamentos; y, en la agricultura, para la elaboración de
anti alimentarios para plagas y feromonas para trampas de insectos (Breitmaier,
2006).
1.2.2. CLASIFICACIÓN DE LOS TERPENOS
Los terpenos son metabolitos secundarios, abundantes en las plantas. Su
clasificación se determina según el número de unidades de isopreno, que
contiene su estructura (Breitmaier, 2006; Samuelsson y Bohlin, 2009).
Se nombra a los terpenos de acuerdo con el número de carbonos presentes
asociados al número de unidades de isopreno, que se repiten y se utilizan los
siguientes prefijos: hemi (cinco carbonos “isopreno”), mono (diez carbonos),
sesqui (quince carbonos), di (veinte carbonos), tri (treinta carbonos), tetra
(cuarenta carbonos) y poli (cuando son más de cuarenta carbonos) (Breitmaier,
2006; Samuelsson y Bohlin, 2009). A continuación se mencionan ejemplos y
utilidades de cada uno de estos terpenos.
8
1.2.2.1. Monoterpenos
Son conocidos como los constituyentes de los aceites esenciales. Son utilizados
en la farmacéutica para dar olor y sabor a los medicamentos y también son
utilizados en la elaboración de especerías y son parte de los ingredientes en la
perfumería. Además, algunos son utilizados como agentes antibacterianos, en
este caso se menciona al timol (Samuelsson y Bohlin, 2009; Crozier et al., 2008).
En la Figura 1.5 se muestran las estructuras de tres monoterpenos.
OH
MENTOL
a)
OH
GERANIOL
b)
LIMONENO
c)
Figura 1.5. Estructuras químicas de tres monoterpenos: a) Mentol, b) Geraniol, c) Limoneno
(Samuelsson y Bohlin, 2009; Fenaroli, 1968)
1.2.2.2. Sesquiterpenos
Estos terpenos son poco utilizados en la industria farmacéutica, algunos son
tónicos muy amargos. Las mayores aplicaciones están orientadas por sus
propiedades antiinflamatorias, además se los puede utilizar en la elaboración de
trampas para insectos (Samuelsson y Bohlin, 2009; Crozier et al., 2008; Fenaroli,
1968). En la Figura 1.6 se muestran las estructuras de dos sesquiterpenos,
además se pueden mencionar otros ejemplos como son el copaeno, el gama
muuroleno, alfa cubebeno, entre otros (Ordaz et al., 2011).
9
OH
FARNESOL ÁCIDO ABSCÍSICO
OOH
COOHa) b)
Figura 1.6. Estructuras químicas de dos sesquiterpenos: a) Farnesol, b) Ácido abscísico (Samuelsson y Bohlin, 2009; Fenaroli, 1968)
1.2.2.3. Diterpenos
Dentro de este grupo de terpenos, se encuentran las giberilinas, conocidas como
reguladores del crecimiento de las plantas y pueden tener aplicaciones en el
cultivo de flores u otros productos agrícolas, para mejorar rendimientos o
cualidades específicas. Otros representantes de este grupo son el ácido abiético,
el retinol y el esteviol, responsable, este último, del sabor dulce de la estevia,
además del toxol que es utilizado en algunos tratamientos contra el cáncer
(Samuelsson y Bohlin, 2009; Crozier et al., 2008). En la Figura 1.7, se muestran
las estructuras de dos diterpenos.
a) b)
H
HHOOC
ÁCIDO ABIÉTICO
OH
RETINOL VITAMINA A
Figura 1.7. Estructuras químicas de dos diterpenos: a)Ácido abiético, b) Retinol (Samuelsson y Bohlin, 2009; Crozier et al., 2008)
10
1.2.2.4. Triterpenos
Existen triterpenos en la naturaleza, por ejemplo, el ácido fusídico (antibiótico), las
saponinas, el escualeno y el lanosterol (Samuelsson y Bohlin, 2009; Crozier et al.,
2008). En la Figura 1.8 se muestran las estructuras de dos de triterpenos.
a)
b)
ESCUALENO
H
HHO
H
LANOSTEROL
Figura 1.8. Estructuras químicas de dos triterpenos: a) Escualeno, b) Lanosterol (Samuelsson y Bohlin, 2009; Fenaroli, 1968)
1.2.2.5. Tetraterpenos
Los más importantes de estos terpenos son los carotenoides, los cuales son los
pigmentos amarillos y rojos de algunos alimentos, entre ellos, la yema del huevo y
la zanahoria (Samuelsson y Bohlin, 2009; Fenaroli, 1968). En la Figura 1.9 se
muestra la estructura del licopeno, que es el pigmento de los tomates.
LICOPENO
Figura 1.9. Estructura química del licopeno (Samuelsson y Bohlin, 2009)
11
1.2.3. BIOSÍNTESIS DE TERPENOS
Como muestra la Figura 1.10, el proceso de fotosíntesis en las plantas genera
glucosa. Este compuesto se oxida en un proceso de glicólisis y da lugar a la
formación de fosfoenolpiruvato (PEP), a partir del cual se genera la acetil-
coenzima A (acetil-CoA), precursora de los terpenos, por otro lado el PEP
participa también en la ruta metabólica del ácido shiquímico, en la cual se forman
los aminoácidos fenilalanina, tirosina y triptófano (Ávalos y Pérez-Urria, 2009).
O
OH
H
H
OH
OH
HH
CH2OH
H
OH
CH2
C
COOH
OP
Glucosa
Fosfoenolpiruvato (PEP)
Acetil-CoA
O
C SCoAH3C
COOH
OH
OH
HO
Ác. shiquímico
Fotosíntesis
H2O
CO2
Glicólisis
TerpenosCarotenoidesEsteroides
FenilalaninaTirosinaTriptófano
O2 (Oxígeno)
Figura 1.10. Origen de algunos metabolitos secundarios en el metabolismo primario de las plantas
(Ávalos y Pérez-Urria, 2009)
12
Dos moléculas de acetil-CoA se acoplan, mediante una reacción similar a una
condensación de Claisen, es decir las dos moléculas se conectan por un enlace
sencillo carbono-carbono y dan lugar al aceto-acetil-CoA (Breitmaier, 2006).
Una vez obtenido el aceto-acetil-CoA, este se une a otra molécula de acetil-CoA,
mediante una reacción aldólica que une las dos moléculas debido a la formación
de un enlace carbono-carbono y se obtiene el β-hidroxi-β-metilglutaril-CoA. Sobre
el β-hidroxi-β-metilglutaril-CoA actúa una reducción enzimática con
dihidronicotinamida adenina dinucleótido (NADPH+H+) para obtener ácido
mevalónico (Breitmaier, 2006).
Después se presenta el proceso de fosforilación con adenosín trifosfato (ATP),
para formar difosfato de ácido mevalónico, el cual se descarboxila y da como
resultado el isopentildifostato (IPP). El IPP después de la isomerización da lugar
al dimetilalil-pirofosfato (DMAPP) (Breitmaier, 2006).
La Figura 1.11 describe un ejemplo de la secuencia de formación de terpenos,
donde la unión del IPP y su isómero DMAPP da lugar a la formación de geranil-
difosfato (GPP), que es un monoterpeno. Al GPP se une un isopentildifosfato y
forma un farnesildifosfato (FPP), el cual es un sesquiterpeno (Breitmaier, 2006).
13
CH3
CCH2H2C
CH2 O PP
CH3
CCHH3C
CH2 O PP
P O P OH
OHOH
O O
PP=
CH3
CCH
CH2CH2
C
CH3
CHCH2 O PP
H3C
CH3
CCH
CH2CH2
C
CH3
CHCH2
CH2C
CH3
CHCH2 O PP
H3C
CH3
CCH
CH2CH2
C
CH3
CHCH2
CH2C
CH3
CHCH2
CH2C
CH3
CHCH2 O PP
H3C
CH3
CCH2H2C
CH2 O PP
CH3
CCH2H2C
CH2 O PP
Isopeltildifosfato (IPP) Dimetilalil pirofosfato (DMAPP)
Isopreno (C5)
Monoterpenos (C10)
Geranildifosfato (GPP)
IPP
Farnesildifosfato (FPP)
Sesquiterpenos
IPP
Geranilgeranildifosfato (GGPP)
Politerpenos
Diterpenos
Tetraterpenos
(C20)
(C40)
+
Triterpenos (C15)
(C30)
+ FPP
+GGPP
Figura 1.11. Síntesis de terpenos y su clasificación según las unidades de isopreno que contienen
(Ávalos y Pérez-Urria, 2009)
1.2.4. IDENTIFICACIÓN Y EXTRACCIÓN DE TERPENOS
Los terpenos son metabolitos secundarios presentes en las plantas en bajas
concentraciones. Para determinar su presencia y aprovechar sus propiedades, es
necesario realizar procesos de extracción.
Existen algunos métodos para obtener extractos vegetales: extracción por
solventes, extracción asistida con ultrasonido, extracción asistida con soxhlet, etc.
(Núñez, 2008; Azuola y Vargas, 2007; Rios y Aguilar-Guadarrama, 2006). Una
vez obtenido el extracto, es necesario realizar un estudio de los analitos de
14
interés. La cromatografía de gases son espectrometría de masas (GC/MS) es una
técnica que se utiliza para la identificación de terpenos en extractos vegetales
(Arraiza, 2005).
La cromatografía de gases es una técnica ampliamente utilizada para la
separación y análisis cualitativo y cuantitativo de muestras gaseosas, soluciones
líquidas y sólidos volátiles. La muestra es separada entre dos fases, la una
llamada fase estacionaria (columna) y la otra fase móvil (gas inerte, ejemplo:
helio) que está en contacto con la muestra (Gutiérrez y Droguet, 2002; Grob y
Barry, 2004). Existen varios sistemas de detección de las señales de respuestas
de los compuestos químicos separados por esta técnica, por ejemplo, el detector
de fotoionización; detector de conductividad térmica; detector de espectrometría
de masas; entre otros, los cuales son seleccionados según la industria en la que
se empleará esta técnica (Grob y Barry, 2004).
En la GC/MS, los compuestos volatilizados de la muestra salen de la columna y
se transfieren a la trampa de iones, donde se aplica la técnica de MS, la cual se
basa en la naturaleza y distribución de los fragmentos moleculares, lo que se
consigue al bombardear la muestra con electrones de alta velocidad. Estos
fragmentos se ionizan y se detectan mediante un filtro de masas (Grob y Barry,
2004).
1.3. ANTIOXIDANTES
1.3.1. GENERALIDADES
La etimología de la palabra antioxidante viene del término griego anti que significa
opuesto o con propiedades contrarias y de la palabra oxidante cuyo significado
químico es que oxida (RAE, 2011). Los antioxidantes son sustancias que impiden
o neutralizan cualquier reacción de oxidación (Venereo, 2002; Avello y Suwalsky,
2006). En los seres vivos, los antioxidantes actúan sobre la producción de
radicales libres, los cuales son generados en los procesos de obtención de
15
energía (García et al., 2001).
