faculté de chirurgie dentaire université paris 5 des glycosaminoglycannes à l’utilisation...
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Faculté de chirurgie Dentaire Université Paris 5
Des glycosaminoglycannes à l’utilisation potentielle de
polysaccharides en thérapie tissulaire
Karim Senni
A
Matrice extracellulaireMatrice extracellulaire
Adhésion
ProliférationDifférentiation
Dégradation
SynthèseMigration
Mort
B
Cytokines, Facteurs de croissance, chémokines
Remodelage tissulaire
Synthèse
DégradationSynthèses macromoléculaires
Prolifération cellulaireDégradations macromoléculaires
Mort cellulaire
Synthèse
Dégradation
Remodelage pathologique
Fibroses, ex: chéloïdes
Synthèse
Dégradation
Parodontite
Ulcères chroniques cutanées
Remodelage pathologique
Inflammations chroniques Cicatrisations retardées
Thérapies tissulaires
Mobiliser au mieux les ressources in situ afin de parfaire la réparation voir la régénération tissulaire
Recrutement des phénotypes cellulaires les plus aptes
Aide à la reconstruction: matrice exogène, potentialisation des ressources tissulaires
Arrêt des processus dégénératifs
Agir sur les acteurs du remodelage tissulaire
Cellules résidentes: épithéliales, endothéliales, fibroblastes, ostéoblastes …
Cellules inflammatoires: Macrophages, lymphocytes, PMN
Agents de clivages: protéases (MMPs, sérine protéases…), glycosidases, radicaux libres…
Facteurs de croissances (FGF, TGF, cytokines (IL-1, TNF, IL-4), matrikines (endostatine, peptides de collagènes et d’élastine)
Matrice extracellulaire
Protéines fibreuses
Collagènes Elastine
Fibrillaires FACITs réseau MACITsFilaments perlés fibrilles d’ancrage Multiplexines
XXVII XI
V
III
II
I
XXI, XXVI XIX, XX XIV, XVI IX, XII
X
VIIIV VI VII
XVIII
XV
XXVXXIIIXVIIXIII
Glycoprotéines
Fibronectine
Laminines
Vitronectine
Fibulines
Fibrillines
Nidogène
Ténascine
Ostéocalcine
Ostéonectine
FVW…
GAG
Acide Hyaluronique
Riches en Leucine Agrégats surface cellulaire Intracellulaire
Décorine
Biglycane
Fibromoduline…
Versicane
Agrecane
Perlécane
Agrine….
Syndécane
Bétaglycane
Glypicane...
Serglycine
Héparine
HS
CS
DS
KS
Protéoglycannes
membrane basale
K. Senni
un contexte la matrice extracellulaire
Acide hyaluronique (D-GlcU-D-GlcNac)
Kératane sulfate (D-Gal-D-GalNAc)
Héparine/Héparane sulfate (L-IdoA-D-GlcNAc)
Chondroïtines sulfate (D-glcU-D-GalNAc)
Dermatane sulfate (L-IdoA-D-GalNac)
Unités disaccharidiques répétitives des glycosaminoglycannes
Les glycosaminoglycannes
[acide uronique (ose neutre)-hexosamine]n
Unité disaccharidique répétée n fois:
Sulfatation, Epimérisation => grande variabilité à l’intérieur d’une même chaîne
Définit les interactions avec les autres acteurs du remodelage tissulaire: un code?
Protéoglycannes et Glycosaminoglycannes de la matrice extracellulaire
Protéoglycannes formant de grands agrégats matriciels.
Acide Hyaluronique (HA)
Chondroïtine sulfate
Protéine de liaison
Core protéique
Agrécane: Cartilage, 1 centaine de CS quelques KS
Versicane: Peau, Vaisseaux, 1 trentaine de CS
PM: jusqu’à 106 Da
Création d’espaces, rétention d’eau, circulation de petites
molécules
K. Senni
Agrécane
Roseman S 2001
Angiogenic oligosaccharides of hyaluronan induce multiple signaling pathways affecting vascular endothelial cell mitogenic and wound healing response
Slevin et al J biol Chem 277 41046-41059
Fragments d’acides hyaluronique = Matrikine?
