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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Extração do corante do fruto de castanhola (Terminalia
catappa Linn) e estudos dos seus compostos fenólicos,
antocianinas e atividade antioxidante
Viviane Hiromi Uchida
Orientadora: Profª. Drª. Márcia Maria Lima Duarte
Natal/RN
Dezembro/2014
Viviane Hiromi Uchida
Extração do corante do fruto de castanhola (Terminalia
catappa Linn) e estudos dos seus compostos fenólicos,
antocianinas e atividade antioxidante
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Química da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, como parte dos requisitos
necessários para obtenção do título de mestre
em Engenharia Química, sob orientação da
Profª. Drª. Marcia Maria Lima Duarte.
Natal/RN
Dezembro/2014
Catalogação da Publicação na Fonte.
UFRN / CT / DEQ
Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nícolás Sólimo”.
Uchida, Viviane Hiromi.
Extração do corante do fruto de castanhola (Terminalia catappa Linn) e estudos
dos seus compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante / Viviane Hiromi
Uchida. - Natal, 2014.
76 f.: il.
Orientador: Márcia Maria Lima Duarte.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro
de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-graduação
em Engenharia Química.
1. Pigmentos vegetais - Dissertação. 2. Antocianinas - Dissertação. 3. Antioxidantes -
Dissertação. 4. Compostos fenólicos - Dissertação. I. Duarte, Márcia Maria Lima. II.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF CDU 667.272/.276 (043.3)
UCHIDA, V. H. – Extração do corante do fruto de castanhola (Terminalia catappa Linn) e
estudos dos seus compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante. Dissertação de
Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Área de
concentração: Engenharia Química, Natal, Brasil, 2014.
Orientadora: Profª. Drª. Marcia Maria Lima Duarte
Resumo: A Terminalia catappa Linn pertencente à família Combretaceae, popularmente
conhecida como castanhola, possui frutos constituídos por uma polpa carnosa, semente
arredondada e uma casca muito dura. A pigmentação natural existentes no fruto da castanhola
indica a presença de antocianinas, componentes de natureza fenólica pertencentes ao grupo
dos flavonóides, que apresentam atividade antioxidante. A presente pesquisa foi realizada
com a castanhola e teve como principal objetivo o estudo de fatores que influenciam a
extração de corantes a partir de sua polpa. Os extratos foram obtidos utilizando-se um reator
enjaquetado por extração sólido líquido. Os fatores avaliados foram a temperatura, o tempo, a
proporção do solvente e o pH de extração. Adotando-se um planejamento fatorial de 24, com 4
repetições no ponto central, os efeitos destes fatores sobre o processo de extração foram
analisados utilizando-se o software Statistica 7.0. A atividade antioxidante (AA), o teor de
compostos fenólicos totais (CFT) e o teor de antocianinas monoméricas totais (AMT) foram
avaliadas como variáveis resposta do planejamento. Na análise estatística dos resultados, os
efeitos que mais influenciaram a extração foram diferentes para cada uma das respostas (CFT,
AMT e AA). No entanto o pH se mostrou significativo para a extração de todos os compostos.
O comportamento cinético da extração do corante também foi estudado para os compostos
fenólicos totais, antocianinas monoméricas e atividade antioxidante, em que o equilíbrio foi
atingido após os 90 minutos de extração. No estudo da estabilidade das antocianinas a
temperatura foi o fator que mais influenciou na estabilidade, contudo a concentração e o pH
também tiveram influência.
Palavras-chave: Terminalia catappa Linn, compostos fenólicos, antocianinas, atividade
antioxidante.
UCHIDA, V. H. – Extraction of dye from the fruit of castanhola (Terminalia catappa Linn)
and studies of its phenolic compounds, anthocyanins and antioxidant activity. Dissertation,
UFRN, Graduate Program in Chemical Engineering, Area of Concentration: Chemical
Engineering, Natal, Brazil, 2014
Advisor: Dr. Marcia Maria Lima Duarte
Abstract: The Terminalia catappa Linn belonging to Combretaceae family, popularly known
as castanets, has fruits consists of a fleshy pulp, rounded seed and a very hard shell. The
natural pigmentation existing in the fruit of castanet indicates the presence of anthocyanins,
phenolic nature components belonging to the group of flavonoids, which have antioxidant
activity. This research was conducted with the castanets and aimed to the study of factors
influencing the extraction of dyes from its pulp. The extracts were obtained using a reactor
enjaquetado by solid-liquid extraction. The factors were evaluated as temperature, time,
solvent ratio and pH extraction. Adopting a factorial design of 24, with 4 repetitions at the
central point, the effects of these factors on the extraction process were analyzed using
Statistica 7.0 software. The antioxidant activity (AA), the content of phenolic compounds
(CFT) and the total monomeric anthocyanin content (AMT) were evaluated as response
variables planning. Statistical analysis of the results, the effects that influenced the extraction
were different for each response (CFT, AMT and AA). However, the pH was significant for
the extraction of all compounds. The kinetic behavior of the dye extraction was also studied
for phenolic compounds, monomeric anthocyanins and antioxidant activity, in which the
equilibrium was reached after 90 minutes of extraction. To study the stability of anthocyanins
temperature was the factor that most influenced the stability, however the concentration and
pH also played a part.
Keywords: Terminalia catappa Linn, phenolic compounds, anthocyanins, antioxidant
activity.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente aos meu pais que tanto me ajudaram na realização de meus
estudos.
Ás professoras Márcia Maria e Ana Lúcia pela orientação, paciência e transmissão de
conhecimento que muito contribuíram para a minha formação.
Aos meus colegas do Laboratório de Tecnologia de Alimentos, Glenda, Mayara,
Isadora, Camila, Thaise, professora Fátima e especialmente a Thais pela amizade,
companheirismo e por todas as sugestões para o desenvolvimento deste trabalho.
Não poderia esquecer dos meus amigos Suzara, Emyliane, Indira, Paula e Pedro pelos
momentos ótimos e por sempre estarem ao meu lado.
Ao meu namorado Marcelo pela ajuda que me forneceu no mestrado e principalmente
amor e paciência durante tantos anos.
As minhas amigas queridas de longa data, Dalva e Sabrina que tanto me incentivaram
nos estudos.
Por fim, agradeço à CAPES e à UFRN pelo apoio financeiro deste projeto.
SUMÁRIO
1 - INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 2
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 5
2.1 - Castanhola (Terminalia catappa Linn) ........................................................................... 5
2.1.1 - Composição nutricional da castanhola ......................................................................... 6
2.2 - Compostos fenólicos .................................................................................................... 10
2.3 - Flavonóides ................................................................................................................. 12
2.4 - Antocianinas ................................................................................................................ 14
2.5 - Estabilidade das antocianinas ....................................................................................... 15
2.5.1 - Copigmentação ......................................................................................................... 15
2.5.2 - pH..................................................................................................................................16
2.5.3 - Temperatura .............................................................................................................. 18
2.5.4 - Luz............... ............................................................................................................. 18
2.6 - Ação antioxidante ........................................................................................................ 18
2.7 - Extração sólido-líquido por imersão ............................................................................. 19
2.8 - Solvente ....................................................................................................................... 20
2.9 - Metodologia da superfície de resposta .......................................................................... 23
2.9.1 - Análise da variância .................................................................................................. 23
3 - MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 26
3.1 - Matéria-prima .............................................................................................................. 26
3.2 - Obtenção do corante por extração sólido-líquido .......................................................... 26
3.2.1 - Seleção do fruto e obtenção da polpa......................................................................... 27
3.2.2 - Secagem e moagem e análise granulométrica ............................................................ 27
3.2.3 - Planejamento Experimental ....................................................................................... 28
3.2.4 - Extração sólido-líquido por imersão .......................................................................... 29
3.2.5 - Análises do extrato .................................................................................................... 30
3.2.5.1 - Determinação de Compostos fenólicos totais (CFT) ............................................... 30
3.2.5.2 - Determinação da Atividade antioxidante (AA) pelo sequestro do radical DPPH· .... 31
3.2.5.3 - Determinação de antocianinas monoméricas totais (AMT) ..................................... 32
3.3 - Estudo cinético do processo de extração ....................................................................... 34
3.4 - Estudos da estabilidade das antocianinas nos extratos .................................................. 34
4 - RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................... 37
4.2 - Extração do corante e avaliação do planejamento ......................................................... 38
4.3 - Análise da superfície de resposta .................................................................................. 43
4.3.1 - Atividade antioxidante .............................................................................................. 43
4.3.2 - Compostos Fenólicos Totais ...................................................................................... 46
4.3.3 - Antocianinas monoméricas totais .............................................................................. 49
4.4 - Correlação na extração entre os compostos fenólicos, antocianinas e a atividade
antioxidante ......................................................................................................................... 52
4.5 - Estudo Cinético do processo de extração ...................................................................... 54
4.5.1 - Análise do comportamento cinético ........................................................................... 55
4.6 - ESTUDOS DA ESTABILIDADE DE ANTOCIANINAS PRESENTES NO
EXTRATO... ....................................................................................................................... 58
5 - CONCLUSÃO ................................................................................................................ 63
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 64
APÊNDICE I. CURVAS DE CALIBRAÇÃO ..................................................................... 76
LISTA DE FIGURAS
Figura 2. 1- Ávore de castanhola ............................................................................................ 5
Figura 2. 2 - Fruto da castanhola ............................................................................................ 6
Figura 2. 3 - Capacidade de sequestrar o radical DPPH (%) ................................................... 7
Figura 2. 4 - Metabolismo dos compostos fenólicos em plantas. ........................................... 11
Figura 2. 5 - Biossintese dos Flavonoides. ............................................................................ 12
Figura 2. 6 - Estruturas químicas dos principais flavonóides................................................. 13
Figura 2. 7 - Forma básica das antocianinas. ........................................................................ 14
Figura 2. 8 - Estrutura química das antocianinas ................................................................... 15
Figura 2. 9 - Possíveis mudanças estruturais das antocianidinas em meio aquoso em função do
pH. ....................................................................................................................................... 17
Figura 3. 1 - Fluxograma do processo de extração do corante ............................................... 26
Figura 3. 2 - Pó da castanhola pronta para a extração ........................................................... 28
Figura 3. 3 - Reator enjaquetado acoplado a um banho termostático ..................................... 30
Figura 3. 4 - Extratos com concentrações de 50 e 30% com as soluções tampão de KH2PO4
(pH = 6) e KCl (pH = 3). ...................................................................................................... 35
Figura 4. 1 - Valores preditivos em relação aos valores observados para a atividade
antioxidante ......................................................................................................................... 41
Figura 4. 2 - Valores preditivos em relação aos valores observados para os Compostos
Fenólicos Totais ................................................................................................................... 41
Figura 4. 3 - Valores preditivos em relação aos valores observados para as Antocianinas
Monomérica Totais .............................................................................................................. 42
Figura 4. 4 - Diagrama de Pareto para AA ............................................................................ 44
Figura 4. 5 - Curvas de nível para a interação da porcentagem do etanol com o pH (2by4) para
a extração da atividade antioxidante ..................................................................................... 45
Figura 4. 6 - Curvas de nível para a interação da temperatura com o pH (1by4) para a extração
da atividade antioxidante ...................................................................................................... 46
Figura 4. 7- Diagrama de Pareto para os compostos fenólicos .............................................. 47
Figura 4. 8 - Curvas de nível para a interação da temperatura (ºC) com o pH(1by4) para a
extração de compostos fenólicos .......................................................................................... 48
Figura 4. 9 - Diagrama de Pareto para as antocianinas .......................................................... 49
Figura 4. 10 - Curvas de nível para a interação da porcentagem do etanol com o tempo (2by3)
para a extração de antocianinas ............................................................................................ 50
Figura 4. 11 - Curvas de nível para a interação da temperatura com o tempo (1by3) para a
extração de antocianinas ...................................................................................................... 51
Figura 4. 12 - Curvas de nível para a interação da temperatura com o pH (1by4) para a
extração de antocianinas ...................................................................................................... 52
Figura 4. 13 - Correlação entre a extração dos compostos fenólicos com antocianinas com r =
0,79...................................................................................................................................... 53
Figura 4. 14 - Correlação entre a extração dos compostos fenólicos com a atividade
antioxidante com r = 0,69 ..................................................................................................... 53
Figura 4. 15 - Correlação entre a extração das antocianinas com a atividade antioxidante com
r = 0,64 ................................................................................................................................ 54
Figura 4. 16 - Concentração dos compostos fenólicos em função do tempo nas condições de
50°C, 50% de etanol e pH igual a 3,5. .................................................................................. 56
Figura 4.17 - Concentração de antocianinas em função do tempo nas condições de 50°C, 75%
de etanol e pH igual a 3,5. .................................................................................................... 57
Figura 4.18 - Concentração de atividade antioxidante em função do tempo nas condições de
50°C, 75% de etanol e pH igual a 3,5. .................................................................................. 58
Figura 4. 19 - Gráfico da porcentagem de degradação em função das temperaturas a, pH e a
porcentagem da concentração em cada um dos ensaios. ....................................................... 60
Figura 6. 1 - Curva de calibração para CFT .......................................................................... 76
Figura 6. 2 - Curva de calibração de AA .............................................................................. 76
LISTA DE TABELAS
Tabela 2. 1 - Composição nutricional dos resíduos de polpas de frutas tropicais. .................... 8
Tabela 2. 2 - Composição química (ou nutricional) do fruto da castanhola. ............................ 8
Tabela 2. 3 - Parâmetros físicos da castanhola. ....................................................................... 9
Tabela 2. 4 - Estudos publicados sobre a utilização de solventes na extração e as condições de
operação para a recuperação de compostos bioativos naturais. ............................................. 22
Tabela 2. 5 - Análise de variância para o ajuste do modelo matemático através da tabela
ANOVA. ............................................................................................................................. 24
Tabela 3. 1 - Planejamento experimental 24 (4 fatores e 2 níveis) ......................................... 29
Tabela 4. 1 - Diâmetro da abertura das peneiras e o valor da fração mássica (xi) da massa
retida em cada peneira. ......................................................................................................... 37
Tabela 4. 2 - Resultados da extração de atividade antioxidante, compostos fenólicos e
antocianinas da polpa do fruto de castanhola ........................................................................ 39
Tabela 4. 3 - Valores dos efeitos para AA, CFT e AMT ....................................................... 40
Tabela 4. 4 - Valores de Fcal e Ftab para AA, CFT e AMT .................................................. 42
Tabela 4. 5 - Valores de Fcal/Ftab para AA, CFT e AMT respectivamente ........................... 43
Tabela 4. 6 - Concentrações de CFT, AMT e AA com o tempo de extração ......................... 55
Tabela 4. 7 - porcentagem de degradação de antocianinas em 5 dias a 25°C ......................... 58
Tabela 4. 8 - Porcentagem de degradação de antocianinas em 5 dias a 60°C ......................... 59
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES
AA – Atividade antioxidante
CFT – Compostos fenólicos totais
AMT – Antocianinas monoméricas totais
DPPH – 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (C18H12N5O6)
Ci-3-gli – Cianidina-3-glicosídeo
GAE – Equivalentes em ácido gálico
%SRL – Porcentagem do radical livre
ANOVA – Análise da variância
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO
Capítulo 1 - Introdução
2 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
1- Introdução
Terminalia catappa Linn (da família Combretaceae), popularmente conhecida como
castanhola, cresce em regiões tropicais e subtropicais, particularmente localizadas em áreas
costeiras (RODRIGUES, 2012). Ela é nativa de áreas próximas a regiões costeiras do Oceano
Índico. Os frutos da castanhola possuem uma polpa carnosa, contendo em seu interior uma
semente arredondada e rica em óleo, envolvida por uma casca muito dura (LIMA, 2012). A
coloração do fruto é verde passando ao amarelo e vermelho quando maduros. Eles são
comestíveis, fonte de proteínas e lipídios e são utilizados como alimentos, aves e outros
animais (MARQUES et al., 2013). A pigmentação natural presente no fruto da castanhola
indica a presença de antocianinas, componentes de natureza fenólica pertencente ao grupo dos
flavonóides, que apresentam atividade antioxidante.
