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PAULO ROBERTO BERTOLETTO
ESTUDO MORFOLGICO DO INTESTINO DELGADO DE RATOS NA
ISQUEMIA-REPERFUSO SOB OXIGENAO HIPERBRICA
Tese apresentada Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina, para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias.
SO PAULO 2005
PAULO ROBERTO BERTOLETTO
ESTUDO MORFOLGICO DO INTESTINO DELGADO DE RATOS NA
ISQUEMIA-REPERFUSO SOB OXIGENAO HIPERBRICA
Tese apresentada Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina, para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Djalma Jos Fagundes
SO PAULO 2005
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA UNIFESP-EPM
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM
CIRURGIA E EXPERIMENTAO COORDENADOR: Prof. Dr. Djalma Jos Fagundes
TESE DE MESTRADO
AUTOR: Paulo Roberto Bertoletto ORIENTADOR: Prof. Dr. Djalma Jos Fagundes TTULO: Estudo morfolgico do intestino delgado de ratos na isquemia-reperfuso sob oxigenao hiperbrica. BANCA EXAMINADORA: 1- Presidente: Prof. Dr. Djalma Jos Fagundes Coordenador do Programa de Ps-Graduao em Cirurgia e Experimentao da UNIFESP-EPM. MEMBROS EFETIVOS: 2 Prof. Dr. Danilo C. Teves Professor Adjunto da Disciplina de Histologia e Biologia Estrutural da UNIFESP-EPM. 3 Prof. Dr. Joo Ricardo Filgueiras Tognini Professor Titular do Departamento de Clnica Cirrgica da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. 4 Profa. Dra. Maria Ligia Lyra Pereira Professora Assistente do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Cincias Mdicas de Santos UNILUZ. MEMBRO SUPLENTE 1- Prof. Dr. Hlio Plapler Professor Adjunto da Disciplina de Tcnica Operatria e Cirurgia Experimental da Universidade Federal de So Paulo-Escola Paulista de Medicina.
ii
o principio da Sabedoria o desejo autntico de instruo, e a preocupao pela instruo o amor Sabedoria II:6
iii
DEDICATRIA
minha esposa Maria Anglica e filhos Ana Carolina, Vanessa, Eduardo e Renata
que compartilham comigo os mritos e as tribulaes da jornada do mdico.
iv
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao Prof. Dr. Djalma Jos Fagundes, Coordenador do Programa de Ps-
Graduao em Cirurgia e Experimentao da Universidade Federal de So Paulo Escola
Paulista de Medicina, orientador deste trabalho; pesquisador e condutor deste programa, que
com o seu trabalho certamente melhorar o ensino e a pesquisa mdica no nosso pas.
v
AGRADECIMENTOS
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO PAULO ESCOLA PAULISTA DE
MEDICINA UNIFESP-EPM, que me recebeu no Programa de Ps- Graduao em
Cirurgia e Experimentao tornando possvel este antigo objetivo.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL- UFMS, por ter
acreditado neste propsito.
Ao Prof. Dr. Luiz Francisco Poli de Figueiredo, Livre-Docente, Titular da
Disciplinade Tcnica Operatria e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, que me
acolheu.
Ao Prof. Dr. Celso Massaschi Inoueye, pela persitncia, entusiasmo e idealismo que o
caracterizam.
Ao Prof. Dr. Manuel de Jesus Simes, que com sua competncia e participao foi
fundamental na realizao deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Paulo de Oliveira Gomes, Professor Adjunto da Disciplina de Tcnica
Operatria e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM, que transmite a sua imensa cultura.
Profa. Dra. Edna Frasson de Souza Montero, Professora Afiliada ao Departamento
de Cirurgia da UNIFESP-EPM, pelos ensinamentos transmitidos.
Ao Prof. Dr. Murched Omar Taha, Professor do Departamento de Cirurgia da
UNIFESPEPM, pelos competentes ensinamentos transmitidos.
Profa. Dra. Celina Fochima, que colaborou na realizao deste trabalho.
Profa. Dra. Mirian A. Ghiraldini Franco, com o seu conhecimento e informaes
transmitidas.
Aos meus colegas mdicos de Dourados, Dr. Joo Vidigal, Dra. Stela Vidigal e Dr.
Jos Carlos Chaves que compartilharam comigo este caminho e que incentivaram
mutuamente nas etapas deste trabalho.
vi
Aos Acadmicos de Medicina do Curso de Medicina de Dourados da UFMS ,
epresentados por Adriana Regina Gonalves Ribeiro, Evandro Eduardo Canhao, Fbio de
Oliveira Riuto, Fernando Csar Frana Arajo, Karine Keiko Leito Higa, Lena Maria
Mukai Verri, Lvia Afonso Santos, Lvia Villela Teixeira e Thiago Pauluzi Justino que nos
acompanharam e participaram deste trabalho.
Elaine, Valdelice e Margarete e no nome delas eu quero agradecer a pacincia e
dedicao que todos os funcionrios tiveram para o desenvolvimento deste trabalho.
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Foto do confinamento dos animais................................................. 5
Figura 2 - Esquema de distribuio dos animais nos diversos grupos de
estudo..............................................................................................
6
Figura 3 - Foto do animal anestesiado e aps a tricotomia............................. 8
Figura 4 - Foto do ato operatrio com pina transpassando e isolando a veia
e artria mesentricas superiores, vistas por transparncia abaixo
do peritnio parietal........................................................................
9
Figura 5 - Foto mostrando a veia e artria mesentricas dissecadas e sendo
ocludas com pina hemosttica de microcirurgia tipo bulldog.....
9
Figura 6 - Foto das alas intestinais isquemiadas (macroscopia) aps a
abertura da cavidade e com a presena da pina hemosttica sem
oxigenao hiperbrica).................................................................
10
Figura 7 - Foto da cmara hiperbrica em acrlico para animais de pequeno
porte.B (base), T (Tampo) V (vlvula)...........................................
11
Figura 8 - Foto mostrando o manmetro e a presso usada durante o
experimento....................................................................................
11
Figura 9 - Foto do animal no interior da cmara durante o procedimento de
oxigenao hiperbrica. A (animal), C (cal sodada), V (vlvula)..
12
Figura 10 - Foto mostrando o segmento de leo terminal seccionado 40 mm
da juno leo-cecal com 50 mm de extenso, pronto para ser
imerso na soluo de fixao de formalina tamponada 10%.........
14
Figura 11 - Foto do procedimento de eutansia com aplicao de soluo
cloreto de potassio na veia cava inferior........................................
15
Figura 12 - Fotomicrografia caracterstica de uma lmina de intestino
delgado prepara pelo mtodo imunohistoqumica para expresso
da caspase 3, mostrado pela colorao acastanhada das clulas
em apoptose....................................................................................
16
viii
Figura 13 - Fotomicrografia caracterstica de uma lmina corada em HE com
a destruio das vilosidades intestinais classificada como grau 2
de leso celular...............................................................................
17
Figura 14 - Mostrando o equipamento usado para a leitura, microscpio Carl
Zeiss Axilab, sistema de captura Axiocom MRC e
processamento com o programa de computador Axiovision Rel
42.- (Zeiss)......................................................................................
20
Figura 15 - Mostrando detalhes do programa de computador usado Axiocam
MRC da Zeiss.................................................................................
20
Figura 16 - Fotomicrografia caracterstica de uma lmina corada pela HE,
mostrando as reas consideradas para a medio da parede
intestinal e demarcadas para identificao e contagem pelo
programa de computador (Axiovision Rel 4.2 da ZEISS)............
21
Figura 17 - Fotomicrografia de uma lmina de um animal do grupo I, onde
pode-se notar a desestruturao das vilosidades, restos celulares
desprendidos no lmen intestinal e achatamento global da
mucosa .As criptas esto relativamente conservadas. A camada
sero-muscular est preservada. (HE 20X )..................................
24
Figura 18 - Fotomicrografia de uma lmina de um animal do grupo I, onde
pode-se notar que as criptas esto relativamente conservadas.
Porm com focos de extravasamento hemorrgico na lmina
prpria e entre as criptas (setas) (HE 200X)...............................
24
Figura 19 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do
grupo II, mostrando a integridade das vilosidades e criptas,
embora em alguns setores possam perceber-se discretas
alteraes apicais na estruturao da vilosidade (HE 20X)........
26
Figura 20 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do
grupo II, mostrando a integridade da vilosidade, com edema
discreto (seta fina), sem alteraes estruturais relevantes, porm
com discretos focos de extravasamento hemorrgico (seta
espessa). (HE 200X)....................................................................
26
ix
Figura 21 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do
grupo III, onde se pode notar a desestruturao das vilosidades,
restos celulares desprendidos no lmen intestinal, achatamento
global da mucosa e focos esparsos de extravasamento
hemorrgico. As criptas esto desestruturadas com sinais de
edema e descolamento da lmina prpria. A camada sero-
muscular est preservada. (HE 20X)...........................................
28
Figura 22 - Fotomicrografia de uma lmina de um animal do grupo III, onde
pode-se notar a ausncia de vilosidades, as criptas esto
destrudas, com focos de extravasamento hemorrgico na lmina
prpria e entre as criptas (setas) (HE 200X)...............................
28
Figura 23 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do
grupo IV, mostrando a integridade das vilosidades e criptas,
embora em raros setores possam perceber-se discretas alteraes
apicais na estruturao da vilosidade (HE 20X).........................
