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EXPERIENCIA DEL LABORATORIO DE
GASTROENTEROLOGÍA EN LA DETERMINACIÓN DE
CALPROTECTINA FECAL
EXPLORACIÓN BIOQUÍMICA DE LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA
INTESTINAL
17-noviembre 2017 MªJosé Ariza Astolfi
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Índice
1ª PARTE: EXPLORACIÓN BIOQUÍMICA DE LA ENFERMEDAD
LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA
PAPEL DE LOS MARCADORES BIOLOGICOS
MARCADORES FECALES
CALPROTECTINA
CONSIDERACIONES PREANALÍTICAS
CONSIDERACIONES ANALÍTICAS: MÉTODOS
CONSIDERACIONES POSTANALÍTICAS
2ª PARTE: EXPERIENCIA EN EL LABORATORIO
TRAYECTORIA
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA
1ª PARTE: EXPLORACIÓN BIOQUÍMICA DE LA INFERMEDAD
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Definición
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) se define como un trastorno constituido por dos entidades clínicas diferentes: la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC). El denominador común es la presencia de inflamación crónica a nivel intestinal, que suele acompañarse de manifestaciones extradigestivas
Colitis ulcerosa Enfermeda de Crohn
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Curso Clínico
Curso clínico
Diagnóstico/ Diferencial diagnóstico
Pronóstico/ riesgo de
complicaciones
Actividad inflamatoria
Predición de
recurrencia de la enfermedad
Optimización de farmacoterapia
Riesgo de recurrencia post cirugia
Síntomas Diagnóstico Actividad
intermitente Cirugía
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
MARCADORES BIOLÓGICOS
1ª PARTE: EXPLORACIÓN BIOQUÍMICA DE LA ENFERMEDAD
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Tipos
Bioquímicos de rutina
Serológicos
Fecales
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Tipos
Hematimetría completa
Reactantes de fase aguda VSG, PCR (Importancia en terapia biológica), Orosomucoide (alfa 1 glicoproteína) Albumina
Anticuerpos anti Transglutaminasa
Heces Aspectos macro y microscópico, alfa 1-antitripsina y estudio microbiológico
Bioquímica general
Enzimas hepáticas, parámetros de función renal, electrolitos, estudio de tiroides, hierro, ferritina, proteínas totales, vitamina B12, acido fólico
Bioquímicos de rutina
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Tipos
Fecales
Anticuerpos séricos frente a antígenos microbianos Anticuerpos anti-Saccharomyces cerevisiae ASCA (CD)
Anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos perinucleares P-ANCA (CU) Anti-OmpC Anti-pseudomonas 12 Anti-flagelin
Nuevos marcadores: Antiglicoproteina 2(Anti-GP2)
Hepatitis B,C,HIV y Prueba de Tuberculina Niveles de Anti-TNF y anticuerpos y metabolitos de Tiopurinas TPMT(Polimorfismo de Tiopurin metil transferasa)
Serológicos
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
MARCADORES FECALES
1ª PARTE: EXPLORACIÓN BIOQUÍMICA DE LA ENFERMEDAD
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Tres razones a tener en cuenta…
Sirven de medida objetiva de la actividad de la enfermedad
Evitan métodos invasivos
Interés del estudio se debe a la propia fisiopatología de la enfermedad
Vermiere et al .Gut 2006; 55: 426-431
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Un marcador ideal
Vermiere et al.Gut 2006; 55: 426-431
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Marcadores fecales en uso clínico
Lehmann et al. Ther Adv Gastroenterol 2015; Vol. 8(1) 23–36
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Una representación Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
CALPROTECTINA
1ª PARTE: EXPLORACIÓN BIOQUÍMICA DE LA ENFERMEDAD
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Estructura y localización
S100A8/S100A9
Epitelio escamoso y neutrófilos, también en macrófagos y monocitos. Representa el 60% de las proteínas
citoplasmáticas del neutrófilo
Fijadora de Ca2+ y Zn2+
Forma parte de la família de las proteínas S100
Fagerhol et al. 1980
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Características
Papel importante en la regulación de la inflamación , procesos neoplásicos e infecciosos.