Según González et al. (2000), los antioxidantes pueden ser clasificados como
antioxidantes enzimáticos y antioxidantes no enzimáticos. Dentro de los
antioxidantes no enzimáticos se encuentran el alfa tocoferol, los beta carotenos, el
ácido ascórbico, los flavonoides, entre otros.
Los beta carotenos se encuentran en plantas como la zanahoria, la calabaza y
otras verduras amarillas. El alfa tocoferol se considera un importante agente
antioxidante, que se puede encontrar en los aceites de soya, algodón, maíz y
palma real, en el germen de trigo y en frutos secos como las almendras y las
avellanas. El ácido ascórbico está presente en naranjas, toronjas, guayabas,
mangos, fresas, papayas, kiwis, entre otras. Las fuentes alimenticias ricas en
flavonoides son el café, las aceitunas, las cebollas y algunas briófitas (García et
al., 2001; Avello y Suwalsky, 2006; Aubad et al., 2007).
1.3.2. EL ÁCIDO ASCÓRBICO
El ácido ascórbico es reconocido por su acción antioxidante, se lo puede
encontrar en varias frutas y vegetales, ya que este puede ser sintetizado a partir
de glucosa y galactosa en las plantas. La deficiencia de esta sustancia en el
organismo de los seres vivos causa el escorbuto. La dosis diaria de ácido
ascórbico recomendada para prevenir el escorbuto es de 60 mg (Ledezma-
Gairaud, 2005).
Además, ácido ascórbico actúa directamente con varias especies reactivas del
oxígeno, además regenera a otros antioxidantes, por ejemplo a la vitamina E
(García et al., 2001).
González et al. (2000) afirman que el ácido ascórbico es la defensa más
importante de los antioxidantes contra los radicales libres. Adicionalmente, se
16
conoce que el ácido ascórbico puede absorber la radiación ultravioleta y proteger
así a las plantas de dicha radiación (Serra y Cafaro, 2007).
1.3.2.1. Estructura
La estructura del ácido ascórbico corresponde a una lactona de seis carbonos
como se muestra en la Figura 1.12 (Oro y Donnamaría, 2006).
HO
HO O O
HO OH
Figura 1.12. Estructura del ácido ascórbico
(NIST, 2011)
El ácido ascórbico es un ácido ligeramente más fuerte que el ácido acético,
puesto que su pKa es de 4,2, frente a 4,8 del ácido acético (Oro y Donnamaría,
2006; Hartigan-Go, 1996); al mismo tiempo, se lo considera como un reductor
fuerte. Dicha propiedad se debe a la presencia de un enediol y además a que el
grupo hidroxi, presente en el carbono 3, puede ceder su protón (Oro y
Donnamaría, 2006; Serra y Cafaro, 2007).
1.3.2.2. Propiedades
La Tabla 1.1 muestra algunas propiedades físico-químicas del ácido ascórbico.
Tabla 1.1. Propiedades físico-químicas del ácido ascórbico
Propiedad Descripción
Fórmula molecular C6H8O6
Masa molecular 176,12 g/mol
17
Tabla 1.1. Propiedades físico-químicas del ácido ascórbico (Continuación...)
Propiedad Descripción
Apariencia y olor Sólido blanco o amarillo, inodoro
Densidad 1,65 g/cm³
Punto de fusión 190 - 192 °C
Solubilidad en agua 80%, a 100 ºC; 40%, a 45 ºC Fuente: ACHS, 2007; NIST, 2011
1.3.2.3. Determinación
El contenido de ácido ascórbico de una solución puede ser determinado por
varios métodos, entre los cuales se pueden mencionar: el método volumétrico con
2,6-diclorofenolindofenol, el método microfluorométrico y el método fluorométrico
semiautomático (AOAC, 2007).
Otra forma para determinar la concentración de una solución de ácido ascórbico
es la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Este método
comienza con la extracción del ácido ascórbico en condiciones que eviten al
máximo su deterioro (4 ºC y cubierto de la luz). Un medio que permite mantener
las propiedades del ácido ascórbico es el ácido metafosfórico. El análisis por
HLPC se realiza con fase reversa, mediante la utilización de una columna LC-18,
una fase móvil de agua acidificada y un detector UV a 264 nm. (Ledezma-
Gairaud, 2005; Serra y Cafaro, 2007).
1.3.2.4. Usos del ácido ascórbico
Según Ledezma-Gairaud (2005), el ácido ascórbico es utilizado como un
indicador de la calidad nutricional de los alimentos procesados, esto se debe a su
fácil degradación, por lo que se entiende que si en un alimento procesado existe
la presencia de ácido ascórbico, todos los demás nutrientes estarán en buen
estado.
El ácido ascórbico es un aditivo ampliamente utilizado en la industria alimenticia
por ejemplo, se añade a las conservas de frutas para que estas no se oscurezcan,
además que evita la corrosión de los envases metál
También es utilizado en suplementos vitamínicos distribuidos por la industria
farmacéutica (Oro y Donnamaría, 2006).
1.4. GLIFOSATO
El glifosato es un herbicida que
cultivos ilícitos de coca
causado una serie de efectos ambientales, socioeconómicos y de salud en la
frontera norte ecuatoriana (Ávila
El uso de este herbicida en las fumigaciones aéreas ha sido
puesto que en su hoja técnica
directa al follaje de las plantaciones
plantas nativas (Ávila et al
1.4.1. CARACTERÍSTICAS GENE
La DNE (2000) señala que el
sistémica, de amplio espectro”, que es utilizado para eliminar varias especie
malezas o para la eliminación de plantas vasculares de una zona determinada
fórmula molecular es C
química se presenta en la Figura. 1.13.
Figura 1.13.
El ácido ascórbico es un aditivo ampliamente utilizado en la industria alimenticia
se añade a las conservas de frutas para que estas no se oscurezcan,
además que evita la corrosión de los envases metálicos (Ibáñez
También es utilizado en suplementos vitamínicos distribuidos por la industria
farmacéutica (Oro y Donnamaría, 2006).
es un herbicida que ha sido utilizado, para el control aéreo de los
de coca, en el Plan Colombia desde el año 2000, lo cual ha
causado una serie de efectos ambientales, socioeconómicos y de salud en la
ontera norte ecuatoriana (Ávila et al., 2007).
El uso de este herbicida en las fumigaciones aéreas ha sido muy
que en su hoja técnica se especifica que se debe utiliza
directa al follaje de las plantaciones, para evitar la contaminación de cultivos y
et al., 2007).
CARACTERÍSTICAS GENE RALES
señala que el “glifosato es un herbicida no selectivo de acción
sistémica, de amplio espectro”, que es utilizado para eliminar varias especie
malezas o para la eliminación de plantas vasculares de una zona determinada
fórmula molecular es C3H8NO5P (Burger y Fernández, 2004) y su estructura
química se presenta en la Figura. 1.13.
Figura 1.13. Estructura química del glifosato (Solomon et al., 2005)
18
El ácido ascórbico es un aditivo ampliamente utilizado en la industria alimenticia,
se añade a las conservas de frutas para que estas no se oscurezcan,
icos (Ibáñez et al., 2003).
También es utilizado en suplementos vitamínicos distribuidos por la industria
para el control aéreo de los
en el Plan Colombia desde el año 2000, lo cual ha
causado una serie de efectos ambientales, socioeconómicos y de salud en la
muy cuestionado,
utilizar en aplicación
la contaminación de cultivos y
“glifosato es un herbicida no selectivo de acción
sistémica, de amplio espectro”, que es utilizado para eliminar varias especies de
malezas o para la eliminación de plantas vasculares de una zona determinada. Su
(Burger y Fernández, 2004) y su estructura
19
En la Tabla.1.2 se mencionan las propiedades físico-químicas más importantes
del glifosato.
Tabla 1.2. Propiedades físico-químicas del glifosato
Propiedad Valor Unidad
Peso Molecular 169,1 g/mol
Olor Inodoro -
Densidad 0,5 g/mL
Punto de fusión 184, 5 ºC
Presión de vapor 1,84 x 10-7 mm de Hg a 45 °C
Solubilidad en agua 1,05 g/mL, a 25 ºC
Estabilidad 32 días, a 25 ºC y pH= 5, 7 ó 9 Fuente: Barpen, 2009 y DNE, 2000
En general, el glifosato comercial contiene surfactantes que ayudan a mejorar la
estabilidad de la formulación, además de incrementar la eficiencia del herbicida.
Eslava et al. (2007) apuntan que “los surfactantes son un tipo de adyuvantes;
sustancias adicionadas a una formulación herbicida para facilitar y/o mejorar la
mezcla, aplicación o efectividad biológica de los mismos, por interacciones
básicas químicas o físicas con el herbicida y el blanco al que va dirigido”.
En la actualidad se utiliza el surfactante Cosmo-Flux. Eslava et al. (2007)
mencionan que “mejora la adherencia y la uniformidad de las preparaciones
agroquímicas (...). Las dosis recomendadas oscilan entre 0,1 y 1% del volumen
de la mezcla a asperjar”.
1.4.2. MECANISMO DE ACCIÓN DEL GLIFOSATO
El glifosato interfiere en la síntesis de aminoácidos debido a la inhibición de la
enzima 5-enolpiruvil-shiquimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS), que actúa en la ruta
metabólica del ácido shiquímico. Villalba (2009) afirma que la EPSPS “está
asociada a la síntesis de tres aminoácidos aromáticos: fenilalanina, tirosina y
20
triptófano”; estos aminoácidos intervienen en la síntesis de otros compuestos
como los flavonoides, alcaloides, etc., por lo que estos compuestos también se
ven afectados por la acción del glifosato. Además, la inhibición de la EPSPS
disminuye la síntesis de proteínas, el ácido indol acético y la clorofila, por esta
razón la muerte de la planta es lenta y el primer efecto notorio de la acción del
glifosato en la planta es la interrupción del crecimiento; después se evidenciará la
clorosis y, finalmente, la necrosis de la planta (Solomon et al., 2005).
En la Figura 1.14 se muestra el mecanismo de acción del glifosato en la ruta
metabólica del ácido shiquímico.
CO2
O
OH
=O3POH
N+ H
CO2
PO3=
CO2
OH
O=O3PO CO2
OPO3=
CH3
CO2
OH
O=O3PO
CH2
CO2
+ HPO42-
=O3PO
CH2
CO2
=O3P N+ CO2HH
Complejo EPSPS - S3P
Fosfoenol piruvato (PEP)Glifosato
Tetraedro intermedioComplejo glifosato/Shiquimato-3-fosfato
Fosfato
5-Enolpiruvilshiquimato-3-fosfato(EPSP)
+ +
H
Figura 1.14. Mecanismo de inhibición de la ruta metabólica del ácido shiquímico por el glifosato
21
(Eslava et al., 2007) La EPSPS, inicialmente, se une al shiquimato-3-fosfato (S3P). Después, una
molécula de fosfoelnolpiruvato (PEP) se une al sitio activo de la enzima y se
produce el 5-enolpiruvil-shiquimato-3-fosfato (EPSP).
