espectrometria de luminescência molecular_aula unica
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Espectrometria de Luminescência Molecular
Universidade Federal de PernambucoDepartamento de Química Fundamental
Química Analítica 12A (Instrumental)
Espectrometria de Luminescência Molecular
Fluorescência Molecular
Fosforescência
Quimioluminescência
Fotoluminescência
Espectrometria de Luminescência Molecular
É a emissão de radiação eletromagnética (na região UV-Visível) proveniente de moléculas excitadas voltando ao estado fundamental
Quando a absorção de fótons é responsável pela excitação da molécula pela elevação de elétrons de valência de um orbitalmenos energético para um de maior energia
Fotoluminescência (flourescência e fosforescência)
Quimioluminescência
Está baseada no espectro de emissão de uma espécie excitada que é formada no decorrer de uma reação química
Ocorre em sistemas químicos gasosos, líquidos e sólidos simples bem como em sistemas complexos
Teoria da Fluorescência e Fosforescência
Fluorescência
O estado excitado envolvido é singlete, onde o spin do elétrons no orbital excitado mantém sua orientação.O retorno ao estado fundamental é rápido (10-5 a 10-8 s)
Fosforescência
A orientação do elétrons que foram promovidos ao estado excitado é invertida (estado excitado triplete). O retorno ao estado fundamental é mais lento (10-4 a 10 s ou mais) que no caso do singlete.
Teoria da Fluorescência e Fosforescência
A fluorescência é um fenômeno luminescente mais comum que a fosforescência
É observada em temperatura ambiente e diretamente em
solução o que torna o procedimento
experimental fluorimétrico, bastante simples
Fluorescência
É observada apenas em baixas temperaturas em
meios altamente viscosos, ou em moléculas que estão absorvidas em superfícies
sólidas
Fosforescência
Estados Excitados que Produzem Fluorescência e Fosforescência
Spin Eletrônico
Princípio de Exclusão de Pauli
Quaisquer dois elétrons em um átomo não podem ter os mesmos valores dos quatro números quânticos.
Não mais de dois elétrons podem ocupar um orbital e devem ter spins opostos (spins emparelhados).
A maioria das moléculas não apresenta campo magnético intrínsecosendo denominada de diamagnética (não é atraída nem repelida por
campos magnéticos estáticos).
Os radicais livres, que contém elétrons desemparelhados, têmmomento magnético e são atraídos por um campo elétrico.
Eles são paramagnéticos.
Estados Excitados Singlete e Triplete SingleteEstado eletrônico molecular no qual todos os spins eletrônicos estão emparelhados e nenhuma separação de níveis de energia ocorre quando a molécula é exposta a um campo magnético.
TripleteEstado eletrônico molecular no qual os spins eletrônicos estão desemparelhados e são paralelos
DubleteEstado fundamental para um radical livre onde, o elétron isolado pode ter duas orientações em um campo magnético, o que dá energias diferentes.