30
Figura 24 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do
grupo IV, mostrando a integridade da vilosidade, sem edema ou
alteraes estruturais relevantes. (HE 200X)..............................
30
Figura 25 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do
grupo I, onde se pode notar as vilosidades marcadas mais
intensamente em marrom nas suas pores mdias e apicais,
sendo que a parte basal a colorao ocorra em menor
freqncia.(Imunohistoqumica 20X).........................................
32
Figura 26 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do
Grupo I, onde se pode notar uma freqncia menor de clulas
marcadas em marrom acastanhado nas reas das criptas
intestinais. (Imunohistoqumica - 200X)........................................
32
Figura 27 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do
Grupo II, onde se nota que as vilosidades esto bem conservadas
e a colorao marrom acastanhada se faz presente em maior
freqncia e intensidade nas bordas apicais. (Imunohistoqumica
20X).............................................................................................
34
x
Figura 28 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do
grupo II, onde se pode notar nas criptas intestinais uma
marcao celular em marrom acastanhado de menor intensidade
e freqncia do nas correspondentes vilosidades do mesmo
grupo. (Imunohistoqumica 200X).................................................
34
Figura 29 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do
grupo III, onde se pode notar intensa desestruturao das
vilosidades intestinais e colorao marrom acastanhada das
vilosidades remanescentes at junto s criptas intestinais.
(Imunohistoqumica- 20X).............................................................
36
Figura 30 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do
Grupo III, onde se pode notar as criptas alteradas e freqncia e
intensidade da colorao marrom acastanhada semelhante a das
vilosidades. (Imunohistoqumica -200X).......................................
36
Figura 31 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do
Grupo IV, onde se pode notar que as vilosidades esto
preservadas e a colorao marrom acastanhada em pequena
intensidade e freqncia ocorre em reas discretas no pice.
(Imunohistoqumica -20X).............................................................
38
Figura 32 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do
grupi IV, onde se pode notar a quase total ausncia de clulas
marcadas em marrom acastanhado. (Imunohistoqumica
200X)..............................................................................................
38
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) da espessura
(micrometros) da parede intestinal medidas em cada animal de
cada grupo em vinte campos aleatrios em lminas coradas em
HE 20X........................................................................................
39
Tabela 2 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas
vilosidades intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte
campos aleatrios, em lminas marcadas pela
imunohistoqumica 20X..............................................................
41
Tabela 3 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas
criptas intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte
campos aleatrios, em lminas marcadas pela
imunohistoqumica 20X..............................................................
43
xii
LISTA DE GRFICOS
Grfico 1 - Mdias e erro padro das mdias da espessura (micrometros) da
parede intestinal medidas em cada animal de cada grupo em
vinte campos aleatrios em lminas coradas em HE 20X...........
40
Grfico 2 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas
vilosidades intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte
campos aleatrios, em lminas marcadas pela
imunohistoqumica 20X..............................................................
42
Grfico 3 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas
criptas intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte
campos aleatrios, em lminas marcadas pela
imunohistoqumica 20X..............................................................
44
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS
m = micrmetro
ATA= atmosfera absoluta
cm = centmetro(s)
cm = centmetro (s) cbico (s)
g = grama
H.E.= hematoxicilina eosina
I/R = isquemia e reperfuso
kg = kilograma
kgf = kilograma fra
m = metro
mg = miligrama
min = minuto
mL= mililitro
mm = milmetro
mmHg = milmetro(s) de mercrio
C = grau (s) Celsius
OHB = oxigenao hiperbrica
UNIFESPEPM = Universidade Federal de So Paulo, Escola Paulista de Medicina
xiv
RESUMO Objetivo: Estudar aspectos morfolgicos e imuno-histoqumicos do intestino delgado de ratos
sob isquemia e reperfuso (I/R) e submetidos oxigenao hiperbrica. Mtodos: Trinta e
dois ratos foram distribudos em quatro grupos (n=8) nos quais foi realizada a isquemia de
sessenta minutos e avaliados aps reperfuso de sessenta minutos. Nos animais do grupo I no
foi realizado nenhum procedimento de oxigenao hiperbrica (OHB), no grupo II a OHB foi
realizada no perodo de isquemia, no grupo II a OHB foi realizada no perodo de reperfuso e
no grupo IV foi realizada nos perodos de isquemia e reperfuso. Foi usada uma cmara
especial de acrlico para animais de pequeno porte com 2,0 atmosferas de presso e oxignio a
100% para os procedimentos de OHB. Segmentos de cinco centmetros de leo terminal foram
coletados aps sessenta minutos de reperfuso para estudo histolgico e imuno-histoqumico,
sendo avaliados os graus de leso da mucosa intestinal (ausente, leve, moderada e acentuada),
espessura da camada mucosa e do ndice de apoptose pela caspase 3. Resultados: O grupo I
apresentou leses acentuadas da mucosa, diminuio da espessura da camada mucosa e alto
ndice de apoptose (GI=0,70), caracterizando um modelo de leso de I/R. O grupo II
apresentou graus de leses de mucosa ausentes ou leves e menor ndice de
apoptose(GII=0,16). Os resultados dos grupos I e III so semelhantes com grau de leses
moderadas ou acentuadas e diminuio da espessura da camada mucosa e ndice de apoptose
prximo (GI= 0,70 e GII=0,84). No grupo IV os graus de leses foram semelhantes ao grupo
II, porm, com maior ndice de apoptose (GII=0,16 e GIV=0,42). Concluso: A oxigenao
hiperbrica realizada no perodo de isquemia preveniu as leses de I/R de modo mais eficaz
do que aplicada no perodo de isquemia e reperfuso. Quando aplicada somente no perodo de
reperfuso os resultados foram piores sugerindo que seu efeito protetor esteja vinculado a
preveno da formao dos radicais livres no perodo de isquemia.
xv
ABSTRACT
Objective: To study morphologic and immune-hystochemical aspects of the small intestine of
rats under ischemia and reperfusion (I/R) and submitted to the hyperbaric oxygenation
(HBO). Methods: Thirty two rats were distributed in four groups (n=8) us which the ischemia
of sixty minutes was accomplished and appraised after reperfusion of sixty minutes. In the
animals of the group I any procedure of HBO was not accomplished, in the group II HBO was
accomplished in the ischemia period, in the group II HBO was accomplished in the
reperfusion period and in the group IV it was accomplished in the ischemia periods and
reperfusion. A special acrylic chamber was used with 2.0 pressure atmospheres and oxygen to
100% for the procedures of HBO. Segments of five centimeters of terminal ileum were
collected after sixty minutes of reperfusion for histological study and immune-hystochemical,
being appraised the degrees of lesion of the intestinal mucosa (absent, mild, moderate and
severe), thickness of the mucosa and of the apoptosis index for the caspase 3. Results: The
group I presented accentuated lesions of the mucosa, decrease of the thickness of the mucosa
layer and high apoptosis index (GI=0.70), characterizing a model of lesion of I/R. The group
II presented degrees lesions of mucosa absent or mild and smaller apoptosis (GII=0.16). The
results of the groups I and III are similar with degree of moderate or accentuated lesions and
decrease of the thickness of the mucosa and index of similar apoptosis (GI = 0.70 and
GII=0.84). In the group IV the degrees of lesions were similar to the group II, however, with
larger apoptosis index (GII=0.16 and GIV=0.42). Conclusions: The hyperbaric oxygenation
accomplished in the ischemia period prevented the lesions of I/R in way more effective than
applied in the ischemia period and reperfusion. When only applied in the reperfusion period
the results were worse suggesting that the protecting effect is linked the prevention of the
formation of the free radicals in the ischemia period.
xvi
SUMRIO
1. INTRODUO.................................................................................................. 1
2. OBJETIVOS....................................................................................................... 4
3. MTODOS......................................................................................................... 5
4. RESULTADOS.................................................................................................. 23
5. DISCUSSO...................................................................................................... 45
6. CONCLUSES.................................................................................................. 54
7. REFERNCIAS................................................................................................. 55
8. NORMAS ADOTADAS.................................................................................... 60
APNDICE......................................................................................................... 61
xvii
1. INTRODUO A isquemia um fenmeno caracterizado pela restrio parcial ou total do aporte
sangneo arterial uma determinada rea do organismo. As conseqncias desta restrio
dependem das caractersticas metablicas do tecido atingido, da existncia de circulao
colateral e do tempo de restrio1.
Classicamente as repercusses da isquemia esto associadas a alteraes
morfolgicas e funcionais resultantes da necrose tecidual. Nas ltimas dcadas tm-se,
tambm, estudado os aspectos de morte celular programada. As alteraes provocadas pela
falta de aporte sangneo desencadeiam processos metablicos celulares que induzem a
clula a sua autodestruio sem a caracterstica reao inflamatria, conhecido como
fenmeno de apoptose1-4.
Portanto, a necrose e apoptose celular podem ser utilizados como indicadores das
alteraes de tecidos submetidos isquemia1-4.
O processo isqumico ganhou maior interesse com o avano na rea de
transplantes de tecidos e rgos. A retirada do tecido do doador at a implantao no
receptor passa obrigatoriamente por um perodo de isquemia5. Vrios procedimentos
foram elaborados para diminuir os danos atribuveis a ela. Fundamentalmente procuraram-
se meios de diminuir as necessidades metablicas dos tecidos transplantados pelo uso da
hipotermia ou o uso de solues de preservao com nutrientes e eletrlitos que suprissem
as necessidades do tecido as ser transplantado6.