Os corantes são adicionados aos alimentos por várias razões, que incluem as perdas ou
alterações da cor natural que ocorrem durante o processamento e estocagem, ou ainda por
problemas de matérias-primas de origens diferentes (AZEREDO, 2012). Além disso, se
espera ver nos alimentos, principalmente naqueles processados, uma aparência natural que os
torna atraentes.
Tem havido uma tendência crescente para substituir os tradicionais corantes artificiais,
empregados em alimentos industrializados, pelos corantes naturais, em virtude dos efeitos
nocivos, tal como alergias, apresentados por alguns corantes artificiais (OLIVEIRA, 2005).
Os corantes naturais estão espalhados pela natureza, geralmente nos frutos, nos
vegetais, nas sementes e nas raízes. Estes pigmentos apresentam propriedades físicas e
químicas muito distintas, são sensíveis à oxidação, as mudanças de pH, à luz e apresentando
uma estabilidade muito inferior a dos corantes sintéticos (MEINICKE, 2008).
Muitos dos pigmentos naturais utilizados, inicialmente, com o objetivo de colorir os
alimentos, são fotoquímicos com um elevado poder antioxidante (PEREIRA et al., 2008;
SOUSA et al., 2011). O fato que as reações de oxidação podem estar relacionadas com o
aparecimento de diversas doenças, impulsiona o desenvolvimento de métodos de extração de
corantes naturais e inúmeros investimentos na sua aplicação industrial.
Um grupo de antioxidante bastante estudado é o das antocianinas, pertencentes a um
dos maiores grupos de pigmentos solúveis em água. Esses pigmentos naturais são encontrados
em diversas plantas e, em elevada quantidade, em diversos frutos. Estes compostos são
potentes antioxidantes e apresentam uma forte atividade bioquímica e farmacológica, que
Capítulo 1 - Introdução
3 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
inclui efeitos anticarcinogênicos, anti-inflamatórios e antimicrobianos (SALES, 2013). As
antocianinas que são extraídas de certas plantas e frutos comestíveis são utilizadas como
corantes alimentares. Estas constituem uma das subclasses dos flavonoides, compostos
polifenólicos constituídos por dois anéis de benzeno e um anel central heterocíclico contendo
oxigênio.
A extração dos produtos naturais depende de uma série de fatores, tais como suas
propriedades físico-químicas e a finalidade a que se destina. Por isso existem vários fatores
que influenciam a extração de corantes como: Tamanho da partícula, solvente, temperatura e
pH.
Este trabalho propõe o estudo do processo de extração do corante do fruto da
castanhola (Terminalia catappa Linn) e, o estabelecimento das melhores condições para o
processo de extração do corante, caracterizando o extrato obtido em suas principais
potencialidades. O estudo propõe realizar extrações sólido-líquido por imersão mediante o
controle de parâmetros por planejamento, para se conhecer a influência dos parâmetros no
processo de extração: relação do solvente, temperatura, tempo e pH. Propõe-se ainda
descrever a curva cinética dos compostos fenólicos, antocianinas e a atividade antioxidante no
processo de extração em estudo baseado nas condições de operação ótimas do sistema.
Finalmente o presente trabalho teve por objetivo o estudo da estabilidade do corante visando o
seu armazenamento e a utilização em alimentos.
CAPÍTULO 2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Capítulo 2 – Revisão bibliográfica
5 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
2 - Revisão bibliográfica
2.1 - Castanhola (Terminalia catappa Linn)
A castanhola existe em grande quantidade na região Nordeste. A amendoeira-da-praia
(Terminalia catappa Linn) com origem na Índia e Malásia, também chamada de castanhola, é
uma árvore de grandes dimensões que pode atingir 35 metros de altura. Foi introduzida no
Brasil pelos Portugueses no período de colonização do país e se adaptou em diversos climas.
Esta árvore (Figura 2.1) foi bastante cultivada ao longo do litoral brasileiro. Como é muito
resistente à salinidade e aos efeitos do vento, desenvolve-se bem na areia das praias.
Figura 2. 1- Ávore de castanhola
O fruto da castanhola (Figura 2.2) apresenta uma coloração entre o verde intenso e o
vermelho rubro. Embora seja abundante em algumas regiões, seu consumo in natura é
moderado. As cascas da castanhola são usadas como diurético e as folhas agem como
sudorífico e contra a dor de cabeça (PAWAR et al., 2002).
Capítulo 2 – Revisão bibliográfica
6 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Figura 2. 2 - Fruto da castanhola
2.1.1 - Composição nutricional da castanhola
Alimentos de origem vegetal contêm quantidades significativas de compostos
bioativos, que fornecem benefícios à saúde e são desejáveis além da nutrição básica
(CARTEA et al., 2011).
O consumo de frutas está recebendo uma maior atenção, devido principalmente ao fato
destas apresentarem propriedades funcionais serem reconhecidas como fontes de vitaminas,
minerais e fibras, logo são alimentos nutricionalmente importantes da dieta (MELO et al.,
2008).
Segundo Kuskoski et al. (2006), o consumo de frutas tropicais tem aumentado com o
passar do tempo devido ao valor nutritivo e aos efeitos terapêuticos.
Vizzotto (2013) relata que frutas vermelhas, possuem diferentes grupos de
fitoquímicos e que podem trazer benefícios para a saúde humana quando consumidos como
parte da dieta habitual.
Têm sido desenvolvidas pesquisas envolvendo compostos antioxidantes provenientes
de fontes naturais, devido a sua importância na prevenção de reações oxidativas, já que os
antioxidantes podem agir retardando ou prevenindo a oxidação do substrato envolvido nos
processos oxidativos e, portanto impedindo a formação de radicais livres (BROINIZI et al.
2007). Segundo Cartea et al. (2011) os efeitos benéficos do Brássicas (família de hortaliças)
para a melhoria da saúde têm sido, em parte, atribuídos à fitoquímicos que possuem atividade
antioxidante.
Estudos anteriores têm demonstrado que as frutas são ricas em muitos nutrientes e
compostos antioxidantes, e que esses constituintes se concentram em sua grande maioria nas
cascas e sementes (COSTA et al., 2000; MELO et al., 2008; ABRAHÃO et al., 2010 apud
SOUSA et al., 2011).
A maior parte do efeito antioxidante das frutas é devido, principalmente, à presença de
compostos fenólicos, que têm sido associados com características de sabor e cor dos frutos e
legumes (CARTEA et al., 2011).
Capítulo 2 – Revisão bibliográfica
7 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Existe diferença nos teores de compostos bioativos em espécies de diferentes frutas
vermelhas (VIZZOTTO et al., 2013). Segundo Broinizi et al. (2007) frutas e outros vegetais
contêm substâncias antioxidantes distintas.
Melo et al. (2008) estudaram a habilidade de sequestrar o radical estável 1,1-difenil-2-
picrilhidrazil (DPPH), em diversas frutas tropicais (Figura 2.3), com extratos aquosos e
acetônicos. Foi constatado que todas as frutas estudadas apresentaram capacidade
antioxidante, entretanto a intensidade desta ação foi diferenciada entre elas.
Figura 2. 3 - Capacidade de sequestrar o radical DPPH (%). Fonte: (MELO et al., 2008)
Sousa et al. (2011) disseram que as frutas não são fontes de proteínas, entretanto esse
macronutriente é predominantemente nas cascas e sementes.
Os compostos fenólicos presentes nas plantas estão relacionados, principalmente, com
a proteção, conferindo alta resistência a microrganismos e pragas (ROCHA et al., 2011). Nos
alimentos, estes compostos podem influenciar o valor nutricional e a qualidade sensorial,
conferindo atributos como cor, textura, amargor e adstringência. Na maioria dos vegetais, os
compostos fenólicos constituem os antioxidantes mais abundantes (EVERETTE et al., 2010).
Capítulo 2 – Revisão bibliográfica
8 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Tabela 2. 1 - Composição nutricional dos resíduos de polpas de frutas tropicais. Fonte: Sousa,
et al. (2011)
Resíduo Umidade% Cinzas% Proteína% Lipídios% Carboidratos
totais%
Calorias
(100g)
Goiaba 65,54 ±0,32a 0,72 ±0,02a 2,82 ±0,19a 2,94 ±0,01c 27,98 150
Acerola 83,45 ±0,06b 0,55 ±0,03a 1,65 ±0,26b 3,59 ±0,15d 10,76 82
Abacaxi 88,19 ±0,80b 0,53 ±0,04a 1,05 ±0,01b 0,69 ±0,03a 9,54 49
Graviola 83,16 ±0,83b 0,48 ±0,04a 1,09 ±0,07b,c 2,28 ±0,13b 12,99 77
Bacuri 85,81 ±0,13b 0,65 ±0,28a 0,56 ±0,03b,c 3,84 ±0,02e 9,14 74
Cupuaçu 93,86 ±0,08b 0,20 ±0,12a 1,65 ±0,38c 3,69 ±0,02d 0,6 42
a,b,c,d,e médias, na mesma coluna, seguidas de letras diferentes, diferem entre si pelo teste
de Tukey a 5% de probabilidade.
A composição nutricional dos frutos pode variar em função das condições climáticas,
do solo e do manuseio (Augusta, 2011). A castanhola possui um teor de umidade bem abaixo
em relação às frutas apresentadas na Tabela 2.1. De acordo com a Tabela 2.2 pode-se
observar que a castanhola possui uma quantidade mais elevada de carboidratos e calorias em
relação a outras frutas apresentadas na Tabela 2.1.
Tabela 2. 2 - Composição química (ou nutricional) do fruto da castanhola. Fonte Marques et
al. (2013)
Nutrientes Castanhola
Umidade 17,2 ± 1,13
Lipídios 2,79 ± 0,58
Proteínas 2,30 ± 0,00
Carboidratos 76,88 ± 0,58
Vitamina C (mg.100 g-1
) 0,22 ± 0,00
Valor energético total (TEV) (kcal.100 g-1
) 341,83
Capítulo 2 – Revisão bibliográfica
9 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Tabela 2. 3 - Parâmetros físicos da castanhola. Fonte Marques et al. (2013)
Parâmetros Valores obtidos
Numero de frutos 20
Média do peso dos frutos (g) 19,60 ± 0,00
Polpa (g) 11,24 ± 2,35
Casca (g) 1,08 ± 0,00
Semente (g) 7,28 ± 0,59
Rendimento da polpa (%) 57,34
Porcentagem da casca 5,51
Porcentagem da semente 97,14
Altura (cm) 4,32 ± 0,00
Largura (cm) 3,16 ± 0,00
Espessura (cm) 2,57 ± 0,00
Sólidos solúveis (ºBrix) 8 ± 0,00
De acordo com Huber e Rodriguez-Amaya (2008) a quantidade de flavonóides em
alimentos são determinados geneticamente, entretanto fatores como estação do ano, clima,
composição do solo, estágio de maturação, preparo, processamento e estocagem dos
alimentos podem influenciam nestas concentrações (HUBER e RODRIGUEZ-AMAYA,
2008). Vizzotto (2013) afirma que existe diferença nos teores de compostos bioativos em
diferentes espécies de frutas vermelhas. Nos frutos de castanhola existem diferentes
quantidades de compostos bioativos dependendo da maturação ou em condições climáticas e
de solos diferentes.
Embora os frutos da castanhola não sejam explorados comercialmente, segundo
Marques et al. (2013), estes possuem um elevado teor calórico e podem ser usados como uma
fonte de hidratos de carbono, sendo uma fonte de compostos fenólicos com propriedades
antioxidantes.
Capítulo 2 – Revisão bibliográfica
10 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
2.2 - Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos são substâncias bastante distribuídas na natureza que estão
presentes em vegetais. Estes estão presentes nos alimentos como ácidos fenólicos,
flavonóides, lignanas, estilbenos, coumarinas, e taninos (BERTOLD, 2006).
Segundo Shahidi e Naczk (2004a), os compostos fenólicos também podem agir como
antibióticos, pesticidas naturais, agentes de proteção contra radiação ultravioleta (UV),
materiais isolantes para fazer as paredes das células impermeáveis à água e gás como
materiais estruturais para dar estabilidade plantas.