Estados Excitados Singlete e TripleteAs propriedades de uma molécula no estado excitado triplete
diferem muito daquelas do estado singlete
Molécula é paramagnética no estado triplete e diamagnética no estado singlete
Transições singlete/triplete ou triplete/singlete (que também envolvem mudanças de estado eletrônico) são menos prováveis que uma transição singlete/singlete correspondente
Estado Excitado Tempo de vida médio, s
Triplete 10-4 a vários segundos
Singlete 10-5 a 10-8
Excitação produzida por radiação de uma molécula no estado fundamental ao estado triplete tem pouca probabilidade de ocorrer e os picos decorrentes desse processo são muito menores que as transições singlete/singlete
Diagrama de Níveis de Energiade Moléculas Fotoluminescentes
Níveis excitados de energia
S = singlete
T = triplete
Estadofundamental
singlete
Estadoexcitadosinglete
Estadofundamental
triplete
Excitação não significativaDevido a mudança de multiplicidade
Emissão Fluorescência
Fosforescência
10-5 a 10-9 s
10-4 a 10 s ou mais
<10-9 s
Tempo de vida médio de uma espécie excitada
Tempo de vida médio de uma espécie excitada
Velocidades de Absorção e Emissão
t (10-14 a 10-15 s)
t estado excitado 1/(pico de absorção)(vida)
t (10-7 a 10-9 s)
M + hv M*vel. altíssima
M* Mreemissão
vel. menor
absorção
fluorescência fosforescência
Não há mudança de spin (t. curto)
Há mudança de spin (t. longo)
10-4 a 10 s10-5 a 10-8 s
Processos de Desativação
M* Mreemissão
vel. menorMolécula excitada
Molécula no estado
fundamental
Etapas Mecanísticas da volta ao Estado Fundamental
• Fluorescência• Fosforescência
Emissão de um fóton de radiação
Processos radiativos
Processos não-radiativosNão há emissão de fóton de radiação
• Relaxação Vibracional
Processos de Desativação
“A trajetória favorecida é aquela que minimiza o tempo de vida do estado excitado”
Se a fluorescência é mais rápida que os processos
sem radiação
Se a trajetória não-radiativa tem constante de velocidade
mais favorável
Emissão por fluorescência
Não há fluorescênciaou é pouco intensa
Etapas Mecanísticas da volta ao Estado Fundamental
Processos de Desativação
Relaxação Vibracional
A banda de fluorescência para uma dada transição eletrônica está deslocada para freqüências mais baixas ou comprimentos de onda
maiores em relação a banda de absorção
Como a relaxação vibracional é muito rápida, não há emissão
consequência
A transição ocorre a partir de um nível vibracional mais baixo de um estado eletrônico excitado
Níveis excitados de energia
S = singlete
T = triplete
Cruzamento interno(10-13 a 10-11 s)
Processos de Desativação
Não há emissão
t. de vida do estado excitado
(10-7 a 10-9 s)t. de vida do
estado excitado(10-4 a 10 s)
Relaxação Vibracional
r’ produz r
Processos de Desativação
Conversão Interna
Descreve processos intermoleculares pelos quais uma molécula passa para um estado eletrônico de energia
menor sem emissão de radiação
A conversão interna parece ser eficiente quando dois níveis eletrônicos de energia estão próximos o suficiente para que
haja uma superposição de níveis de energia vibracionais
Quando as energias potenciais dos dois estados excitados são idênticas, a transição é muito eficiente
Processos de Desativação
Conversão Interna
A conversão interna explica o fato de não haver banda de fluorescência proveniente de uma transição de S2 S0
A transição acontece de S1 S0
A fluorescência ocorre somente em 3, não importando qual radiação de comprimento de onda 1 ou 2 foi responsável pela excitação
Níveis excitados de energia
S = singlete
T = triplete
Processos de Desativação
Conversão Interna S1 S0
Processos de Desativação
Exemplo de Conversão Interna
Quinino
Processos de Desativação
Conversão Interna S1 S0
Os níveis vibracionais do estado fundamental podem se sobrepor aos do primeiro estado eletrônico excitado
A desativação ocorrerá rapidamente pelo mecanismo S1 S0
Compostos alifáticos têm esse comportamento e por isso, não fluorescem. A desativação vibracional é muito mais
rápida que a desativação por fluorescência
S = singlete
T = triplete
Processos de DesativaçãoConversão Interna S1 S0
Níveis excitados de energia
Processos de Desativação
Conversão Externa ou supressão (extinção) por colisão
É a desativação de um estado eletrônico excitado que envolve interação ou transferência de energia entre a
molécula excitada e o solvente ou soluto
M* solvente ou solutoh
A redução do número de colisões (baixa temperatura e alta viscosidade) aumentam a fluorescência.
S = singlete
T = triplete
Processos de DesativaçãoConversão Externa S1 S0
Níveis excitados de energia
Processos de Desativação
É um processo no qual o spin de um elétron excitado é invertido resultando em uma mudança de multiplicidade da molécula
A probabilidade dessa transição é aumentada se os níveis vibracionais dos dois estados se interpenetram.