Contudo, apesar da adequao das solues de preservao, verificou-se que
grande parte das leses subseqentes apresentadas pelos tecidos transplantados estava
ligada ao perodo de reperfuso7. O reparo da circulao arterial leva ao tecido o
comburente necessrio para as reaes de oxidao. O oxignio oferecido aos tecidos
provoca uma produo quantitativamente elevada de espcies reativas de oxignio em
curto espao de tempo. A presena destes radicais livres de oxignio, que so altamente
energticos, causa a perioxidao das membranas celulares, ocasionando a necrose ou
desencadeando uma cascata de reaes bioqumicas que caracterizam o estresse oxidativo
e a apoptose 8-10.
2
Pra contornar essas situaes procurou-se acrescentar s solues de preservao,
ao doador e/ou ao receptor, substncias que tivessem ao antioxidante11. Vrias
substncias associadas diminuio da produo de espcies reativas de oxignio foram e
so testadas como o alfatocoferol, alopurinol, cido ascrbico, N-acetil-cistena,
fitoterpicos, entre outras. Tambm foram e so pesquisadas substncias que retiram as
espcies reativas de oxignio j produzidas conhecidas varredores (scavengers)4-6,11. Outra
proposta tambm em tela o procedimento de pr-condicionamento isqumico, onde
perodos curtos de isquemia so seguidos de perodos correspondentes de reperfuso
fazendo com os tecidos se adaptem a um perodo mais prolongado de isquemia
sustentada5,11.
Considerando estas propostas, surge a possibilidade do emprego da oxigenao
hiperbrica, partindo do princpio que a oferta de oxignio ao tecido isqumico poderia
interferir na subseqente fase da reperfuso. O surgimento das espcies reativas de
oxignio est ligado avidez que o tecido tem para realizar suas reaes de oxidao, e
conseqente produo de energia para o metabolismo celular, logo a seguir ao perodo em
que este elemento esteve escasso ou ausente. A oferta do oxignio nesta etapa poderia
evitar este mecanismo e assim poupar os tecidos do efeito deletrio da ao oxidantes
destes radicais livres12,13.
A oxigenao hiperbrica um procedimento que oferece oxignio puro (100%)
sobre presso, que varia entre 1 a 2,5ATA (atmosfera de presso). Baseada na Lei de
Henri (a diluio de um gs em um lquido diretamente proporcional a sua presso) e na
Lei de Boyle (em uma temperatura constante, o volume e a presso de um gs so
inversamente proporcionais) a oxigenao hiperbrica ir favorecer a difuso nos lquidos
e tecidos a serem transplantados14,15. Deste modo, seria mantida uma taxa metablica
bsica, que diminuiria os processos ligados isquemia14. A oferta de oxignio reproduziria
as condies habituais do tecido e impediria a formao anormal de espcies reativas de
oxignio16.
O Programa de Ps-Graduao em Cirurgia e Experimentao dentro da linha de
pesquisa de Integrao Orgnica de Transplantes desenvolve projetos voltados para o
estudo da aplicao da oxigenao hiperbrica no fenmeno de isquemia e reperfuso17-20,
em especial voltada para o transplante intestinal21,22.
3
Pesquisa anterior demonstrou que a oxigenao hiperbrica capaz de melhorar a
viabilidade das vilosidades intestinais de intestino delgado de ratos submetidos a trinta
minutos de isquemia e estudados aps trinta minutos de reperfuso. Os benefcios da
oxigenao hiperbrica, avaliados pela morfologia das vilosidades, so mais evidentes
quando ela aplicada no perodo de isquemia 21,22.
A literatura biomdica escassa respeito da oxigenao hiperbrica e o fenmeno
de isquemia e reperfuso de intestino. H um nico relato em que intestino delgado de
ratos foi submetido a cento e vinte minutos de isquemia (ocluso da artria mesentrica
superior) e noventa minutos de oxigenao hiperbrica nos perodos de isquemia e
imediatamente aps a reperfuso. O grau menor de leso da mucosa intestinal foi menor
quando a oxigenao hiperbrica foi aplicada no perodo de isquemia do que no perodo
de reperfuso 23, 24.
Existem evidncias experimentais em outros tipos de tecidos e rgos como
sistema nervoso25-27, clon28,29, fgado30, traumas31, choque32, leses actnicas18,33,34,
retalhos cutneos 35-37 em que a oxigenao hiperbrica trouxe efeitos benficos.
Deste modo, dando continuidade linha de pesquisa procurou-se investigar o papel
da oxigenao hiperbrica no modelo animal de isquemia e reperfuso intestinal de ratos,
submetendo-os um perodo de isquemia mais prolongado e aplicando a oxigenao
hiperbrica nos trs perodos do processo, ou seja somente na isquemia, somente na
reperfuso e em ambos, isquemia e reperfuso.
O objetivo foi verificar se h diferenas dos efeitos da oxigenao hiperbrica
dependente do perodo de aplicao e com isto contribuir para um melhor entendimento da
fisiopatologia do fenmeno de isquemia e reperfuso.
2. OBJETIVOS
Geral:
Estudar a integrao orgnica de transplantes intestinais de ratos com o uso de oxigenao
hiperbrica no fenmeno de isquemia e reperfuso.
Especfico:
Estudar a morfologia e a apoptose da mucosa intestinal de ratos submetidos isquemia e
reperfuso sob a ao da oxigenao hiperbrica.
3. MTODOS
Esta pesquisa foi submetida apreciao e aprovao da Comisso de tica em
Pesquisa do Hospital So Paulo - Universidade Federal de So Paulo - Escola Paulista de
Medicina (UNIFESP-EPM) com a referncia CEP n. 1581/03 e ratificada pelo Comit de
Biotica em Pesquisa da Universidade Federal do Mato Grosso do Sul (UFMS) sob o n.
44/2003.
Amostra
Foram utilizados trinta e dois ratos machos (Rattus norvegicus albinus), da
linhagem Wistar, adultos, com peso mdio de 300g, procedentes do Biotrio da UFMS,
identificados por picotes no pavilho auricular direito ou esquerdo. No perodo que
precedeu o experimento os animais foram confinados individualmente em gaiolas plsticas
com tampo metlico na medida padro de 40x30x20cm, alimentados com dieta prpria
para a espcie (Purina) e gua vontade. As condies de aerao e luminosidade foram
naturais, em ambiente exclusivo para roedores e com baixo nvel de rudos externo. Os
cuidados de higienizao e alimentao foram dirios e realizados por tratador nico, sob
superviso de mdico veterinrio.
Figura 1 - Foto do confinamento dos animais.
6
Os procedimentos operatrios e de oxigenao hiperbrica foram realizados em
ambiente apropriado, em centro cirrgico adaptado para operaes em animais de pequeno
porte e em condies de assepsia e anti-sepsia.
Os animais foram distribudos em aleatoriamente em quatro grupos de estudo,
saber (Figura 2):
Grupo I (IR/ sem OHB): formado por 8 animais, submetidos isquemia e
reperfuso sem aplicao de oxigenao hiperbrica.
Grupo II (IR/OHB-I): formado por 8 animais, submetidos isquemia e reperfuso
de intestino delgado, com aplicao de oxigenao hiperbrica durante o perodo da
isquemia.
Grupo III (IR/OHB-R): formado por 8 animais, submetidos isquemia e
reperfuso de intestino delgado, com aplicao de oxigenao hiperbrica durante o
perodo de reperfuso.
Grupo IV (IR/OHB-IR): formado por 8 animais, submetidos isquemia e
reperfuso de intestino delgado, com aplicao de oxigenao hiperbrica nos perodos de
isquemia e de reperfuso.
AMOSTRA N= 32 ratos
Grupo I (n = 8)
I + R s/ OHB
Grupo II (n = 8)
I (OHB) + R
Grupo III (n = 8)
I + R (OHB)
Grupo IV (n = 8)
I (OHB)+ R (OHB)
Figura 2 Esquema de distribuio dos animais nos diversos grupos de estudo.
7
Procedimento anestsico
Os animais foram pesados em balana de preciso, sendo os valores obtidos (em
gramas), anotados no protocolo n 1; a seguir, foram anestesiados por via intramuscular
com soluo de cloridrato de quetamina (80mg.mL-1), acepromazina (1mg.mL-1) e
cloridrato de xilazina (10mg.mL-1), administrada por via intramuscular, na dose de
0,1mL.450g-1. A avaliao da eficcia da anestesia foi verificada pela perda do reflexo
crneo-palpebral e pela ausncia de reao preenso digital do coxim da pata traseira. As
doses ministradas foram suficientes para realizao de todo os procedimentos operatrios
e de oxigenao hiperbrica, sem necessidade de doses de complementao (Figura 3).
Procedimento operatrio
Os animais foram posicionados em decbito dorsal horizontal com as patas
dianteiras e traseiras fixadas com fita adesiva em prancha operatria; foi feita a epilao
da parede abdominal, e a anti-sepsia da pele com polivinilpirrolidona a 10% e iodo ativo a
1% (Povidine). Delimitao de campo operatrio pela colocao de pano fenestrado
esterilizado.
A inciso foi mediana, iniciada no processo xifide, com 50mm de extenso, no
sentido crnio caudal, interessando pele, tela subcutnea, aponeurose muscular e peritnio.
