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Post on 05-Aug-2019
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Fische und Stress –Tierschutzaspekte auf
molekularbiologischer Ebene
Dr. med. vet. Henrike Seibel
Hintergrund Tierschutzaspekt immer mehr im Fokus der Öffentlichkeit
Zunehmende Intensivierung der Fischproduktion
In wie weit sind Haltungsbedingungen tiergerecht?
Art. 20a Grundgesetz: der Staat hat in Verantwortung für
die künftigen Generationen die natürliche Lebensgrundlage und
die Tiere zu schützen
§ 2 Tierschutzgesetz: Tier muss angemessen ernährt,
gepflegt und verhaltensgerecht untergebracht sein und
Schmerzen oder vermeidbare Leiden oder Schäden müssen
vermieden werden
2
Hintergrund
Etablierung von Stressparametern auf mRNA Basis aus Vollblut
Drittmittelprojekt, finanziert von der Bundesanstalt für
Landwirtschaft und Ernährung, Bundesprogramm Ökologischer
Landbau und andere Formen nachhaltiger Landwirtschaft (BÖLN)
3
Bei der Regenbogenforelle
Definition von Stress“… unspezifische Reaktion des Körpers auf jegliche Anforderung.” (Selye, 1973)
Stressor
z.B.Organismus
Reaktion
Äußere
Anforderungsbedingung,
in deren Folge es zur
Auslösung einer
Stressreaktion kommt
„… Zustand, in dem die körpereigene Homöostase bedroht ist, bzw.
angenommen wird, dass sie bedroht ist.“ (Chrousos, 1998)
4
Stressreaktion… alle Prozesse, die im Organismus als Antwort auf einen Stressor
in Gang gesetzt werden.
Gen-Expression
Stoff-wechsel
Energie-haushalt
Immun-system
Hormon-haushalt
Verhalten
Änderungen im/von …
Nerven-system
5
Dauer
Intensitiät
1. Reaktion
• Neuroendokrine Ebene (Alarmreaktion)
• Ausschüttung von Stresshormonen
• z.B. plötzliche Verhaltensänderungen
2. Reaktion
• Physiologische Veränderungen (Resistenz)
• z.B. Erythrozyten ↑ oder Blutglukosespiegel ↑
• Sauerstoffaufnahme ↑ über Kiemen (Ventilation ↑)
3. Reaktion
• Gesamtkörpereinfluss (Erschöpfung)
• z.B. Wachstum ↓ oder Reproduktion ↓
• Krankheitsanfälligkeit ↑; Immunsuppression
akutMin.-Std.
chronischTage-Wochen-Monate
Stressreaktion
6
Bild: GMA
Kein Stress Milder Stress Moderater Stress Hochgradiger Stress
Austausch von Fischmehl (50% in Basaldiät) durch Sojabohnenmehl um:
0 % 33 % 66 % 100 %
Fütterungsversuch mit Sojabohnenmehl (SBM)
Antinutritive Inhaltsstoffe
wie Saponine, Lectine, Phytinsäuren
Verkürzung der Darmzotten
↑ Durchlässigkeit der Darmschranke
Entzündungserscheinungen
7
Bild: GMA
Untersuchte Parameter
Parameter auf molekularbiologischer Basis
Hämatologische Parameter: Hämatokrit
Differentialblutbild (Dip-Quick gefärbte Blutausstriche)
andere Parameter: Cortisol-Menge im Blut
Histologie (Leber, Milz, Darm, Haut)
Wasserparameter (O2, NO2, pH, NH4, Temp.), täglich bestimmt
Wachstums- und Konditionsparameterz.B. Länge, Größe, Gewicht, Leber- und Milz-Gewicht, Futteraufnahme,
Mortalität, Gesundheitsstatus) Büsumer Fischtag 2016
8
https://www.aquaculture.uni-
kiel.de/de/fischtage/fischtag-2016-1