Buena correlación con la excreción fecal de leucocitos marcados con Indio111
Estable en heces
Se encuentra en plasma y otros fluidos corporales . En heces, se halla 6 veces más concentrada
POR TODO ESTO SE CONSIDERA TEST DE ELECCIÓN COMO MARCADOR DE INFLAMACION INTESTINAL
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Diversos usos
Diferenciar Síndrome de Intestino Irritable vs Enfermedad Inflamatoria Intestinal
o Roseth el al 1992
o Gisbert and Mc Nicholl 2009 (metaanálisis 2475 pacientes sensibilidad de 83% y especificidad 84%)
Evaluación de la actividad de la enfermedad
o Schoepfer et al 2013
Respuesta a tratamientos y predicción de recaídas
o Burry et al 2015;
Eficiencia de la CF frente a síntomas clínicos para reducir colonoscopia (67% en adultos y 35% en niños)
o Van Rheenen et al 2010
Otros desordenes tracto gastro intestinales:
o Screening y vigilancia en pacientes de alto riesgo de cáncer colorectal
o Tratamiento de drogas antiinflamatoria no esteroideas
o Gastroenteritis infecciosa
o Diverticulitis
Walshman et al.Clinical and Experimental Gastroenterology 2016;9 :21-29
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
No existe un punto de corte para definir actividad y remisión clínica de la enfermedad
Superposición entre enfermedad orgánica y funcional. Valores entre 50-100µg/g de heces. Repetir test
CF y lactoferrina puede ser normal en pacientes con enfermedad clínica y endoscópica activa, particularmente en enfermedad ileal o (Sipponen et al.2008)
CF no ayuda a diferenciar entre Enfermedad de Crohn y Colitis ulcerosa
CF no puede ser usada para la localización de la enfermedad inflamatoria intestinal
Lehmann et al. TheAdv Gastroenterol 2015 ; vol 8(1)23-26
Inconvenientes Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Fecal Calprotectin NOT ELEVATED
No Evidence of Inflammation
Infection C-difficile Stool test by PCR C&S Stool T Ova & parasite stool tests
Inflam.Bowl disease ASCA Serum T CRP Serum T ESR Serum T pANCA Serum T Endoscopy & Medical Imaging
Microscopic Colitis ASCA Serum T pANCA Serum T Endoscopy & Medical Imaging
Food intolerance Lactose Intolerance Serum and Breath tests SAIGE Serum (IgE)
Rare Disorders Bile Acids Serum test SIBO Breath test Endoscopy & Medical Imaging
Irritable bowl Syndrome Psychogenic Factors
Abdominal Pain & Change in Bowel Habit
Patient History & Physical Exam
Fecal Calprotectin
Fecal Calprotectin ELEVATED
Inflammation present
Celiac Disease Deaminated Gliadin Peptides(IgA/IgG) Endomysial Anti- Serum test HLA-DQ2 test IgA Quantitation Serum T Tissue Transglutaminase Serum test (IgA) Endoscopy & Medical Imaging
Pancreatic Insufficiency Fat & Meat Fibers Fecal Elastase Xylose test
Malignancy Cologic Serum testFecal Immunochemical T (FIT) Guaiac Stool T Lynch Disease Genetic T* Endoscopy & Medical aging
Ayuda al diagnóstico
Aids the Diagnosis
of GI disease
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Es suficiente muestra aislada, buena correlación 24 horas
Es recomendable que las muestras se obtengan de la primera excreción del día Can J GastroenterolHepatol 2015;29(7):369-372.
Estabilidad de la muestra
hasta 7 días a temperatura ambiente
Si almacenamiento > 7 días (congelar -20ºC)
Extracción
Gold standard: pesada
Uso de dispositivos
Consistencia de la muestra
Heces con sangre deben ser rechazadas
Consideraciones Preanalíticas Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
En 1992 Roseth et al. desarrollaron el primer método de
determinación de calprotectina fecal (CPF), mediante una técnica de
ELISA.
Técnicas inmunoquímicas utilizando bien anticuerpos policlonales
o monoclonales frente a varios epítopos del dímero de la molécula
de CPF.