Aps a abertura da cavidade peritoneal, foram afastadas as vsceras abdominais;
identificadas e isoladas a artria e a veia mesentricas superiores, tendo com ponto de
referncia a coluna vertebral e a raiz do mesentrio (Figura 4). Dissecados os vasos, esses
foram ocludos com pina vascular de microcirurgia (tipo bulldog), durante sessenta
minutos, provocando-se a isquemia (Figura 5).
As vsceras foram recolocadas na cavidade abdominal e as bordas da parede
abdominal foram temporariamente aproximadas com quatro pontos simples de fio de
algodo 00, eqidistantes, em plano total, tracionados por pinas hemostticas com a
tenso necessria para coaptar as bordas e impedir o contato da cavidade peritoneal com o
ambiente externo e assim evitar exposio e ressecamento das vsceras (Figura 6).
8
Transcorridos os sessenta minutos os pontos de algodo foram afrouxados,
novamente as vsceras foram mobilizadas, identificada e removida a pina vascular
hemosttica, iniciando o perodo de reperfuso. Os pontos foram tracionados mantendo as
bordas da ferida abdominal aproximadas para o procedimento seguinte de oxigenao
hiperbrica.
Figura 3 Foto do animal anestesiado e aps a tricotomia.
9
Figura 4 - Foto do ato operatrio com pina transpassando e isolando a veia e artria mesentricas
superiores, vistas por transparncia abaixo do peritnio parietal.
Figura 5 Foto mostrando a veia e artria mesentricas dissecadas e sendo ocludas com pina
hemosttica de microcirurgia tipo bul dog. l
10
Figura 6 Foto das alas intestinais isquemiadas (macroscopia) aps a
abertura da cavidade e com a presena da pina hemosttica sem oxigenao hiperbrica).
A cmara de oxigenao hiperbrica.
Foi utilizada uma cmara idealizada e construda para uso em pequenos animais,
desenvolvida em pesquisa anterior22 no Programa de Ps-Graduao em Tcnica
Operatria e Cirurgia Experimental da UNIFESP-EPM (Figuras 7 e 8).
A cmara foi construda em acrlico cristal transparente com resistncia de at 560
quilogramas por centmetro quadrado (kg/cm2) de tenso de ruptura e massa especfica a
20 graus igual a 1,19 (g/cm3). O cristal transparente permitiu a observao dos animais no
seu interior durante o experimento (Figura 9).
11
V
T
B
Figura 7 Foto da cmara hiperbrica em acrlico para animais de pequeno porte.B (base), T (Tampo) V (vlvula).
Figura 8 Foto mostrando o manmetro e a presso usada durante o experimento.
12
V
C
A
Figura 9 Foto do animal no interior da cmara durante o procedimento de oxigenao hiperbrica. A (animal), C (cal sodada), V (vlvula).
A construo em forma cilndrica com um fundo fixo e uma tampa do mesmo
material tem um dimetro de quarenta centmetros permitiu a presena de trs a quatro
animais em cada sesso de oxigenao hiperbrica.
No interior do cilindro, foi colocado um recipiente plstico multiperfurado com cal
sodada para reteno do gs carbnico exalado pelos animais (Figura 9).
Na tampa superior foi fixada uma conexo reta de de dimetro para sada de um
tubo de polietileno do mesmo calibre e conectado a um filtro regulador de presso com
capacidade de 0 a 10 quilogramas fora por centmetro quadrado (kgf/cm2). O filtro foi
conectado a um medidor de vazo pertencente a um tubo de oxignio, cilindro do tipo T,
com um volume de 10 metros cbicos (m3) e com regulador de presso em 315 kgf/cm2.
O aparato permitiu obter a presso estabelecida para o experimento de 2,0 ATA
(duas atmosferas de presso) e oxigenao constante de 100%.
13
Procedimento de oxigenao hiperbrica
Com a cmara devidamente preparada, logo aps o procedimento operatrio de
isquemia (Grupo II), reperfuso (Grupo III) ou isquemia e reperfuso (Grupo IV) os
animais foram colocados em seu interior, a tampa foi hermeticamente fechada e iniciada o
compresso com oxignio 100%.
Grupo I: os animais no foram submetidos oxigenao hiperbrica. Aps a
ocluso da artria e veia mesentricas superiores durante sessenta minutos, foram
afrouxados os pontos, aberta a parede abdominal, retirada a pina hemosttica (bulldog) e
iniciou-se a contagem de sessenta minutos do perodo de reperfuso.
Grupo II: imediatamente aps a aplicao da pina vascular, ocluindo os vasos
mesentricos superiores, os animais foram colocados na cmara hiperbrica, por um
perodo de sessenta minutos. Retirados da cmara, os pontos da parede abdominal foram
afastados, removida a pina vascular, aproximadas as bordas da ferida e iniciada a
contagem dos sessenta minutos do perodo de reperfuso.
Grupo III: aps a aplicao da pina vascular, ocluindo os vasos mesentricos
superiores, os animais foram mantidos fora da cmara hiperbrica por perodo de sessenta
minutos. Os pontos aplicados parede abdominal foram afastados, removida a pina
vascular, aproximadas as bordas da ferida e ento os animais foram colocados na cmara
hiperbrica e iniciada a contagem dos sessenta minutos do perodo de reperfuso.
Grupo IV: imediatamente aps a aplicao da pina vascular, ocluindo os vasos
mesentricos superiores, os animais foram colocados na cmara hiperbrica, por um
perodo de sessenta minutos. Retirados os animais da cmara hiperbrica, os pontos da
parede abdominal foram afastados, removida a pina vascular, aproximadas as bordas da
ferida, recolocados os animais na cmara e iniciada a contagem dos sessenta minutos do
perodo de reperfuso.
Procedimento de coleta de material
Nos animais de todos os grupos, aps os perodos de sessenta minutos de isquemia
e sessenta minutos de reperfuso, os pontos da parede abdominal foram removidos.
Identificou-se a juno do leo com o intestino grosso onde 40mm, medidos pela borda
14
contra-mesenterial, montante foram coletados fragmentos de intestino delgado com 5mm
de extenso (Figura 10).
Os fragmentos foram imersos em frasco hermtico contendo soluo de
formaldedo a 10%. O volume do fixador foi dez vezes superior ao do tecido fixado.
Figura 10 Foto mostrando o segmento de leo terminal seccionado 40 mm da juno leo-cecal com
50 mm de extenso, pronto para ser imerso na soluo de fixao de formalina tamponada 10%.
15
Procedimento de eutansia
Concluda a coleta dos fragmentos de intestino delgado, procedeu-se eutansia dos
animais ainda anestesiados, com aplicao endovenosa de 2mL de cloreto de potssio a
19,1% na veia cava inferior e verificado o bito pela parada cardiorespiratria (Figura 11).
Figura 11 - Foto do procedimento de eutansia com aplicao de
soluo cloreto de potssio na veia cava inferior.
16
Processamento histolgico
Aps vinte e quatro a quarenta e oito horas de fixao em formaldedo as peas
foram submetidas trocas sucessivas com lcool a 70oGL, progressivamente at 100oGL.
O processamento dos tecidos foi feito por duas imerses em lcool 70% por uma hora
cada, uma imerso em lcool 80% por uma hora, uma imerso em lcool 95% por uma
hora, trs imerses em lcool absoluto por uma hora cada, trs imerses em ter de
petrleo sendo a primeira por uma hora e as outras duas por duas horas cada, e trs
imerses em parafina, as primeiras duas por duas horas e a terceira por meia a uma hora
em vcuo.
Figura 12 Fotomicrografia caracterstica de uma lmina de intestino delgado prepara pelo mtodo
imunohistoqumica para expresso da caspase 3, mostrado pela colorao acastanhada das clulas em apoptose.
17
Figura 13 Fotomicrografia caracterstica de uma lmina corada em HE com a destruio das
vilosidades intestinais classificada como grau 2 de leso celular.
A seguir, os fragmentos foram submetidos tcnica de incluso em parafina e
realizados cortes de 7m de espessura em micrtomo rotativo. Os cortes histolgicos de
todos os animais foram corados pela hematoxilina-eosina (H.E.) e analisados em
microscpio de luz.
As imagens foram capturadas atravs de cmara de captura de imagem de alta
resoluo, software AXIOcam MRC da ZEISS e a leitura realizada em microscpio ptico
CARL ZEISS Axilab. O programa utilizado foi a Axiovision Rel 4.2 da ZEISS (Figuras
14 e 15).
Processamento de imunohistoqumica
Foi realizado processamento imuno-histoqumico para marcao da caspase e
mensurao da apoptose celular nas vilosidades intestinais, utilizando o complexo avidina-
biotina- peroxidase (ABC.).
Os tecidos foram cortados com 3 micra (m) de espessura e montados em lminas
de vidro previamente preparadas com o adesivo poli- D-lisina (Sigma Chemical
18
Corporation, P- 7886, Saint Louis MO. EUA). Os cortes foram desparafinizados em xilol
por 5 minutos (3 banhos), hidratados em lcool etlico absoluto (4 banhos) e lavados com
soluo salina tamponada (SST) em pH 7,4 por 5 minutos; posteriormente os cortes foram
tratados com perxido de hidrognio (HO) a 3% diludo em SST por 5 minutos para
bloqueio de peroxidase endgena. Utilizou-se o mtodo de recuperao de eptopos pelo
calor (SST de citrato com pH 6,4 por 15 minutos em forno de microondas) para a pesquisa
de caspase 3.