Villalba (2009) menciona que la estructura del PEP y del glifosato son similares,
por lo que el glifosato actúa como un inhibidor competitivo, el cual se une al
complejo formado por S3P y EPSPS, que da como resultado la acumulación de
shiquimato y el bloqueo de la síntesis de los aminoácidos aromáticos.
1.4.3. COMPORTAMIENTO DEL GLIFOSATO EN EL SUELO
El glifosato es adsorbido en el suelo, como consecuencia de la fijación del fosfato,
que existe en el suelo. Existen varios factores que intervienen en este proceso,
por ejemplo la presencia de materia orgánica, el tipo de suelo y el pH del mismo
(DNE, 2000).
Esto permite sugerir que la movilidad del glifosato en el suelo es mínima.
También, se puede mencionar que, según la DNE (2000), la vida media típica del
glifosato en el suelo es de 42 días.
1.4.4. EFECTOS DEL GLIFOSATO SOBRE EL MEDIO AMBIENTE Y LA
SALUD HUMANA
La utilización del herbicida glifosato en forma indiscriminada en las fumigaciones
aéreas, para erradicar los cultivos ilícitos, produce varios efectos en el medio
ambiente. Ávila et al. (2007) mencionan que afecta a las cadenas alimentarias,
agrícolas y acuáticas, puesto que disminuyen las fuentes alimenticias de los seres
vivos, elimina especies medicinales y altera los hábitats de muchas especies de
mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces e invertebrados, debido a la acción del
glifosato sobre las plantas.
22
La población de las zonas cercanas, en donde las fumigaciones aéreas son
constantes, se ha visto obligada a migrar a otros lugares, lo que la expone,
además, a una agresión psicológica-social continua (Ávila et al., 2007).
Los efectos más comunes de las fumigaciones aéreas de glifosato son las
afecciones en la dermis y en los ojos. Si una persona se encuentra expuesta a las
aspersiones de este herbicida presentará fuertes irritaciones dérmicas, oculares y
de las membranas mucosas, que pueden ocasionar incluso reacciones alérgicas
graves (Kaczewer, 2002; EPA, 1993).
La intoxicación aguda, debida a la ingesta del glifosato, produce efectos que
dependen de la cantidad ingerida, los cuales pueden variar desde una condición
leve, en la que se manifiestan el vómito y la diarrea, hasta condiciones de mayor
intoxicación y, que por ejemplo, pueden darse esofagitis, hemorragias intestinales,
disfunción respiratoria, fallas de los diferentes órganos y finalmente la muerte del
individuo (Varona et al., 2009).
23
2. PARTE EXPERIMENTAL
Para el desarrollo de la parte experimental se utilizaron los siguientes materiales,
equipos y reactivos:
a) Materiales
• Glifosato Ranger 480
• Aspersores de 250 mL con boquilla plástica
• Gavetas plásticas, para recolección y transporte de las plantas (70 x 40 cm)
• Mortero de porcelana con pistilo
• Matraces aforados de 25 y 50 mL
• Embudos de vidrio
• Papel filtro
• Viales ámbar de 2 mL
• Soxhlet
• Manta de calentamiento
• Balón de fondo plano de 250 mL
• Vasos de precipitación de 50, 100 y 250 mL
• Kitasatos de 500 y 1000 mL
• Embudos Büchner
• Frascos ámbar de 250 y 750 mL
• Frascos plásticos estériles de recolección de muestras biológicas de 100 mL
• Filtros Millipore de 0,45 µm
• Jeringas plásticas desechables de 5 mL
b) Equipos
• Rotavapor-R, marca Büchi, modelo KRvr 65/45
• Cromatógrafo de gases/espectrómetro de masas (GC/MS), marca Perkin
Elmer, modelo CLARUS 500
• Baño maría, marca Buchler Instruments, modelo Thermo Lift
24
• Baño ultrasónico, marca Branson, modelo 1510
• Bomba de vacío, presión 0 – 14 psi, 1/3 HP, marca ACR source, modelo AVP
501
• Balanza analítica, precisión 0,1 mg, marca Denver Instruments, modelo TP-
214
c) Reactivos
El reactivo que se utilizó para la obtención de extractos vegetales de plantas
briófitas y la determinación de la presencia de terpenos fue el metanol (CH3OH),
grado HPLC, 99,99%, J.T. Baker.
2.1. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS VEGETALES
2.1.1. RECOLECCIÓN Y ACONDICIONAMIENTO DE PLANTAS BRIÓFITA S
Las plantas briófitas fueron recolectadas de un ensayo de cultivares de cacao de
la Estación Central de la Amazonía del INIAP. La Estación Experimental Central
de la Amazonía se encuentra ubicada en la vía Sacha s/n, San Carlos a 3 km de
la entrada a la Parker, cantón La Joya de los Sachas, Provincia de Orellana.
Las plantas briófitas fueron recolectadas de forma manual. Estas plantas se
colocaron en gavetas plásticas y se trasladaron a la ciudad de Quito (Sánchez,
2011).
En la ciudad de Quito, las plantas fueron ubicadas a manera de alfombra de 1 cm
de espesor, sobre una capa de sustrato, compuesto por hojarasca y troncos en
descomposición. Posteriormente, se colocaron las muestras en invernaderos de
madera con tapa de vidrio, los cuales estuvieron provistos de un foco de 15 W,
para que se mantuviera una temperatura promedio de 25 ºC.
Además, se aplicaron, semanalmente, 26 mL de agua por cada 100 cm2 de área
25
de plantas briófitas, con el fin de obtener la humedad relativa promedio de 75
%HR (Sánchez, 2011).
2.1.2. MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA OBTENCIÓN DE EXTRACTOS D E
PLANTAS BRIÓFITAS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA PRESE NCIA
DE TERPENOS
Para la obtención de los extractos vegetales de las plantas briófitas, se probaron
tres métodos, entre los cuales fue seleccionado aquel que permitiera la
identificación de la presencia de terpenos, en la Tabla 2.1 se indican los métodos
utilizados y además los extractos obtenidos con cada método.
Tabla 2.1. Enumeración de los métodos utilizados para la obtención de extractos de plantas briófitas y la codificación de cada extracto
Método Extracto Código
Extracción soxhlet con metanol
Extracto concentrado soxhlet 1 S1c
Extracto concentrado soxhlet 2 S2c
Extracción con metanol asistida con ultrasonido
Extracto ultrasonicado 1 U1
Extracto ultrasonicado 1 concentrado U1c
Extracto ultrasonicado 2 U2
Extracto ultrasonicado 2 concentrado U2c
Extracto ultrasonicado 3 U3
Extracto ultrasonicado 3 concentrado U3c
Extracción y maceración con metanol
Extracto macerado 1 M1
Extracto macerado 1 concentrado M1c
Tabla 2.1. Enumeración de los métodos utilizados para la obtención de extractos de plantas briófitas y la codificación de cada extracto (Continuación...)
Método Extracto Código
Extracción y maceración con metanol
Extracto macerado 2 M2
Extracto macerado 2 concentrado M2c
Para el análisis de los extractos obtenidos con los tres métodos, se procedió a
inyectar al GC/MS primero los extractos concentrados, ya que al eliminar el
26
solvente los extractos podrían contener mayor cantidad de los compuestos de
interés. Después, se inyectaron los extractos no concentrados, para verificar si al
no estar concentrados los extractos también presentan los analitos de interés.
2.1.2.1. Método de extracción soxhlet con metanol
El primer método utilizado para obtener los extractos vegetales de plantas
briófitas consistió en la utilización de un equipo soxhlet y metanol. El metanol
utilizado fue de grado HPLC (Núñez, 2008).
• Se pesaron 5 g de plantas briófitas, que se empacaron en un cartucho de
papel filtro que se colocó en el soxhlet.
• Se añadieron 75 mL de metanol, grado HPLC, al balón conectado al soxhlet.
Este volumen permitió cubrir el cartucho y garantizar que el balón no quedara
seco. La extracción se realizó durante 5 h, con una manta de calentamiento a
60 ºC. Esta temperatura aseguró que el metanol llegara a su temperatura de
ebullición, la cual fue calculada según la ecuación de Sidney Young y que en
la ciudad de Quito es de 56 ºC (Dimas, 2008).
• Después de este tiempo, se concentró la muestra hasta 30 mL en un
rotavapor, a una temperatura de 60 ºC y se verificó que el extracto (S1c) no
presentara ningún residuo sólido.
• Se colocó el extracto S1c en un vial, color ámbar, para inyectarlo al GC/MS
donde se comprobó la presencia/ausencia de terpenos. El diagrama de flujo
de este método se observa en la Figura 2.1.
Este mismo método fue modificado con la aplicación de un tiempo de extracción
de 10 h y se obtuvo un segundo extracto concentrado (S2c) que también fue
analizado.
27
Figura 2.1. Diagrama del proceso para la obtención de extractos de plantas briófitas en un equipo soxhlet con metanol
2.1.2.2. Método de extracción con metanol asistida con ultrasonido
El segundo método utilizado para obtener los extractos vegetales de plantas
briófitas correspondió a una extracción con metanol, grado HPLC, asistida con
ultrasonido (Azuola y Vargas, 2007).
• Se pesaron 5 g de plantas briófitas y se colocaron en un vaso de precipitación.
Se agregaron 60 mL de metanol, grado HPLC, y la mezcla se colocó dentro
del baño ultrasónico durante 1 h.
• Después de este tiempo, el extracto (U1) se filtró al vacío y se verificó que el
filtrado no presentara ningún residuo sólido. Se tomaron 15 mL del extracto
U1 filtrado y fueron concentrados en un rotavapor, a una temperatura de 60
ºC, para obtener el extracto U1c.
28
• Se colocaron los extractos U1 y U1c en viales para inyectarlos al GC/MS,
donde se comprobó la presencia/ausencia de terpenos, se inyectó primero el
extracto U1c y posteriormente el extracto U1. El diagrama de flujo de este
método se observa en la Figura 2.2.
Figura 2.2. Diagrama del proceso para la obtención de extractos de plantas briófitas con metanol y ultrasonido
Se realizaron dos modificaciones del método de extracción asistida con
ultrasonido. En la primera modificación, se incrementó la cantidad de plantas
briófitas y se las sometió a un proceso de molienda, con el volumen adecuado
para cubrir la mezcla. En la segunda modificación, se incrementó la cantidad de
plantas briófitas molidas y, finalmente, se realizó una maceración durante cuatro
semanas.
Estos procesos modificados se describen a continuación:
a) Primera modificación del método de extracción asistida con ultrasonido
• Se pesaron 30,5 g de plantas briófitas, las mismas que fueron molidas en un
mortero. Las plantas molidas se colocaron en un vaso de precipitación.
29
• A estas plantas fueron agregados 50 mL de metanol grado HPLC. La mezcla
se sometió al ultrasonido durante 1h.
• El extracto (U2) se filtró al vacío y se verificó que el filtrado no presentara
ningún residuo sólido; se tomó 15 mL del extracto U2 para concentrarlo en un
rotavapor y se obtuvo un extracto concentrado (U2c).