Métodos cuantitativos o cualitativos
Metodología Point of care
Se han mejorado y validado extensamente los métodos
Hoy día hay múltiples ensayos disponibles
Consideraciones Analíticas Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Consideraciones Analíticas - Inmunoensayos disponibles
Enzimoinmunoanálisis ELISA Calprest, Eurospital (inc. NG) Bühlmann Euroinmun Orgentec
Inmunoquímicos ramdomizados Inmunoturbidimétricos (Bühlmann) Inmunofluorescencia ( Thermo Fisher Diagnostics) Inmunoquimioluminiscencia (Liaison DiaSorin e Inova Werfen)
Test rápido Quantum blue® - Bühlmann Calfast (Vircell Eurospital)
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Enzimoinmunoanálisis ELISA Calprest
Anticuerpo policlonal. Material de referencia interno procedente de extracción de calprotectina de pool de neutrófilos
Intervalo de medición 15-500 µg/g
Enzimoinmunoanálisis ELISA Calprest NG
Calprotectina humana recombinante.
0-3000 µg/g
Enzimoinmunoanálisis ELISA Bühlmann
Material de referencia interno procedente de extracción de calprotectina de pool de neutrófilos
30-1800 µg/g
Consideraciones Analíticas - ELISA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
5/6 Viales calibradores
2 Viales de control
Tampón de extracción
Microplaca
Tampón de lavado
Tampón de incubación
Conjugado
Sustratro
Solución de parada
Manual o automatizado
1h 30min-2h 30min para resultado
Obligatorio realizar curva de calibración (recomendado por duplicado)
Montaje por tandas para optimizar el número de determinaciones efectivo de cada placa
Extrapolación de los resultados superiores al último punto de calibración
Consideraciones Analíticas - ELISA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Inmunoturbidimétrico: Bülhmann fCALturbo
Anticuerpos policlonales anti-calprotectina humana
Material de referencia: calprotectina extraída de pool de neutrófilos.
Metodología PETIA (Particle enhanced turbidimetric inmunoassay)
Intervalo de calibración 15-2000 µg/g
Intervalo de medición 15-8000 µg/g
Resultados comparables a ELISA Bülhmann
Posibilidad de autodilución
Curva de calibración cada cuatro semanas
Obtención del primer resultado en 10 min
Posibilidad de montarlo en diferentes equipos de bioquímica (equipo ofrecido Mindray 200E)
Consideraciones Analíticas - PETIA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Consideraciones Analíticas - PETIA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Fluoroenzimoinmunoensayo (ELiA/FEIA): ELiA Calprotectin/ELiACalprotectin 2 Thermofisher
Anticuerpos monoclonales anti-calprotectina de ratón (ELiACalpro 2)
Intervalo de medición: 15-3000 µg/g / 3,8-6000 µg/g
Dilución: 1:100 / 1:200
Curva de calibración: una vez al mes
Mayor estabilidad del extracto Elia Calprotectin 2 (3 dias T.ambiente)
Extrapolación de los resultados superiores al último punto de calibración (750 ng/mL)
Obtención de los resultados aprox 2h
Diferente instrumentación: Phadia 100 ELiA Calprotectin
Phadia 250/2500/5000 ELiA Calprotectin y ELiA Calprotectin 2
Consideraciones Analíticas – ELiA/FEIA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Consideraciones Analíticas – ELiA/FEIA
Anticuerpos de la FS unen antigenos CF de la muestra
Se añaden anticuerpos conjugados a una enzima,que a
su vez se une al complejo antigeno anticuerpo
El complejo se incuba con agente de desarrollo.
Medimos Fluorescencia.
1
2
3
4
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Quimioluminiscencia: Liaison Calprotectina - DiaSorin Anticuerpo monoclonal frente a dímero S100A8-S100A9, fabricado con
antígeno recombinante (estructura 3D) .
Intervalo de medición:5 – 800 µg/g; autodilución hasta 8000 µg/g
Curva de calibración cada cuatro semanas
Equipo de carga continua para muestras, reactivo y fungible
Consideraciones Analíticas - CLIA
S10
0A
8
S10
0A
9
ABEI Magnetic Particle
MAb Anti – Heterodimer Calprotectin
IgG Mab anti-S100A9 ABEI
labelled Emitted light
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Consideraciones Analíticas - CLIA
Reactivo único que incluye todas las soluciones necesarias para la reacción
Proceso de extracción y procesamiento en el mismo dispositivo, sin trasvases.