nach 4 Wochen
nach 8 Wochen
CD SBM33 SBM66 SBM100
K 0,89 ± 0,24 0,95 ± 0,29 0,94 ± 0,22 0,88 ± 0,20
SGR [%*d-1] 1,00 ± 0,12 0,87 ± 0,34 0,86 ± 0,1 0,44 ± 0,21
Cortisol und Kondition
V0 Initialbeprobung
CD Kontrolldiät
SBM Sojabohnenmehl
33,66,100 Austauschraten
K = Fulton´scher Konditionsfaktor; SGR = spezifische Wachstumsrate
n = 6
Stress konnte mit suboptimaler Futterformulierung erzeugt werden
0
5
10
15
20
25
30
35
Cort
isol [n
g/m
L]
Durchfall
Durchfall
Durchfall
V0 CD SBM33 SBM66 SBM100
9
Untersuchte Parameter
Parameter auf molekularbiologischer Basis
Hämatologische Parameter: Hämatokrit
Differentialblutbild (Dip-Quick gefärbte Blutausstriche)
andere Parameter: Cortisol-Menge im Blut
Histologie (Leber, Milz, Darm, Haut)
Wasserparameter (O2, NO2, pH, NH4, Temp.), täglich bestimmt
Wachstums- und Konditionsparameterz.B. Länge, Größe, Gewicht, Leber- und Milz-Gewicht, Futteraufnahme,
Mortalität, Gesundheitsstatus)
10
Ausschüttung von
Botenstoffen
DNA
mRNA
11
Bild: Seibel
DNA
mRNA
Minimal-invasive Methode zur
validen Stressdiagnostik
EDTA Vollblut
12
Bild: Seibel
Molekularbiologie
Fluidigm Biomark HD-System
C3aR C3a Rezeptor
C5aR C5a Rezeptor
CCL4-1 C-C motif Ligand 4 Chemokin
CD41 Cluster of differentiation 41
ENPP3 Ectonucleotide
pyrophosphatase/phosphodi-
esterase family member 3
FGL2 Fibinogen like protein 2
Forellen-
spezifisches
CC-Chemokin
CC- Chemokin
FTH Ferritin Heavy Chain Gen
G-CSFR Granulozyten-Kolonie-
stimulierende Faktor Rezeptor
HP Haptoglobin
HSP30 Heat Shock Protein 30
HSP47b Heat Shock Protein 47b
HSP90AA1a Heat Shock Protein 90AA
Untereinheit 1a
HSP90AA1b Heat Shock Protein 90AA
Untereinheit 1b
IgM Immunglobulin M
IL1b Interleukin 1 beta
IL4 Interleukin 4
IL6 Interleukin 6
CXCL8 CXC-Motiv-Chemokine
Ligand 8, entspricht IL8
MPO Myeloperoxidase
MX1 Myxovirus 1 Gen
NCCRP1 Non-specific cytotoxic cell
receptor protein 1
NOS2 Stickstoffmonoxid-Synthase
PPARG Peroxisom-Proliferator-
aktivierte Rezeptoren
gamma
PSMB7 Proteasome subunit beta
type- 7 precursor
SAA Serum amyloid A
SOD1 Superoxid Dismutase 1
TCRB T cell receptor beta chain
Gen
TLR20 Toll like Rezeptor 20
TLR22a Toll like Rezeptor 22a
TLR3 Toll like Rezeptor 3
TLR5 Toll like Rezeptor 5
TLR9 Toll like Rezeptor 9
TNFa Tumor Nekrose Faktor alpha
TNFb Tumor Nekrose Faktor beta
UCP2 Mitochondrial uncoupling
protein 2
13
Auszug
Allgemeine Ergebnisse
Die mRNA einiger Gene wurde z.Z. der Blutabnahme nicht
expremiert (CXCL12, HSP47α, IFNγ1, IL10, TCBP1)
Unterschiedlich hohe mRNA Expression
z.B. UCP2 zwischen 15 bis 100 Kopien / µg RNA
TLR20 bis 721.838 Kopien /µg RNA in der SBM100-
Gruppe
Teilweise deutliche individuelle Unterschiede zwischen
Fischen
14
mRNA Expression der Myeloperoxidase (MPO)
Ko
pie
n / µ
g R
NA
Zeit
nach 4 Wochen nach 8 Wochen
n = 6
p=0.029
Wichtiges Enzym der
neutrophilen Granulozyten
H2O2
Starkes
Oxidations-
mittel
bakterizid
Regulation und
Termination von