• Los extractos U2 y U2c se colocaron en sus respectivos viales para,
posteriormente, inyectarlos al GC/MS, donde se comprobó la
presencia/ausencia de terpenos, se inyectó primero el extracto U2c y
finalmente el extracto U2.
b) Segunda modificación del método de extracción asistida con ultrasonido
• Se pesaron 57,0 g de plantas briófitas. Estas plantas fueron molidas en un
mortero.
• Las plantas molidas se colocaron en un vaso de precipitación y se agregaron
100 mL de metanol grado HPLC.
• Esta mezcla fue sometida al ultrasonido durante 1 h. Después de este tiempo,
la mezcla se colocó en un frasco de 250 mL, color ámbar, para dejarlo
macerar durante 4 semanas a temperatura ambiente.
• Se filtró al vacío el extracto macerado de plantas briófitas (U3) y se verificó
que el filtrado no presentara ningún residuo sólido. Se tomaron 15 mL del
extracto U3, ya filtrado, se concentraron en un rotavapor y se obtuvo un
extracto concentrado (U3c).
• Se colocaron los extractos U3 y U3c en viales, para inyectarlos al GC/MS,
donde se comprobó la presencia/ausencia de terpenos. Primero se inyectó el
extracto U3c y posteriormente el extracto U3.
30
2.1.2.3. Método de extracción y maceración con metanol
El tercer método utilizado para la obtención de extractos vegetales de plantas
briófitas consistió en un proceso de extracción y maceración con metanol
(Asakawa et al., 1987). El diagrama de flujo de este método se observa en la
Figura 2.3.
Figura 2.3. Diagrama del proceso para la obtención de extractos de plantas briófitas mediante maceración con metanol, grado HPLC
• Se pesaron 220 g de plantas briófitas, que fueron secadas a temperatura
ambiente.
• Las plantas fueron colocadas en una botella de 750 mL, color ámbar y se
añadieron 350 mL de metanol.
• La mezcla se dejó macerar durante 4 semanas en un lugar oscuro a
temperatura ambiente.
31
• Al término de este tiempo, se filtró al vacío el extracto macerado de plantas
briófitas (M1). Además, se tomaron 15 mL del extracto M1 filtrado y se
concentraron en un rotavapor, a una temperatura de 60 ºC, para obtener un
extracto concentrado (M1c).
• Los extractos M1 y M1c fueron filtrados en Millipore de 0,45 µm. Se verificó
que los filtrados no presentaran ningún residuo sólido.
• Se colocaron los extractos filtrados M1 y M1c en viales para, posteriormente,
inyectarlos al GC/MS, donde se comprobó la presencia/ausencia de terpenos.
El primer extracto inyectado fue el M1c y después el extracto M1.
Se realizó una variación de este método para determinar si con una masa menor
de plantas briófitas se logra obtener los mismos resultados, según la siguiente
descripción:
• Se pesaron 50 g de plantas briófitas, las mismas que fueron molidas en un
mortero y se colocaron en una botella color ámbar de 250 mL.
• Se añadieron 100 mL de metanol, grado HPLC y se dejó macerar la mezcla,
durante 4 semanas, en un lugar oscuro, a temperatura ambiente.
• Al término de este tiempo, el extracto macerado de plantas briófitas (M2) se
filtró al vacío. Se tomaron 15 mL del extracto filtrado para concentrarlos en un
rotavapor y se obtuvo un extracto concentrado (M2c).
• Los extractos M2 y M2c fueron filtrados a través de un Millipore de 0,45 µm y
se verificó que los extractos no presentaran ningún residuo sólido.
• Se colocaron los extractos M2 y M2c en viales para, posteriormente,
inyectarlos al GC/MS, donde se comprobó la presencia/ausencia de terpenos.
Se inyectó primero el extracto M2c y finalmente el extracto M2.
32
2.2. DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE TERPENOS EN
EXTRACTOS VEGETALES
Para determinar la presencia de terpenos en los extractos vegetales de plantas
briófitas se utilizó la técnica de GC/MS, bajo las condiciones que se presentan en
la Tabla 2.2, que corresponden al método descrito por Pendergrass (1996). Se
realizó una modificación del método antes mencionado ya que la columna
utilizada en el presente estudio fue ZB-5ms (30 m; 0,25 mm; 0,25 µm).
Tabla 2.2. Condiciones del GC/MS CLARUS 500 para la determinación de terpenos
Condiciones del equipo Valor Unidad
Volumen de inyección 1 µL
Temperatura de inyección 250 ºC
Temperatura del detector 300 ºC
Gas transportador, helio (He) 30 mL/min
Tiempo de corrida 36 min Fuente: Pendergrass (1996)
La programación de temperatura del horno del GC/MS, que se utilizó en este
método fue una variación de lo descrito por Pendergrass (1996), debido a el quipo
y la columna utilizados y se detalla en forma gráfica, en la Figura 2.4.
0
50
100
150
200
250
300
0 10 20 30 40
Tem
pe
ratu
ra (
°C
)
Tiempo (min)
33
Figura 2.4. Perfil de temperatura del horno utilizado para el análisis de terpenos en el GC/MS Clarus 500
Todos los extractos elaborados fueron inyectados 2 veces al GC/MS. De los
cromatogramas obtenidos se seleccionó el cromatograma con picos
cromatográficos simétricos y bien resueltos.
En el programa Turbo-mass se analizaron todos los picos presentes en los
cromatogramas, una vez obtenido el espectro de cada uno de ellos, se los
comparó con la base de datos de los compuestos de la librería NIST (Instituto
Nacional de Estándares y Tecnología), para identificarlo y establecer una
probabilidad de correspondencia y verificar así la presencia/ausencia de terpenos.
2.3. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDO
ASCÓRBICO EN EXTRACTOS VEGETALES
Para la determinación del contenido de ácido ascórbico, las muestras fueron
enviadas al laboratorio Labolab, que utilizó la técnica de cromatografía líquida de
alta resolución (Labolab, 2009).
• Para determinar el contenido de ácido ascórbico en las plantas briófitas se
pesó, exactamente, 1 g de las mismas.
• Las plantas pesadas se colocaron en un mortero y se agregó ácido
metafosfórico al 6%, para obtener una muestra homogénea.
• Se colocó la mezcla en un balón de 100 mL y se aforó con el mismo ácido. Se
dejó en reposo media hora en la oscuridad.
• Luego se filtró en papel libre de cenizas, a temperatura ambiente, y se inyectó
al equipo HPLC a las condiciones presentadas en la Tabla 2.3. La columna
utilizada en el presente estudio fue 6x139 mm packing L39 y la fase móvil fue
fostafo monosódico al 1% (Labolab, 2009).
34
Tabla 2.3. Condiciones que se utilizaron en el HPLC para la determinación del contenido de ácido ascórbico en las muestra de plantas briófitas
Condiciones del equipo Valor Unidades
Longitud de onda 264 Nm
Temperatura 20 – 25 ± 1 ºC
Flujo 0,6 mL/min
Volumen de inyección 4 µL
Fuente: Labolab (2009).
2.4. EVALUACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN
BRIÓFITAS EXPUESTAS A UNA DOSIS DE GLIFOSATO
2.4.1. APLICACIÓN DE UNA DOSIS DE GLIFOSATO A LAS PLANTAS
BRIÓFITAS
El área de cada muestra de plantas briófitas utilizada para la aplicación del
glifosato fue de 2 925 cm2, las mismas que no eran exactamente iguales ni
homogéneas, puesto que no se trataba de una sola especie de plantas.
El establecimiento de la concentración del 20,2 % de glifosato, que se aplicó a las
plantas briófitas en esta investigación, se basó en lo reportado por Sánchez
(2011). Esta dosis de glifosato se utilizó debido a que causó deterioro evidente,
pero paulatino en las plantas briófitas.
Para la aplicación del glifosato, se utilizó la fórmula comercial Ranger 480, la cual
se preparó en una solución al 20,2 %. El volumen necesario para fumigar los
2 925 cm2 de cada unidad experimental fue de 1 462,5 mL (Sánchez, 2011).
Se realizó una sola aplicación de la solución de glifosato mediante la utilización de
aspersores plásticos de 250 mL. La fumigación de las diferentes muestras se
35
ejecutó de tal manera, que la distribución del herbicida fuera homogénea en toda
el área.
2.4.2. DISTRIBUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE PLANTAS BRIÓFITAS P ARA
LA EVALUACIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDO ASCÓRBICO
Se prepararon 4 muestras de plantas briófitas, cada una de un área de 2 925 cm2,
las cuales fueron fumigadas una sola vez, como se indicó en el acápite 2.4.1. Se
evaluaron las muestras semanalmente, como se indica en la Tabla 2.4.
Tabla 2.4. Codificación y tiempo de recolección de los extractos expuestos a la acción de una dosis glifosato, para la evaluación del contenido de ácido ascórbico
Muestra Código de la muestra
Tiempo de recolección (semana)
Testigo TAA0 0
Muestra para evaluación de ácido ascórbico (1) MAA1 1
Muestra para evaluación de ácido ascórbico (2) MAA2 2
Muestra para evaluación de ácido ascórbico (3) MAA3 3
La muestra testigo (TAA0) se envío al laboratorio Labolab antes de aplicar la
fumigación con glifosato.
Las muestras MAA1, MAA2 y MAA3 fueron fumigadas con 1 462,5 mL, de una
solución de glifosato al 20,2 %. Las muestras fueron enviadas a los laboratorios
de Labolab, inmediatamente después de su recolección para determinar el
contenido de ácido ascórbico mediante HPLC, según se detalló en el acápite 2.3.
Se tomó a la muestra TAA0 como referencia para determinar el porcentaje de
disminución del contenido de ácido ascórbico de las demás muestras, según el
tiempo de recolección.
36
2.5. EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE TERPENOS EN
BRIÓFITAS EXPUESTAS A UNA DOSIS DE GLIFOSATO
Se prepararon 3 muestras de plantas briófitas, cada una de un área de 9 180 cm2.
El área de las muestras fue cuatro veces el área indicada en el acápite 2.4.1, ya
que para cada semana de evaluación se tomaron 2 295 cm2 de muestra.
El área de las 3 muestras después de retirar los 2 295 cm2, que se utilizaron para
realizar los extractos respectivos y determinar la presencia de terpenos sin la
exposición a una dosis de glifosato, modificó el área de las muestras a 6 885 cm2.
Estos extractos fueron codificados según se detalla en la Tabla 2.5 y cuyos
resultados se muestran en el acápite 3.2.
Tabla 2.5. Codificación de los extractos de las tres muestras sin la exposición a la acción del glifosato
Extractos sin la aplicación de glifosato Código del extracto
Tiempo de recolección (semanas)
Réplica 1 sin aplicación de glifosato 1MT0 0
Réplica 2 sin aplicación de glifosato 2MT0 0
Réplica 3 sin aplicación de glifosato 3MT0 0
Las 3 muestras de 6 885 cm2 fueron fumigadas con 4 387,5 mL, con una solución
de glifosato al 20,2 %. Después de una semana de la fumigación se recolectaron,
de cada muestra 2 295 cm2, lo que corresponde a la cantidad necesaria para la
realización del extracto. De igual manera, se recolectaron 2 295 cm2 de cada
muestra, a la segunda y tercera semana de fumigación. Estas muestras fueron
codificadas como se muestra en la Tabla 2.6.