Fragments d’acide hyaluronique
Petits protéoglycannes riches en leucine: Décorannes
Décorines: 1 Chaîne CS ou DS en N-ter
Biglycane: 2 chaînes CS ou DS en N-ter
Fibromoduline: jusqu’à 4 à 5 chaînes KS tout au long du core protéique
Fibre de collagènes
Décorine
Chaîne GAG
Structuration de la matrice collagénique
Séquestration du TGF (core protéique)
Liaison au FGFR et activation (décorine)
K. Senni
Structuration du réseau élastique
Heparan Sulfate Depletion Within Pulmonary Fibroblasts: Implications for Elastogenesis and RepairBuszceck-Thomas et al J Cell Physiol 192:294–303 (2002)
Les chaînes héparane sulfate participent à la structuration du réseau élastique
Protéoglycannes de la membrane basale
Perlécane: CS/DS
Collagène XVIII: HS
Filtration: glomérule rénal, barrière hémato-encéphalique
Caractère polyanionique
Crinopexie
Les protéoglycannes de la membrane cellulaire
Syndécane 4 et adhésion cellulaire: formation des contacts focaux d’adhésion
PKC
PIP2
Intégrine
Syndécane 4
fibronectineHéparane sulfate
Microfilaments
D’après Tumova et al 2000
Protéoglycannes à Héparanes sulfate (syndécanes, glypicanes) et facteurs de croissance.
Signal
syndécane
FGFR
HS
Membrane cellulaire
FGF
K Senni
D’après Plotnikof et al 1999
Zn
ZnZn
Zn
Zn
V3
MMP-2
TIMP-2
MT1-MMP
CD44 V3 isoform
MMP-7
MMP-9
Heparan sulfate
D’après Seiki Curr Op Cell Biol 2002Membrane plasmique
Interaction CD44 - protéases matricielles:
migration cellulaire, remodelage tissulaire
V3V3
Réplication, différentiation, survie cellulaire
proHB-EGF
ErbB4
CD44v3MMP-7
Focalisation de la MMP-7 (matrilysine) par le CD44v3
Implication dans la survie cellulaire
D’après Yu et al 2002
Les glycosaminoglycannes sont impliqués dans de nombreux mécanismes biologiques
Crinopexie:potentialisation/protection des facteurs de croissance
Contrôle de la protéolyse matricielle
Structuration macromoléculaire/formation d’hydrogels
Régulent avec la margination des cellules inflammatoires
Des acteurs essentiels à la résolution des remodelages tissulaires
De bons candidats en thérapie tissulaire
MAIS
ORIGINE ANIMALEACTIVITE ANTICOAGULANTE
VOLUME/COÛT
II Favoriser la régénération tissulaire.
Trouver des substituts
GAGs mimétiques
I S’opposer au processus inflammatoire
Exopolysaccharides bactéries extrêmophiles
Fucanes
Source: biotechnologie marine
2 Des structurants tissulaires, des biomatériaux
1 Des effecteurs pharmacologiques
Héparane-mimétiques
Hyaluronane-mimétiques
Polysaccharides GAGs mimétiques
Héparane-mimétiques: Portrait robot
- PM: 5 à 80 kDa
- 20 à 40% sulfates/sulfonates
-Structure tridimensionnelle importante -Souplesse de chaîne, embranchements
FucanesPolysaccharides pariétaux des phéophycées
Ascophyllum nodosum
29%6.3%55.7%16000Fucane
OSO3-Ac uronique L-fucosePM
OOH
ROO
OSO3-
OSO3-
RO
O
O
RO
O
O
R = SO3- ou fucose sulfaté
R= SO3-, fucose sulfaté ou acide uronique
Yellow submarine
Source hydrothermale profonde
Écosystème extrême
Exopolysaccharides des bactéries extrêmophyles abyssales (EPS)
Exopolysaccharides des bactéries extrêmophyles abyssales (EPS)
Sélection
Fermentation Production pilote
Boisset C
GY 785 DR
Sulfatation
GY 785
Dépolymérisation radicalaire
EPS d’Altéromonas infernus: GY 785
GY 785 DR0S
Sulfate
Brevet FR0406405
[SO3Na] 2
[4)--Glc-(14)--GalA-(14)--Gal-(1] 3 1
-Glc-(1 6)--Gal -(14)--GlcA -(1 4)--GlcA 2 3
1 1 -Glc -Glc
[SO3Na]
[SO3Na]
[SO3Na]
3
4
6
GY 785 DROS
Roger et al 2004
40%, de sulfates, des acides uroniques, des oses neutres et une structure branchée
PM 20-30 kDa
I S’opposer au processus inflammatoire
(+)
Roulement + adhésion faible
(sélectines)
Perméabilité vasculaire
Prolifération
Chimiotactisme
(+)
C5aC3a (+)
Histamine
IL-8 LTB4 LPS F-Met peptides C5a
Leucocytes
Margination
Adhésion forte(Intégrines…)