Em seguida, os tecidos foram incubados com anticorpo primrio anti- caspase 3 em
mdia por 16 horas, incluindo o perodo noturno. No dia seguinte, aps lavagem em SST,
os cortes foram incubados com anticorpo secundrio biotinilado na diluio de 1: 300
(Vector Corporation, Burlingame, Califrnia, EUA). A seguir realizou-se incubao por
45 minutos com complexo ABC na proporo de 1 gota do reagente A (avidina) e uma do
reagente B(biotina ligada peroxidase) na diluio de 5 ml de soluo do TRIS.
Para visualizao da reao, os cortes foram tratados com soluo de DAB (3-3) -
tetrahidrocloreto de diaminobenzidina na concentrao de 1 mg/ml de soluo tampo de
TRIS e soluo de perxido de hidrognio (HO) por 5 minutos. Os cortes foram contra-
corados com hematoxilina de Harris por 20 segundos ou verde de metila por 5 minutos
com posterior desidratao em banhos de lcool etlico absoluto (5 banhos) e xilol (3
banhos).
Todos os passos da reao imunohistoqumica foram realizados temperatura
ambiente, com exceo da incubao no forno de microondas. Entre cada passo da reao
as laminas foram lavadas varias vezes com SST (pH = 7,4).
A expresso imunhistoqumica da caspase foi identificada e quantificada por
programa de computador (o programa AXIOVISION Rel 4.2 da ZEISS) partir de tecido
com cor marron acastanhado (Figura 12)
Critrios de avaliao histolgica pela colorao em HE
As lminas coradas em HE foram avaliadas qualitativamente pela descrio do
histologista, sem conhecimento dos grupos a que pertenciam as lminas.
A descrio qualitativa procurou avaliar a viabilidade da mucosa intestinal pelo
grau de leso celular segundo os seguintes critrios:
19
a) grau 0: ausncia de restos celulares no lmen intestinal, vilosidades integras,
pice de vilosidades sem sinais de necrose;
b) grau I: ausncia de restos celulares no lmen intestinal, vilosidades ligeiramente
alteradas na sua disposio com descolamento em relao a sua lmina prpria e/ou sinais
de necrose celular em clulas apicais;
c) grau II: presena de restos celulares no lmen intestinal, vilosidades
desestruturadas e necrose de clulas epiteliais alm de sua parte mdia ou prxima s
criptas intestinais (Figura 13).
Obedeceu-se tambm um critrio quantitativo de medio da espessura da parede
intestinal, desde a sua camada mais externa (serosa) at o alto da vilosidade mais
proeminente dentro do lmen intestinal ou das criptas (Figura 16). Foram escolhidos vinte
campos aleatoriamente para a leitura e medidas de espessura. As medidas, expressas em
micrometros, foram processadas por programa de computador Axiovision Rel 42.-Zeiss e
apresentadas pelas suas mdias e desvio-padro.
20
Figura 14 Mostrando o equipamento usado para a leitura, microscpio Carl Zeiss Axilab, sistema de
captura Axiocom MRC e processamento com o programa de computador Axiovision Rel 42.-(Zeiss).
Figura 15 - Mostrando detalhes do programa de computador usado Axiocam MRC da Zeiss.
21
Figura 16 - Fotomicrografia caracterstica de uma lmina corada pela HE, mostrando as reas consideradas
para a medio da parede intestinal e demarcadas para identificao e contagem pelo programa de computador (Axiovision Rel 4.2 da ZEISS).
Critrios de avaliao imunohistoqumica
O programa de computador Axiovision Rel 42.-Zeiss permitiu a marcao das
clulas coradas em marron acastanhado (expresso imunohistoqumica da caspase 3), sua
contagem em vinte campos aleatrios, clculo de sua porcentagem em relao s clulas
no coradas em marron-castanho (clulas sem expresso imunohistoqumica da caspase 3)
e apresentao dessas medidas em mdia e desvio-padro. O ndice da apoptose foi
calculado considerando a porcentagem de clulas apoptticas marcadas em cada 1000
clulas contadas.
22
Anlise estatstica
De acordo com a natureza das variveis foi utilizado o teste de anlise por
varincia (ANOVA) e o teste de Tukey Kramer para comparaes mltiplas de variveis.
Estabeleceu-se um p< 0,05 (5%) para rejeio da hiptese de nulidade e os valores
significantes foram assinalados com um asterisco.
4. RESULTADOS Descrio qualitativa microscpica (colorao em HE)
As lminas de cada um dos oito animais de cada grupo, coradas pela hematoxilina-
eosina, foram lidas e submetidas descrio qualitativa submetidas aos critrios de graus
de leso.
Animais do Grupo I Isquemia e reperfuso sem oxigenao hiperbrica.
A avaliao realizada pela leitura em pequeno aumento (20x) e grande aumento
(200x), em vrios campos escolhidos aleatoriamente mostrou ampla prevalncia de leses
celulares grau II. Foi freqente o encontro da presena de restos celulares no lmen
intestinal, vilosidades desestruturadas e necrose de clulas epiteliais alm de sua parte
mdia ou prxima s criptas intestinais, sendo raras as que apresentaram aspecto
aparentemente normal (Figura 17). As criptas intestinais embora conservadas em sua
maioria, em alguns focos j apresentavam sinais de desestruturao e necrose celular
esparsa (Figura 18) A camada seromuscular est preservada sem edema ou focos de
hemorragia.
24
Figura 17 Fotomicrografia de uma lmina de um animal do grupo I, onde pode-se notar a desestruturao das vilosidades, restos celulares desprendidos no lmen intestinal e achatamento global da mucosa .As criptas esto relativamente conservadas. A camada sero-muscular est preservada. (HE 20X )
Figura 18 Fotomicrografia de uma lmina de um animal do grupo I, onde pode-se notar que as criptas esto relativamente conservadas. Porm com focos de extravasamento hemorrgico na lmina prpria e entre as criptas (setas) (HE 200X).
25
Animais do grupo II Oxigenao hiperbrica somente no perodo de isquemia.
.
A avaliao realizada pela leitura em pequeno aumento (20x) e grande aumento
(200x), em vrios campos escolhidos aleatoriamente mostrou ocorrncia de leses
celulares grau I. entremeadas com prevalncia de ausncia de leses (grau 0). Foi patente a
ausncia de restos celulares no lmen intestinal, algumas vilosidades estavam ligeiramente
alteradas na sua disposio com descolamento em relao a sua lmina prpria e/ou com
sinais de necrose celular em clulas apicais, porm a grande maioria das vilosidades no
apresentou sinais de leso celulares (Figuras 19 e 20).
26
Figura 19 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo II, mostrando a
integridade das vilosidades e criptas, embora em alguns setores possam perceber-se discretas alteraes apicais na estruturao da vilosidade (HE 20X).
Figura 20 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo II, mostrando a integridade da vilosidade, com edema discreto (seta fina), sem alteraes estruturais relevantes, porm com discretos focos de extravasamento hemorrgico (seta espessa). (HE 200X).
27
Animais do grupo III Oxigenao hiperbrica somente no perodo de reperfuso.
A avaliao realizada pela leitura em pequeno aumento (20x) e grande aumento
(200x), em vrios campos escolhidos aleatoriamente mostrou ampla prevalncia de leses
celulares grau II. Foi freqente o encontro da presena de restos celulares no lmen
intestinal, vilosidades desestruturadas e necrose de clulas epiteliais alm de sua parte
mdia ou prxima s criptas intestinais, no tendo sido encontradas vilosidades normais
(Figura 21). As criptas intestinais em sua maioria esto alteradas, com focos j freqentes
de desestruturao, necrose celular e extravamento hemorrgico (Figura 22) A camada
seromuscular est preservada sem edema ou focos de hemorragia.
28
Figura 21 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo III, onde se pode notar
a desestruturao das vilosidades, restos celulares desprendidos no lmen intestinal, achatamento global da mucosa e focos esparsos de extravasamento hemorrgico. As criptas esto desestruturadas com sinais de edema e descolamento da lmina prpria. A camada sero-muscular est preservada. (HE 20X).
Figura 22 Fotomicrografia de uma lmina de um animal do grupo III, onde pode-se notar a ausncia
de vilosidades, as criptas esto destrudas, com focos de extravasamento hemorrgico na lmina prpria e entre as criptas (setas) (HE 200X).
29
Animais do Grupo IV Oxigenao hiperbrica nos perodos de isquemia e de
reperfuso
A avaliao realizada pela leitura em pequeno aumento (20x) e grande aumento
(200x), em vrios campos escolhidos aleatoriamente mostrou ocorrncia de poucas leses
celulares grau I, com ampla prevalncia de ausncia de leses (grau 0). Foi patente a
ausncia de restos celulares no lmen intestinal, poucas vilosidades ligeiramente alteradas
na sua disposio com descolamento em relao a sua lmina prpria e/ou sinais de
necrose celular em clulas apicais e a grande maioria das vilosidades no apresentava
sinais de leso celulares (Figuras 23 e 24).
30
Figura 23 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo IV, mostrando a integridade das vilosidades e criptas, embora em raros setores possam perceber-se discretas alteraes apicais na estruturao da vilosidade (HE 20X).
Figura 24 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo IV, mostrando a integridade da vilosidade, sem edema ou alteraes estruturais relevantes. (HE 200X).
31
Descrio qualitativa microscpica ( imunohistoqumica caspase 3)
Animais do Grupo I Isquemia e reperfuso sem oxigenao hiperbrica.
presentavam tambm, embora
em bem menor freqncia clulas em apoptose (Figura 26).