Desses compostos fazem parte os pigmentos que dão a aparência colorida aos
alimentos, sabor e adstringência, sendo produtos do metabolismo secundário, derivando de
reações de defesa das plantas contra agressões do ambiente (SILVA et al., 2010; SOTO et al.
2011). Segundo Ignat et al. (2011), estes compostos são de grande importância fisiológica e
morfológica em plantas.
Os compostos fenólicos possuem um anel aromático com um ou mais grupos
hidroxilos variando de uma molécula fenólica simples para compostos altamente
polimerizados (BALASUNDRAM et al., 2006; IGNAT et al., 2011).
Os compostos fenólicos obtidos dos vegetais são constituídos de fenóis simples, ácidos
fenólicos (tanto benzóico e derivados do ácido cinâmico), cumarinas, flavonóides, estilbenos,
taninos hidrolisáveis e condensados, lignanas e ligninas (SHAHIDI e NACZK, 2004a).
Várias pesquisas estão sendo feitas para os compostos fenólicos, pois demonstram que
estes compostos possuem a capacidade de capturar radicais livres, e por isso podem prevenir
várias doenças degenerativas.
A atividade antioxidante de compostos fenólicos deve-se principalmente às suas
propriedades redutoras e estrutura química. Segundo Sousa et al. (2007) estas características
desempenham um papel importante na neutralização ou sequestro de radicais livres. Sousa et
al. (2007) ainda afirmam que os intermediários formados pela ação de antioxidantes dos
compostos fenólicos são relativamente estáveis, devido à ressonância do anel aromático
presente na estrutura destas substâncias.
Os compostos fenólicos que ocorrem em alimentos pertencem à família dos
fenilpropanóides (C6-C3) que são derivados de ácido cinâmico (ANGELO e JORGE, 2006).
Estes compostos não estão de forma homogênea nos frutos e vegetais, assim como as classes
e subclasses destes compostos (CRUZ, 2008).
Capítulo 2 – Revisão bibliográfica
11 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Segundo Cartea et al. (2011) estudos recentes sugerem que os vegetais podem ser uma
boa fonte de antioxidantes naturais, devido aos altos níveis de carotenóides, tocoferóis e ácido
ascórbico.
Os compostos fenólicos são derivados metabólicos da fenilalanina que é produzida em
células vegetais (CRUZ, 2008). Por meio da eliminação de uma molécula de amônia, a
fenilalanina se transforma no ácido cinâmico (Figura 2.4), onde é catalisada pela fenilalanina
amonialiase (PAL) (AZEVEDO, 2010). Esta é uma etapa reguladora na formação de vários
compostos fenólicos nos vegetais.
Figura 2. 4 - Metabolismo dos compostos fenólicos em plantas. Fonte: Shahidi e Naczk
(2004a)
Capítulo 2 – Revisão bibliográfica
12 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
2.3 – Flavonóides
Os flavonóides são metabólicos secundários sintetizados pelas plantas (HUBER et al.,
2008). Segundo Kahkonen et al. (1999) os principais subgrupos de flavonóides em frutos são
as antocianinas, flavonóis, e catequinas.
Estes compostos são formados a partir de fenilalanina (Figura 2.4), a condensação de
compostos C3-C6 através da participação de malonil-coenzima A, conduz à formação de
chalconas, e sob condições ácidas, produz flavonóides e isoflavonas, entre outros (SHAHIDE
e NACZK, 2004) (Figura 2.5).
Figura 2. 5: Biossintese dos Flavonoides. Fonte: Shahidi e Naczk. (2004b)
Sugundo Huber e Rodriguez-Amaya (2008) a estrutura dos flavonóides é baseada no
núcleo que consiste de dois anéis fenólicos A e B e um anel C, e que se diferem em dois
grupos: pirano heterocíclico (flavanóis e antocianidinas) e pirona (flavonóis, flavonas,
isoflavonas e flavanonas) que compreendem as principais classes dos flavonóides (Figura
2.6).
Capítulo 2 – Revisão bibliográfica
13 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
As classes de flavonoides que são consideradas as mais importantes são os flavonóis e
as antocianidinas (MARÇO e POPPI, 2008).
Segundo Huber e Rodriguez-Amaya (2008) a atividade biológica dos flavonóides e de
seus metabólitos depende da sua estrutura química e dos vários substituintes da molécula, já
que é possível a estrutura básica sofrer uma série de modificações como a glicosilação,
esterificação, amidação, hidroxilação, que podem alterar a polaridade, toxicidade e
direcionamento intracelular.
Figura 2. 6 - Estruturas químicas dos principais flavonóides. Fonte: Huber e Rodriguez-
Amaya. (2008)
Capítulo 2 – Revisão bibliográfica
14 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
2.4 - Antocianinas
Antocianinas são importantes flavonóides que são responsáveis por apresentarem
cores visíveis ao olho humano presentes nas flores, frutas e folhas desempenhando um papel
importante na sobrevivência fisiológico das plantas (HARBORNE e WILLIAMS, 2000).
Segundo Harborne e Williams (2000), a cor vermelho-púrpura que aparece nas flores
das orquídeas são derivados de cianidina e glicosídeos peonidina, com ligações de açúcares
acilados.
As antocianinas possuem uma estrutura principal chamada de aglicona e tem como
cromóforo básico o 2-fenilbenzopirílio, também conhecido como catião flavílio (Figura 2.7)
(COSTA, 2012).
As antocianinas são classificadas de acordo com o número de moléculas de hidratos de
carbono (ou glicosídeos) ligadas ao cromóforo em monoglicosiladas, diglicosiladas e
triglicosiladas (COSTA, 2012).
Figura 2. 7 - Forma básica das antocianinas. Fonte: Cruz (2008)
As funções que as antocianinas desempenham nas plantas são: ação antioxidante,
proteção à luz, mecanismo de defesa e função biológica (LOPES et al., 2007b)
Segundo Cruz (2008), as antocianinas se apresentam no vegetal mais
predominantemente na forma de mono ou di-glicosídeos, e muito pouco na forma de
agliconas.
As antocianinas são pigmentos naturais e por isso, são responsáveis por uma variedade
de cores nas frutas (Figura 2.8), flores e folhas, que variam do vermelho ao azul (SANTOS et
al., 2014). Enquanto que as chalconas e flavonas são amarelos. Essas cores variam de acordo
com as ligações feitas no anel “B” nos radiais R1 e R2 (Figura 2.8).
Capítulo 2 – Revisão bibliográfica
15 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Shahidi e Naczk (2004b) também relatam que as antocianinas são pigmentos solúveis
em água.
Figura 2. 8 – Estrutura química das antocianinas Fonte: Bobbio e Bobbio (1995)
2.5 – Estabilidade das antocianinas
A utilização de antocianinas na indústria de alimentos é bastante restrita devido à sua
baixa estabilidade. Segundo Schmitz (2014) a instabilidade das antocianinas está associada a
composição inicial do fruto como enzimas, íons metálicos, ácido ascórbico, dióxido sulfúrico,
açúcares e copigmentos. Sendo os principais fatores da estabilidade das antocianinas são as
influências como a copigmentação, temperatura, luz e pH. A interação entre estes fatores
também pode afetar a estabilidade (FAVARO, 2008).
2.5.1 - Copigmentação
Segundo Stringheta e Bobbio (2000), nos vegetais o pH se encontra na faixa
ligeiramente ácida para neutra e por isso seria impossível que as antocianinas estejam
coloridas se considerarmos que a coloração das antocianinas são apenas em função do pH. A
presença de compostos chamados copigmentos pode ser um dos fatores que determinem a
estabilidade de antocianinas em pH neutro.
Capítulo 2 –Revisão Bibliográfica
16 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Stringheta e Bobbio (2000), também relata que os flavonóides não antociânicos,
alcalóides, aminoácidos e nucleosídeos, entre outros, podem atuar como copigmentos e a
própria antocianina pode agir copigmentando outra antocianina.
2.5.2 - pH
O pH tem grande influência na estabilidade das antocianinas. Segundo Falcão (2006) a
estrutura das antocianinas em meio ácido são determinadas por uma substituição no anel B da
aglicona. Assim, com o aumento do grau de metoxilação, a cor vermelha é intensificada. Já
um maior grau de hidroxilação a intensidade da cor azul é aumentada.
Lopes et al. (2007)b relatam que as antocianinas em solução aquosa são encontradas
com diferentes estruturas químicas e em equilíbrio. Estas estruturas estão na forma de cátion
flavilio, de cor avermelhada, base anidra quinoidal possuem cor azul, pseudo-base carbitol
sendo incolor, e a chalcona que varia do incolor a levemente amarelado (XAVIER, 2004).
Segundo Março e Poppi (2008), a característica importante das antocianinas é o fato
de, em soluções aquosas, estas apresentam diferentes estruturas em função do pH. A Figura
2.9 apresenta as diferentes estruturas químicas das antocianinas em função da mudança do
pH.
Em um pH abaixo de 2 (ácido) as antocianinas estão na forma do cátion flavílico
(AH+), mas com o aumento do pH ocorre uma desprotonação formando uma estrutura
chamada de pseudobase carbinol (B) (XAVIER, 20040; MARÇO e POPPI, 2008).
Março e Poppi (2008) relatam que, com o aumento do pH, as antocianinas perdem a
cor até se tornarem incolores em pH aproximadamente igual a 6, devido o pseudobase
carbinol (B) ser predominante. Março e Poppi (2008) também afirmam que em um pH acima
de 6,0, as duas estruturas: pseudobase carbinol(B) e anidrobase quinoidal (A) podem formar a
espécie cis-chalcona (CC) e que quando se aumenta, de forma brusca, o valor do pH a
Anidrobase Quinoidal(A) tende a formar a Anidrobase Quinoidal Ionizada(A-).
Segundo Heredia et al. (1998) com o aumento da temperatura o equilíbrio se desloca
na direção da formação da base chalcona.
As antocianinas são solúveis em água e a acidez influi na cor, por causar mudanças na
estrutura química (AUGUSTA, 2011) como pode ser observado na Figura 2.9.
Capítulo 2 –Revisão Bibliográfica
17 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Figura 2. 9 - Possíveis mudanças estruturais das antocianidinas em meio aquoso em função do
pH. Fonte: Março e Poppi (2008)
A cor das antocianinas é diretamente influenciada pela substituição dos grupos
hidroxila e metoxila na molécula (XAVIER, 2004). Segundo Bridle e Timberlake (1997)
quando um ou mais grupos acilas estão presentes na molécula da antocianina, estes tendem a
dificultar a hidrólise do cátion flavilium, de coloração vermelha, formando a base carbinol,
sendo incolor, permitindo a formação da base quinoidal que possui coloração azul.
Segundo Xavier (2004), o aumento de grupos hidroxilas na molécula tendem a tornar a
coloração azul e aumentos do número de grupos metoxilas aumentam a intensidade do
vermelho.
Capítulo 2 –Revisão Bibliográfica
18 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
2.5.3 - Temperatura
A temperatura é um fator importante na degradação destes pigmentos. Brouillard e
Dubois (1977) relataram que o aumento da temperatura favorece à formar a chalcona, que e
incolor, a partir do carbinol.
A estabilidade das antocianinas frente à temperatura é influenciada pelo grau de
acilação (LOPES et al., 2007). Um estudo feito por Falcão (2006) em um sistema modelo de
geleia de uvas, mostrou que no processamento a 45ºC não houve diferença significativa na
concentração de antocianinas depois do processo.
Malacrida e Motta (2006) relatam que existem evidências que a principal causa da
perda de cor seja a hidrólise glicosídica das antocianinas, pois a velocidade da liberação do
açúcar é proporcional à velocidade da perda da cor vermelha.
2.5.4 - Luz
A luz é um dos principais fatores de degradação das antocianinas. Segundo Malacrida
et al. (2006) as antocianinas são instáveis à luz visível e ultravioleta, ou até mesmo fontes de
radiação ionizante.
Extratos de antocianinas são mais estáveis sob proteção da luz quando comparados
àqueles que permaneceram expostos à luz. A radiação UV interage no extrato de maneira a
facilitar reações como, por exemplo, copigmentação com outros compostos presentes
alterando a estabilidade das antocianinas, além de favorecer a formação de produtos de
degradação oxidativa das antocianinas que possuem coloração marrom (FAVARO, 2008).
Segundo Nachtigallo et al. (2010) em um estudo do impacto da luz na estabilidade das
antocianinas constataram que o efeito da luz foi bastante destrutivo para a cor das
antocianinas, principalmente em pH 4,0.
2.6 - Ação antioxidante
Os compostos fenólicos encontrados em plantas possuem vários efeitos biológicos,
entre elas a atividade antioxidante (KAHKONEN et al., 1999). Os ácidos fenólicos são
compostos fenólicos primários responsáveis pela ação antioxidante. Bernardes (2014) relata
que alguns fitoquímicos, tais como flavonoides, ácidos fenólicos, alcalóides, esteróides e
Capítulo 2 –Revisão Bibliográfica
19 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
saponinas foram descritos na literatura com potencial antioxidante, ou seja, com capacidade de
sequestrar ou neutralizar espécies reativas de oxigênio e/ou nitrogênio.
Segundo Sucupira et al. (2012), os compostos fenólicos são poderosos antioxidantes,
pois atuam combatendo os radicais livres através da doação de um átomo de hidrogênio de um
grupo hidroxila (OH), isto porque através da sua estrutura aromática possui a capacidade de
suportar um elétron desemparelhado através do deslocamento deste ao redor de todo o sistema
de elétrons da molécula e assim interrompendo a reação de propagação dos radicais livres.
Frankel (1980) apresentou o mecanismo da ação antioxidante (Equação 2.1).
𝑅𝑂𝑂∙ + 𝐴𝐻 → 𝑅𝑂𝑂𝐻 + 𝐴∙ (2.1)
Sendo: 𝑅𝑂𝑂∙– radical livre;
𝐴𝐻 – antioxidante com um átomo de hidrogênio ativo;
𝐴. – radical inerte.