Cruzamento Intersistema S1 T1
O cruzamento intersistema é mais comum em moléculas que contém átomos pesados, como iodo ou bromo
A presença de espécies paramagnéticas como o oxigênio, facilita o cruzamento intersistema decrécimo da fluorescência
S = singlete
T = triplete
Processos de Desativação
Níveis excitados de energia
Cruzamento Intersistema S1 T1
Processos de Desativação
Depois do cruzameto intersistema para um estado triplete, uma desativação interna pode ocorrer, seja por conversão interna ou
seja por fosforescência
Uma transição triplete singlete é muito menos provável que pela conversão singlete/singlete . O tempo de vida médio do estado
triplete em relação à emissão varia de 10-4 a 10 s ou mais
Fosforescência
As conversões interna e externa competem de tal modo bem-sucedido com a fosforescência que esse tipo de emissão é
normalmente observado apenas em baixas temperaturas em meios altamente viscosos, ou em moléculas que estão absorvidas em
superfícies sólidas
S = singlete
T = triplete
Processos de Desativação
Níveis excitados de energia
Fosforescência
Variáveis que afetam a Fluorescência e a Fosforescência
Rendimento Quântico
Tipos de transições na Fluorescência
Eficiência Quântica e Tipos de transições na Fluorescência
Fluorescência e a Estrutura
Efeito da Rigidez Estrutural
Efeito do Solvente e da Temperatura
Efeito do pH na Fluorescência
Efeito do Oxigênio Dissolvido
Efeito da Concentração na Intensidade da Fluorescência
Rendimento Quântico ou Eficiência Quântica ()
É a razão no número de moléculas que fluorescem pelo número total de moléculas excitadas
Para a fluoresceína, a eficiênciaquântica se aproxima da unidade
f = fluorescênciai = cruzamento intersistemace = conversão externaci = conversão internapd = pré-dissociaçãod = dissociação
Tipos de Transições de Fluorescência
Radiação muito energética pode causar desativação dos estados excitados.
Algumas ligações da maior parte das moléculas orgânicas podem ser rompidas.
Fluorescência devido a transições * dificilmente é observada
A fluorescência dificilmente resulta da absorção ultravioleta
de comprimento de onda menores que 250 nm.
Ligante
Ligante
Não-ligante
Antiligante
Antiligante
Tipos de Transições de Fluorescência
Ligante
Ligante
Não-ligante
Antiligante
Antiligante
Emissão fica restrita aos processos menos energéticos transições * e * n
Eficiência Quântica e Tipo de Transição
Empiricamente:
* > * n
Fluorescência
transição de menor energia é *
transição de menor energia én *
* = (100 a 1000) x * n
t vida(* ) = 10-7 a 10-9 s t vida(* n) = 10-5 a 10-7 s
Eficiência Quântica e Tipo de Transição
Conclusão
A fluorescência está mais comumente associada atransições * porque apresentam tempo de vida
médio menores (kf é maior) e porque os processos dedesativação que competem com a fluorescência são
de ocorrência menos provável
Fluorescência e Estrutura
A fluorescência é mais intensa em compostos contendo grupos funcionais aromáticos com níveis de transição * de baixa energia
Estruturas comanéis condensadosapresentam fluorescência
Heterocíclicossimples nãoapresentam fluorescência
transição n *
O tempo de vida do anel benzeno é menor
Fluorescência e Estrutura
Efeito do átomopesado
Efeito da Rigidez Estrutural
A fluorescência é favorecida em moléculas quepossuem estrutura rígida
= 1,0 = 0,2
grupometileno
Efeito da Rigidez Estrutural
Certos agentes quelantes orgânicos tem sua fluorescência aumentada quando complexam com um íon metálico
N
OZn
2
N
OH
8-hidroxiquinolina
Intensidade da fluorescência
complexo de Zncom 8-hidroxiquinolina
Efeito do Solvente e da Temperatura
O aumento da temperatura aumenta a freqüência de colisões aumentando a probabilidade de desativação por conversão externa
A fluorescência de uma molécula é diminuída por solventes contendo átomos pesados ou outros solutos com tais átomos em sua estrutura
Ex.de solventes:Tetraboreto de carbono e iodeto de etila
Efeito do pH na Fluorescência
A anilina tem várias formas ressonantes. As formas ressonantes adicionais tornam o primeiro estado excitado mais estável.