Tabla 2.6. Codificación de las muestras testigo y las tres repeticiones expuestas a la acción del glifosato
Muestras con aplicación de una dosis única de
glifosato Código del extracto
Tiempo de recolección (semanas)
Réplica 1 con aplicación de glifosato, semana 1 1MT1 1
Réplica 2 con aplicación de glifosato, semana 1 2MT1 1
37
Réplica 3 con aplicación de glifosato, semana 1 3MT1 1
Réplica 1 con aplicación de glifosato, semana 2 1MT2 2
Réplica 2 con aplicación de glifosato, semana 2 2MT2 2
Réplica 3 con aplicación de glifosato, semana 2 3MT2 2
Réplica 1 con aplicación de glifosato, semana 3 1MT3 3
Réplica 2 con aplicación de glifosato, semana 3 2MT3 3
Réplica 3 con aplicación de glifosato, semana 3 3MT3 3
Todas las muestras fueron utilizadas para realizar los respectivos extractos de
plantas briófitas con el método seleccionado, de acuerdo con los resultados del
acápite 2.1.
Cuando se determinó la presencia de terpenos en todos los extractos, se evaluó
el área de cada uno de los picos de los cromatogramas en los que se identificaron
estos compuestos. Estas áreas fueron relacionadas con el volumen extraído y
fueron normalizadas a un solo volumen, correspondiente al obtenido con una
muestra preliminar de 78,5 mL. Esta relación permitió obtener un área
normalizada, para realizar comparaciones. El cálculo se realizó con el uso de la
ecuación (1), que se presenta a continuación:
�� � �� � ��
�
[1]
Donde:
An: área normalizada
A1: área del pico de un terpeno que se reporta en el cromatograma de un
extracto de plantas briófitas
V1: volumen del extracto inicial de plantas briófitas analizado en el GC/MS, en
mL.
Vo: volumen referencial del extracto de plantas briófitas = 78,5 mL.
Con la información de las áreas normalizadas de los picos, correspondientes a
terpenos de cada extracto, se realizaron los promedios de las réplicas en las 3
semanas de evaluación, como se muestra en la Tabla 2.7 y se estableció si
38
existía variación de la áreas normalizadas de los picos cromatográficos de cada
replica de las plantas expuestas a la acción de una dosis de glifosato, respecto a
las plantas que no fueron fumigadas.
Tabla 2.7. Codificación de los valores promedios de áreas calculados de los extractos para la evaluación de terpenos
Nombre Código Tiempo de recolección (semanas)
Promedio de las replicas: 1MT0, 2MT0 y 3MT0 MT0p 0
Promedio de las replicas: 1MT1, 2MT1 y 3MT1 MT1p 1
Promedio de las replicas: 1MT2, 2MT2 y 3MT2 MT2p 2
Promedio de las replicas: 1MT3, 2MT3 y 3MT3 MT3p 3
Finalmente, se tomó el valor del promedio MT0p como referencia para determinar
el porcentaje de disminución de cada promedio según su tiempo de recolección.
39
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. ESTABLECIMIENTO DE UN MÉTODO DE OBTENCIÓN DE
EXTRACTOS ORGÁNICOS DE PLANTAS BRIÓFITAS PARA
LA DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE TERPENOS
Todos los extractos de plantas briófitas, obtenidos para la identificación de la
presencia de terpenos, fueron inyectados en el equipo GC/MS. Este análisis
permitió seleccionar el método para determinar la presencia de terpenos.
3.1.1. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE PLANTAS BRIÓFITAS POR EL
MÉTODO DE EXTRACCIÓN SOXHLET CON METANOL
En este caso, se obtuvieron dos extractos de plantas briófitas, S1c y S2c, los
cuales se diferenciaron por el tiempo de extracción en el soxhlet. Estos dos
extractos fueron evaluados según la presencia/ausencia de terpenos.
El cromatograma obtenido del análisis del extracto S1c, que se muestra en la
Figura 3.1, el espectro de masas y el reporte de la librería NIST se observan en el
Anexo B.
Figura 3.1. Cromatograma del extracto obtenido con metanol, 5,0 g de plantas briófitas y 5
h en el soxhlet (extracto S1c)
2.50 4.50 6.50 8.50 10.50 12.50 14.50 16.50 18.50 20.50 22.50 24.50 26.50 28.50 30.50 32.50 34.50 36.50 38.500
100
%
090902 muestra evep soxleth1 Scan EI+ 1.78
Tiempo
(min)
40
El extracto S1c mostró únicamente la presencia del solvente, lo que podría
deberse a que el tiempo de extracción utilizado no fue el suficiente, ya que
pudieron extraerse de la muestra de plantas briófitas solo las fracciones de fácil
separación. Por esta razón, se decidió incrementar el tiempo de extracción para
incrementar el número de sifoneadas que realiza el equipo soxhlet y una mayor
extracción.
Al incrementar el tiempo de extracción en el soxhlet a 10 h, se obtuvo el extracto
S2c, el cual, después de ser analizado, también mostró únicamente la presencia
del solvente. El cromatograma del extracto S2c se muestra en la Figura 3.2 y su
espectrograma de masas y respectivo reporte de la librería NIST se observa en el
Anexo B.
Figura 3.2. Cromatograma del extracto obtenido con metanol, 5,0 g de plantas briófitas y
10 h en el soxhlet (extracto S2c)
Los resultados obtenidos con el método de extracción soxhlet, al utilizar 5 g de
plantas briófitas y metanol, grado HPLC, como solvente, no mostraron la
presencia de terpenos, por lo que se descartó este método.
2.50 4.50 6.50 8.50 10.50 12.50 14.50 16.50 18.50 20.50 22.50 24.50 26.50 28.50 30.50 32.50 34.50 36.50 38.500
100
%
1.78
Tiempo
(min)
41
3.1.2. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE PLANTAS BRIÓFITAS POR EL
MÉTODO DE EXTRACCIÓN CON METANOL ASISTIDA CON
ULTRASONIDO
Para aplicar este método se utilizaron 3 cantidades de plantas briófitas, los
mismos que fueron evaluados según la presencia/ausencia de terpenos. Los
pesos utilizados fueron 5,0; 30,5 y 57,0 g de plantas briófitas, cantidades
establecidas por la disponibilidad de la muestra.
Una fracción de cada extracto obtenido con los pesos antes mencionados, fue
concentrada y otra no. En total, se obtuvieron seis extractos de plantas briófitas a
ser analizados.
Los 2 cromatogramas correspondientes al análisis de los extractos de plantas
briófitas U1 y U1c se presentaron similares al cromatograma del solvente. El
espectrograma de masas y el reporte de la librería NIST se muestra en el Anexo
B.
Estos resultados pueden tener relación con la pequeña cantidad de plantas
utilizada que, probablemente, no permitió identificar los analitos de interés. Por
esta razón, se decidió incrementar la masa de la muestra.
Se incrementó el peso de las plantas briófitas a 30,5 g, para obtener un nuevo
extracto U2. En este caso, se molieron previamente las plantas, con la ayuda de
un mortero para incrementar el área de contacto con el solvente.
Los dos extractos U2 y U2c mostraron cromatogramas similares al del solvente.
El espectrograma de masas y el reporte de la librería NIST se observa en el
Anexo B.
Se decidió, entonces, realizar otra prueba con un peso de la muestra de 57 g
(extracto U3). En la Figura 3.3 se muestra el cromatograma del extracto U3.
42
3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.000
100
%
091026 br6 b1.43
1.52
1.75
30.59
Figura 3.3. Cromatograma del extracto obtenido con metanol, 57 g de plantas briófitas y 1
h en el ultrasonido (extracto U3)
Como se puede observar en la Figura 3.3, el cromatograma presentó un pico a los
30,59 min. El espectrograma de masas de este pico fue analizado con la librería
NIST, la cual lo identificó como un éster metílico del ácido 10, 13 dimetil
tetradecanoico. El reporte de la librería NIST de este pico y su espectrograma de
masas se pueden observar en el Anexo B.
De acuerdo con la información presentada por Morantes et al. (2007) y Glime
(2007), el resultado obtenido podría atribuirse a la presencia de ácidos grasos en
las plantas briófitas.
En el caso del extracto concentrado (U3c) el cromatograma mostró solamente la
presencia del solvente, este comportamiento podría deberse a que el éster que se
presentó en el extracto U3 se degradó debido a la interacción con los demás
compuestos presentes en el extracto, los cuales pudieron otorgar las condiciones
necesarias para que el éster se degradara (Caglieri y Macaño, 2009). El espectro
y el reporte de la librería NIST del extracto U3c se muestra en el Anexo B
Tiempo (min)
43
La utilización de este método se descartó para la obtención de extractos
vegetales de plantas briófitas, puesto que no se detectó la presencia de terpenos.
3.1.3. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE PLANTAS BRIÓFITAS POR EL
MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y MACERACIÓN CON METANOL
En este método se utilizaron 50,0 y 220,0 g de plantas briófitas. El extracto
realizado con 50,0 g de plantas briófitas (M2) y su muestra concentrada (M2c)
fueron inyectados en el GC. Los cromatogramas de cada uno de los extractos M2
y M2c no evidenciaron la presencia de terpenos, sino solamente la del solvente
utilizado.
Estos resultados coinciden con los obtenidos al utilizar las otras metodologías, en
las que se pesaron cantidades menores a 50 g de plantas briófitas, para la
obtención de los extractos.
El extracto concentrado, obtenido con 220 g de plantas briófitas (M1c), presentó
un cromatograma con varios picos, como se muestra en la Figura 3.4.
Figura 3.4. Cromatograma del extracto M1c
26.94 27.44 27.94 28.44 28.94 29.44 29.94 30.44 30.94 31.44 31.94 32.44 32.94 33.44 33.94 34.44 34.94 35.44 35.940
100
%
091026 br1 a30.59
30.30
34.08
32.55
32.48
31.69
31.02
31.39
31.8732.01
33.70
32.66
32.92
33.15
34.53
34.31
35.16
34.84
35.52
35.93
1
2
3 5
4
8
7
6 10
9
Tiempo (min)
44
Se evaluaron los espectros de los picos predominantes, con la librería de
espectros de masas NIST. La Tabla 3.1 muestra los nombres de los compuestos
identificados y su correspondencia o no con la estructura de un terpeno.
Tabla 3.1. Identificación de los picos enumerados en el cromatograma del extracto M2c
Probabilidad Nº del pico
Tiempo de retención
(min) Nombre del compuesto Terpeno
907 1 30,59 Éster metílico del ácido 10, 13 dimetil
tetradecanoico No
790 2 31,02 Ácido eicosanoico No
831 3 31,69 Furanocumarinas No
759 4 32,55 Ácido 11,14,17 eicosatrienoico No
750 5 32,66 Isofitol No
893 6 33,70 Furanocumarinas No
796 7 34,08 Ácido 5, 8, 11, 14 eicosatetraenoico No
781 8 34,53 Sigmasterol No
890 9 35,16 Furanocumarinas No
889 10 35,52 Furanocumarinas No
Como se puede observar en la Tabla 3.1, los compuestos identificados con la
librería de espectros de masas no corresponden a terpenos.