O átomo de hidrogênio ativo presente no antioxidante é afastado pelo radical livre
(𝑅𝑂𝑂∙) formando uma espécie inativa (𝑅𝑂𝑂𝐻) e um radical inerte (𝐴∙) procedente do
antioxidante, logo estabilizado por ressonância, não tendo a capacidade de iniciar reações
de oxidação.
Segundo Frankel (1980) o processo de inibição dos compostos fenólicos está na
facilidade de doar um átomo de hidrogênio.
2.7 - Extração sólido-líquido por imersão
A extração tem como objetivo retirar dos materiais orgânicos ou inorgânicos as
substâncias de interesse. Para cada substância a ser extraída há um tipo de extração, pois o
caráter das substância pode variar. O método de extração vai depender da proposta de
aplicação, para uma aplicação industrial, será considerado um método simples, rápido, custo
baixo e que utilize solventes extratores de baixa toxicidade (FAVARO, 2008).
Existem diversas técnicas de extrações que têm sido desenvolvidas para melhorar o
isolamento e produção de compostos bioativos de origem vegetal. Os métodos mais utilizados
são as extrações sólido-líquido que podem ser realizadas por percolação ou imersão.
Capítulo 2 –Revisão Bibliográfica
20 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
A extração sólido-líquido é utilizada para se obter determinados compostos de
materiais diferentes, tais como sedimentos, solos, polímeros, bactérias, fungos, algas e de
microalgas, e mais comumente de plantas. (HATTAB et al., 2007). Nessa extração os
componentes de uma fase sólida podem ser separados a partir de um dissolução da parte
solúvel do sólido por meio de um solvente apropriado.
A extração sólido-líquido por imersão normalmente é utilizada para separar compostos
bioativos de produtos vegetais. A extração desses compostos é influenciada pela natureza
química, o método de extração utilizado, o tamanho da partícula, o tempo e as condições de
armazenamento, assim como a presença de substâncias interferentes (AZEVEDO, 2010). A
identificação e isolamento de compostos bioativos em fontes naturais, como frutas, é
necessária a realização da extração com solventes orgânicos (ANDREO et al., 2006).
Os grãos do material orgânico quando colocados em contato com o solvente ocorre
uma troca contínua entre o composto a ser extraído. Neste processo é necessário uma agitação
para garantir que o solvente localmente saturado seja substituído pelo solvente (OETTERER,
REGITANO D´ARCE, SPOTO, 2006).
O rendimento da extração pode ser influenciado por fatores como: o tamanho da
partícula, o solvente, temperatura e a agitação. Na extração de substâncias antioxidantes com
solventes orgânicos pode ser eficiente para alguns casos e exige controle de alguns fatores
como, a polaridade do solvente, o tempo e a temperatura de extração, pois podem ocorrer
perda ou destruição dos compostos antioxidantes (ANDREO, 2006). As antocianinas são
compostos bastantes solúveis em água e podem ser facilmente extraídas com solventes
polares (CARDOSO, 2011). Segundo Hattab et al. (2007), o processo para extração de
compostos antioxidantes é normalmente realizado a partir da matéria-prima com diferentes
solventes, com o objetivo de otimizar a extração dos compostos de interesse.
Alguns dos solventes bastante utilizados nos processos de extração são o hexano, éter,
clorofórmio, acetonitrilo, benzeno, acetona, metanol, e etanol e são comumente usado em
diferentes proporções com água.
2.8 - Solvente
Os compostos fenólicos podem ser extraídos de vegetais e plantas. Existem diversos
métodos para a extração destes compostos em frutas e vegetais utilizando solventes orgânicos.
Os solventes mais utilizados para estas extrações são água, etanol, metanol e acetona. O
Capítulo 2 –Revisão Bibliográfica
21 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
metanol é pouco utilizado pela indústria de alimentos por ser impróprio para o consumo, já
que é um solvente bastante toxico.
Não existe um sistema perfeito de extração para o isolamento de todos os compostos
bioativos, Andreo (2006) relata que há uma grande diversidade de compostos que podem
fazer interações formando complexos entre eles.
As antocianinas são compostos bastante solúveis em água e podem ser facilmente
extraídas com solventes polares (CARDOSO, 2011). O etanol é bastante utilizado como
solvente, já que não é toxico.
Lopes et al. (2007) relata que o recomendado é usar ácidos fracos para as extrações,
como o ácido cítrico. O ácido clorídrico diluído é o mais efetivo, contudo é corrosivo e
prejudicial para a saúde humana por isso não pode ser empregado para fins alimentícios. É
comum a utilização de solventes acidificados, pois auxilia a penetração do solvente nos
materiais orgânicos, além de aumentar a estabilidade dos extratos e assim favorecem a
extração (FAVARO, 2008).
Segundo Favaro, (2008) é necessário o cuidado na adição dos ácidos nos solventes
para a extração de antocianinas, pois o excesso de ácido pode levar à formação de
antocianidinas e outros flavonóides por hidrólise, então gerar resultados superestimados da
quantidade total de antocianinas presentes no material extraído.
A extração de substâncias antioxidantes com solventes orgânicos pode ser eficiente
para alguns casos e exige controle de alguns fatores como, a polaridade do solvente, o tempo
e a temperatura de extração, pois podem ocorrer perda ou destruição dos compostos
antioxidantes (ANDREO, 2006).
Na Tabela 2.4 são apresentados alguns estudos, em que utilizam diferentes solventes e
as condições de operação das extrações realizadas, seguidos dos compostos obtidos a partir
dessas condições. É necessária a realização da extração com solventes de diferentes
polaridades para a identificação e isolamento de compostos bioativos em fontes naturais.
Capítulo 2 –Revisão Bibliográfica
22
Tabela 2. 4 - Estudos publicados sobre a utilização de solventes na extração e as condições de
operação para a recuperação de compostos bioativos naturais. Fonte: Gil-Ch´avez et al. (2013)
Solvente e condições
de operação Material
Composto
de interesse
Rendimento da
extração Referencia
Etanol acidificado,
ácido tartárico e
ácido málico, 1,25%
v/v, 40 ºC, 60-80 min
Casca de berinjela Antocianinas 65,79–76,44 mg/100 g
de casca Todaro et al., 2009
Decano e decano 190
mM CH2Cl2
Microalga: Dunaliella
salina β-Caroteno 345±5 μg/mL Mojaat et al., 2008
Etanol 68%, 55 ºC,
sólido-líquido de
32,7 mL / g
Cascas Pajang
Mangifera fenólicos 12,9 mg GAE/g
Nagendra et al.,
2011
Acetona: água 50%
v/v, 2 horas, 60ºC
Refosk bagaço de
uvas.
Fenólicos e
antocianinas
16,7 mg GAE / g e 0,74
mg / g de material seco Vatai et al., 2008
Etanol, acetato de
etilo e acetona, 20-
60ºC, 2 h
Sabugueiro (EB) e 3
variedades de bagaço
de uva vermelha
(RGM): Refosk,
Merlot, e Cabernet
Fenólicos e
antocianinas
EB: 60,6 mg GAE / g
RGM: 17,3-20,2
mg GAE/g de material
seco EB:
0,5-1,2 mg/g RGM: 10,5
mg/g de
material seco para
antocianinas
Vatai et al., 2009
Metanol, etanol,
acetona, água
acidificada, ou
misturas (1:1, v/v). 1
ou 120 min, pH 3 ou
8, 22 ou 55ºC
Cascas de banana a
partir de 2 cultivares
(Grande Naine e
Gruesa) Subproduto
Fenóis totais
e
antocianinas
3,1-3,8 GAE/100 g e 434
ug c-3-gE/100 g de
material seco
(Gonz´alez-
Montelongo
et al., 2010)
Acetona a 50%, de
solventes para-sólido
proporção de 20
mL/g, 35-36ºC e
100-102 min
Parkia speciosa
vagem de agro-
resíduos
Fenólicos
totais e
flavonóides
668 mg GAE / 100 g e
49,6 mg pirocatecol E /
100 g
(Gan e Latiff,
2010)
mg GAE/100 g: miligramas de acido gálico equivalentes a 100 g de extrato.
mg CE/100 g: milligramas de catechin equivalentes a 100 g de extrato.
PLE, Extração liquido pressurizado; SE, solvente extração.
Capítulo 2 –Revisão Bibliográfica
23
2.9 - Metodologia da superfície de resposta
O planejamento fatorial, associados à análise de superfície de resposta, é uma
ferramenta estatística, que fornece informações seguras sobre o processo (Lopez, Jiménez,
Vargas, 2007).
A metodologia de superfície de resposta baseia-se na construção de modelos
matemáticos empíricos que geralmente empregam funções polinomiais lineares ou
quadráticas para descrever o sistema estudado (SANTO et al., 2008). Usa-se a análise de
superfície de resposta quando as variáveis de resposta são influenciadas por muitas variáveis
independentes.
A superfície de resposta pode ser representada pelo modelo matemático apresentado
na Equação (2.2).
�̂� = 𝛽𝑜 + 𝛽1𝑥1 + 𝛽2𝑥2 + 𝛽3𝑥3 + 𝛽4𝑥4 + 𝛽12𝑥12 + 𝛽13𝑥13 + 𝛽14𝑥14 + 𝛽23𝑥23 + 𝛽24𝑥24
+𝛽34𝑥34 (2.2)
Em que:
�̂� é o valor experimental do composto a ser estudado;
𝛽𝑖 são os parâmetros do modelo em função dos fatores
𝑥𝑖 são os fatores
2.9.1 - Análise da variância
O modelo matemático obtido pode não ser exatamente aquele que descreve a região
estudada do sistema, assim não pode ser usado para fazer estimativas para deslocamento e
muito menos para extrair conclusões (TEÓFILO e FERREIRA, 2006). Logo, é necessário
avaliar a qualidade do ajuste deste modelo. Esta avaliação é determinada com o emprego da
análise de variância (ANOVA).
O exame dos resíduos é fundamental, para a avaliação a qualidade do ajuste de
qualquer modelo (BARROS NETO et al., 2010). Sendo que o valor dos resíduos deve ser
pequenos.
Para se avaliar a qualidade do ajuste é necessário calcular os valores de Fcalc através
dos valores obtidos a partir da tabela ANOVA e assim comprovar se o modelo é adequado
(Tabela 2.5).
Capítulo 2 –Revisão Bibliográfica
24
Tabela 2. 5 - Análise de variância para o ajuste do modelo matemático através da tabela
ANOVA. Fonte: Azevedo (2010)
Fonte de Variação
Soma
Quadrática
Média
Quadrática Fcal
Regressão 𝑆𝑄𝑅 𝑀𝑄𝑅 𝑀𝑄𝑅
𝑀𝑄𝑟
Resíduo 𝑆𝑄𝑟 𝑀𝑄𝑟
Falta de Ajuste 𝑆𝑄𝑓.𝑎𝑗. 𝑀𝑄𝑓.𝑎𝑗.
𝑀𝑄𝑓.𝑎𝑗.
𝑀𝑄𝑒𝑝
Erro puro 𝑆𝑄𝑒𝑝 𝑀𝑄𝑒𝑝
Total 𝑆𝑄𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙
% da variação explicada
𝑆𝑄𝑅
𝑆𝑄𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙
% máxima da variação
explicável
𝑆𝑄𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 − 𝑆𝑄𝑒𝑝
𝑆𝑄𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙
Para o modelo ser satisfatório é necessário realizar a análise dos valores de Ftab, onde
se 𝑀𝑄𝑅 𝑀𝑄𝑟⁄ > Ttab o modelo linear é satisfatório sendo então significativo. Se 𝑀𝑄𝑅 𝑀𝑄𝑟⁄ <
Ttab o modelo é preditivo. Sendo o modelo significativo e preditivo o R2 também será
satisfatório. O valor máximo de R2 é igual 1. Isto só ocorre se não houver resíduo nenhum e
toda a variação em torno da média for explicada pela regressão (BARROS NETO et al.,
2010). Portanto quanto mais próximo de 1 for o valor de R2, melhor terá sido o ajuste do
modelo em relação às variáveis respostas.
O R2 (coeficiente de determinação do modelo) fornece uma medida da proporção da
variação explicada pela equação de regressão em relação à variação total das respostas
(RODRIGUES et al., 2009). Ou seja, fornecer uma medida da qualidade do ajustamento da
reta de regressão à nuvem de pontos.
CAPÍTULO 3
MATERIAIS E MÉTODOS
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
26 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
3 – Materiais e Métodos
Neste item o projeto será dividido em etapas. A primeira etapa irá tratar da otimização
da extração dos compostos bioativos do fruto da castanhola, utilizando o planejamento
experimental; a segunda será o estudo cinético do processo de extração e a última etapa será
sobre os estudos na estabilidade do fruto da castanhola.
3.1 - Matéria-prima
Os frutos da castanhola in natura utilizados neste trabalho foram obtidos no Campus
Universitário da UFRN, colhidos manualmente durante seu período de safra, nos meses de
dezembro a março de 2013 e em novembro de 2014.
3.2 - Obtenção do corante por extração sólido-líquido
As etapas desenvolvidas para extração do corante encontram-se descritas no
fluxograma apresentado na Figura 3.1 e serão descritas a seguir.
Figura 3. 1 - Fluxograma do processo de extração do corante
Castanhola
Seleção do fruto
Obtenção da Polpa
Secagem e moagem
Análise granulométrica
Planejamento experimental
Extração
Análises
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
27 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
3.2.1 – Seleção do fruto e obtenção da polpa
Os frutos de castanhola in natura depois de obtidos foram lavados em água corrente e
então selecionados de acordo com a cor e o grau de maturidade. Em seguida foram
descascados para a retirada da polpa. A casca e o caroço foram desprezados.
3.2.2 – Secagem e moagem e análise granulométrica
Os frutos de castanhola foram submetidos à secagem em uma estufa com ventilação
(Marco, modelo MA033) a uma temperatura de 70ºC por 1 hora. Segundo Malacrida e Motta
(2006), processos utilizando baixo tempo em altas temperaturas têm sido recomendados para
melhor retenção dos pigmentos.