A avaliao realizada pela leitura em pequeno aumento (20x) e grande aumento
(200x), em vrios campos escolhidos aleatoriamente mostrou ampla prevalncia de leses
celulares grau II. Foi freqente o encontro da presena de clulas marcadas em marrom
acastanhado, ou seja a expresso da marcao da caspase 3, na vilosidade intestinal sendo
em maior intensidade da sua parte mdia para o pice (Figura 25). As criptas intestinais
embora conservadas em sua maioria, em alguns focos j a
32
Figura 25 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo I, onde se pode notar as vilosidades marcadas mais intensamente em marrom nas suas pores mdias e apicais, sendo que a parte basal a colorao ocorra em menor freqncia.(Imunohistoqumica 20X)
Figura 26 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do Grupo I, onde se pode notar uma freqncia menor de clulas marcadas em marrom acastanhado nas reas das criptas intestinais. (Imunohistoqumica - 200X).
33
Animais do grupo II Oxigenao hiperbrica somente no perodo de isquemia.
A avaliao realizada pela leitura em pequeno aumento (20x) e grande aumento
(200x), em vrios campos escolhidos aleatoriamente mostrou ocorrncia de leses
celulares grau I. entremeadas com prevalncia de ausncia de leses (grau 0). A grande
maioria das vilosidades no apresentou sinais de leso celulares e a colorao marrom
acastanhada da marcao imunohistoqumica da caspase 3 se fez notar com maior
freqncia e intensidade nas bordas apicais das vilosidades (Figura 27). As criptas
intestinais estavam conservadas e a colorao marrom foi bem menos intensa e freqente
que nas vilosidades (Figura 28).
34
Figura 27 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do Grupo II, onde se nota que as vilosidades esto bem conservadas e a colorao marrom acastanhada se faz presente em maior freqncia e intensidade nas bordas apicais. (Imunohistoqumica 20X).
Figura 28 - Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo II, onde se pode notar nas criptas intestinais uma marcao celular em marrom acastanhado de menor intensidade e freqncia do nas correspondentes vilosidades do mesmo grupo. (Imunohistoqumica 200X).
35
Animais do grupo III Oxigenao hiperbrica somente no perodo de reperfuso.
A avaliao realizada pela leitura em pequeno aumento (20x) e grande aumento
(200x), em vrios campos escolhidos aleatoriamente mostrou ampla prevalncia de leses
celulares grau II. Foi freqente o encontro da presena de restos celulares no lmen
intestinal, vilosidades desestruturadas e necrose de clulas epiteliais alm de sua parte
mdia ou prxima s criptas intestinais, no tendo sido encontradas vilosidades normais
(Figura 29). As criptas intestinais em sua maioria esto alteradas, com focos j freqentes
de desestruturao, necrose celular e extravamento hemorrgico (Figura 30) A camada
seromuscular est preservada sem edema ou focos de hemorragia.
36
Figura 29 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupo III, onde se pode notar
intensa desestruturao das vilosidades intestinais e colorao marrom acastanhada das vilosidades remanescentes at junto s criptas intestinais. (Imunohistoqumica- 20X).
Figura 30 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do Grupo III, onde se pode notar as criptas alteradas e freqncia e intensidade da colorao marrom acastanhada semelhante a das vilosidades. (Imunohistoqumica -200X).
37
Animais do Grupo IV Oxigenao hiperbrica nos perodos de isquemia e de
reperfuso
A avaliao realizada pela leitura em pequeno aumento (20x) e grande aumento
(200x), em vrios campos escolhidos aleatoriamente mostrou ocorrncia de poucas leses
celulares grau I, com ampla prevalncia de ausncia de leses (grau 0). A colorao
marrom acastanhada ocorreu em pequena intensidade e menor freqncia nas regies
apicais das vilosidades poupando as partes mdias e basais (Figura 31). As criptas no
apresentam sinais de colorao acastanhada (Figura 32).
38
Figura 31 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do Grupo IV, onde se pode notar que as vilosidades esto preservadas e a colorao marrom acastanhada em pequena intensidade e freqncia ocorre em reas discretas no pice. (Imunohistoqumica -20X).
Figura 32 Fotomicrografia de uma lmina caracterstica de um animal do grupi IV, onde se pode notar
a quase total ausncia de clulas marcadas em marrom acastanhado. (Imunohistoqumica 200X).
39
Medidas de espessura da parede intestinal
As diversas medidas da espessura das paredes intestinais medidas nas lminas
individuais de cada animal em cada grupo, contadas pelo programa de computador em
vinte campos aleatrios so apresentadas como uma tabela das mdias e erro padro da
mdia (Tabela 1 e Grfico1).
Tabela 1 Mdia e erro padro da mdia (EPM) da espessura (micrometros) da parede intestinal medidas em cada animal de cada grupo em vinte campos aleatrios em lminas coradas em HE 20X.
Animais
Grupos
GI
GII
GIII
GIV
Mdia
172,79
327,50
142,50
266,49
EPM
5,95
30,23
6,05
20,01
Teste ANOVA (p < 0,001)
GI = GIII
GII = GIV
GII = GIV > GI = GIII
40
0
50
100
150
200
250
300
350
GRUPO IGRUPO IIGRUPO IIIGRUPO IV
Grfico 1 - Mdias e erro padro das mdias da espessura (micrometros) da parede intestinal medidas em cada animal de cada grupo em vinte campos aleatrios em lminas coradas em HE 20X.
Medidas dos ndices de apoptose
41
As medidas dos ndices de apoptose, calculados para as clulas marcadas em
marrom acastanhado nas vilosidades e criptas e contados pelo programa de computador,
so apresentados com mdias e erro padro das mdias nas tabelas 2 e 3 e nos grficos 2 e
3.
Tabela 2 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas vilosidades intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte campos aleatrios, em lminas marcadas pela imunohistoqumica 20X.
Animal
Grupos
GI
GII
GIII
GIV
Mdia
0,70
0,16
0,84
0,42
EPM
0,08
0,01
0,03
0,05
Teste ANOVA (p < 0,001)
Teste de Tuke - Kramer para comparaes mltiplas ( F calculado =20,980)
GII < GIV < GI = GIII
42
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
Grupo IGrupo IIGrupo IIIGrupo IV
Grfico 2 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas vilosidades intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte campos aleatrios, em lminas marcadas pela imunohistoqumica 20X.
43
Tabela 3 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas criptas intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte campos aleatrios, em lminas marcadas pela imunohistoqumica 20X.
Animal
Grupos
GI
GII
GIII
GIV
Mdia
0,44
0,43
0,41
0,46
EPM
0,11
0,05
0,07
0,06
Teste ANOVA (p < 0,001)
Teste de Tuke - Kramer para comparaes mltiplas ( F calculado = 0,066)
GI = GII = GIII = GIV
44
0,38
0,39
0,4
0,41
0,42
0,43
0,44
0,45
0,46
Grupo IGrupo IIGrupo IIIGrupo IV
Grfico 3 - Mdia e erro padro da mdia (EPM) do ndice apopttico nas criptas intestinais de cada animal, de cada grupo, em vinte campos aleatrios, em lminas marcadas pela imunohistoqumica 20X.
5. DISCUSSO O fenmeno de 0isquemia e reperfuso pode ocorrer em processos patolgicos
envolvendo vsceras abdominais, em especial o intestino delgado. Tem interesse particular
o fenmeno quando associado aos procedimentos de transplante intestinal. A retirada do
rgo do doador, sua preservao at o implante no receptor e a subseqente reperfuso
objeto de estudo na literatura pertinente, pois so diversos os pontos ainda no
adequadamente esclarecidos1-4.
A linha de pesquisa em Integrao Orgnica de Tecidos e rgos, do Programa de
Ps-Graduao em Cirurgia e Experimentao, dedica sua ateno para os problemas
envolvidos no transplante intestinal e entre as propostas para melhorar os resultados desses
transplantes investiga o papel da oxigenao hiperbrica17-22.
Para consecuo do modelo animal de doena foi escolhido o rato, uma vez que
outros trabalhos na literatura o utilizam, o que pde facilitar a confrontao dos
resultados23,38-40. Por outro lado o rato um dos animais mais frequentemente usados em
modelos experimentais, tendo em vista sua fcil obteno e manipulao, com custos
baixos41. A facilidade de manuteno em ambiente controlado facilitou a elaborao de
uma amostra homognea de ratos machos, com idade e peso similares.
Os procedimentos seguiram as diretrizes do Comit Brasileiro de Experimentao
Animal (COBEA) e devidamente avaliado pelos Comits de tica das instituies
envolvidas na pesquisa.
Os procedimentos anestsicos usados foram os que so padronizados pelo
Programa de Ps-graduao em seus experimentos envolvendo ratos. O uso da associao
de quetamina, acepromazina e xilazina foi suficiente para manter os animais em plano
anestsico durante todos os procedimentos operatrios e de oxigenao hiperbrica. A
administrao intramuscular por sua vez evitou eventuais intercorrncias dos anestsicos
com a aplicao intraperitoneal (leso de alas ou interao com os procedimentos
operatrios). A aplicao de anestsicos inalatrios seria incompatvel com a necessidade
de manter os animais sob a oxigenao hiperbrica23,40-43.
