fetal nükleik asit

İstanbul Üniversitesi Fetal Nükleik Asit Araştırma Grubu Sonuçları

Türkiye Maternal Fetal Tıp ve Perinatoloji Derneği VIII.Kongresi 11-14 Ekim 2012 , İstanbul

sFETAL DNA

Lo ve ark. 1997 yılında anne plazma ve serumunda erkek fetusa ait

DNA’yı saptadığını yayınladı.

Lo YM ve ark. Lancet 350 , 485 , 1997

GENOM DNA

TRANSKRİPTOM RNA (mRNA , rRNA , tRNA , miRNA , siRNA , snoRNA )

PROTEOM

GEN DNA molekülü üzerinde protein kodlayan özgül bir nukleotid dizisidir.

Hastalıklar genetik koddaki hata veya kodun proteine çevrilmesi sırasında oluşan düzensizlikler nedeniyle olabilir.

.Spektral analiz

. Elektroforetik analiz

. PCR

.Real-time PCR

. Dijital PCR

. Southern Blot Analiz

.Q-PCR

. Array-CGH

. Dizileme

. Kopya sayısı değişiklikleri

.Elektroforetik Analiz

. cDNA ile PCR

.cDNA ile Dijital PCR

.Northen Blot Analiz

.Dizileme

. Mikroarray ile gen anlatımı

.Western Blot Analiz

.Poliakrilamid jel elektroforezi

.Kromotografik yöntemler

Genomik DNA

Transkriptomik RNA

Proteomik Protein

Yöntemler Anlatım Miktar Dizi analizi esasına dayanmaktadır.

sFETAL DNA

RT-PCR Dijital PCR QF-PCR Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (Array CGH) Tüm genom mikrodizin (microarray) MPSS (Masif paralel rastgele dizileme)

Cinsiyet RhD Tek gen hastalıkları Kromozom sayısı Kromozom yapısı Preeklampsi IUGG Fetal Fizyoloji Fetal Gelişim

İstanbul Üniversitesi Fetal Nükleik Asit Araştırma Grubu

İstanbul Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum ABD Prof.Dr. Hayri Ermiş Dr. İbrahim Kalelioğlu

Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum ABD Prof.Dr.Kılıç Aydınlı Prof.Dr.Semih Kaleli Doç.Dr.Ali Benian Dr. Görkem Yosun Zeybek Dr. Hayrettin Şahin

İÜ Fen Fakültesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü Y.Doç.Dr. Tuba Günel Mohammad Hosseini (Doktora öğr) Ece Gümüşoğlu Didem Altındirek

sFETAL DNA Cinsiyet Tayini

Kuşkulu Genitalia KAH X – Kromozomu geçişli hastalıklar

Maternal kanda cinsiyet tayini yapılan

5.-10. GH arasındaki 24 olgunun analiz sonuçları İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu

Marker gen olarak Y kromozomu üzerinde bulunan DYS14 geni kullanıldı

5.GH 10 olgu

6.GH 7 olgu

7.GH 3 olgu

9.GH 3 olgu

10.GH 1 olgu

RT-PCR ile 15 erkek (pozitif ) 9 kız ( negatif ) sonuç elde edildi ve bütün sonuçlar doğumdan sonra doğrulandı ( % 100 )

sFETAL DNA RhD Tayini

Rh sisteminin antijenleri 1. kromozom’da taşınan bir çift paralog gen

(RHD-RHCE) tarafından kodlanır.

RHD RHCE

D+

RHD RHCE

veya

D-

Maternal kanda RHD geni açısından analiz edilen

11.-15. GH arasındaki immunize olmamış 60 olgunun analiz sonuçları

İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu

Örnek Exon 7 CT Exon 10 CT Fetal RHD (34,11 – 37,21) (34,45 – 37,35)

_________________________________________________________________ 40 (%66.7) pozitif pozitif pozitif 17 (%28,3) negatif negatif negatif 2 (% 3.3) negatif pozitif RhDΨ

RHD variant psödogen

1 (% 1.6) pozitif negatif pozitif

Exon 7 daha güvenilir _________________________________________________________________

SERBEST FETAL DNA ile RHD TANISI

T. Gunel, I. Kalelioglu, A. Gedikbasi, H. Ermis

and K. Aydinli Genet. Mol. Res. 10 (4): 2653-2657 (2011)