Após a secagem, as amostras foram trituradas e então foi realizado a análise
granulométrica do material. Esta foi feita em peneiras vibratórias (Bertel, série Tyler 12.11).
Foram analisadas abertura, por polegada linear das peneiras de 10, 24, 32 e 48 mesh, com
duração de 10 minutos e intensidade de vibração 4. O pó que estava retido nas peneiras foi
utilizado para calcular o diâmetro médio das partículas através do cálculo do diâmetro de
Sauter de acordo com a Equação (3.1).
𝑑𝑝𝑠 =1
∑𝑥𝑖𝑑𝑖
(3.1)
Depois o pó foi acondicionado em potes plásticos brancos e opacos, de forma que não
recebessem luz, e foi refrigerado até o momento de ser utilizadas. O pó é apresentado na
Figura 3.2.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
28 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Figura 3. 2 - Pó da castanhola pronta para a extração
3.2.3 - Planejamento Experimental
A extração foi realizada variando: temperatura, porcentagem do etanol, tempo e pH
sendo aplicado o planejamento experimental de acordo com esses parâmetros. Para o solvente
foi escolhido um sistema binário de água e etanol representado por porcentagem de etanol. O
etanol foi o solvente escolhido para as extrações por não ser tóxico e o mais indicado para
aplicação para fins alimentícios.
O planejamento fatorial consiste, em selecionar um número fixo de níveis nos quais
cada variável investigada varia em todas as combinações possíveis umas com as outras
(LOPES et al., 2007a). Os resultados obtidos são aplicados ao planejamento fatorial,
fornecendo os efeitos das variáveis em relação a variável resposta. Assim o uso do
planejamento determina as variáveis mais importantes que influenciam no processo de
extração.
Os valores dos fatores foram escolhidos a partir de testes realizados anteriormente,
para estabelecer as condições operacionais, para um melhor rendimento dos extratos. Um
planejamento com maiores valores de água no solvente não obteve condições necessárias para
a realização do planejamento, pois o modelo não era adequado para as condições de operação.
O planejamento foi realizado a partir de dois níveis e 4 pontos centrais conforme é
apresentado na Tabela 3.1.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
29 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Tabela 3. 1 - Planejamento experimental 24 (4 fatores e 2 níveis)
Níveis
Fatores -1 0 1
Temperatura (ºC) 25 37,5 50
Porcentagem do etanol 50 62,5 75
Tempo (min) 10 20 30
pH 3,5 5,5 7,5
Ensaio Temperatura Etanol % Tempo pH
1 + + + +
2 - + + +
3 + - + +
4 - - + +
5 + + - +
6 - + - +
7 + - - +
8 - - - +
9 + + + -
10 - + + -
11 + - + -
12 - - + -
13 + + - -
14 - + - -
15 + - - -
16 - + - -
17 0 0 0 0
18 0 0 0 0
19 0 0 0 0
20 0 0 0 0
3.2.4 – Extração sólido-líquido por imersão
Para a extração foram utilizados 8 g de pó para cada extração com 80 mL de solvente
de acordo com os níveis (superior e inferior), que representam a porcentagem do solvente,
para cada ensaio.
O pó foi submetido à extração sólido-líquido em um reator por agitação mecânica
acoplado onde foi realizado o controle dos parâmetros: temperatura, pH, porcentagem de
etanol e tempo.
Esta extração possui um mecanismo simples de baixo custo. A Figura 3.3 apresenta o
os aparelhaem utilizada para a extração. O material a ser extraído é agitado em uma
velocidade de 12 rpm, previamente estabelecida, em um reator enjaquetado (Sulglass). O
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
30 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
reator é acoplado em um banho termostático (Tecnal, série TE – 184) onde ocorre
recirculação de água a uma temperatura constante.
Figura 3. 3 - Reator enjaquetado acoplado a um banho termostático
A extração sólido-líquido é uma operação unitária que basicamente se resume na
separação de um ou mais componentes de uma mistura sólida através de um solvente líquido.
Neste processo ocorrem as seguintes etapas: contato do solvente com o sólido, que lhe cede o
componente solúvel; separação da solução do sólido remanescente por filtração para
recuperação do soluto dissolvido no líquido extrator (FELLOWS, 2006).
3.2.5 – Análises do extrato
Após a realização do experimento, as amostras foram retiradas e levadas às análises de
compostos fenólicos totais, antocianinas monoméricas totais e atividade antioxidante.
3.2.5.1 - Determinação de Compostos fenólicos totais (CFT)
O teor de compostos fenólicos totais foi determinado segundo a metodologia descrita
por Cheplick et al., (2010). A metodologia consiste em colocar em um tubo de ensaio 1 mL
do extrato, 1 mL de etanol 95%, 5 mL de água destilada e 0,5 mL do reagente Folin-
Ciocalteau. A solução é homogeneizada e deixada em repouso durante 5 minutos. Após este
tempo adiciona-se à solução 1 mL de Na2CO3 5% e mantem-se em câmara escura por 60
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
31 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
minutos. Após o tempo determinado, homogeneízam-se as amostras novamente e medem-se
suas absorbâncias no comprimento de onda de 725 nm contra branco, constituído apenas de
solução etanoica 95%. Estas medidas expressam os resultados de compostos fenólicos em
miligramas equivalentes de ácido gálico (GAE) por 100g de pó. Para isto utilizou-se uma
curva de calibração (Figura 6.1), apresentada no Apêndice, construída a partir de diferentes
concentrações de ácido gálico.
Os reagentes necessários foram preparados da seguinte maneira: Para o reagente
Folin-Ciocalteau mediu-se 25 mL do reagente que foi dissolvido com 25 mL de água
destilada. Foi preparado apenas o necessário para os experimentos semanais para não
ultrapassar a sua validade. O reagente foi conservado sob refrigeração e em ausência de luz. A
solução de Carbonato de sódio 5% foi preparada pesando 5g de Na2CO3 e diluído em água
destilada, completando o volume em um balão de 100 mL.
3.2.5.2 – Determinação da Atividade antioxidante (AA) pelo sequestro do radical DPPH·
O método mais utilizado para se determinou-se a atividade antioxidante é apresentado
por Brand-Williams et al. (1995) e consiste em avaliar a atividade sequestradora do radical
livre DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) por antioxidantes. Por ação de um antioxidante
(AH) ou uma espécie de radical (R-), o DPPH é reduzido, formando o difenil-picril-hidrazina.
Isto ocasiona o desaparecimento da absorção, podendo a mesma ser monitorada pelo
decréscimo da absorbância a 515 nm. Rezende (2010) relata que o método DPPH possui
vantagens como: poder avaliar grande quantidade de amostras em um curto período de tempo;
o método é sensível e detecta pequenas concentrações do ativo contido na amostra; permite
avaliar antioxidantes lipofílicos, isto porque o solvente do processo é metanol ou etanol.
A partir dos resultados obtidos determina-se a porcentagem de atividade antioxidante
(sequestradora de radicais livres) ou a porcentagem de DPPH remanescente no meio
reacional.
A porcentagem de atividade antioxidante corresponde à quantidade de DDPH·
consumida pelo antioxidante. A quantidade de antioxidante necessária para decrescer a
concentração inicial de DPPH em 50% é denominada concentração eficiente (CE50), também
chamada de concentração inibitória (CI50). Quanto maior o consumo de DPPH por uma
amostra, menor será a sua CE50 e maior a sua atividade antioxidante (SOUSA et al., 2007).
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
32 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Preparou-se uma solução metanólica de 0,004 g de DPPH em 100 mL de álcool
metílico, sendo homogeneizado e transferido para um frasco de vidro âmbar, devidamente
etiquetado.
O decaimento da absorbância das amostras (Aamostra) correlacionado ao decaimento da
absorbância do controle (Acontrole), resultando na porcentagem de sequestro de radicais livres
(%SRL), que pode ser expresso através da Equação (3.2):
% 𝑆𝑅𝐿 = 𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 −𝐴𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒
× 100 (3.2)
A curva de calibração foi estabelecida conforme o procedimento a seguir. Após
realizar a extração do corante, uma amostra de 0,3 mL era retirada e adicionada a 1,7 mL do
reagente em um frasco de eppendorf. Para o controle o procedimento foi repetido trocando o
extrato por metanol. Para o branco foram adicionados em um eppendorf 2 mL de metanol.
Aguardando-se 30 min em uma câmara escura. Foram realizadas leituras das absorbâncias em
um espectrofotômetro no comprimento de onda de 517 nm.
Uma curva de calibração (Figura 6.2), apresentada no Apêndice, foi construída a partir
de diferentes valores da concentração do extrato.
Os resultados para a atividade antioxidante foram expressos em grama de
concentração inibitória (IC50).
3.2.5.3 – Determinação de antocianinas monoméricas totais (AMT)
O método diferencial baseia-se nas mudanças de absorbância resultantes da variação
do pH das soluções e no fato das características espectrais dos produtos de degradação não
serem alteradas por mudanças no pH (MALACRIDA e MOTTA, 2006). O conteúdo de
antocianinas monoméricas e poliméricas foi determinado pelo método do pH diferencial
descrito por Giusti e Wrolstad (2001). As antocianinas, em pH baixo, encontram-se
predominantemente na forma de cátion flavílico, apresentando coloração vermelha em
solução aquosa. Em pH alto, esse cátion é convertido em outras espécies incolores.
Cada extrato foi diluído, tanto em tampão cloreto pH = 1,0 quanto em tampão acetato
pH = 4,5, de acordo com o valor do fator de diluição (FD) previamente calculado (FD = 10,
ou seja, 2 mL de amostra / 0,2 mL extrato). Sendo assim, será adicionado 1,8 mL de cada
tampão em 0,2 mL de extrato, homogeneizados em agitador e deixados a temperatura
ambiente e na ausência de luz por 30 minutos. Ao término desse período, a absorbância foi
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
33 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
medida no comprimento de onda do visível, em 510 nm e 700 nm de acordo com o método de
Giusti e Wrolstad (2001). O comprimento a 510 nm é a máxima absorbância para a
identificação das antocianinas e a 700 nm é usado para corrigir o espalhamento de luz
produzido por uma possível turbidez da amostra (AZEVEDO, 2010). Foi utilizado o mesmo
procedimento para o preparo do branco, sendo substituído o extrato por 0,2 mL de H2O
destilada. Todas as medidas foram realizadas em triplicatas para cada amostra.
Em seguida determinou-se a absorbância resultante (A) pela Equação (3.3), partindo-
se das leituras das soluções obtidas.
𝐴 = (𝐴510 − 𝐴700)𝑝𝐻1,0 − (𝐴510 − 𝐴700)𝑝𝐻4,5 (3.3)
O calculo da concentração das antocianinas nos extratos foi realizado de acordo com a
Equação (3.4).
𝐶 =(𝐴×𝐹𝐷×𝑀𝑀×1000)
(𝜀×𝑏) (3.4)
em que:
C é a concentração de antocianinas (mg / L);
A é a absorbância;
FD é o fator de diluição utilizado;
MM é a massa molar do padrão (g / mol);
ɛ é o coeficiente de absortividade molar do padrão (L / cm.mol);
b é o caminho óptico ( a espessura da cubeta utilizada para leitura no espectrofotômetro) (cm).
Para o procedimento foram preparados o tampão KCl (pH 1,0) pela pesagem de 1,86 g
de KCl e diluição em 980 mL de água destilada. Foi ajustado o pH desejado da solução com
HCl (37%), em seguida a solução foi transferida para um balão de 1 L que teve seu volume
completado com água destilada.
Também foi preparada a solução tampão CH3COONa (pH 4,5) pesando-se 54,43 g de
CH3COONa, e que foram diluídos em 960 mL de água destilada. Ajustado o pH desejado da
solução com HCl (37%), a solução foi transferida para um balão de 1 L e completado o seu
volume com água destilada.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
34 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
3.3 – Estudo cinético do processo de extração
Para o estudo cinético foram realizados ensaios em que se acompanhou a concentração
ao longo do tempo.
Os ensaios foram realizados utilizando 8 g de pó de castanhola com 80 mL do
solvente. A proporção de água e etanol foi obtida a partir dos resultado do planejamento
realizado anteriormente para cada composto analizado. O estudo foi realizado com extrações
em batelada a cada 20 minutos, avaliando os teores dos compostos fenólicos, antocianinas e a
atividade antioxidante.
As condições de extração foram realizadas a partir das condições ótimas obtidas no
planejamento fatorial 24
dos melhores valores obtidos nas extrações de compostos fenólicos,
antocianinas e atividade antioxidante.
Os ensaios realizados foram então analisados em espectrofotômetro, seguindo as
metodologias citadas no item 3.2.5.
3.4 - Estudos da estabilidade das antocianinas nos extratos
Foram feitos estudos de estabilidade no extrato do fruto de castanhola em relação a
temperatura (25°C e 60°C), concentração do extrato (30% e 50%) e pH (3 e 6). As amostras
foram diluídas com concentrações diferentes de extrato em duas soluções tampão. Para o pH
igual a 3 foi utilizado a solução tampão de KCl e para o pH igual a 6 foi utilizado uma
solução tampão de KH2PO4.
O extrato foi obtido a partir de uma extração sólido-liquido por imersão, utilizando 30
g de pó de castanhola com 300 ml de solvente. As condições de operação (%Etanol,
temperatura, pH e tempo) foram obtidas a partir dos dados do planejamento experimental.
As concentrações de extratos foram realizadas de acordo com Chigurupati et al. (2002)
da seguinte maneira: utilizou-se um volume total de 100 mL para cada amostra. Para as
amostras com concentrações de 30% foram adicionados em dois elermeyers 30 mL de extrato
e 70 mL de cada solução tampão. Para a concentração de 50% foram adicionados 50 mL de
extrato e 50 mL da solução tampão. Para cada concentração foram alternados os tampões de
pH 3 e 6. Foram preparadas um total de 8 amostras. Metade das amostras (Figura 3.6) foram
mantidas em um shaker com velocidade de agitação de 80 rpm a 25°C em um período de 5
dias. A outra metade foi colocada em outro shaker com temperatura de 60°C com agitação de
80 rpm por 5 dias.