Existem vrios modelos na literatura biomdica de provocao do fenmeno de
isquemia e de reperfuso44. A isquemia pode ser total45-50 ou parcial51-65 e pode-se ocluir o
componente arterial isoladamente47-67 ou em associao com o componente
46
venoso23,43,55,57. A interrupo do fluxo arterial ou artrio-venoso pode ser mantida durante
todo o experimento40,61.66 ou podem-se estabelecer perodos variveis de isquemia e
perodos variveis de estudo aps a reperfuso50-65.
A associao de ocluso da artria e da veia concomitantemente um modelo que
est mais prximo da realidade de um transplante. O intestino removido do doador ter
ambos os componentes vasculares ligados e retirados. Trabalhos experimentais mostraram
que a dupla ocluso leva o comprometimento significativo da mucosa intestinal, j aos
trinta minutos de isquemia21,22,43,50,63. Ampliou-se o perodo para sessenta minutos para
surpreender leses mais significativas e para corresponder a um tempo maior que ocorre
nos procedimentos de transplante ou nas leses oclusivas arteriais do mesentrio47.
O modelo proposto mostrou que nos animais do grupo I, em que aps a isquemia e
a reperfuso no foram submetidos oxigenao hiperbrica, ocorreram leses
importantes da mucosa intestinal. As figuras 17 e 180 mostram o grau de destruio
celular caracterizado como grau I, onde houve destruio celular com desestruturao das
vilosidades intestinais, presena de restos celulares no interior do lmen intestinal. Focos
de necrose puderam ser identificados em alguns campos. As criptas, embora com
celularidade conservada, apresentaram descolamento da lmina prpria e focos
hemorrgicos. A marcao pela caspase 3 mostrou que as clulas das criptas embora
conservadas morfologicamente apresentaram-se em boa parte marcadas pelo corante
marrom acastanhado (Figuras 25 e 26). Ocorreu uma significativa diminuio da espessura
da camada mucosa (Tabela 1). Os achados demonstraram um padro de destruio celular
mensurvel e mais intenso que o encontrado em outro experimento da linha de pesquisa
em que a isquemia de trinta minutos e reperfuso de trinta minutos mostraram leses
qualitativamente similares, porm em menor intensidade21,22. O modelo atendeu ao
proposto: produo de leso de mucosa mensurvel e de intensidade moderada grave,
semelhante a outros modelos43,49,55,65. No se identificou alteraes morfolgicas
importantes nas camadas serosa e muscular.
Uma vez que o modelo produziu as leses padronizadas foi possvel avaliar o papel
da aplicao da oxigenao hiperbrica na evoluo destas leses.
As leses necrticas e apoptticas que se manifestaram na avaliao do grupo I
podem ser atribudas ao mecanismo conhecido e bastante estudado da isquemia e
reperfuso.
47
O oxignio o comburente da reao de combusto essencial para a produo de
energia no organismo humano, armazenado em ltima instncia nos complexos de
adenosina trifosfato (ATP). Estas reaes de combusto partir de substratos oxidveis ou
combustveis, em especial a glicose, so levadas cabo em sua maior parte nas
mitocndrias e dependem de uma interelao de substratos, enzimas, vitaminas e
eletrlitos, evidentemente reaes ocorrendo no meio interno aquoso1-4.
Uma enzima, a xantina desidrogenase, uma das responsveis pelo mecanismo de
fornecimento de um eltron altamente energtico para a nicotinamida adenina difostato
(ADP) que sendo receptora deste eltron se transforma no ATP, armazenando a energia
resultante da combusto de modo estvel e transportvel dentro da prpria clula ou para
outros tecidos e rgos. A supresso do oxignio determina a converso da XD em xantina
oxigenase (XO)10. Esta enzima utiliza o oxignio como receptor de eltrons, numa ligao
instvel e altamente energtica formando os conhecidos radicais livres de oxignio (RLO)
ou espcies reativas de oxignio (EROs) como o superxidos (OH-) e perxido de
hidrognio (H2O2)10,51,67. Os radicais livres de oxignio determinam a destruio das
camadas lipoproticas das membranas celulares do ncleo, mitocndrias e do citossol
levando a morte celular imediata por necrose ou desencadeando processos bioqumicos
que, aps um determinado tempo, levar morte celular por apoptose1-4.
As pesquisas tm buscado formas de evitar ou atenuar os efeitos destas espcies
reativas de oxignio ou radicais livres5-7. Tm-se utilizado substncias inibidoras da
formao dos radicais livres conhecidas como antioxidantes, substncias varredoras destas
substncias (scavengers), processos de pr-condicionamento fsico ou qumico, onde
supresses parciais e progressivas de oxigenao antecedem uma supresso sustentada
mais prolongada2-7. Cada proposio tem mostrado vantagens e desvantagens na
dependncia dos modelos utilizados de isquemia/reperfuso, nas doses das substncias
utilizadas, nos perodos em que so empregadas, nos parmetros que so usados para
avaliao dos resultados, entre outras variveis intervenientes1-7.
Entre as mltiplas propostas em estudo, a oxigenao hiperbrica tem um suporte
terico que a torna objeto de pesquisa nas situaes de isquemia/reperfuso. Considerando
que o fator desencadeante de todo o processo a privao do oxignio, o oferecimento
deste elemento aos tecidos, no momento em que a perfuso sangunea estiver ausente ou
48
prejudicada, poder suprimir ou diminuir o desencadeamento da cascata de eventos
bioqumicos que levaro formao dos radicais livres.
Na OHB, a respirao de oxignio a 100% sob condies hiperbricas pode
aumentar em muitas vezes a presso parcial do oxignio no plasma e lquidos corporais14-
16,67,68. Se a respirao de oxignio a 100% ocorrer em meio de presso igual a 2 ATA
(atmosferas de presso), a presso parcial do oxignio aumentada de 150mmHg para
2.280mmHg com um contedo de oxignio dissolvido no plasma de 0,32mL/100cm3 de
sangue para 6,8mL/100cm3 de sangue69. Este oxignio dissolvido pode, por difuso,
alcanar o tecido privado de circulao7-9,14-16.
Baseado neste suporte terico e tambm no suporte emprico da utilizao da
oxigenao hiperbrica em outros trabalhos experimentais, fundamenta-se a linha de
pesquisa e em particular este projeto de pesquisa.
Por outro lado as leses advindas deste processo de isquemia/reperfuso e o
eventual efeito da oxigenao hiperbrica podem ser avaliados morfologicamente pela
extenso da necrose resultante, bem como pela avaliao do processo apopttico.
A avaliao da necrose se fez pela descrio qualitativa dos achados histolgicos
identificveis na colorao pela hematoxilina e eosina. Estabeleceu-se um escore de
acordo com o grau das leses, classificando-as em leses leves ou ausentes (grau 0)
moderadas (grau I) e graves (Grau II). A literatura apresenta classificaes mais
detalhadas e diferentes critrios de graduao para avaliar a leso das clulas epiteliais de
revestimento das vilosidades intestinais43,49,50,55,65,66. Como aqui se associou a medio do
processo apopttico, que tido como indicador mais fidedigno do fenmeno estudado,
optou-se por uma avaliao morfolgica qualitativa mais singela e complementada com
estudo quantitativo de medio das camadas da parede intestinal.
Os resultados mostraram que nos animais em que a oxigenao hiperbrica foi
aplicada somente no perodo de isquemia (Grupo II) apresentaram um escore de leso
celular grau 0 (Figuras 19 e 20), uma espessura de camada mucosa mais espessa,
traduzindo uma maior preservao das vilosidades (Tabela 1). Estes resultados foram
significantes quando comparados com os dos animais do Grupo I tido como controle.
Portanto de se presumir que o oxignio 100% fornecido sob duas atmosferas de
presso foi capaz de manter os processos bioqumicos celulares prximos normalidade
49
evitando que as clulas do revestimento epitelial das vilosidades entrassem em processo
necrtico.
A aplicao da oxigenao hiperbrica no perodo de reperfuso (Grupo III) por
sua vez no foi capaz de proteger a mucosa com a mesma intensidade mostrando um
escore de leso celular grau II (Figuras 21 e 22), uma espessura de camada mucosa
prxima ao do grupo I (Tabela 1) onde no foi aplicada a oxigenao hiperbrica.
Portanto, no perodo de reperfuso licito imaginar que os processos envolvidos no
mecanismo de necrose celular j teriam ocorrido no perodo anterior de isquemia e que a
oferta de oxignio no perodo subseqente foi incapaz de impedir a cadeia de eventos
biolgicos.
Os animais do grupo IV que receberam a oxigenao hiperbrica tanto no perodo
de isquemia quanto de reperfuso apresentaram resultados similares aos animais do grupo
II. As leses celulares foram leves ou ausentes, porm com espessura de camada mucosa
inferior mostrando um grau maior de comprometimento. Os resultados mostram que h
certa similaridade deste grupo IV com os do grupo II, embora haja uma diferena na
medida da espessura da mucosa em nmeros absolutos, mas considerando o desvio-padro
os dados se sobrepem. Uma limitao do experimento , pois o tamanho da amostra. de
se esperar que uma amostra maior possa expressar esta diferena com maior clareza.