Emigration
Cascade du complément
Lumière vasculaire Endothélium Membrane basale
Protéases
Protéases
IL-1
(+)
Chimiokines(IL-2, TNF
(+)
(+)
Pro-MMP 12
Mastocyte sensibilisé
(Dégranulation)
Dégradation et désorganisation de la matrice extracellulaire
MMP 8
(+)
Polynucléaire neutrophile
MMPs
Pro-MMP 8
ElastaseleucocytaireCathepsine G
SynergieMMP 12
Macrophage (+)
(+)
Cellules résidentes
TNF
IL-1
Pro-MMPs
Lymphocytes
K Senni
Inflammation
CIBLE 1
Recrutement des cellules inflammatoires: activités anti-complémentaires
Inhibition de la voie du complément
Productions d’anaphylatoxines, d’opsonines
Activation et Recrutement
Recrutement des cellules inflammatoires: activités anti-complémentaires
C5aC3a
Cascade du complément
C5 et C3 convertases
0
20
40
60
80
100
5µg 10µg
Pou
rcen
tage
d'i
nhib
itio
n
Fucane FTDR
GY785 DROS
GY785 OSDR
Activités anti-complémentaires des dérivés de l’EPS GY785 et du fucane
Courtois A
Inhibition de l’activité cytolytique
Brevet FR0406405
CIBLE 2
Recrutement des cellules inflammatoires: inhibition de la margination
Recrutement des cellules inflammatoires: inhibition de la margination
-Interférence avec les sélectines
-Séquestration des chimiokines
Leucocytes
ProtéasesGlycosidases
Rolling des leucocytes
ProtéasesGlycosidases
Membrane basales
Modèle « d’air pouch » chez la souris: chambre de chémo-attraction in vivo
Dr CD Arréto: Faculté de Chirurgie Dentaire Montrouge, Données personnelles
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000N
om
bre
de
cellu
les
x 10
00Témoin
FucoidineLeucocytes PMNs
Fucane (10mg/kg/h)
Fucane--
Les protéases matricielles
CIBLE 3
Les protéases matricielles
2 Métalloprotéases matricielles (MMPs): (collagénases, gélatinases, stromélysines…)
Inhibiteurs: Serpins
Remodelage tissulaire:Physiologique: embryogénèse, angiogénèse, cicatrisation…Pathologique: Invasion tumorale, ulcèrations chroniques, parodontopathies, …
1 Sérine Protéases (PAs, plasmine, élastase leucocytaire, cathepsine G…)
Dégradation et désorganisation de la matrice extracellulaire
Elastase leucocytaireCathepsine G
Synergie Activation des MMPs
1 Sérine protéases
- Utilisation de fucane comme régulateur de la reconstruction des tissus conjonctifs. Senni et al 1997 Brevet FR2772618
Inhibition de sérine protéases
Substrat synthétique
Interaction avec lysines du site actif
sur substrat naturel?
Exemple: Les fibres élastiques cutanées
Coupes histologiques
Témoin ELH
ELH/ Fucane (10µg/ml)
ELH / Fucane (100µg/ml)
EpFE
Inhibition de l’élastase leucocytaire humaine (ELH)
Ox
Ela
Inhibition de l’élastase leucocytaire humaine (ELH) par un fucane
Lu
LE
Témoin
ELH/fucane (1µg/ml)
ELH/Fucane (100µg/ml)
ELH
Métalloprotéases matricielles (MMPs)
Dégradation et désorganisation de la matrice extracellulaire
MMPs
Cellules résidentes
TNF
IL-1
Pro-MMPs
Les fucanes inhibent la sécrétion de la gélatinase A par des fibroblastes dermiques en culture
Les fucanes inhibent l’induction par l’IL-1 de la MMP-3 sécrétée par des fibroblastes dermiques en culture
(+)
Roulement + adhésion faible
(sélectines)
Perméabilité vasculaire
Prolifération
Chimiotactisme
(+)
C5aC3a (+)
Histamine
IL-8 LTB4 LPS F-Met peptides C5a
Leucocytes
Margination
Adhésion forte(Intégrines…)
Emigration
Cascade du complément
Lumière vasculaire Endothélium Membrane basale
Protéases
Protéases
IL-1
(+)
Chimiokines (IL-2, TNF
(+)
IL-1
(+)
Pro-MMP 12
Mastocyte sensibilisé
(Dégranulation)
Dégradation et désorganisation de la matrice extracellulaire
MMP 8
(+)
Polynucléaire neutrophile
MMPs
Pro-MMP 8
ElastaseleucocytaireCathepsine G
SynergieMMP 12
Macrophage(+)
(+)
Cellules résidentes
TNF
IL-1
Pro-MMPs
Lymphocytes
K Senni
Les héparane-mimétiques marins: des anti-inflammatoires non conventionnels?