Capítulo 3 – Materiais e Métodos
35 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Figura 3. 4 – Extratos com concentrações de 50 e 30% com as soluções tampão de
KH2PO4(pH = 6) e KCl(pH = 3).
No estudo da estabilidade foram feitas análises para a queda do teor de antocianinas
monoméricas em 5 dias.
Método espectrofotométrico foi utilizado para determinar o teor de antocianinas
monoméricas.
O resultado foi expresso pela porcentagem da queda do teor de antocianinas
monoméricas totais presentes ao final do estudo.
O calculo da queda do teor de antocianinas é realizado pela equação (3.5).
%𝐶𝑓 =𝐶𝑓×100
𝐶𝑖 (3.5)
Em que:
%𝐶𝑓 - Porcentagem da concentração final de antocianinas monoméricas totais.
𝐶𝑓 - Concentração final de antocianinas monoméricas totais.
𝐶𝑖 - Concentração inicial de antocianinas monoméricas totais.
CAPÍTULO 4
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Capítulo 4 – Resultados e discussões
37 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
4 - Resultados e discussões
No presente capítulo serão apresentados e discutidos os resultados obtidos conforme a
metodologia descrição do capítulo anterior.
4.1 – Análise granulométrica do pó da polpa de castanhola
A partir do pó adquirida foi realizada a análise granulométrica. Na Tabela 4.1 é
apresentada a massa das partículas retidas e a respectiva fração mássica (xi) do material retido
em cada peneira. Foram utilizadas 3 peneiras onde o fundo é a sobra do material que
conseguiu passar por todas as peneiras. As aberturas das peneiras são apresentadas em
milímetros e o diâmetro médio de cada partícula (di) em milímetros.
Tabela 4. 1 - Diâmetro da abertura das peneiras e o valor da fração mássica (xi) da massa
retida em cada peneira.
Diâmetro das
peneiras (mm) di (mm) xi
0,7 0,7 0,383
0,5 0,6 0,219
0,3 0,4 0,239
Fundo 0,15 0,159
O valor do diâmetro médio de Sauter foi calculado de acordo com a Equação (3.1) no
Item 3.2.2. A partir dos valores obtidos na Tabela 4.1, o diâmetro de Sauter obtido foi de
0,389 mm.
Capítulo 4 – Resultados e discussões
38 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
4.2 - Extração do corante e avaliação do planejamento
As extrações foram realizadas de acordo com o planejamento fatorial 24 conforme os
itens 3.2.3 e 3.2.4. Os extratos retirados do reator e filtrados eram submetidos às análises de
compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante.
Os resultados experimentais decorrentes do processo de extração do corante do fruto
de castanhola conforme o planejamento previamente mostrado na Tabela 3.1, estão
apresentados na Tabela 4.2.
O melhor resultado obtido com a amostra em base seca foi: 30307,53 mg GAE/100g
da amostra para o teor de compostos fenólicos totais (CFT) quando utilizaram-se 50°C, 30
minutos, 50% de Etanol e pH igual a 3,5. Para a para a atividade antioxidante (AA) obteve-se
0,17 de IC50 (g/mL) da amostra em 50°C, 75% de etanol, 10 minutos e pH igual a 3,5. Para a
concentração de antocianinas monoméricas totais (AMT) verificou-se 376,33 mg ci-3-gli/100
g para 50°C, 30 minutos, 75% de etanol e pH igual a 3,5. O melhor resultado para a atividade
antioxidante foi o menor valor obtido, já que este valor representa a concentração do extrato
que inibe o radical livre (DPPH).
Os resultados para CFT, AA e AMT foram bastante superiores quando comparados a
resultados obtidos por outros autores para o estudo da castanhola, como Marques et al. (2012), que
obtiveram 244,33 mg de GAE/100g de compostos fenólicos e Lima (2012) com 142,84 mg de GAE/g
no processo de extração da polpa da castanhola. Esta diferença pode ter ocorrido devido o fruto ter
sido produzido em condições climáticas, grau de maturação, condições de estocagem ou condições do
processo para a extração do corante não semelhante.
Capítulo 4 – Resultados e discussões
39 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Tabela 4. 2 - Resultados da extração de atividade antioxidante, compostos fenólicos e
antocianinas da polpa do fruto de castanhola
T
(⁰C)
Etanol
%
t
(min)
pH AA
IC50(g/mL)
CFT
mg GAE/100g
AMT
mg ci-3-gli/100 g
50 75 30 7,5 1,51 2767,62 92,90146
25 75 30 7,5 1,55 3548,67 76,64788
50 50 30 7,5 1,16 6365,27 88,61542
25 50 30 7,5 1,24 3415,33 80,3773
50 75 10 7,5 1,57 5089,36 86,3332
25 75 10 7,5 1,47 13564,6 78,45693
50 50 10 7,5 1,31 2268,84 53,9374
25 50 10 7,5 1,22 5142,25 75,47896
50 75 30 3,5 0,64 26106,8 376,3929
25 75 30 3,5 1,21 20668,5 218,3101
50 50 30 3,5 0,84 30307,5 203,0584
25 50 30 3,5 1,45 14958,1 163,4264
50 75 10 3,5 0,17 23361,5 177,5648
25 75 10 3,5 1,11 18324,1 151,4032
50 50 10 3,5 1,14 23274,3 209,6267
25 50 10 3,5 0,90 20106,2 213,1891
37,5 62,5 20 5,5 1,29 14034,2 161,4226
37,5 62,5 20 5,5 1,30 17302,4 119,0074
37,5 62,5 20 5,5 1,08 14034,2 161,4226
37,5 62,5 20 5,5 1,11 18302,4 169,9077
A partir dos valores reais obtidos na extração foram calculadas as estimativas dos
efeitos, que correspondem aos parâmetros β (Tabela 4.3) dos modelos matemáticos de
regressão. A Tabela 4.3 apresenta também os parâmetros estatisticamente significantes (p ≥
0,05), sendo que os efeitos em negrito dizem respeito aos valores dos efeitos dos fatores e a
interação entre eles que apresentaram significância estatística.
Capítulo 4 – Resultados e discussões
40 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Tabela 4. 3 - Valores dos efeitos para AA, CFT e AMT
Efeitos
Fator AA CFT AMT
βo 37,2907 14062,4 142,020
β1 10,9131 2763,1 12,272
β2 -0,2698 -949,1 0,296
β3 -4,3869 -732,2 47,097
β4 -21,5537 -16868,2 -156,611
β12 -6,5371 2171,8 -1,618
β13 4,7310 3119,2 45,761
β14 -11,7350 -4771,6 -47,769
β23 2,7290 1437,8 -57,489
β24 14,1859 -995,5 33,888
β34 5,5216 -2117,9 0,950
β123 7,4545 1238,7 -29,999
β124 7,2130 161,4 35,426
β134 -1,0387 116,9 4,463
β234 -0,8258 2239,0 23,027
As Equações (4.1), (4.2) e (4.3) representam os modelos obtidos no estudo dos
compostos AA, CFT e AMT respectivamente.
𝑦𝐴𝐴 = 37,29 + 10,91𝑥1 − 21,55𝑥4 − 11,73𝑥14 + 14,19𝑥24 (4.1)
𝑦𝐶𝐹𝑇 = 14062,4 − 16868,2𝑥4 − 4771,6𝑥14 (4.2)
𝑦𝐴𝑀𝑇 = 142,02 + 47,097𝑥3 − 156,61𝑥4 + 45,76𝑥13 − 47,76𝑥14 − 57,49𝑥23 (4.3)
Os valores dos coeficientes de correlação (R2) de cada modelo matemático gerado
foram 94,68%, 97,03% e 98,26% (Figuras 4.1, 4.2, 4.3) para a atividade antioxidante,
compostos fenólicos totais e antocianinas monoméricas totais, respectivamente.
Capítulo 4 – Resultados e discussões
41 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Os gráficos nas Figuras 4.1, 4.2 e 4.3 apresentam os valores preditivos, que são
adquiridos a partir do modelo matemático gerado, versus os valores observados ou valores
experimentais. Os valores de R2 são adquiridos a partir destes gráficos.
Figura 4. 1 - Valores preditivos em relação aos valores observados para a atividade
antioxidante
Figura 4. 2 - Valores preditivos em relação aos valores observados para os Compostos
Fenólicos Totais
Capítulo 4 – Resultados e discussões
42 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Figura 4. 3 - Valores preditivos em relação aos valores observados para as Antocianinas
Monomérica Totais
Os valores de R2 representam a quantidade de variabilidade nos dados que é explicada
pelo modelo de regressão ajustado, ou seja a média da qualidade do ajuste. Entretanto, não
demonstra a significância do modelo realizado. Para isso usa-se a análise da variância.
A partir da ANOVA podem ser obtidos os valores de Fcal e Ftab (Tabela 4.4).
Tabela 4. 4- Valores de Fcal e Ftab para AA, CFT e AMT
Fcal Ftab
AA CFT AMT AA CFT AMT
𝑴𝑸𝑹
𝑴𝑸𝒓
6,40 17,96 13,37 4,62 5,66 5,86
𝑴𝑸𝒇𝒂𝒋
𝑴𝑸𝒆𝒑
0,75 2,07 1,76 9,55 19 19
A partir da Tabela 4.4 foram obtidos os valores de Fcal/Ftab para os testes F de
significância (Tabela 4.5).
Capítulo 4 – Resultados e discussões
43 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Tabela 4. 5- Valores de Fcal/Ftab para AA, CFT e AMT
Fcal/Ftab
AA CFT AMT
𝑴𝑸𝑹
𝑴𝑸𝒓 1,38 3,17 2,28
𝑴𝑸𝒇𝒂𝒋
𝑴𝑸𝒆𝒑 0,07 0,10 0,09
A partir da Tabela 4.4 pode-se observar que para todas as variáveis (AA, CFT e AMT)
o Fcal > Ftab para 𝑀𝑄𝑅 𝑀𝑄𝑟⁄ , sendo Fcal muito maior que o Ftab, levando a valores de
Fcal/Ftab (1,38, 3,17, 2,28) na Tabela 4.5, portanto o modelo é significativo. Tem-se então
evidência estatística suficiente para se acreditar na existência de uma relação linear entre as
variáveis resposta (AA, CFT e AMT) e as variáveis independentes (Temperatura, proporção
do solvente, tempo e pH).
Além do modelo ser significativo deve ser observado se o modelo também é preditivo
para a falta de ajuste. Foi observado que os valores para 𝑀𝑄𝑓.𝑎𝑗 𝑀𝑄𝑒𝑝⁄ (0,07, 0,10, 0,09)
estão abaixo de 𝑀𝑄𝑅 𝑀𝑄𝑟⁄ (1,38, 3,17, 2,28) na Tabela 4.5, então o modelo é preditivo. Isto
reforça ainda mais a significância do modelo, o que também pode ser confirmado pelos
valores de Fcal serem muito menores que Ftab na Tabela 4.4 para a falta de ajuste e o erro.
Portanto todos os modelos são significativos e preditivos para o intervalo de confiança de
95%. Nenhum dos modelos demonstraram a necessidade de modificação dos níveis dos
parâmetros de controle.
4.3 - Análise da superfície de resposta
4.3.1 - Atividade antioxidante
O Diagrama de Pareto (Figura 4.4) demostram os valores para os efeitos das variáveis
sobre a resposta para 95% de confiança, sendo o pH o fator mais significativo na extração.
Observa-se também que a interação da proporção do solvente com o pH (2by4), a interação da
temperatura com o pH (1by4) e o efeito isolado da temperatura foram também significativos.
Capítulo 4 – Resultados e discussões
44 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Figura 4. 4 - Diagrama de Pareto para AA
O pH influenciou bastante o processo de extração. O valor negativo do tcalc observado
no Diagrama de Pareto demonstra que a extração alcançou valores maiores no nível inferior,
ou seja em pH igual a 3,5. Entretanto aumentando o pH, a atividade antioxidante diminuiu.
Isto se deve ao fato de que com o aumento do pH menos compostos bioativos, responsáveis
pela atividade antioxidante, são extraídos, ocasionando uma queda na extração de compostos
antioxidantes.
A temperatura também apresentou uma influência na extração, contudo a partir do
valor tcalc observado na Figura 4.4, demonstra que em temperaturas mais altas, na faixa de
25°C a 50°C, pode ser extraído mais composto antioxidante.
A interação da porcentagem de etanol com o pH (Figura 4.5) também influenciou na
extração, sendo que quando esses dois fatores interagiram ocasionou numa melhor extração,
ou seja, contribuiu favoravelmente para a extração dos compostos antioxidantes, usando-se
quantidades maiores de etanol e em baixo pH na faixa de 3,5 a 7,5. Constata-se que em boa
parte da faixa da porcentagem do etanol, de 75% até 66% de etanol, e pH entre 3 e 4, o
rendimento foi favorável para a extração.
Capítulo 4 – Resultados e discussões
45 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Figura 4. 5 - Curvas de nível para a interação da porcentagem do etanol com o pH (2by4) para
a extração da atividade antioxidante
No presente estudo o efeito isolado da porcentagem de etanol utilizada no solvente não
foi significativo, entretanto observou-se que, tanto na interação de proporção do solvente com
o pH como no ponto de melhor rendimento da extração, obteve um melhor resultado quando
se utilizaram quantidades maiores de etanol. Sun et al. (2007) afirmaram em seus estudos,
envolvendo cinco solventes (água, metanol, etanol, éter dietílico e acetona) na extração da
atividade antioxidante utilizando cascos Avellana gevuina, que os extratos de etanol e de
metanol apresentaram um maior teor de atividade antioxidante, enquanto a extração apenas
com água resultou em um menor teor de atividade antioxidante, determinada pelo método de
DPPH. Segundo Azevedo (2010), em um estudo com o jambo, a temperatura e a proporção de
solventes foram bastante significativas na extração da atividade antioxidante, sendo observado
um melhor desempenho em toda a faixa de temperatura para maiores quantidades de etanol.
