インフルエンザウイルスの 転写機構を視る -...

インフルエンザウイルスの転写機構を視る

野田 岳志京都大学ウイルス研究所 ウイルス微細構造研究領域JSTさきがけ

160716

京都大学ウイルス研究所

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下鴨神社

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鴨川

「視る研究」

見る…なんとなく見る。観る…見物する、観賞する。視る…考えながら注意深く見る。

「視る研究」

見る…なんとなく見る。観る…見物する、観賞する。視る…考えながら注意深く見る。

さまざまな顕微鏡を使った研究

蛍光顕微鏡原子間力顕微鏡

透過型電子顕微鏡

クライオ電子顕微鏡当研究室の顕微鏡

なぜ、さまざまな顕微鏡が必要なのか？

視るウイルス研究の究極の目標

1. 細胞の中で（その場で）2. 原子レベルで

（非常に高い分解能で）3. 構造・変化・動き

（生きている状態で）

を視覚的に明らかにして、ウイルスの増殖機構を理解する。

これらを満たす究極の顕微鏡は存在しない

なぜ、さまざまな顕微鏡が必要なのか？

それぞれの特徴・長所がある。これらを組み合わせて使う必要がある。

動き・変化

分解能

その場

動

静

in situ

in vitro

低高

電顕

原子間力顕微鏡

NMR

X線結晶

蛍光顕微鏡

蛍光顕微鏡

○見たいものが見える○その場で見られる○動きも見られる

▲そのものの構造は見えない▲分解能が高くない▲見たいもの以外は見えない

(高速)原子間力顕微鏡

○比較的高い分解能○動きも見られる

▲その場では見えない▲小さいものしか見られない▲何を見てるか断言できない

(クライオ)電子顕微鏡

○比較的高い分解能○画像解析で高分解能○その場で見ることも可能

△固定・脱水・染色等の処理▲動き・変化は見られない▲何を見てるか断言できない

「視る研究」

特徴を理解して使えば、顕微鏡法はパワフルな研究ツール！

1. 百聞は一見に如かず

間接的な証拠を集めるより、1枚の写真で証明。

2. 代替法がない。

見ないとどうしてもわからないこともある。

見て初めてわかることもある

百聞は一見に如かずの例：インフルエンザウイルスのゲノムパッケージング機構

インフルエンザウイルスの遺伝子RNA

1

2

3

4

5

6

7

8

各遺伝子分節から様々なタンパク質が作られる

PB2

PB1/PB1-F2

PA

HA

NP

NA

M1/M2

NS1/NS2

vRNA

NP

PB1

PB2

PA

1 2 3 4 5 6 7 8

50-

120nm

12nm

遺伝子RNA-タンパク質複合体 (RNP）

インフルエンザウイルスの増殖環

インフルエンザウイルスの増殖環

インフルエンザウイルスの増殖環

インフルエンザウイルスの増殖環

感染性を持つ完全なウイルス粒子を形成するためには…

８種類のRNA分節をウイルス粒子内に取り込む必要がある

インフルエンザウイルスの増殖環

1 2 3 4 5 6 7 8

８種類のRNA分節を個々のウイルス粒子がもれなく取り込むのはとても難しい

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8

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感染細胞内でゲノムが複製

８種類のRNA分節を個々のウイルス粒子がもれなく取り込むのはとても難しい

123

4 5

6

7 8

1 2

3

4

5

6

7

8

1

234

5

6

78

12

3

4 56

7

8

感染細胞

123

4 5

6

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1 2

3

4

5

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7

8

1

234

5

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12

3

4 56 8

感染細胞

1 2 3 45 6

7

7 8

袋から８種類を選びとる

ランダム説

数も種類もバラバラに取り込まれる。

たまたま8種類を取り込んだウイルスのみ感染性を持つ。あるいは、複数の不完全なウイルスが１つの細胞に感染する。

Noda & Kawaoka

PNAS 20１2

8種類8本が選択的に取り込まれる。

ウイルス粒子はすべて感染性を持つ。

Noda & Kawaoka

PNAS 20１2

選択仮説

個々のウイルス粒子がどのようにゲノムを取り込むのか？

ウイルス粒子の中を観察

50年以上もの謎

？

？

縦断面を観察

100nm

vRNA

NP

PB1

PB2

PA

RNP

横断面を観察

50nm

Noda et al. Nature, 2006

8本のRNP

電子線トモグラフィー(3次元電子顕微鏡法)