II Favoriser la régénération tissulaire
Signal
syndécane
FGFR
Héparane sulfate
Membrane cellulaire
FGF
Senni K
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
J2 J4 J7 J10
jour de culture
Ind
ice
Té
mo
in
Témoin0,1µg/ml1µg/ml10µg/ml100µg/ml
0
20
40
60
80
100
120
140
160
J2 J4 J7 J10
Jours de culture
Ind
ice
Té
mo
in
Témoin
1µg/ml
10µg/ml
100µg/ml
Prolifération de fibroblastes dermiques en culture bidimensionnelle
GY785 DROS
Fucane
Dérivés d’EPS, fucanes et prolifération cellulaire
K Senni
FGF
Forte concentration en polysaccharides:
prolifération
Signal
FGFR
Dérivés d’EPS, fucane
Membrane cellulaire
FGF
Faible concentration en polysaccharides:
prolifération
Ex: Fibroblastes
Myofibroblaste SMA positif
Fibroblaste SMA négatif
Résolution des pathologies fibrotiques ?
Sélection phénotypiques
Lors de certains types de fibroses il y persistance d’un phénotype fibroblastique sécrétoire: le myofibroblaste
Sélection de sous populations fibroblastiques par le GY785DROSImmuno-détection de l' actine des muscles lisses dans des cultures fibroblastiques en cours de
prolifération (7ème jours)
a
fe
dc
b
Observation de sous populations myofibroblastiques dans une culture de fibroblastes dermiques: (a, c et e) GY785 DRS (10µg/ml) (b, d et f) Témoin. -Grandissements: a et b 13; c et d 26, e et f 52 -Immunodétection de l' SMA et contre-coloration à l'hémalun). Myofibroblaste isolé,
La stimulation de la prolifération cellulaire s'accompagne d'une sélection des sous populations non myofibroblastiques
TEMOINGY785 DROS
Senni KBrevet FR0406405
En présence d’une matrice extracellulaire?
Tissu conjonctif reconstruit
(fibroblastes, cellules souches mésenchymateuses)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Jours de culture
No
mb
re d
e c
ellu
les
(x
10
-5)
Témoin GY785 DRS 10µg/ml
Prolifération au sein d’un derme reconstruit
GY785 DROS 10µg/ml
Brevet FR0406405 Gueniche F
Hyaluronane-mimétiques : Portrait robot
-Viscosité
- PM 1000 kDa
Couverture épidermiques des plaies chroniques
L’acide hyaluronique: un biomatériau
Acide hyaluronique: PM = 500 à 1000 kDa
[((3)D GlcNac-(1-4) D-GlcA (1)]n
HE800: PM = 800kDa
(3) D GlcNAc (1-4) D GlcA (1-4) D GlcA (1-4)-D-GalNAc (1)]n
L’exopolysaccharides de Vibrio diabolicus
HE 800 = Hyaluronate mimétique?
A New Bone-Healing Material: A Hyaluronic Acid-Like Bacterial Exopolysaccharide Zanchetta et al Calcif Tissue Int (2003) 72:74–79
Cicatrisation osseuse in vivo
Fischer AM
U765 LBMM
Guézennec J
EA 2496
Godeau G
-Biotechnologie marine
-Thérapies tissulaires
GdR Exopolysaccharides bactériens
Chimie, angiogenèse, ingénierie et régénération tissulaire
-Valorisation industrielle
Faculté de Chirurgie Dentaire
Gaston Godeau
Myriam Yousfi
Farida Gueniche
Grégory Korb
Florence Fioretti
Sylvie Igondjo-Tchen
Karim Senni
Biotechnologie et Molécules marine
Les bretons
Jean Guézennec
Sylvia Colliec-Jouault
Claire Boisset
Corinne Sinquin
Jacqueline Rastikol
Anthony Courtois
Patrick Durand
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