O íon anilínio apresenta somente uma forma ressonante
Exemplo do efeito do pH na Fluorescência
Titulação ácido/base da forma fenólicado ácido 1-naftol-4-sulfônico
A fluorescência da forma fenólica do ácido 1-naftol-4-sulfônico
não é detectada visualmente porque ocorre no ultravioleta.
Uma vez convertido a forma de fenolato por adição de base, o pico de emissão se desloca para comprimentos de onda no visível onde pode ser visto.
A constante de dissociação ácida da forma excitada é diferente daquela da mesma espécie no estado fundamental
Efeito do Oxigênio Dissolvido
A presença de oxigênio dissolvido frequentemente reduz a intensidade de fluorescência de uma solução
Razões plausíveis:
Resultado da oxidação da espécie fluorescente, induzida fotoquimicamente
A supressão acontece como consequência das propriedades paramagnéticas do oxigênio molecular
Promove cruzamento intersistema convertendo as moléculas excitadas em estado triplete
OBS. Outras espécies paramagnéticas também tendem a suprimir a fluorescência
Efeito da Concentração na Intensidadeda Fluorescência
PPKF 0' bc
P
P 100
...
!3
303,2
!2
303,2303,2
22
0' bcbc
bcPKF
bcPKF 1010'
05,0303,2 Abc 0'3,2 bcPKF
KcF cteP 0
Expansão do termo exponencial em série de Maclaurin:
Efeito da Concentração na Intensidadeda Fluorescência
...
!3
303,2
!2
303,2303,2
22
0' bcbc
bcPKF
grandec
importantes
05,0303,2 Abc
A linearidade é perdida:
F situa-se abaixo de uma extrapolação da parte linear
Efeito da Concentração na Intensidadeda Fluorescência
grandec
Auto-supressão
Auto-absorção
Resultado de colisões de moléculas excitadas. Ocorre umatransferência não-radiativa talvez de modo semelhantea transferência para moléculas do solvente na conversão externa
Ocorre quando o comprimento de onda de emissão se sobrepõea um pico de absorção. A fluorescência diminui na proporção quea emissão atravessa a solução e é reabsorvida por moléculasfluorescentes.
Espectros de Excitação e Emissão
Intensidade de luminescência medido em fixo
de excitação variável
A intensidade de emissãoé registrada em função de
Na fluorescência e fosforescência de excitação é fixo
excitação<fluorescência<fosforescência
Espectrometria de Luminescência Molecular
Universidade Federal de PernambucoDepartamento de Química Fundamental
Química Analítica 12A (Instrumental)
Instrumentos para medida de Fluorescência e a Fosforescência
Componentes de um Fluorímetro ou Espectrofluorímetro
1°
2°
1° (excitação)
2° (emissão)
Componentes de um Fluorímetro ou Espectrofluorímetro
Fontes
Lâmpadas • Vapor de mercúrio de baixa pressão: Linhas úteis para excitar fluorescência (254, 302, 313, 546, 578, 691, e 773 nm)
Lasers• Laser de corante sintonizado bombeado com laser de nitrogênio pulsado ou laser Nd:YAG
O isolamento da linha adequada é feito com filtros de absorção ou interferência
Componentes de um Fluorímetro ou Espectrofluorímetro
Fontes
Desvantagem: As fontes com Lasers são mais caras que as com lâmpadas
Vantagem:
Melhor para amostras muito pequenas Excelente para sensoreamento remoto(detecção de radicais hidroxila na atmosfera) Ideal quando é necessário uma excitação essencialmente monocromática (minimiza os efeitos de fluorescências interferentes)
Componentes de um Fluorímetro ou Espectrofluorímetro
Filtros e Monocromadores
Filtros de absorção e
Filtros de Interferência
Seleção do feixe de excitação