電子顕微鏡で様々な角度から試料を撮影し、それらをコンピューターで組み合わせ、試料の3次元立体構造を作る。

電子線トモグラフィー

電子線トモグラフィー

電子線トモグラフィー

Noda et al. Nature communications, 2012

12345678

ほぼすべてのウイルス粒子が8本のRNPを取り込んでいた。8本のRNPは長さが違っていた。

8種類のゲノムRNAを取り込む

百聞は一見に如かずの例：インフルエンザウイルスのゲノムパッケージング機構

代替法がないの例：

見ないとどうしてもわからないこともある。

見て初めてわかることもある。

インフルエンザウイルスの転写機構

セントラルドグマ

DNA

タンパク質

mRNA

(-) vRNA

(+) mRNA

インフルエンザウイルスの転写・複製

複製転写

(+) cRNA

(-) vRNA

(+) mRNA

インフルエンザウイルスの転写・複製

複製転写

(+) cRNA

翻訳

タンパク質

・ウイルスゲノムのコピー

・ウイルスRNAポリメラーゼ

(-) vRNA

(+) mRNA

インフルエンザウイルスの転写・複製

複製転写

(+) cRNA

翻訳

タンパク質

・ウイルスRNAポリメラーゼ

・mRNAを合成

インフルエンザウイルスの遺伝子RNA

1

2

3

4

5

6

7

8

各遺伝子分節から様々なタンパク質が作られる

PB2

PB1/PB1-F2

PA

HA

NP

NA

M1/M2

NS1/NS2

5’ 3’ vRNA

NP

RNA polymerase

(PB2, PB1, PA)

RNP

vRNAはNPとウイルスポリメラーゼとともに二重らせんのRNP複合体として存在する

インフルエンザウイルスvRNAの転写

NP

RNP

5’ 3’ vRNA mRNAの合成転写

vRNAはRNPの状態で

転写されるRNA polymerase

(PB2, PB1, PA)

インフルエンザウイルスvRNAの転写

感染細胞におけるウイルスゲノムの転写

核

細胞質

ウイルス粒子

吸着

侵入核

細胞質

感染細胞におけるウイルスゲノムの転写

脱殻

膜融合

核

細胞質

感染細胞におけるウイルスゲノムの転写

核内輸送

核

細胞質

感染細胞におけるウイルスゲノムの転写

Pol II

DNA

m7G

宿主pre-mRNA

宿主PolIIがpre-mRNAを合成

CTD

感染細胞におけるウイルスゲノムの転写

Cap

Pol IIm7G

宿主pre-mRNA

CTD

感染細胞におけるウイルスゲノムの転写

RNPがPolIIに結合

Cap

転写開始

Pol II

宿主pre-mRNA

感染細胞におけるウイルスゲノムの転写

1. Cap結合

Cap

Pol II

宿主pre-mRNA

感染細胞におけるウイルスゲノムの転写

2. Cap-RNAの切断

Cap

Pol II

感染細胞におけるウイルスゲノムの転写

3. 転写開始(プライマー依存的)

Pol II

感染細胞におけるウイルスゲノムの転写

4. 伸長反応（vRNA 3’→5’）

Pol II

感染細胞におけるウイルスゲノムの転写

5. Poly(A)付加(U track)

ウイルスゲノムの転写

1. Pre-mRNAのCapに結合2. Cap-RNA切断（Cap snatching）3. プライマー依存的転写開始反応4. 伸長5. U trackによるPoly(A)付加

転写中のRNPの構造?

ウイルスゲノムの転写

1. Pre-mRNAのCapに結合2. Cap-RNA切断（Cap snatching）3. プライマー依存的転写開始反応4. 伸長5. U trackによるPoly(A)付加

疑問点

3’

3’

RNP構造変化モデル?

AAA

3’

3’

5’

5’

ポリメラーゼ移動モデル?

[目的]

[方法]

in vitro 転写系を用いて、転写中RNPの顕微鏡解析

転写中のRNPの構造を明らかにする構造変化の有無?どのような構造変化?

謝辞

[京都大学ウイルス研究所]

中野雅博

神道慶子

村本裕紀子

[沖縄科学技術大学院大学]

Matthias Wolf

杉田征彦

[金沢大学バイオAFM先端研究センター]

古寺哲幸

[東京大学医科学研究所]

河岡義裕