Los picos 2, 4 y 7 corresponden a ácidos grasos y el pico 1 es un éster metílico de
ácido graso; estos resultados coinciden con lo descrito por Morantes et al. (2007)
y Glime (2007), quienes identificaron la presencia de ácidos grasos en plantas
briófitas.
Los picos 3, 6, 9 y 10 fueron identificados como furanocumarinas, cumarinas que
se pueden encontrar en plantas briófitas, según lo reportado por Morantes et al.
(2007) y Glime (2007). Las cumarinas son metabolitos secundarios y su
determinación se puede realizar mediante la utilización de la técnica GC/MS
(Bogdal, 1998).
EL pico 5 corresponde al isofitol, un alcohol sintetizado en las plantas, al igual que
45
otros compuestos como los terpenos que se pueden determinar con la técnica de
GC/MS (Ordaz et al., 2011).
El pico 8 fue identificado como sigmasterol que es un fitoesterol. Los fitoesteroles
son esteroles de origen vegetal que tienen amplia distribución en la naturaleza y
su estructura es similar a la del colesterol (Valenzuela y Ronco, 2004).
Una vez evidenciada la ausencia de terpenos en el cromatograma del extracto
M1c, se procedió a inyectar el extracto no concentrado (M1), de la misma
muestra, al GC/MS.
En la Figura 3.5 se muestra el cromatograma del extracto M1.
10.50 15.50 20.50 25.50 30.50 35.50 40.50 45.500
100
%
20100831 repeteticion t01a24.82
18.12
11.47
24.4420.39
23.42
27.27
27.17
25.63
29.32
27.39
27.61 29.38
Figura 3.5. Cromatograma del extracto M1
En la Figura 3.5, se observa que se presentaron 5 picos predominantes. Los
espectrogramas de masas de estos picos fueron analizados con la librería de
espectros de masas NIST. En la Tabla 3.2 se muestran los nombres de los
compuestos identificados.
1
2
3
5
4
Tiempo (min)
46
Tabla 3.2. Identificación de los picos presentes en el cromatograma del extracto M1
Probabilidad Nº del pico
Tiempo de retención
(min) Nombre del compuesto Terpeno
843 1 18,12 Ciclopentanona No
759 2 20,39 Gama muuroleno Si
944 3 24,82 Éster metílico del ácido 10, 13 dimetil
tetradecanoico No
897 4 27,17 Ácido 9,12 Octadecadienoico No
853 5 27,27 Ácido 9,12,15 Octadecatrienoico No
El pico 1 corresponde a la ciclopentanona, la cual es un derivado de los ácidos
grasos y participa en la biosíntesis de los jasmonatos (García, 2008).
El pico 2 fue identificado como gama muuroleno, un sesquiterpeno presente en
plantas, según lo reportado por Ordaz et al. (2011).
Los picos 3, 4 y 5 corresponden a ácidos grasos o sus derivados (García, 2008).
Por este resultado, se escogió como método de obtención de extractos vegetales
de plantas briófitas, para la determinación de la presencia de terpenos, al
tratamiento de 220 g de plantas briófitas con 350 mL de metanol, grado HPLC
como solvente, durante 4 semanas de maceración.
3.2. DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE TERPENOS EN LOS
EXTRACTOS ORGÁNICOS DE PLANTAS BRIÓFITAS
Los resultados de la presencia de terpenos en los extractos 1MT1, 2MT1, 3MT1,
1MT2, 2MT2, 3MT2, 1MT3, 2MT3, 3MT3 se mostrarán en el acápite 3.3, donde se
evaluará la presencia de terpenos al estar sometidos a la acción de una dosis de
glifosato.
En los extractos 1MT0, 2MT0, 3MT0, se determinó la presencia de terpenos, y los
47
resultados se muestran a continuación.
En la Figura 3.6, se observa el cromatograma de la muestra denominada 1MT0.
11.00 13.00 15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.000
100
%
20100831 repeteticion t01b24.82
18.13
11.47
24.45
20.3923.42
27.28
27.18
25.64
29.33
27.40
27.61 29.38
Figura 3.6. Cromatograma del extracto 1MT0
El pico de interés se presentó a los 20,39 min. El espectrograma de masas de
este pico fue analizado con la librería NIST, la cual lo identificó como gama
muuroleno, con una probabilidad de 75,9 %, el cual se observa en la Figura 3.7.
El reporte de la librería NIST para este pico se muestra en el Anexo C.
Figura 3.7. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,39 min, identificado como gama-muuroleno del extracto 1MT0
El cromatograma del extracto 2MT0 se presenta en la Figura 3.8. El pico de
interés del cromatograma de la Figura 3.8 fue el que se presentó a los 20,41 min.
49 59 69 79 89 99 109 119 129 139 149 159 169 179 189 199 209m/z0
100
%
6.70e5161
119
10595
795553 6958 67 71
77
9381
91109
121
133 136204
162189
Tiempo (min)
Gama muuroleno
48
Según el reporte de la librería NIST, que se muestra en el Anexo C, este pico fue
identificado como gama muuroleno, con una probabilidad de 85 %. Su
espectrograma de masas se muestra en la Figura 3.9.
11.00 13.00 15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.000
100
%
20100831 repeteticion t02c27.32
24.85
20.41
18.11
24.46
23.4322.6721.24
27.21
25.40
29.36
27.43
27.62
29.42
29.56
Figura 3.8. Cromatograma del extracto 2MT0
Figura 3.9. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,41 min, identificado como gama-muuroleno del extracto 2MT0
El cromatograma del extracto 3MT0 se muestra en la Figura 3.10. El pico de
interés se presentó a los 20,40 min. Su espectro fue analizado en la librería NIST
y se muestra en el Anexo C. El pico fue identificado como gama muuroleno, con
una probabilidad de 80,7 % y su espectrograma de masas se muestra en la
Figura 3.11.
El gama muuroleno es un sesquiterpeno, el cual es un componente presente en
plantas, según lo reportado por Ordaz et al. (2011). La presencia de terpenos en
estos extractos coincide con los resultados obtenidos por Morantes et al. (2007)
49 59 69 79 89 99 109 119 129 139 149 159 169 179 189 199 209m/z0
100
%
2.08e6161
119
1059593
795553 6958 67 71
77
81
82 96 109 117
121
133122 136147 160
204162
189 205
Tiempo (min)
Gama muuroleno
49
que encontraron estos metabolitos secundarios en el musgo Polytrichum
juniperinum.
11.00 13.00 15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.000
100
%
29.3927.32
24.84
20.40
18.1115.71
24.45
27.20
25.46
27.43
29.44
29.57
Figura 3.10. Cromatograma del extracto 3MT0
Figura 3.11. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,40 min, identificado como gama-muuroleno del extracto 3MT0
3.3. PRESENCIA DE TERPENOS EN LOS EXTRACTOS
ORGÁNICOS DE PLANTAS BRIÓFITAS EXPUESTAS A LA
ACCIÓN DE UNA DOSIS DE GLIFOSATO
Después de transcurrida una semana de la aplicación de la dosis de glifosato, se
obtuvieron los cromatogramas de los extractos 1MT1, 2MT1 y 3MT1, a partir de las
muestras tratadas con glifosato. En la Figura 3.12 se observa el cromatograma
del extracto 1MT1.
49 59 69 79 89 99 109 119 129 139 149 159 169 179 189 199 209m/z0
100
%
1.09e6161
119
1059593
795553 6958 67 71
77
81
96 109
121
133122 136204
162189 205
Tiempo (min)
Gama muuroleno
50
11.00 13.00 15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.000
100
%
24.77
24.39
20.3316.45
11.06 19.3118.04
23.3622.72
22.30
29.95
27.22
27.11
25.38 26.66
27.3429.26
27.55
32.82
32.34
31.20
Figura 3.12. Cromatograma del extracto 1MT1
Se evaluó el espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,33 min
con la librería NIST, el cual se identificó como copaeno, con una probabilidad de
81,6 % y se observa en la Figura 3.13. El reporte de la librería se muestra en el
Anexo D.
Figura 3.13. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,33 min, identificado como copaeno del extracto 1MT1
El cromatograma del extracto 2MT1 se observa en la Figura 3.14. En el Anexo D,
se muestra el reporte de la librería NIST que identificó al pico que se presentó a
los 20,34 min como alfa cubebeno, con una probabilidad de 75 %. El
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210m/z0
100
%
1.05e6161
119
10595
9381796955
5358 67
7177
91
8396 109
121
133122 136147
204162
189 205
Tiempo (min)
Copaeno
51
espectrograma de masas del pico mencionado que se indica en la Figura 3.15.
11.00 13.00 15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.000
100
%
29.99
24.75
22.74
19.33
12.92
10.24
11.6410.80
15.8315.08
18.2717.06
22.44
19.54
20.3421.37
22.89
23.09
23.36
27.22
27.12
26.91
27.29
27.56
29.2528.55
32.94
32.54
31.21
30.82
Figura 3.14. Cromatograma del extracto 2MT1
Figura 3.15. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,34 min, identificado como alfa cubebeno del extracto 2MT1
En el cromatograma del extracto 3MT1 no se identificaron terpenos, esto
corresponde a un valor atípico, el cual es aceptable ya que se trabajó una
muestra de plantas que tuvieron edades diferentes, estados diferentes e incluso
49 59 69 79 89 99 109 119 129 139 149 159 169 179 189 199 209m/z0
100
%
280910 1 semana r2a 2057 (20.340) Cm (2050:2064-(2064:2103+2017:2050)) Scan EI+ 6.73e5161
11910595
81795855
53
69
6759 65
71
77
9388
83 9197 109
121
133 136 204162
Tiempo (min)
Alfa cubebeno
52
de concentraciones del compuesto de interés diferentes.
Al cabo de la segunda semana, después de la fumigación se procesaron los
extractos de plantas briófitas, expuestas a la acción del glifosato, y se obtuvieron
los siguientes cromatogramas:
a) En la Figura 3.16 se muestra el cromatograma del extracto 1MT2.
b) En la Figura 3.18 se muestra el cromatograma del extracto 2MT2.
c) En la Figura 3.20 se muestra el cromatograma del extracto 3MT2.
19.65 19.85 20.05 20.25 20.45 20.65 20.85 21.05 21.25 21.45 21.650
100
%
280910 2 semana r1b Scan EI+
7.31e619.73;55
19.5655
19.6588
20.888820.36
58
20.7788
20.5288
21.0588 21.60
5821.25
8821.43
88
Figura 3.16. Cromatograma del extracto 1MT2
En la Figura 3.17 se muestra el espectrograma de masas del pico que se
presentó a los 20,36 min.