Detection of fetal RHD pseudogene (RHDΨ) and hybrid RHD-CE-Ds from RHD-negative pregnant women with a free DNA fetal kit

Normal Preeklampsi

Desidua

1/3

miyometriyum

Spiral arter Spiral arter

Bazal arter Bazal arter

Radial arter

İntervillöz aralık

Daralmış

damar

Fizyolojik değişiklikler

çap 500 mm

Elastik müsküler duvar çap 150-200 mm Radial arter

Yetersiz trofoblastik invazyon

Oksidatif stres artışı

Sitokin salınımında bozukluk

Maternal dolaşıma trofoblast

salınımında artış

Apoptosis artışı

Endotel hasarı

Akut aterozis

Tromboz veya luminal obliterasyon

Trombofili

Antifosfolipid sendromu

İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu

sFetal DNA Preeklampsi Sonuçları

REAL TIME PCR ARACILIĞI İLE ANNE KANINDA FETAL DNA MİKTARININ SAPTANMASI VE PREEKLAMPSİ GELİŞİMİ İLE

İLİŞKİSİNİN ORTAYA KOYULMASI

Zeybek YG1, Gunel T2, Kaleli S1 Benian A1,Aydınlı K1

1: İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Kadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı

2: İstanbul Üniversitesi, Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

Zeybek YG ve ark : Clinical evaluations of cell-free fetal DNA quantities in pre-eclamptic pregnancies , J. Obstet. Gynaecol. Res (baskıda)

MATERYAL VE YÖNTEM

• 26-40 gebelik haftaları arasında klinik olarak tanı koyulmuş 30 preeklamptik hasta 18 kontrol hastası ile eşleştirildi.

• Anne kanındaki serbest fetal DNA düzeyi

SRY (Y kromozomu üzerinde cinsiyet belirleyici bölge) ve GAPDH (gliseraldehid fosfat dehidrogenaz) gen dizileri kullanılarak Real Time PCR yöntemi ile karşılaştırıldı.

Zeybek ve ark 2012

SONUÇLAR

Zeybek ve ark, 2012

SONUÇLAR

• 30 preeklamptik hastada aynı haftadaki kontrol hastalarına göre anne kanındaki serbest DNA düzeyinde 3,06 kat

• ikinci trimestrede 1,5

• üçüncü trimestrede 3,5

• Erken başlangıçlı preeklampside 4,6

• Geç başlangıçlı preeklampside 3,2 kat artış saptanmıştır.

Zeybek ve ark ,2012

Real Time PCR ile 12.-14. Gebelik Haftasında CD34 ve CD 133 Geninin Maternal Kanda Düzey Analizi ve Gebelik Prognozu ile İlişkisi

Dr. Hayrettin Şahin – Uzmanlık Tezi - 2012

• 12.-14. GH’ları arasında 65 gebe rastgele seçildi.

• 6 hastada preeklampsi gelişti.

• CD34+ ve CD133+ kodlayan serbest fetal DNA analiz edildi.

Fetal Anöploidilerin Noninvaziv Prenatal Tanısı

Maternal kanda çalışılan sFetal DNA ile trizomi 21 sonuçlarımız

İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu

40 örnek çalışıldı. 20 tanesi Trizomi olgularına 20 tanesi normal gebelere ait DNA örnekleri incelendi.

Yukarıdada görülen grafik 2.trimestrede sitogenetik olarak trizomi saptanan 10 gebenin

tıbbi tahliye öncesi alınan maternal kan örneklerinde DSCR3 (Down Syndrome Critical

Region ) geninin anlatımına göre normal fetal DNA ile karşılaştırılmasından elde edilen

değerleri gösteriyor. Tüm örneklerde artan gen anlatım miktarları görülüyor.

Yukarıda ise 15 gebede çalışılan DSCR3 (Down Syndrome Critical Region ) genine ait

miktar belirleme grafiği. Yedinci ve 11. örnekler trizomi 21 olgularına diğerleri normal

olgulara ait. Alta doğru olan çizgi grafikleri trizomili örneklere göre genin miktarının az

olduğunu gösteriyor (normal olgular).