Carga continua de muestras y reactivos Tiempo para primer resultado 35 min Instrumentacion LIAISON Y LIAISON XL
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Test rápido (inmunocromatografía):
Quantum blue – Bülhmann
Anticuerpos policlonales anti-calprotectina humana
Material de referencia: calprotectina extraída de pool de neutrófilos
Intervalo de medición:
Quantum Blue® fCAL: 30-300 µg/g
Quantum Blue® fCAL extended: 30 – 1000 µg/g
Quantum Blue® fCAL high range: 100-1800 µg/g
Obtención del primer resultado en 15 min
Bajo volumen de muestras
Consideraciones Analíticas - IC Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Consideraciones Analíticas - IC Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Consideraciones Postanalíticas
Basso et al. Clinical Chem Lab Med 2014; 52(4):471-481
Marcadores fecales no son específicos de la enfermedad inflamatoria
La concentración de CP
Diversos factores fisiológicos (edad, comorbilidades clínicas) Joshi et al 2010
Considerable variación día a día. Lasson et al 2014
Puntos de corte
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Consideraciones Postanalíticas: Puntos de corte
Walsham et al. 2016; 9: 21–29
* Un valor entre 50-150 µg/g, se puede interpretar como zona gris y debería repetirse entre 4 y 6 semanas
Se ha asumido un punto de corte universal 50 µg/g para diferenciar EII de SII
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Se sugieren los siguientes puntos de corte para monitorización y manejo de estrategias
Consideraciones Postanalíticas: Puntos de corte
Panaccione et al. Can J GastroenterolHepatol.2015 ;29(7):369-372.
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Gran dispersión de cut-off “ideales” para las diferentes metodologías Es necesaria la estandarización del material de referencia .
Oyaert et al. Clin Chem Lab Med 2017; 55(10): 1564–1573
Consideraciones Postanalíticas: Puntos de corte Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
TRAYECTORIA
2ª PARTE: EXPERIENCIA DEL LABORATORIO
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
2002 2004 2006 2008 2010 2012 2014 2016 2018
Nº
Cal
pro
tect
ina
Año
>13 años determinando calprotectina
ELISA
Método de pesada Quimioluminiscencia
Dispositivo extracción
ELISA Dispositivo extracción
EQAS INSTAND
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Estudio de la utilidad de la Calprotectina fecal como marcador de inflamación en pacientes pediátricos con enfermedad intestinal inflamatoria
Estudio realizado en 43 pacientes(19H y 24 M con edades entre los 1,5 y 24,5 años. Objetivo: estudiar el comportamiento de la CF como marcador de inflamación en pacientes pediátricos . Resultados :Los niveles de CF fueron significativamente mas altos en el grupo de EII media de 155,7µg/g heces frente al grupo control media de 24,2µg/g .
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Calprotectina y Lactoferrina fecal: dos proteinas leucoitarias como indicadores de enfermedad inflamatoria intestinal activa
Estudio realizado en 55 pacientes adultos. objetivo: determinar correlación de estos parámetros con los índices de actividad en EC y CU y el efecto del consumo de tabaco sobre ellos Resultados : Con los índices de corte considerados como patológicos >200µg/g de heces para calprotectina y 12,5µg/g de heces para lactoferrina, se observa que el 88% de los pacientes tienen ambos parámetros elevados. El consumo de tabaco modifica la excreción de ambos
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Enfermedad inflamatoria intestinal: Calprotectina vs Hemoglobina fecal
Se estudiaron 80 pacientes,23 con EC,11 con CU y 45 con otras patologías. Objetivo : comprobar si el aumento de Hb F influye en la concentración de CF en los pacientes con EII Resultados : La relación entre CF y Hb F es débil, solo se encuentra una correlación significativamente positiva en la CU. Estos resultados apoyan la hipótesis de que en la EC, existe un mecanismo de excreción luminal de CF diferente del sangrado.