Tiempo (min)
Muurolanodieno
53
Figura 3.17. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,36 min,
identificado como muurolanodieno del extracto 1MT2
18.27 18.77 19.27 19.77 20.27 20.77 21.27 21.77 22.27 22.77 23.27 23.77 24.270
100
%
280910 2 semana r2b Scan EI+
2.07e722.70;55
19.3188
18.0088
19.5255
22.605522.41
55
22.305519.73
88
20.3588
22.8755
23.0755
23.3488
24.595824.37
8824.14100
23.7388
Figura 3.18. Cromatograma del extracto 2MT2
En la Figura 3.19 se observa el espectrograma de masas del pico que se presentó
a los 20,35 min.
Figura 3.19. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,35 min, identificado como muurolanodieno del extracto 2MT2
53 73 93 113 133 153 173 193 213 233 253 273 293m/z0
100
%
7.02e4161
119
58
55
53
1059579
716759 938199 109
121
136127 152147 207162
195187172 179 285271243234222 263258292
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210m/z0
100
%
2.11e5161
119
10595
795855 6967 71 77 9381 91
8796 100 109 117
121133124
147136 204162
173
Tiempo (min)
Muurolanodieno
54
16.95 17.95 18.95 19.95 20.95 21.95 22.95 23.95 24.95 25.95 26.950
100
%
280910 2 semana r3a Scan EI+
2.10e722.70;55
19.668819.32
5519.0288
18.0358
19.7288
22.4155
22.3058
20.3558 21.62
58
24.7274
22.8755
23.0755
24.1410023.35
58 23.6658
24.3858 26.73
19324.9958
Figura 3.20. Cromatograma del extracto 3MT2
El espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,35 min se muestra
en la Figura 3.21.
Figura 3.21. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,36 min, identificado como muurolanodieno del extracto 3MT2
En la segunda semana de fumigación, los 3 extractos evaluados presentaron el
pico de interés que, en cada caso, fue analizado con la librería NIST, la cual los
identificó como muurolanodieno. Las probabilidades de los 3 picos analizados
fueron de 63,9%, 66,3% y 61,3%, respectivamente, para los espectrogramas de
masas de los cromatogramas presentados en las Figuras 3.17, 3.19 y 3.21. Los
reportes de la librería para cada uno de los picos se indican en el Anexo D.
Finalmente, al cabo de las 3 semanas después de la fumigación se evaluaron los
51 61 71 81 91 101 111 121 131 141 151 161 171 181 191 201 211 221 231 241 251 261 271 281 291m/z0
100
%
280910 2 semana r3a 2059 (20.349) Cm (2054:2064-(2064:2126+2007:2054)) Scan EI+ 1.69e5161
119
105955855 8179
706793 96
109
121
133 149 204 285
Tiempo (min)
Muurolanodieno
55
extractos 1MT3, 2MT3 y 3MT3.
En la Figura 3.22, se presenta el cromatograma del extracto 1MT3.
18.47 18.97 19.47 19.97 20.47 20.97 21.47 21.97 22.47 22.97 23.47Time0
100
%
280910 3 semana r1a Scan EI+
3.45e722.70;55
19.3257
18.2588
19.5258
22.3055
19.7258
20.3688
21.1688
22.4188
22.5988
23.3595
22.8755
23.0788
23.7288
23.4558
Figura 3.22. Cromatograma del extracto 1MT3
Se analizó el espectrograma de masas del pico que se presentó a los 30,36 min
con la librería NIST, el cual se observa en la Figura 3.23. Con una probabilidad
del 72 %, la librería NIST identificó al compuesto como muurolanodieno. El
reporte de la librería se muestra en el Anexo D.
Figura 3.23. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,36 min, identificado como muurolanodieno del extracto 1MT3
El cromatograma del extracto 2MT3 se observa en la Figura 3.24.
47 57 67 77 87 97 107 117 127 137 147 157 167 177 187 197 207 217 227 237 247 257 267 277 287m/z0
100
%
2.66e5161
119
10595
795855 696771
819391 96
109
121
133122 136 207164 190
186281
Tiempo (min)
Muurolanodieno
56
11.00 13.00 15.00 17.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.000
100
%
280910 3 semana r2b Scan EI+ 30.01
24.74
22.70
19.31
18.0514.6122.31
20.3821.17
22.87
24.38
27.20
29.6427.57
33.02
32.56
31.25
Figura 3.24. Cromatograma del extracto 2MT3
En este caso, el pico fue identificado como copaeno con una probabilidad de 78,4
% y el espectrograma de masas del pico se indica en la Figura 3.25. El reporte de
la Librería NIST se encuentra en el Anexo D.
Figura 3.25. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,38 min, identificado como copaeno del extracto 2MT3
La Figura 3.26 presenta el cromatograma del extracto 3MT3.
47 57 67 77 87 97 107 117 127 137 147 157 167 177 187 197 207 217 227 237 247 257 267 277 287m/z0
100
%
7.26e5161
119
10595
938179
69555358
6791
82 96 109
121
133122147
204162
189 207 281
Tiempo (min)
Copaeno
57
18.83 19.33 19.83 20.33 20.83 21.33 21.83 22.33 22.83 23.33 23.830
100
%
280910 3 semana r3a Scan EI+
3.52e722.69
19.31
22.40
22.29
19.51
19.71
20.36
23.34
22.86
23.06
24.00
23.72
23.44
Figura 3.26.Cromatograma del extracto 3MT3
El pico analizado fue el que se presentó a los 20,36 min y su espectrograma de
masas se muestra en la Figura 2.27, este fue identificado como alfa cubebeno,
con una probabilidad de 72 %.
Figura 3.27. Espectrograma de masas del pico que se presentó a los 20,36 min, identificado como alfa cubebeno del extracto 3MT3
Es importante mencionar que existen varias opciones de terpenos identificados
con valores bajos del % de probabilidad, esto puede deberse a que el tamaño de
la muestra es grande y alberga gran cantidad de especies de plantas briófitas.
Además la identificación de un compuesto desconocido mediante la utilización de
una librería computacional depende directamente de la calidad y comprensibilidad
de la base de datos utilizada. Sin embargo, debemos tomar en cuenta el hecho de
que a menudo existen isómeros que tienen idénticos espectros de masa, y que
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210m/z0
100
%
3.44e5161
119
95
81585553
79
6967 7177
939187
105
96 100 109121
133124136
148204162
191207
Tiempo (min)
Alfa cubebeno
58
algunas veces un espectro de masas similar corresponde a un compuesto
diferente. (De Hoffmann y Stroobant, 2002).
La Tabla 3.3 indica las áreas de los picos identificados como terpenos para
evaluar el comportamiento de los extractos de plantas briófitas a la acción de una
dosis de glifosato y de las muestras que no estuvieron expuestas al glifosato. El
área teórica calculada se determinó con la ecuación (1) del acápite 2.5. Además,
en la Tabla 3.3 se observan los promedios de las áreas normalizadas de los
extractos, según la semana de análisis.
Tabla 3.3. Áreas de los picos correspondientes a los terpenos encontrados en los extractos de plantas briófitas expuestas a la acción de una dosis de glifosato
Nombre de la muestra Código de la muestra
Terpeno identificado
Área (Unidades de área)
Volumen (mL)
Área normalizada (Unidades de
área)
Réplica 1 sin aplicación de glifosato
1MT0 Gama muuroleno 226 094 57,0 164 170
Réplica 2 sin aplicación de glifosato
2MT0 Gama muuroleno 1’188 494 51,0 772 143
Réplica 3 sin aplicación de glifosato
3MT0 Gama muuroleno 488 957 73,0 454 699
Réplica 1 con aplicación de glifosato,
semana 1 1MT1 Copaeno 588 384 82,0 614 618
Réplica 2 con aplicación de glifosato,
semana 1 2MT1 Alfa cubebeno 329 212 88,0 369 053
Réplica 3 con aplicación de glifosato,
semana 1 3MT1 - 0 127,0 0,000
Réplica 1 con aplicación de glifosato,
semana 2 1MT2 Muurolanodieno 47 089 316,0 189 556
Réplica 2 con aplicación de glifosato,
semana 2 2MT2 Muurolanodieno 39 010 294,0 146 101
Réplica 3 con aplicación de glifosato,
semana 2 3MT2 Muurolanodieno 43 645 274,0 152 341
59
Tabla 3.3. Áreas de los picos correspondientes a los terpenos encontrados en los extractos de plantas briófitas expuestas a la acción de una dosis de glifosato (Continuación...)
Nombre de la muestra Código de la muestra
Terpeno identificado
Área (Unidades de área)
Volumen (mL)
Área normalizada (Unidades de
área)
Réplica 1 con aplicación de glifosato,
semana 3 1MT3 Muurolanodieno 79 945 83,0 84 528
Réplica 2 con aplicación de glifosato,
semana 3 2MT3 Copaeno 231 004 50,5 148 608
Réplica 3 con aplicación de glifosato,
semana 3 3MT3 Alfa cubebeno 107 287 132,0 180 406
Promedio de las muestras 1MT0 , 2MT0
y 3MT0 MT0p - - - 463 671
Promedio de las repeticiones: 1MT1,
2MT1 y 3MT1 MT1p - - - 327 890
Promedio de las repeticiones: 1MT2,
2MT2 y 3MT2 MT2p - - - 162 666
Promedio de las repeticiones: 1MT3,
2MT3 y 3MT3 MT3p - - 137 847
La Figura 3.28 muestra la gráfica del comportamiento de los valores promedios de
las áreas normalizadas de los picos evaluados, durante las 3 semanas de
fumigación.
Estos valores indican que existe una tendencia de disminución de las áreas
normalizadas de los picos identificados, a medida que transcurre el tiempo de
exposición al glifosato. Transcurrida la primera semana de fumigación, el
promedio del área normalizada disminuye en un 29,3 % respecto al valor de
MT0p. A la segunda semana de la fumigación, el promedio del área normalizada
disminuye en un 64,9 % respecto al valor de MT0p. Finalmente, el valor del
promedio del área normalizada a la tercera semana de fumigación, disminuye en
un 70,3 % respecto al valor de MT0p.
60
Figura 3.28. Valores promedios de las áreas teóricas de los extractos de plantas briófitas
expuestos a una dosis de glifosato, evaluados según la semana de análisis
Esta tendencia podría estar relacionada con la acción del glifosato, el cual tiene
una estructura similar al fosfoelnolpiruvato (PEP) (Villalba, 2009), lo que podría
interferir en la formación de la acetil-coenzima A, precursora de la biosíntesis de
los terpenos (Ávalos y Pérez-Urria, 2009). Por otra parte, en las plantas briófitas
expuestas a la acción de una dosis de glifosato, la presencia de cloroplastos
respecto al tiempo tiene una tendencia decreciente (Sánchez, 2011). Los
cloroplastos son los encargados de realizar el proceso de fotosíntesis que finaliza
en la producción de glucosa (Ávalos y Pérez-Urria, 2009), entonces la disminución
de cloroplastos podría afectar la producción de PEP, el cual se produce a partir de
la glucosa y por lo tanto interferir en la formación de terpenos.