Em sntese, a avaliao histolgica dos grupos, mostrou que a oxigenao
hiperbrica aplicada no perodo de isquemia tem um papel preponderante na preservao
do revestimento celular e na integridade das vilosidades intestinais. No entanto a sua
aplicao exclusiva no perodo de reperfuso no surtiu um efeito protetor comparvel aos
dos grupos II e IV. Aventou-se, pois a hiptese que o oxignio hiperbrico oferecido
quando oferecido na ausncia da circulao pode se difundir nos lquidos corporais e, de
algum modo, impedir ou minimizar as leses celulares necrticas. A aplicao do oxignio
hiperbrico nos dois perodos, isquemia e reperfuso, no entanto mostraram resultados
inferiores aos do grupo II e muito superiores aos grupos I e III. Pode-se inferir que o efeito
protetor do oxignio na fase de isquemia foi de algum modo prejudicado pela presena do
mesmo no perodo de reperfuso, mostrando certa independncia dos fenmenos
biolgicos nas duas etapas. Poderia o oxignio ofertado na fase de reperfuso estar
favorecendo a formao de radicais livres e assim favorecendo a leso celular.
50
A apoptose, por sua vez um processo bioqumico complexo que pode ser
desencadeado por estmulos externos ou internos e que tem uma evoluo reversvel ou
irreversvel na dependncia de mltiplos fatores. Ela est envolvida em quase todos os
processos de atividade celular e nos mais diversos tecidos e rgos. Seu comportamento
bioqumico est na dependncia da capacidade que tem a clula, e por conseqncia o
tecido ou mesmo o rgo, de reverter o estmulo desencadeante.
A presena de radicais livres um dos fatores que podem desencadear a cascata de
eventos qumicos que vo desembocar na apoptose celular identificada pelas seguintes
caractersticas morfolgicas: retrao celular, condensao da cromatina sob a membrana
nuclear, formao de bolhas citoplasmticas e corpsculos apoptticos e fagocitose das
clulas ou corpsculos apoptticos.
A apoptose o ponto final de uma cascata, dependente de energia, de eventos
moleculares, desencadeadas por certos estmulos e consiste em quatro componentes
distinguveis mas superpostos: vias sinalizadoras (que desencadeiam a apoptose), controle
e integrao (molculas reguladoras que inibem, estimulam ou antecipam a apoptose e,
assim, determinam o prognstico), fase de execuo comum (onde esto envolvidas as
proteases do grupo das caspases) e remoo das clulas mortas. A remoo das clulas
mortas se faz por fagocitose de modo eficiente, sem deixar vestgios e praticamente no h
inflamao.
A fase de execuo a parte final do processo. Uma cascata de proteoltica, que
est ligada a todas as formas de apoptose, mediada pela famlia das caspases que abrange
mais de dez membros. Elas existem como zimognios e ao sofreram o processo de
clivagem posto em movimento um processo de ativao rpida e seqencial.
Considerando o exposto optou-se por avaliar a apoptose pela expresso da caspase
3 que est relacionada com a fase de execuo do processo e, portanto irreversvel, porm
ainda sem expresso morfolgica identificvel. tambm um bom indicador do dano que
um estmulo lesivo capaz de provocar no tecido.
Nos animais do grupo I o ndice apopttico, ou seja, a relao entre o nmero de
clulas marcadas nas vilosidades por reao imuno-histoqumica pela caspase3 e o nmero
de clulas viveis, no marcadas significantemente maior que em outros dois grupos de
estudo. As vilosidades intestinais, parcialmente ntegras, exibem uma porcentagem
considervel de clulas marcadas inclusive atingindo clulas das criptas intestinais
51
(Figuras 21 e 22). O modelo proposto de isquemia e reperfuso foi, portanto capaz de
produzir alteraes bioqumicas importantes e mensurveis na mucosa intestinal de ratos.
Os animais do grupo II, que receberam a oxigenao hiperbrica no perodo
somente de isquemia exibiram um ndice apopttico significantemente menor que o grupo
I, mostrando que a oferta de oxignio sob presso neste perodo deve realmente ter
influenciado os processos bioqumicos celulares evitando a formao de radicais livres.
Deve ter contribudo para o funcionamento normal do aparato bioqumico celular em que
pese a falta de irrigao arterial e venosa, pela difuso do oxignio nos lquidos corporais.
A fundamentao de ao do oxignio hiperbrico parece ter contribudo para que uma
oferta do mesmo mantivesse as funes bioqumicas celulares de produo de energia sem
desvios na cadeia enzimtica, que o ponto de partida da cadeia de eventos que
desembocam no processo de apoptose.
Os achados da histologia vistos anteriormente so concordantes com os achados da
marcao da apoptose pela caspase 3.
A mesma coincidncia com a histologia ocorreu com os achados de ndice
apopttico nos animais do grupo III. A oferta de oxignio somente no perodo de
reperfuso foi o que apresentou ndices apoptticos significantemente maiores que todos
os grupos. O oxignio hiperbrico no perodo de reperfuso no protegeu as clulas de
uma agresso externa advinda da formao de radicais livres que certamente ocorreu no
perodo de isquemia. Portanto, no perodo de reperfuso licito imaginar que os processos
bioqumicos de produo de radicais livres j teriam ocorrido no perodo anterior de
isquemia e que a oferta de oxignio no perodo subseqente foi incapaz de impedir a
cadeia de eventos bioqumicos.
Por outro lado os animais do grupo IV, que receberam o oxignio hiperbrico nos
dois perodos apresentaram ndice apoptticos menores que o grupo controle (Grupo I),
porm superiores aos do grupo II. De certa forma a oferta de oxignio no perodo de
reperfuso seja de forma isolada ou aps a oferta na isquemia leva a uma piora nos
resultados de preservao celular. Uma hiptese para explicar o fato seria que apesar de
favorecer os processos bioqumicos normais na fase de isquemia a oxigenao hiperbrica
no protegeria de modo total, permitindo na fase subseqente a formao de radicais livres
que teriam sua ao facilitada pela presena abundante do mesmo na reperfuso. Tambm
se observou que houve uma tendncia dos valores encontrados no grupo IV se
52
assemelharem aos do grupo II, e com um aumento da amostra os dados possam mostrar a
real validade da diferena encontrada.
Isto implica que novos estudos com maior nmero de animais ou com marcadores
de apoptose mais especficos para outras fases de sua cascata bioqumica devam ser
estudados.
Os resultados mostraram que as criptas intestinais esto razoavelmente protegidas
da apoptose em todos os grupos (Tabela 2), embora apresentem comprometimento de
edema e infiltrado hemorrgico nos animais sem proteo de oxigenao hiperbrica
(Grupo I). Tambm a marcao da caspase 3 foi mais intensa nos animais deste grupo.
conhecido o fato da migrao das clulas de revestimento das vilosidades ocorrer da base
para o pice, partir da camada celular das criptas. A integridade das criptas mostrou que
ocorreu uma resistncia maior aos fatores agressivos. A sua preservao deve ser um fator
importante na futura reepitelizao da mucosa.
Outro ponto a ser pesquisado a integridade das camadas serosa e muscular
Sabidamente os msculos, lisos ou esquelticos, so tecidos mais resistentes isquemia.
No entanto, a motilidade intestinal de um futuro intestino transplantado depende da
integridade muscular e principalmente dos plexos nervosos submucosos e mioentricos.
Seria outro ponto de interesse a ser pesquisado luz da oxigenao hiperbrica.
53
Consideraes finais
O modelo de promoo de isquemia por perodo de sessenta minutos e seu estudo
tambm aps sessenta minutos de reperfuso permitiu formular um modelo que provoca
alteraes morfolgicas mais intensas na mucosa de ratos. As alteraes bioqumicas pela
marcao da caspase 3 envolvendo o fenmeno da apoptose tambm se mostrou intensa e
mensurvel. Este modelo mais favorvel para estudos que envolvam o transplante
intestinal porque trabalha com perodos de observao mais prximos do que pode ocorrer
na prtica de procedimentos em animais de experimentao ou seres humanos.
A pesquisa permitiu inferir que a oxigenao hiperbrica atende, nos seus
princpios tericos, como um procedimento que pode proteger tecidos, em particular a
mucosa intestinal, num modelo de isquemia/reperfuso. A fundamentao terica da oferta
de oxignio difusvel pelos lquidos corporais parece ter encontrado respaldo nos
resultados uma vez que a sua presena de algum modo protegeu a mucosa intestinal na
vigncia da interrupo arterial e venosa do fluxo sanguneo.
Dentro das limitaes inerentes aos critrios de avaliao histolgicos propostos e
no tipo de marcador utilizado para a apoptose, foi possvel estabelecer uma relao causal
do papel protetor da oxigenao hiperbrica nas leses de isquemia e reperfuso.
A fundamentao terica da ao da oxigenao hiperbrica ficou mais explicita na
avaliao do grupo em que ela foi aplicada no perodo de isquemia mostrando que,
possivelmente impedindo a formao de radicais livres, interferiu favoravelmente na
cadeia de eventos bioqumicos com conseqente preservao morfolgica da mucosa
intestinal.
Fica claro que outros trabalhos devem ser levados cabo com procedimentos de
avaliao mais especficos na mucosa, muscular e plexos mioentricos, para uma
avaliao mais consistente do papel da oxigenao hiperbrica no fenmeno de isquemia e
reperfuso intestinal.
6. CONCLUSES 1- A oxigenao hiperbrica mais eficaz para proteger as leses da mucosa intestinal
de ratos na isquemia e reperfuso quando aplicada no perodo de reperfuso.
2- A oxigenao hiperbrica quando aplicada no perodo de isquemia somente no
protege as leses da mucosa no fenmeno de isquemia e reperfuso.
3- A proteo da oxigenao hiperbrica aplicada no perodo de isquemia e no perodo de
reperfuso qualitativamente inferior aplicao somente no perodo de reperfuso.
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