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Calprotectina fecal: un nuevo parámetro de actividad de Enfermedad Inflamatoria
Estudio realizado en 32 pacientes (1-56 años) con el objetivo de evaluar la efectividad de la CF como marcador clínico, no-invasivo, de actividad de inflamación intestinal en presencia de EII en sus dos principales enfermedades: colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn (EC)
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Estudio analítico comparativo de la determinación de Calprotectina fecal
CONCLUSIONES
Los test rápidos pueden servir como una prueba de cribado de inflamación intestinal, debido a su alta sensibilidad. La banda de sensibilidad de 200µg/g tiene una FC buena con el ELISA automatizado, por lo que ofrece resultados fiables
como apoyo para la detección de agudizaciones de la enfermedad inflamatoria intestinal. Aparecen dos falsos negativos en el test cualitativo que corresponden a valores >700µg/g, pudiendo ser un “efecto
prozona” a valorar en posteriores estudios. Los test rápidos constituyen una herramienta clínica rápida y fiable, útil para el diagnóstico y control de tratamiento de
enfermedades con actividad inflamatoria intestinal en el ámbito sanitario.
MATERIAL Y MÉTODOSSe estudiaron 100 muestras fecales remitidas por el Servicio de Gastroenterología. Se extrajeron según el método especificado por
el fabricante, conservándose a -20ºC hasta su análisis. El mismo extracto se procesó por el método ELISA automatizado Calprest®
Eurospital (ELISA automatizado) y por 2 test rápidos inmunocromatográficos (Certest Calprotectin-Lactoferrin (test cualitativo) y
Certest Calprotectin 50+200 Combo Card (test semicuantitativo)), utilizando las siguientes equivalencias en la posterior
interpretación de resultados:
Para comparar las pruebas se estudiaron la sensibilidad (S), especificidad (E), valor predictivo positivo (VPP), valor predictivo
negativo (VPN), e índice Kappa (IK), utilizando como método de referencia el ELISA automatizado.
RESULTADOSResultados del ELISA automatizado (µg/g): Mediana: 55,2; Máximo: 849,9; Mínimo: 0,1.
ELISA automatizado vs test semicuantitativo (valoración de los 3 rangos): IK=0,48 (SD=0,07; IC95% (0,34-0,62)); FC: moderada.
Se encontraron dos falsos negativos en el test cualitativo que correspondieron a dos valores de Cp-f>700µg/g.
ESTUDIO ANALÍTICO COMPARATIVO DE LA DETERMINACIÓN DE
CALPROTECTINA FECAL: ENSAYO ELISA AUTOMATIZADO VS DOS
TESTS RÁPIDOS INMUNOCROMATOGRÁFICOS
R. Serrano1, JM. Lezana1, I. Martín Mérida1, N. Rico1, S. Gordillo2, MD. Sarrión1 .1Laboratorio de Gastroenterología. Servicio de Bioquímica Clínica . Hospital Universitario La Paz. Madrid; 2Alere Healthcare SAU2. Barcelona.
INTRODUCCIÓNLa calprotectina (Cp) es una proteína muy abundante en neutrófilos. Se encuentra elevada en múltiples estados patológicos
inflamatorios y neoplásicos. En la inflamación intestinal los neutrófilos migran hacia el lumen, donde liberan, tras su activación y
muerte, gran cantidad de Cp. Su excreción fecal, por tanto, es muy útil en la valoración del riesgo inflamatorio intestinal, tratamiento
y evaluación de recidivas. Es una molécula muy estable a temperatura ambiente y fácilmente cuantificable, estando establecido el
punto de corte para actividad inflamatoria intestinal en 50µg/g de heces. En los últimos años están apareciendo a nivel comercial
test rápidos para la detección de Cp fecal (Cp-f), potencialmente útiles en la práctica clínica.
CONCLUSIONES Los test rápidos pueden servir como una prueba de cribado de inflamación intestinal, debido a su alta sensibilidad.
La banda de sensibilidad de 200µg/g tiene una FC buena con el ELISA automatizado, por lo que ofrece resultados fiables como
apoyo para la detección de agudizaciones de la enfermedad inflamatoria intestinal.
Aparecen dos falsos negativos en el test cualitativo que corresponden a valores >700µg/g, pudiendo ser un “efecto prozona” a
valorar en posteriores estudios.
Los test rápidos constituyen una herramienta clínica rápida y fiable, útil para el diagnóstico y control de tratamiento de
enfermedades con actividad inflamatoria intestinal en el ámbito sanitario.
OBJETIVORealizar un estudio comparativo de las determinaciones de Cp-f entre un método cuantitativo ELISA automatizado y dos test rápidos
inmunocromatográficos, uno de ellos semi-cuantitativo y otro cualitativo.