Num estudo com brócolis e aspargos Sun et al. (2007) observaram que os extratos de metanol
e acetona obtinham uma atividade antioxidante mais elevada do que os extratos de água,
concluindo que os flavonoides são mais solúveis em metanol e acetona do que em água.
Assim, concluíram que a utilização de água apenas, não é favorável à extração dos
antioxidantes de espargos ou brócolis.
A Figura 4.6 apresenta as curvas de níveis da interação da temperatura com o pH. Esta
interação gerou em um baixo rendimento para a extração. Apenas uma pequena faixa de pH
entre 3 e 4 com temperaturas mais altas, na faixa de 45°C a 50°C, apresentaram um bom
rendimento na extração.
Capítulo 4 – Resultados e discussões
46 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Segundo Sartori (2013), as condições de pH igual a 4, temperatura de 70°C e 40% de
etanol foi a combinação entre os parâmetros que melhor possibilitou a extração de substâncias
com propriedade antioxidante, quando utilizou-se a cana-de-açúcar como matéria-prima.
Figura 4. 6 - Curvas de nível para a interação da temperatura com o pH (1by4) para a extração
da atividade antioxidante
Oliveira et al. (2009) afirmaram que a obtenção de antioxidantes é influenciada pelo
substrato utilizado no ensaio, pelo solvente e pela técnica de extração empregada, bem como
o tempo e temperatura.
4.3.2 Compostos Fenólicos Totais
Na análise do diagrama de Pareto (Figura 4.7), para a extração de compostos fenólicos
totais, observou-se que o pH foi bastante significativo e também a interação da Temperatura e
pH (1by4), sendo esta bem menos significativa.
De acordo com a Figura 4.7 o valor de tcalc negativo para o pH indica que o nível
inferior referente ao pH favoreceu a extração, ou seja, quanto menor o valor do pH no
solvente maior será a extração de compostos fenólicos. Assim, para a remoção desses
compostos, uma solução mais ácida seria mais favorável, já que de acordo com a literatura os
compostos fenólicos são extraídos de forma mais eficiente em pH ácido. Lopes et al. (2007)b
afirma que a utilização de solvenes ácidos facilitam a extração de compostos fenólicos. É
comum a utilização de solventes acidificados, pois auxiliam na penetração do solvente nos
materiais orgânicos, além de aumentar a estabilidade dos extratos e assim favorecem a
extração (FAVARO, 2008).
Capítulo 4 – Resultados e discussões
47 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Na interação da temperatura com o pH pode-se observar que a junção desses dois
fatores na extração não favoreceu a extração, em que uma análise da curva de nível (Figura
4.8) permite avaliar o resultado sobre esta interação.
Figura 4. 7- Diagrama de Pareto para os compostos fenólicos
Na Figura 4.8 é apresentada a curva de nível da interação entre a temperatura e o pH
(1by4). Constatou-se que as condições ótimas para determinação dos compostos fenólicos
totais estão com valores de temperatura maiores e um menor pH. Souza et al. (2013) em um
estudo com extratos vegetais concluíram que todos os extratos etanólicos acidificados
extraídos em alta temperatura apresentaram elevados teores de compostos fenólicos e
concluiram que o aumento da temperatura promoveria um aumento da reatividade do etanol,
facilitando o processo extrativo das fibras vegetais.
Capítulo 4 – Resultados e discussões
48 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Figura 4. 8 - Curvas de nível para a interação da temperatura (ºC) com o pH(1by4) para a
extração de compostos fenólicos
Os efeitos isolados da porcentagem de etanol, temperatura (ºC) e o tempo (min) não
influenciaram na extração. Entretanto, a maior concentração dos compostos fenólicos foi
obtida com 75 % de etanol, tempo de 30 min e a uma temperatura de 50°C, ou seja, uma
maior proporção de etanol, maior temperatura e maior tempo apresentaram um melhor
rendimento para a extração dos compostos fenólicos. Segundo Sartore et al. (2013), no
processo de extração, o tipo de solvente, a temperatura e pH afetam a quantidade de
compostos fenólicos extraída, mas não foram encontrados na literatura estudos que
relacionam os três parâmetros citados. Haida et al. (2011) afirmaram em um estudo com
folhas de goiaba vermelha, goiaba branca e arruda, que na extração com solvente etanólicos e
aquosos houve extração de compostos fenólicos nas duas variedades de goiaba. Azevedo
(2010) também analisou que as condições ótimas de extração para a determinação de
compostos fenólicos do extrato de jambo estão na faixa de temperatura entre 50ºC a 60ºC com
intervalos de tempo de 25 a 30 min.
Os compostos fenólicos são os maiores responsáveis pela atividade antioxidante em
frutos (HEIM et al., 2002). Segundo Kuskoski et al. (2006), a média dos valores de atividade
antioxidante se correlaciona de forma positiva com a média dos valores de polifenóis e
antocianinas. Os autores observaram uma resposta tanto entre o conteúdo total de polifenóis e
a atividade antioxidante de 15 frutos e que isso indicaria que os compostos fenólicos são
contribuintes na atividade antioxidante dos frutos analisados.
Thoo et al. (2010) relataram que, embora a extração dos compostos fenólicos fosse
melhorada utilizando um solvente composto por 100% de etanol no processo, esta condição
Capítulo 4 – Resultados e discussões
49 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
não contribuiu para elevar a quantidade da atividade antioxidante. Já Chirinos et al. (2007)
inferiram que tal fato devido ao processo utilizar 100% de etanol, o que pode incapacitar a
extração dos compostos fenólicos, por estes serem mais solúveis em água.
Estudos anteriores mostraram que um sistema de solvente binário foi superior a um
sistema de apenas um componente (água ou etanol puros) para a extração de compostos
fenólicos no que diz respeito à sua polaridade relativa (Thoo et al., 2010).
Thoo et al. (2010) afirmaram que em relação ao princípio do equilíbrio, a temperatura
elevada poderia aumentar a taxa de extração e, portanto, reduzir o tempo de extração para
alcançar a máxima recuperação de polifenóis. Entretanto, elevar a temperatura pode não ser
adequado para a extração de todos os tipos de compostos fenólicos. O aumento da
temperatura no presente estudo foi significativo para a faixa de temperatura estudada (25°C a
50°C), o que não garante que em outras faixas de temperatura os resultados se manteriam
significativos.
4.3.3 Antocianinas monoméricas totais
A Figura 4.9 mostra o Diagrama de Pareto relativo ao estudo das AMT, sendo o pH o
fator mais significativo para a extração seguido pela interação da proporção do solvente com
o tempo (2by3), pela a interação da temperatura com o pH e a interação da temperatura com o
tempo.
Figura 4. 9 - Diagrama de Pareto para as antocianinas
Capítulo 4 – Resultados e discussões
50 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
O fator isolado pH (Figura 4.9) foi o mais significativo em relação aos outros. Isto
pode ser afirmado observando o valor de tcalc negativo, que indica que o rendimento da
extração aumenta em valores de pH baixos no processo, tal como ocorreu na extração dos
compostos fenólicos. Portanto, em pH mais baixo é possível extrair um teor maior de
antocianinas. Xavier (2004), em um estudo com repolho roxo, concluiu que quanto menor o
pH maior a quantidade de antocianinas extraídas e que a melhor condição de operação seria
com um pH de 3,5. Favaro (2008) afirma que soluções muito ácidas na presença de agentes
oxidantes favorecem a hidrólise ácida das antocianinas podendo afetar a estabilidade dos
extratos e que soluções muito alcalinas levam à formação irreversível da cis-chalcona
ionizada (solução amarelada). Segundo Kato et al. (2012), o fator determinante na extração de
antocianinas de uvas do tipo Vitis vinífera L. foi a condição do pH, em que quanto mais baixo
o pH, maior foi a concentração destes pigmentos.
De acordo com a Figura 4.19, o segundo fator isolado significativo no processo foi o
tempo. O tempo influenciou de forma positiva na extração, concluindo que quanto maior o
tempo de extração, melhor será o rendimento do teor de antocianinas. No presente estudo o
teor de antocianinas apresentou melhor rendimento em um tempo de 30 minutos de extração.
Ainda na Figura 4.9 observa-se que as interações da porcentagem de etanol com o
tempo (2by3) e a interação da temperatura com o pH (1by4) também foram significativas na
extração.
Pelas curvas de níveis (Figuras 4.10, 4.11 e 4.12) pode-se avaliar melhor as interações
da temperatura com a porcentagem de etanol utilizada
Figura 4. 10 - Curvas de nível para a interação da porcentagem do etanol com o tempo (2by3)
para a extração de antocianinas
Capítulo 4 – Resultados e discussões
51 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Na interação da porcentagem de etanol com o tempo (2by3) apresentado na Figura
4.10 pode-se observar que a interação entre eles ocasionou um bom rendimento para a
extração de antocianinas, em que o valor de tcalc é positivo. As antocianinas tiveram um
melhor rendimento em um tempo maior com maiores quantidades de etanol. Também se
observa que o rendimento foi maior na faixa de 28 a 32 minutos de extração e 66% a 76 % de
etanol. Entretanto Thoo et al. (2010) não obtiveram bons resultados na extração de
antocianinas com altas concentrações de etanol (80%). Os autores também constataram um
menor rendimento de extração das antocianinas para concentrações de etanol abaixo de 40%.
Na interação da temperatura com o tempo (1by3) (Figura 4.11), há um melhor
rendimento na extração de antocianinas quando se empregam temperaturas e tempos de
extração maiores. Os melhores rendimentos na extração de antocianinas foram observados
com valores de temperatura na faixa de 42ºC a 52ºC com o tempo na faixa de 28 a 32 minutos
de extração.
Figura 4. 11 - Curvas de nível para a interação da temperatura com o tempo (1by3) para a
extração de antocianinas
A interação da temperatura com o pH (1by4) (Figura 4.12) proporcionou um bom
rendimento na extração de antocianinas. Observou-se que em temperaturas maiores e pH
baixo ocorre um melhor rendimento na extração numa faixa de temperatura de 32ºC a 52 ºC e
pH entre 3 e 4.
Capítulo 4 – Resultados e discussões
52 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Figura 4. 12 - Curvas de nível para a interação da temperatura com o pH (1by4) para a
extração de antocianinas
Apesar do efeito isolado temperatura não ter sido significativo no sistema de extração
estudado, Sartore et al. (2013) afirmam, em seus estudos sobre extração de compostos
fenólicos, que os teores de flavonóides totais foram maiores para temperaturas inferiores a
30°C. Contudo os autores afirmam que o aumento da temperatura promoveria um aumento da
reatividade do etanol, o que facilitaria o processo de extração das fibras vegetais. Contudo no
presente trabalho a extração de antocianinas foi mais alta em uma temperatura de 50ºC.
4.4 – Correlação na extração entre os compostos fenólicos, antocianinas e a
atividade antioxidante
No presente trabalho foram analisadas correlações entre os compostos fenólicos,
antocianinas e a atividade antioxidante a partir dos dados experimentais adquiridos no
planejamento fatorial 24 avaliando a relação existente entre eles. Os valores e gráficos das
correlações foram obtidos a partir do software Statistica 7.0.
A intensidade da correlação pode ser descrita por Dancey e Reidy (2005), onde
apontam uma classificação sendo: r = 0,10 até 0,30 (fraco); r = 0,40 até 0,6 (moderado); r =
0,70 até 1 (forte).
Na (Figura 4.13) é apresentado a correlação dos compostos fenólicos com o teor de
antocianinas com um valor de r igual a 0,79. Conclui-se que na extração de antocianinas e
compostos fenólicos possui uma forte correlação entre eles. Esta forte correlação também foi
Capítulo 4 – Resultados e discussões
53 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
observada por Azevedo (2010) em um estudo com o jambo, em que constatou um valor de r
igual a 0,97 para a correlação de compostos fenólicos e antocianinas extraídas.
Figura 4. 13 - Correlação entre a extração dos compostos fenólicos com antocianinas com r =
0,79
Na correlação entre os compostos fenólicos e a atividade antioxidante (Figura 4.14) a
correlação demonstrou ser moderada apresentando um valor de r igual a 0,69. Azevedo (2010)
também observou uma correlação na extração de compostos fenólicos com a atividade
antioxidante, no estudo com o jambo, apresentando uma correlação forte com de r igual a
0,83. Já Dos Santos et al. (2008) em um estudo com polpas de açaí, constatou uma correlação
moderada para o compostos fenólico e a atividade antioxidante com valor de r igual a 0,59.
Figura 4. 14 - Correlação entre a extração dos compostos fenólicos com a atividade
antioxidante com r = 0,69
Capítulo 4 – Resultados e discussões
54 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
A correlação da extração de antocianinas com a atividade antioxidante (Figura 4.15)
também mostrou ser uma correlação moderada apresentando um valor de r igual a 0,64.
Segundo Azevedo (2010), a correlação de antocianinas com a atividade antioxidante, em um
estudo com o jambo, demostrou ter um valor de r igual a 0,72, sendo esta uma forte
correlação. Dos Santos et al. (2008) também observaram uma forte correlação entre as
antocianinas com a atividade antioxidante apresentando um valor de r igual a 0,72.
Figura 4. 15 - Correlação entre a extração das antocianinas com a atividade antioxidante com
r = 0,64
Este estudo demonstrou que todos o compostos estudados apresentaram correlação
positiva. Onde a maior correlação observada foi da extração dos compostos fenólicos com o
teor de antocianinas monoméricas. Na correlação dos compostos fenólicos com a atividade
antioxidante e o teor de antocianinas com a atividade antioxidante foi observado uma
correlação moderada. Na extração outros compostos de natureza antioxidante são extraídos,
portanto os compostos fenólicos e antocianinas não são os únicos responsáveis pela atividade
antioxidante no extrato.
4.5 - Estudo Cinético do processo de extração
Neste capítulo serão apresentados os estudos referentes à cinética, demonstrando o
comportamento ao longo de tempo dos compostos fenólicos, antocianinas e atividade
antioxidante.