3.4. CONTENIDO DE ÁCIDO ASCÓRBICO EN LAS PLANTAS
BRIÓFITAS EXPUESTAS A LA ACCIÓN DE UNA DOSIS DE
GLIFOSATO
El contenido de ácido ascórbico de cada una de las muestras de plantas briófitas
se indican en la Tabla 3.4, los cuales fueron determinados en el laboratorio
Labolab, mediante la técnica de HPLC y se presentan en la Figura 3.29. Los
informes entregados por el laboratorio Labolab se observan en el Anexo E.
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
0 1 2 3
Áre
a (
un
idad
es
de
áre
a)
Tiempo (semanas)
61
Tabla 3.4. Contenido de ácido ascórbico en muestras de plantas briófitas expuestas a la aplicación de 20,2 % de glifosato
Muestra Tiempo (semanas)
Contenido de ácido ascórbico (mg/100 g)
TAA 0 0 89,96
MAA 1 1 83,17
MAA 2 2 57,91
MAA 3 3 57,08
Figura 3.29. Contenido de ácido ascórbico en las muestras de plantas briófitas expuestas a
la acción del glifosato durante tres semanas
Como se observa en la Figura 3.29, existe una tendencia de disminución del
contenido de ácido ascórbico presente en la muestra de plantas briófitas
expuestas a la acción del glifosato. Después de la primera semana de fumigación
el contenido de ácido ascórbico disminuye en un 7,5 % respecto a la muestra
TAA0, transcurrida la segunda semana de evaluación se evidencia una
disminución del contenido de ácido ascórbico en un 35,6 % respecto al valor de la
muestra TAA0; y, finalizada la tercera semana, el contenido de ácido ascórbico
disminuye en un 36,5 % respecto a la muestra TAA0.
Este comportamiento podría estar relacionado con que el ácido ascórbico, puede
sintetizarse a partir de glucosa (Ledezma-Gairaud, 2005) cuya formación es
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4
Can
tid
ad d
e á
cid
o a
scó
rbic
o (
mg/
10
0g)
Tiempo (semanas)
62
afectada con la presencia del glifosato ya que disminuye en el tiempo la cantidad
de cloroplastos presentes en la células de las plantas briófitas (Sanchez, 2011),
los mismos que son los responsables de la producción de glucosa de las plantas
ya que dentro de ellos se realiza la fotosíntesis. Además, otra razón que aportaría
con la disminución del ácido ascórbico, es que este actúa como un reductor de los
radicales libres que se forman debido a estrés que produce la presencia de una
sustancia extraña en la planta, que en este caso es el glifosato (Miranda-Ham y
Castro-Concha, 2010; García et al, 2004).
63
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
4.1. CONCLUSIONES
1. Se determinó la presencia de terpenos en los extractos vegetales de plantas
briófitas con el método de extracción y maceración con metanol, grado HPLC,
que utilizó 220 g de plantas briófitas secas, proceso que se llevó a cabo a
temperatura ambiente, con un tiempo de maceración de 4 semanas.
2. Los terpenos identificados en los extractos de las plantas briófitas
corresponden a los sesquiterpenos: copaeno, gama muuroleno,
muurolanodieno y alfa cubebeno.
3. Los extractos realizados con plantas briófitas, expuestas a la acción de una
dosis del 20,2 % de glifosato, muestran una disminución del contenido de
terpenos respecto a la réplica sin aplicación de glifosato (MT0p), durante las 3
semanas de evaluación. Después de la primera semana de fumigación el
contenido disminuye un 29,3 %, transcurrida la segunda semana de
fumigación, disminuye en un 64,9 % y finalmente, a la tercera semana de
fumigación, disminuye un 70,3 %
4. Los extractos realizados con plantas briófitas, expuestas a la acción de una
dosis del 20,2 % de glifosato, muestran una disminución del contenido de
ácido ascórbico respecto a la muestra sin aplicación de glifosato (TAA0),
durante las tres semanas de evaluación. Después de la primera semana de
fumigación el contenido de ácido ascórbico disminuye en un 7,5 %,
transcurrida la segunda semana de evaluación se evidencia una disminución
del 35,6 %; y finalizada la tercera semana el contenido de ácido ascórbico
disminuye en un 36,5 %.
64
4.2. RECOMENDACIONES
1. Realizar este estudio con plantas briófitas de una sola especie, por ejemplo la
Marchantia polymorpha, que sean cultivadas y monitoreadas desde sus inicios
por el investigador, para establecer parámetros como edad, modo de
crecimiento, condiciones atmosféricas, plagas, entre otros, puesto que los
mencionados factores influyen directamente en el metabolismo de estas
plantas.
2. Realizar un análisis estructural de los terpenos identificados en este estudio,
mediante la aplicación de las técnicas de resonancia magnética nuclear y
espectrometría infrarroja, para determinar la estructura de los analitos
identificados y corroborar el nombre establecido.
3. Realizar un estudio comparativo de los efectos del glifosato sobre las plantas
briófitas y una planta vascular, la cual puede ser propia de la zona amazónica
norte del Ecuador.
4. Complementar esta investigación con el estudio del contenido de cumarinas y
ácidos grasos, ya que son compuestos que se encuentran presentes en las
plantas briófitas y, a su vez, son compuestos de interés farmacéutico e
industrial.
5. En próximos estudios, incrementar la cantidad de plantas briófitas utilizada
para la obtención y análisis de extractos, ya que incrementaría la
concentración de los compuestos de interés en los extractos.
6. Realizar un estudio en el cual las aplicaciones de glifosato sean in situ, ya que
se evaluarían las plantas briófitas sin exponerlas a condiciones adicionales de
estrés.
65
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73
ANEXOS
74
ANEXO A
Datos de dosis de fumigación con glifosato en cultivos lícitos
Tabla A.1. Usos registrados de glifosato en SENASA
Cultivos Dosis (L o Kg/ha)
Cítricos 2,5 a 4
Frutales de pepita y vid 1,5 a 4,5
Barbechos de cultivos anuales 2 a 4
Soja RR 1,5 a 2,5
Maíz RR 1,8 a 3,5
Algodón RR 1,1 a 2,5
Fuente: (Arregui et al., 2010)
75
ANEXO B
Reportes de la librería de espectros de masas NIST, registrados en los
métodos de obtención de extractos vegetales de plantas briófitas para la
determinación de la presencia de terpenos
Figura B.1. Espectrograma de masas del cromatograma de los extractos S1c, S2c, U1, U2c, U3, U4c, U6c, M3, M4c
Tabla B.1. Reporte de la librería NIST del espectrograma de masas indicado en la Figura B.1
Nº Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS
1 923 Metanol 32 CH4O 67-56-1
Figura B.2. Espectrograma de masas del cromatograma del extracto U5
(mainlib) Methyl Alcohol0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
0
50
100
14
15
28
29
30
31
32
33
H
H
H
O
H
36 46 56 66 76 86 96 106 116 126 136 146 156 166 176 186 196 206 216 226 236 246 256 266 276m/z0
100
%
1.02e674
43
42
55
44
576967
87
7583
1439788 129101
115 227171157 185 199 270239
%
m/z
76
Tabla B.2. Nombre del compuesto correspondiente al pico del cromatograma del extracto obtenido con 57 g de plantas briófitas y 1 h en el ultrasonido (extracto U5)
Nº Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS
1 907 Éster metílico del ácido 10, 13
dimetil tetradecanoico 270 C17H34O2 267650-23-7
2 834 Éster metílico del ácido
tridecanoico 228 C14H28O2 1731-88-0
3 830 Éster metílico del ácido 12 metil
tetradecanoico 256 C16H32O2 62691-05-8
77
ANEXO C
Reportes de la librería de espectros de masas NIST, registrados en la
determinación de la presencia de terpenos en extractos orgánicos de
plantas briófitas.
Tabla C.1. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los 20,39 min en el cromatograma del extracto 1MT0
Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS
759 Gama muuroleno 204 C15H24 30021-74-0
Tabla C.2. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los 20,41 min en el cromatograma del extracto 2MT0
Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS
850 Gama muuroleno 204 C15H24 30021-74-0
Tabla C.3. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los 20,40 min en el cromatograma del extracto 3MT0
Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS
807 Gama muuroleno 204 C15H24 30021-74-0
78
ANEXO D
Reportes de la librería NIST de la sección Evaluación de la presencia de
terpenos en los extractos orgánicos de plantas briófitas expuestas a la
acción de una dosis de glifosato
Tabla D.1. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los 20,33 min en el cromatograma del extracto 1MT1
Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS
816 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5
809 Gama muuroleno 204 C15H24 30021-74-0
798 Alfa cubebeno 204 C15H24 17699-14-8
Tabla D.2. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los 20,34 min en el cromatograma del extracto 2MT1
Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS
749 Alfa cubebeno 204 C15H24 17699-14-8
741 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5
736 Muurolonodieno 204 C15H24 54324-03-7
Tabla D.3. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los 20,36 min en el cromatograma del extracto 1MT2
Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS
639 Muurolanodieno 204 C15H24 54324-03-7
629 Alfa cubebeno 204 C15H24 17699-14-8
612 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5
79
Tabla D.4. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los 20,35 min en el cromatograma del extracto 2MT2
Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS
663 Muurolanodieno 204 C15H24 54324-03-7
633 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5
625 Alfacubebeno 204 C15H24 17699-14-8
Tabla D.5. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los 20,35 min en el cromatograma del extracto 3MT2
Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS
613 Muurolanodieno 204 C15H24 54324-03-7
597 Alfacubebeno 204 C15H24 17699-14-8
584 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5
Tabla D.6. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los 20,36 min en el cromatograma del extracto 1MT3
Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS
691 Muurolanodieno 204 C15H24 54324-03-7
684 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5
680 Gama muuroleno 204 C15H24 30021-74-0
Tabla D.7. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los 20,38 min en el cromatograma del extracto 2MT3
Probabilidad Nombre del compuesto MW Fórmula CAS
784 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5
777 Gama muuroleno 204 C15H24 30021-74-0
776 Alfa cubebeno 204 C15H24 17699-14-8
80
Tabla D.8. Compuesto correspondiente al pico que se presentó a los 20,36 min en el cromatograma del extracto 3MT3
Nombre del compuesto MW Fórmula CAS
720 Alfa cubebeno 204 C15H24 17699-14-8
715 Gama muuroleno 204 C15H24 30021-74-0
712 Copaeno 204 C15H24 3856-25-5
81
ANEXO E
Informes del contenido de ácido ascórbico en las muestras de plantas
briófitas, realizado en el laboratorio Labolab
Figura E.1. Informe del contenido de ácido ascórbico de la muestra de plantas briófitas sin la exposición a la acción del glifosato (TAA0)
82
Figura E.2. Informe del contenido de ácido ascórbico de la muestra de plantas briófitas expuesta a la acción del glifosato después de una semana de la fumigación (MAA1)
83
Figura E.3. Informe del contenido de ácido ascórbico de la muestra de plantas briófitas expuesta a la acción del glifosato después de dos semanas de la fumigación (MAA2)
84
Figura E.4. Informe del contenido de ácido ascórbico de la muestra de plantas briófitas expuesta a la acción del glifosato después de tres semanas de la fumigación (MAA3)
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