Calprest® Eurospital Certest Calprotectin-Lactoferrin Certest Calprotectin 50+200 Combo Card
<50µg/g Banda negativa/ténue Banda de 50 negativa/ténue y banda de 200 negativa
50-200µg/g Banda positiva Banda de 50 positiva y banda de 200 negativa/ténue
>200µg/g Banda positiva Banda de 50 positiva y banda de 200 positiva
Sensibilidad Especificidad VPP VPN IKFuerza de
concordancia
ELISA automatizado vs test cualitativo
90.9 % IC
95%(79,3-96,6)
51,1% IC
95%(36-66,1)
69,4%IC
95%(57,3-79,5)
82,1%IC
95%(36-66,1)
0,46; SD=0,09 IC
95%(0,27-0,64)
Moderada
ELISA automatizado vs test semicualitativo
(Banda 50μg/g)
94,3% IC
95%(83,8-98,5)
48,9% IC
95%(34,3-63,7)
67,6%IC
95%(55,6-77,7)
88,5%IC
95%(68,7-97)
0,44; SD=0,09 IC
95%(0,27-0,62)
Moderada
ELISA automatizado vs test semicualitativo
(Banda 200μg/g)
83,3%IC
95%(61,8-94,5)
88,2% IC
95%(78,22-94,1)
69%IC
95%(49,-84)
94,4%IC
95%(85,5-98,2)
0,67; SD=0,09;IC
95%(0,50-0,84)
Buena
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
2002 2004 2006 2008 2010 2012 2014 2016 2018
Nº
Cal
pro
tect
ina
Año
>13 años determinando calprotectina
ELISA
Método de pesada Quimioluminiscencia
Dispositivo extracción
ELISA Dispositivo extracción
EQAS INSTAND
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
2016. Situación en el laboratorio de Gastroenterología Ensayo en rutina: ELISA CALPREST Características NO ideales intrínsecas al la metodología ELISA:
calibración en cada montaje necesidad de recolectar muestras diluciones debían esperar al siguiente montaje extrapolación en valores superiores al último punto de calibración
Necesidad del laboratorio de automatizar completamente el ensayo debido a un aumento de la carga asistencial
Mejoras ofrecidas con el cambio a la metodología CLIA Extracto n0 necesita centrifugación (no trasvase del extracto) Mismo dispositivo para la extracción y su posterior análisis en el equipo Mayor rango y dilución automática (no existe extrapolación de resultados) Mejor estandarización al utilizar una calprotectina recombinante como material
de referencia. Mejora en repetibilidad. Menor tiempo de procesamiento de las pruebas 35 minutos Carga continua en el equipo Menor tiempo de repuesta
2016 De ELISA a CLIA
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Estudio de 62 muestras de heces remitidas al laboratorio para la determinación de calprotectina fecal
Procesamiento en paralelo por el ELISA habitual Calprest (con anticuerpos policlonales) y por el inmunoensayo quimioluminiscente Liaison Calprotectina (con anticuerpos monoclonales frente a el dímero recombinante S100A8-S100A9).
2016 De ELISA a CLIA
Extracción de Cp-f siguiendo el protocolo de cada método.
Los extractos del método Calprest fueron congelados hasta su procesamiento
Los extractos del método de DiaSorin, fueron procesados en el día en el autoanalizador Liaison. Todas las muestras fueron procesadas en duplicado para poder calcular la precisión del dispositivo de extracción.
Se descartaron 13 muestras fuera del rango de linealidad (15-500µg/g en Calprest) y 4 outliers; quedando 45 muestras para el estudio estadístico.
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
2016 De ELISA Calprest a CLIA Liaison
DISCUSIÓN
Se observa buena comparabilidad de resultados a pesar de la heterogeneidad de la muestra y de la variabilidad añadida por la etapa de extracción de cada método. Los resultados de ambos métodos en el rango de medición estudiado son intercambiables. Estos resultados son coherentes con la literatura, donde están descritos similares rendimientos diagnósticos entre varios tests pero con diferencias cuantitativas relativamente grandes.