Entzündungsprozessen
CD
SBM33
SBM66
SBM100
Maximum
Median
Minimum
15
mRNA Expression des Uncoupling Protein (UCP)
Ko
pie
n / µ
g R
NA
Zeit
nach 4 Wochen nach 8 Wochen
N = 6
Besonders von Makrophagen
expremiert
Kontrolliert die Aktivierung von
Immunzellen
Hemmt die Produktion von
reaktiven O2-Spezies
p=0.014
p=0.016
CD
SBM33
SBM66
SBM100
Maximum
Median
Minimum
n = 6
16
mRNA Expression des Serum Amyloid A (SAA)
Ko
pie
n / µ
g R
NA
Zeit
nach 4 Wochen nach 8 Wochen
N = 6
p=0.079
Während Akuter-Phase-
Reaktion ausgeschüttet
Rekrutiert Immunzellen
Wichtiger Teil des angeborenen
Immunsystems
Unspezifische
Immunreaktion bei
akuter Entzündung, auch
durch Nahrungsallergene
ausgelöst (Mensch)
CD
SBM33
SBM66
SBM100
Maximum
Median
Minimum
n = 6
17
mRNA Expression der Stickstoffmonoxid-
Synthase (NOS2) K
op
ien
/ µ
g R
NA
Zeit
nach 4 Wochen nach 8 Wochen
p=0.031
Bildet Stickoxid (NO)
Produziert von verschiedenen
Immunzellen
Potenter Immuneffektor mit
antimikrobieller Aktivität
Zu viel führt zu cytotoxischen
Effekten wie Gewebe- oder
Zellzerstörung
nach bakteriellen Infektionen
hochreguliert
CD
SBM33
SBM66
SBM100
Maximum
Median
Minimum
n = 6
18
Fazit
Signifikant erhöhte mRNA Expression in der SBM100-Gruppe im vgl.
zur SBM33-Gruppe z.B. bei NOS2, SAA, UCP und MPO nach 8
Wochen
Verschiedene weitere interessante Gene noch in Auswertung
NOS2, SAA, UCP und MPO können bei Forellen auch über Blut
nachgewiesen werden
Eignung als chronische Futterstress-Anzeiger gegeben
Eignung als allgemeiner Stressparameter wird gerade noch validiert
Die hier vorgestellten Gene stehen mit, durch Sojabohnenmehl
bedingter, Unverträglichkeit und Entzündungen im Darm im
Zusammenhang
Bspw. wird IgM mit steigender Sojabohnenmehlmenge
herunterreguliert
Könnte ein Hinweis auf Immunsuppression sein
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Ausblick
Evaluierung der relevanten Stressparameter auf
molekularbiologischer Ebene in einem Fütterungsversuch auf
Haltungsbedingten Stress
Haltungsversuch nach Öko Richtlinien mit Forellen aus Starnberg
und Wielenbach in initial niedriger (2,5 kg/m3) und „hoher“ (10 kg/m3)
Besatzdichte
Ist eine der Forellenherkünfte für die niedrige/hohe Besatzdichte
besser geeignet ?
20
Carsten Schulz
für das Ermöglichen des Projektes;
Helmut Wedekind, Marcus Zielasko und Kay Lübke (LfL Starnberg)
für die gute Kooperation und Zusammenarbeit;
Alexander Rebl, Tom Goldammer und Team (FBN Dummerstorf)
für Unterstützung beim Primerdesign und Austestung geeigneter Gene;
Kati Schlachter für die Beste Unterstützung bei den Laborarbeiten;
Stephanie Michl und Frederick Kaiser für statistische Unterstützung;
Jonas Müller für die Arbeit im Rahmen seiner Bachelorarbeit;
Laura Schynawa für die Arbeit im Rahmen ihrer Masterarbeit;
Michael Schlachter, Claudia Torno, Markus Griese und allen Kollegen an
der GMA für Unterstützung und Inspiration
Vielen Dank
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