Seleção da radiação Fluorescente resultante
Transdutores Fotomultiplicadoras
Detectores com arranjo de diodos
(Diode array)
Componentes de um Fluorímetro ou Espectrofluorímetro
Células e Compartimentos de Células
Células cilíndricas e retangulares fabricadas com vidro ou sílica
• Deve-se proteger o compartimento contra a radiação espalhada• Evitar impressões digitais na célula porque as gorduras da pele fluorescem
Instrumentos para medida de Fluorescência e a Fosforescência
Projetos de Instrumentos
Fluorímetros de Filtro
SimplesBaixo custo (US$ 5.000)
Projetos de Instrumentos
Espectrofluorímetros
Características dos Espectros de Espectrofluorímetros
Os espectros de emissão variam de aparelho para aparelho e não
podem ser comparados entre si
A informação de saída depende:
Intensidade da fluorescência do analito
Características da lâmpada
Transdutor
Monocromadores
Projetos de Instrumentos
Espectrofluorímetros baseados em Arranjos de Transdutores (diodos)
Projetos de Instrumentos
Sensores de Fluorescência de Fibra Óptica (Optrodos ou optodos)
Consistem de uma fase reagente imobilizada na extremidade de uma fibra óptica.
A interação do analito com o reagente provoca uma mudança na absorbância, reflectância, fluorescência ou luminescência.
Projetos de Instrumentos
Fosforímetros
Dispositivo para Excitar e Observar a Fosforescência
A medida da fosforencênciaé realizada com um atrazo detempo para poder distinguira fluorescêcia (tvida curto) dafosforescência (tvida longo)
Frasco Dewarcom N2 liq.
Padronização de Instrumentos
É necessário realizar uma calibração dos fluorímetrose espectrofluorímetros
A calibração é feita com solução de sulfato de quinino ~10-5 M
A excitação é feita por radiação em 350 nm e a emissão da radiação se dá em 450 nm
Existe um conjunto de 6 padrões sólidos dissolvidosem matriz de plástico que podem ser usados indefinidadmente (fabricante - Perkin Elmer)
AεbcP
P0 logKcF
P0 = cte
Aplicações e Métodos de Fotoluminescência
Espectrofotometria Fluorimetria
Sensibilidade Faixa mais alta
de concentração
Faixa mais baixa
de concentração
(1 a 3 vezes mais sensível)
Dependência
da potência da fonte (P0)
existe Não existe
Precisão e
Exatidão
Melhor Pior
(2 a 5 vezes pior)
Cátions que formam Quelatos Fluorescentes
Íons de metais de transição não formam quelatos fluorescentes
A maioria dos íons são paramagnéticos cruzamento intersistema (triplete)
Complexos de metais de transição caracterízam-se por muitos níveis de energia pouco espaçados conversão interna (triplete)
Íons de outros metais que não são de transição formam quelatos fluorescentes
São menos susceptíveis aos efeitos acima
Reagentes Fluorimétricos
Reagentes Fluorimétricose Aplicações
Medidas de Tempo de Vidade Fluorescência
Saída da fonte em função do tempo
Decaimento do sinal de fluorescência (decaimento da fonte
e decaimento do sinal de emissão do analito)
Sinal de fluorescênciaverdadeiro obtidopor deconvolução
da contribuição da fonte para o sinal
experimental
Determinação Fluorimétrica de Espécies Orgânicas
Compostos orgânicos, Enzimas, Coenzimas, Agentes medicinais,Produtos de plantas,EsteróidesVitaminas
Mais de 200 substâncias podem ser analisadas por fluorimetria
Produtos para alimentos, FármacosAmostras Clínicas Produtos Naturais
Aplicações mais importantes
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