Precisión calculada para el dispositivo de extracción: 11,13%
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Estudio de Estabilidad del extracto
Caso Media Lsn Lsn 6 días 4ºC % desviación
Lsn 10 días 4ºC % desviación
Lsn 10 días -20ºC % desviación
6 días 4ºC 10 días 4ºC 10 días -20ºC
1 14,35 17 18,47 10,1 -29,62 7,9 -44,95
3 56,65 55,6 -1,85 39,9 -29,57 29 -48,81
6 700,5 745 6,35 634 -9,49 476 -32,05
9 535 546 2,06 424 -20,75 352 -34,21
10 37,8 40,9 8,2 26,4 -30,16 22 -41,8
12 136 122 -10,29 87,3 -35,81 78,2 -42,5
21 61,6 69,5 12,82 51,9 -15,75 27,7 -55,03
5,11 % % Desv media 42,76 % 24,45%
Estabilidad del extracto acorde con lo descrito en el protocolo del
fabricante
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Protocolo oficial para el procesamiento de muestras líquidas: método de pesada Objetivo del estudio
Validación de un nuevo protocolo de extracción para muestras líquidas usando el método de pesada como método de referencia
Protocolo de extracción a validar
Coger 10 µl de muestra líquida con punta de pipeta cortada
Añadir los 10 µl de muestra líquida a los 6 mL de buffer de extracción contenidos en el dispositivo de extracción DiaSorin
Agitar 30 min en multivortex junto con el resto de muestras
Procesar en el autoanalizador Liaison®/Liaison XL®
Validación de nuevo protocolo de extracción en muestras líquidas. Protocolo
10 µl muestra
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Se estudiaron 29 muestras procesadas en duplicado por cada uno de los métodos: pesada y nuevo protocolo de extracción
Coeficientes de variación obtenidos: Método de pesada: 5,8 %
Método a validar: 13,5% *Coeficiente de variación calculado para el dispositivo de extracción: 11,13% **Coeficiente de variación óptimo <20% teniendo en cuenta que son muestras de heces (muy heterogéneas) e implica un procedimiento de extracción previo a la medida.
Desviación media del nuevo protocolo de extracción respecto al método de pesada (referencia): +4,36 %
Validación de nuevo protocolo de extracción en muestras líquidas. Resultados
A la vista de los resultados obtenidos podemos confirmar que el nuevo protocolo de extracción para el procesamiento de muestras líquidas es
equiparable al método de referencia establecido en el protocolo del ensayo Liaison® Calprotectin
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Validación clínica. King´s College Londres
Objetivo: establecer los valores de cut-off
Estudio retrospectivo
Pacientes:
Mínimo 60 pacientes con Síndrome de Intestino Irritable (SII)
Mínimo 100 pacientes con Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII)
Datos clínicos disponibles
Enfermedad Inflamatoria Intestinal dividida en:
Activa. Pacientes nuevos o monitorizados con diagnóstico de EII en colonoscopia y/o historia clínica
Inactivos. Pacientes en remisión
IBS. Pacientes con diagnóstico por endoscopia, historia clínica y/o valores de Calprotectina
Elección del punto de corte Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Distribución de los resultados por enfermedades.
Categorización de los diferentes pacientes con el ensayo LIAISON® Calprotectin
Clasificación de pacientes usando un Cut Off de 50µg/g
Elección del punto de corte Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Elección del punto de corte
Clinical LIAISON
Diagnosis < 50 μg/g 50 -100 μg/g > 100 μg/g Total
IBS 67 10 7 84
79.8% 11.9% 8.3% 100%
IBD - Active 3 17 116 136
2.2% 12.5% 85.3% 100%
IBD - Inactive 30 13 3 46
65.2% 28.3% 6.5% 100%
Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
EQAS INSTAND (Julio 2017) Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
Biomarcador valioso para el diagnóstico diferencial entre enfermedad orgánica y funcional y para medir actividad de enfermedad inflamatoria.
Capacidad de evaluar la respuesta al tratamiento, obviando la necesidad de depender de sintomas subjetivos del paciente.
CF reduce el número de pruebas endoscópicas invasivas.
CF puede tener otras aplicaciones. Ejemplo: infeccion aguda, trasplante, cancer.
Marcador estable, sencillo de manejar y con una amplia metodología disponible.
Gran dispersión de cut-off “ideales” para las diferentes metodologías.
Es necesaria la estandarización del material de referencia .
Conclusiones Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017
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