Preeklampsi IUGG Fetal Gelişim Fetal Fizyoloji

Maternal kanda çalışılan sFetal RNA / microRNA

İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu RT-PCR Dijital PCR QF-PCR Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (Array CGH) Tüm genom mikrodizin (microarray) MPSS (Masif paralel rastgele dizileme)

PLASENTAL micro RNA • Maternal plazmadaki plasental microRNA’lar küçük (19-25 nt) ,

tek sıra , kodlamayan ve daha stabil RNA’lardır.

• Hedef mRNA’nın 3’ ucuna (kopyalama yapmayan ) bağlanır ve protein kopyalamasını baskılar. Bir veya birden fazla hedef genin anlatımını değiştirerek gelişim , farklılaşma , çoğalma , hücre ölümü gibi süreçlerde rol oynarlar.

• micro RNA’lar bir çok genin anlatımının anlaşılmasında etkili olabilir. Bu nedenle yeni bir belirteç bulmak için en uygun nükleik asittir.

• 20 normotensif

• 20 preklamptik hasta incelendi

• mir-152 ( HLA-G ‘yi suprese eder , NK-cell kökenli sitolizi indükler , immuniteyi

arttırır )

Çalışmada değişmediği bulundu.

• mir-210 ( sinsisyotrofoblastlardan eksprese edilir. İmmunite , apoptozis ve lipid

metabolizmasından sorumludur)

Çalışmada 2x arttığı saptandı

Maternal kanda çalışılan sFetal RNA / microRNA sonuçları

İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu

Mir-152 ve mir-210 ‘u VEGF geninin düzenlenmesinde rol oynadıkları için araştırmayı tercih ettik.

Serum microRNA expression in pregnancies with preeclampsia

T. Gunel1, Y.G. Zeybek2, P. Akçakaya1, I. Kalelioğlu3, A. Benian4,H. Ermis3 and K. Aydınlı 5 1Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Science, Istanbul University, Vezneciler, Istanbul, Turkey 2Siverek State Hospital, Sanlıurfa, Turkey 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Istanbul University, Istanbul, Turkey 4Department of Obstetrics and Gynecology, Cerrahpasa Medical Faculty, Istanbul University, Istanbul, Turkey 5Medicus Health Center, Istanbul, Turkey Corresponding author: T. Gunel E-mail: gunel@istanbul.edu.tr Genet. Mol. Res. (2011) Ahead of Print Received October 4, 2011 Accepted November 1, 2011 Published November 8, 2011 DOI http://dx.doi.org/10.4238/2011.November.8.5

Preeklampsi ile bağlantılı olarak farklı metabolik yollarda seçtiğimiz özel genler ile belirteç arayışlarımız sürmektedir.

sFETAL DNA , sFETAL RNA ,miRNA ve Fetal Tıp

Cinsiyet RhD Tek gen hastalıkları Kromozom sayısı Kromozom yapısı Preeklampsi IUGG Fetal Fizyoloji Fetal Gelişim

RT-PCR Dijital PCR QF-PCR Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (Array CGH) Tüm genom mikrodizin (microarray) MPSS (Masif paralel rastgele dizileme)

PRENATAL TANININ GELECEĞİ

• Serum tarama testleri ve/veya sFETAL DNA’nın / sFETAL RNA’nın analizi , bireysel fetal tıp , tedavi?

• İnvaziv girişim daha az yapılacak, sitogenetik analizde patolojik bulgu > % 99

• ULTRASONOGRAFİ

Teşekkür ederim ....

sFETAL microRNA

• Plasental microRNA transkriptleri maternal plazmada 4.GH’sından itibaren saptanabilir.

• Ortalama yarılanma yaşamı 14 dakikadır.

• Doğumdan sonra hızla anne kanından temizlenir.

Chiu RW ve ark. Clin Chem , 52 , 313 , 2006

sFETAL DNA RhD Tayini

• RT-PCR ile ilk trimestrede sensivite % 100.

• Yanlış pozitif olgular genellikle RhD psödogeninden (nonfonksiyonel) kaynaklanıyor.

• Özel primer’ler ile bu hata büyük oranda giderilebiliyor.

Finning KM ve ark. Transfusion, 42 , 1079 , 2002

Costa MJ ve ark. Br J Haematol , 119 , 255 , 2002

Günel T ve ark. Genet Mol Res , 10 , 2653 , 2011