Capítulo 4 – Resultados e discussões
55 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
4.5.1 - Análise do comportamento cinético
O estudo das condições de operação (temperatura, pH, proporção dos solventes) para a
extração de antocianinas, compostos fenólicos totais e a atividade antioxidante, permitiu fixar
as condições ótimas de extração.
Assim, para o estudo cinético foram realizadas extrações nas condições ótimas pré-
estabelecidas para compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante apresentadas no
Item 4.2.
A partir dos dados da Tabela 4.6 foram construídas as curvas para compostos fenólicos
totais (CFT) e para antocianinas monoméricas totais (AMT) e atividade antioxidante (AA),
representadas nas Figuras 4.16, 4.17 e 4.18 respectivamente. Tal como o estudo de
Sant’Anna, Marczak, Tessaro, (2011), verifica-se um aumento gradativo na concentração do
componente, com o tempo, com exceção da AA.
Tabela 4. 6- Concentrações de CFT, AMT e AA com o tempo de extração
Tempo (min) CFT (mg GAE/100g) AMT (ci-3-gli/100g) AA (%SRL)
10 23274,35 209,63 52,71
30 30307,53 203,06 62,72
50 16674,92 260,82 75,14
70 16674,92 179,57 79,19
90 20665,95 189,25 23,93
110 18988,81 229,78 30,51
130 20805,94 312,94 25,91
Na curva cinética para a extração dos compostos fenólicos (Figura 4.16) houve um
aumento atingindo 30307,53 mg de GAE/100g de pó. Depois de 30 min o teor de compostos
fenólicos sofreu uma queda apresentando um valor de 16674,92 mg de GAE/100g de pó. Isto
deve-se ao fato que os compostos atingiram o máximo extração e a degradação térmica teve
início após os 30 minutos de extração. Segundo Thoo et al. (2010), em um estudo da extração
de compostos bioativos com o tempo, o excesso de tempo de extração, de fato, reduziu a
produção de compostos fenólicos, concluindo que o tempo de extração (20-120 min) não teve
efeito significativo na extração dos compostos fenólicos. Guedes (2013) afirma que extrações
com um longo tempo provavelmente causa a degradação dos compostos fenólicos. Luz e
oxigênio são os dois fatores mais importantes que facilitam as reações de degradação.
Capítulo 4 – Resultados e discussões
56 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
A partir dos 50 minutos de extração de compostos fenólicos (Figura 4.16), a curva
começa a se tornar estável apresentando o começo da estabilidade. Amendola, De Faveri,
Spigno, (2010) em um estudo com uvas, observaram o começo da estabilidade a partir dos
120 minutos de extração a 60ºC utilizando um solvente com 60% de etanol e 40% de água.
Sant’Anna et al. (2011) em um estudo com bagaços de uvas, também analisaram a cinética de
extração dos compostos fenólico, concluindo que o teor de compostos fenólicos na extração a
60ºC foi maior que a 50ºC, atingindo uma concentração estável em 30 e 45 minutos
respectivamente utilizando um solvente com 50% de metanol.
Figura 4. 16 - Concentração dos compostos fenólicos em função do tempo nas condições de
50°C, 50% de etanol e pH igual a 3,5.
Na curva cinética para antocianinas, Figura 4.17, a concentração de AMT aumenta de
forma gradativa ao longo do processo. A degradação que pode ser observada a partir de 50
minutos de extração, em que o teor de antocianinas cai de 260,08 ci-3-gli/100g em 50 minutos
para 179,57 ci-3-gli/100g em 70 minutos, ocorrendo provavelmente devido ao início do
processo de degradação térmica do composto no extrato (REYES e CISNEROS-ZEVALLOS,
2007). No estudo com bagaços de uvas Sant’Anna et al. (2011) observaram que a estabilidade
na extração começou em 40 minutos de extração. Contudo a partir de 90 minutos a curva
tende a crescer novamente, provavelmente compostos de antocianinas remanescentes no
material.
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
0 20 40 60 80 100 120 140
mg
de
GA
E/1
00
g
Tempo (min)
Capítulo 4 – Resultados e discussões
57 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Figura 4.17- Concentração de antocianinas em função do tempo nas condições de 50°C, 75%
de etanol e pH igual a 3,5.
Na curva cinética da atividade antioxidante (Figura 4.18) observa-se um aumento
gradativo até os 70 minutos de extração, segundo Wang et al. (2007) condições de operação
favoráveis fazem com que os compostos tenham uma maior estabilidade, não havendo tempo
suficiente para que ocorresse a degradação dos compostos antioxidantes. Vieira et al. (2011)
em um estudos com várias frutas regionais (acerola, bacuri, cajá, caju, goiaba e tamarino)
avaliando a atividade antioxidante com o tempo de extração, concluiram que para todas as
frutas em estudo, a curva cinética começou a estabilidade a partir de 10 minutos de extração
utilizando um solvente com 20% de etanol e 80% de água. Segundo Marques et al. (2012) o
equilíbrio da curva cinética para a atividade antioxidante começou em 10 minutos utilizando
um solvente etanoico, já na extração com solvente aquoso a curva cinética não atingiu o
equilíbrio em um tempo total de 20 minutos.
Após os 70 minutos de extração (Figura 4.18) a curva sofre uma queda no valor da
%SRL de 79,19% em 50 minutos para 23,93% em 90 minutos. Isto provavelmente por causa
da degradação térmica dos compostos antioxidantes. Entretanto a partir de 90 minutos de
extração a curva tende a se tornar estável, provavelmente atingindo o equilíbrio.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 20 40 60 80 100 120 140
C (
mg
ci-3
-gli/
L)
Tempo
Capítulo 4 – Resultados e discussões
58 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Figura 4.18- Concentração de atividade antioxidante em função do tempo nas condições de
50°C, 75% de etanol e pH igual a 3,5.
Todas as curvas cinéticas demostraram que após 90 minutos os compostos tendem a
chegar a estabilidade. Contudo para a curva cinética das antocianinas o tempo necessário para
se chegar a estabilidade se mostrou ser maior em relação aos compostos fenólicos e a
atividade antioxidante.
4.6 – Estudos da estabilidade de antocianinas presentes no extrato
As tabelas 4.7 e 4.8 mostram os teores das antocianinas no primeiro dia e no quinto dia
para as temperatura de 25ºC e 60ºC respectivamente. Observou-se que para a temperatura de
60ºC as antocianinas tiveram uma degradação bastante acentuada.
Tabela 4. 7 - Porcentagem de degradação de antocianinas em 5 dias a 25°C
Concentração de AMT
(mg ci-3-gli/L)
concentração de extrato % pH 1º dia 5º dia Degradação %
30 3 37,46 26,66 28,83
50 3 54,44 41,80 23,21
30 6 33,62 6,04 82,04
50 6 53,21 12,47 76,57
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 20 40 60 80 100 120 140
%SR
L
Tempo (min)
Capítulo 4 – Resultados e discussões
59 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Tabela 4. 8 - Porcentagem de degradação de antocianinas em 5 dias a 60°C
Concentração de AMT
(mg ci-3-gli/L)
concentração do extrato % pH 1º dia 5º dia Degradação %
30 3 49,98 26,22 47,55
50 3 54,10 41,91 22,53
30 6 33,01 0,95 97,13
50 6 50,99 4,73 90,72
A concentração de antocianinas afeta na manutenção da cor (LOPES et al., 2007). A
estabilidade da cor é dependente da temperatura, do pH, bem como da concentração
(CHIGURUPATI et al., 2002).
Nas Tabelas 4.7 e 4.8 observou-se que o pH teve bastante influencia na degradação
das antocianinas. As antocianinas em pH igual a 3 obteve maior estabilidade, ou seja, houve
pouca degradação ao longo de 5 dias em relação as antocianinas nos extratos com pH igual a
6.
Na Tabela 4.8 observou-se que as antocianinas em pH igual a 3 em concentração
menor (30%) em temperatura de 60°C, houve uma maior degradação que o extrato com
concentração de 50% em pH igual a 3.
Comparando os valores da Tabela 4.7 e 4.8 do extrato com concentração de 30% e pH
igual a 3 observou-se que o extrato em concentrações baixas pode aumentar a degradação das
antocianinas estando a temperatura 60°C.
De acordo com a Figura 4.19 pode-se perceber que não só o pH e temperatura
influenciaram na degradação. As concentrações dos extratos tiveram influência, sendo que em
concentrações de 30% de extrato, as antocianinas tiveram uma maior degradação em relação
aos ensaios com extratos cujas concentrações foram de 50% para os pH 3 e 6 como também
para as temperaturas de 25°C e 60°C. Também observou-se que a maior degradação das
antocianinas ocorreu em concentrações baixas e pH alto. Em geral, a estabilidade dos extratos
é afetada também pela temperatura.
Malacrida e Motta (2006), afirmam que antocianinas, em pH baixo, permanecem na
forma de cátion flavílio, o qual apresenta coloração vermelha em solução aquosa. Leidens
(2011) afirma que as antocianinas são mais estáveis em soluções ácidas (pH inferior a 3), na
Capítulo 4 – Resultados e discussões
60 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
cor laranja ou vermelha, mas quando se aumenta o pH, ocorre a perda do próton para produzir
as formas quinoidais, azuis ou violetas.
Lima (2012) observou que os extratos de compostos bioativos do fruto de castanhola
possuíam um comportamento diferenciado de acordo com a concentração utilizada do extrato
e que a degradação ocorria logo nos primeiros 5 minutos.
Wang et al. (2007) em um estudo da estabilidade com a temperatura e estocagem com
a amora-preta constataram que a degradação foi mais acentuada com o aumento da
temperatura. Assim, uma maior estabilidade de antocianinas foi conseguida utilizando uma
temperatura mais baixa. Schmitz (2014) afirma que estudos têm demonstrado que a
degradação de antocianinas não é só função da temperatura de processamento e sim de
propriedades intrínsecas do produto e de características do processo realizado.
Figura 4. 19 - Gráfico da porcentagem de degradação em função das temperaturas a, pH e a
porcentagem da concentração em cada um dos ensaios.
Os extratos da polpa da castanhola possuem compostos antioxidantes de ação rápida,
tendo em vista de que os radicais livres fisiológicos são altamente instáveis e com meia vida
muito curta (LIMA, 2012).
A temperatura foi o fator que mais influenciou na estabilidade. A temperatura tem
grande influência na degradação das antocianinas. Albarice e Pessoa, (2012) relata que em
seus estudos com a estabilidade de antocianinas em polpa de açaí, em temperaturas entre
10°C e 40°C não afetaram na degradação das antocianinas. Constatou-se, no estudo da
estabilidade, que a temperatura utilizada na obtenção das propriedades avaliadas poderia estar
0
20
40
60
80
100
120
pH=3 30% pH=3 50% pH=6 30% pH=6 50%
De
grad
ação
T=25ºC
T=60ºC
Capítulo 4 – Resultados e discussões
61 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
muito alta, sendo então, esta, responsável pela degradação excessiva das antocianinas nos
ensaios avaliados no presente estudo. Wang e Xu (2007) observaram que as antocianinas
extraídas de amoras, a temperatura de 60ºC, não apresentaram degradação com 60 min nesta
temperatura, ultrapassando um tempo de 150 min para se atingir uma degradação de
aproximadamente 10%. Segundo Falcão (2006), em um estudo da estabilidade das
antocianinas de uvas Merlot (Vitis vinefera L.), o aumento da temperatura resultou em um
aumento da degradação das antocianinas.
CAPÍTULO 5
CONCLUSÃO
Capítulo 5 - Conclusão
63 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
5 - Conclusão
Os resultados obtidos sob as condições de extração analisadas no presente trabalho
levaram às conclusões que se seguem.
O pH foi o fator que mostrou mais influência na extração de cada um dos compostos
estudados (CFT, AMT e AA). As condições ótimas de extração para CFT são: temperatura de
50oC, 30 minutos, 50% de etanol e pH igual a 3,5; para AMT a temperatura de 50
oC, 30
minutos, 75% de etanol e pH igual a 3,5; para AA as condições ótimas são com temperatura
de 50oC, 10 minutos, 75% de etanol e pH igual a 3,5.
Através do planejamento fatorial 24
foi possível obter os modelos apresentando os
principais fatores que afetaram a extração. Para todos os compostos, o pH foi o que mais
influenciou no processo de extração. Apesar de a temperatura não ter apresentado
significância estatística, como um fator isolado, para os compostos na análise do
planejamento, esta apresentou bastante influência nos rendimento de todos os compostos
estudados.
O presente estudo demonstrou que todos os compostos estudados apresentaram
correlação positiva. Onde a maior correlação observada foi da extração dos compostos
fenólicos com o teor de antocianinas monoméricas com r igual a 0,79. Na correlação dos
compostos fenólicos com a atividade antioxidante e o teor de antocianinas com a atividade
antioxidante foi observado uma correlação moderada apresentando valores de r iguais a 0,69 e
0,64 respectivamente. A correlação moderada dos compostos fenólicos e antocianinas com a
atividade antioxidante pode-se constatar que na extração outros compostos de natureza
antioxidante são extraídos, portanto os compostos fenólicos e antocianinas não são os únicos
responsáveis pela atividade antioxidante no extrato.
Todas as curvas cinéticas apresentam uma queda a partir dos 50 minutos e após 90
minutos os compostos tendem a chegar a estabilidade para os compostos fenólicos e a
atividade antioxidante. Contudo para as antocianinas, a curva cinética demostrou que é
necessário um tempo maior para se chegar a estabilidade.
Na avaliação da estabilidade, todos os fatores (temperatura, pH e concentração) foram
influentes na degradação das antocianinas, sendo aquela temperatura foi a que mais
influenciou na degradação.
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Apêndice I. Curvas de Calibração
76 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014
Apêndice I. Curvas de calibração
Figura 6. 1 - Curva de calibração para CFT
Figura 6. 2 - Curva de calibração de AA
y = 0,0099x - 0,0888 R² = 0,9912
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 20 40 60 80 100 120
Ab
sorb
ânci
a
mg GAE/100g
y = -1,7184x + 98,302 R² = 0,991
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50
%SR
L
Concentração de DPPH (µg/mL)
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