fluorek jako czynnik prozapalny i ograniczajĄcy biodostĘpnoŚĆ atp w komÓrkach makrofagÓw

FLUOREK JAKO CZYNNIK PROZAPALNY I FLUOREK JAKO CZYNNIK PROZAPALNY I

OGRANICZAJĄCY BIODOSTĘPNOŚĆ ATP W OGRANICZAJĄCY BIODOSTĘPNOŚĆ ATP W

KOMÓRKACH MAKROFAGÓWKOMÓRKACH MAKROFAGÓW

Krzysztof Woźniak

Studenckie Koło Naukowe przy Samodzielnej Pracowni Biochemii i Chemii Medycznej, Wydział Nauk o Zdrowiu

• SĄ JEDNYM Z NIEBEZPIECZNIEJSZYCH ZAGROŻEŃ PRZEMYSŁOWYCH

• ZWIĄZKI FLUORU WYSTĘPUJĄ W WODZIE, POWIETRZU I ŻYWNOŚCI

•ZATRZYMYWANE W TKANKACH TWARDYCH MOGĄ BYĆ Z NICH STOPNIOWO UWALNIANE

• DŁUGOTRWAŁA EKSPOZYCJA NA FLUOREK STYMULUJE STRES OKSYDACYJNY

• STRES OKSYDACYJNY JEST STYMULATOREM PROCESU MIAŻDŻYCOWEGO

• W POWSTAWANIU BLASZKI MIAŻDŻYCOWEJ UCZESTNICZĄ MAKROFAGI

Uproszczony schemat powstawania miażdżycy

LDL Ox-LDL

Monocyt

Makrofag

Komórka piankowata

ROSROS

(Reaktywne formy tlenu)(Reaktywne formy tlenu)ROS ROS - - Reactive Oxygen SpeciesReactive Oxygen Species

Receptor LDL

ReceptorZmiatający CD36

• GŁÓWNYM MIEJSCEM POWSTAWANIA REAKTYWNYCH FORM TLENU (ROS) W MAKROFAGACH SĄ MITOCHONDRIALNE ENZYMY ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO

• ŹRÓDŁEM ROS W MAKROFAGACH SĄ TAKŻE ENZYMY AKTYWOWANE PODCZAS RÓŻNICOWANIA MONOCYTÓW W MAKROFAGI (LIPOKSYGENZY, CYKLOOKSYGENAZY, OKSYDOREDUKTAZA NADP)

Mając na uwadze, że zwiększona synteza ROS w makrofagach jest czynnikiem ryzyka rozwoju procesu miażdżycowego za cel pracy przyjęto próbę oceny wpływu fluorków na:

• WEWNĄTRZKOMÓRKOWĄ SYNTEZĘ ROS

• AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO

• SYNTEZĘ ATP

• BADANIA BYŁY PRZEPROWADZONE NA MAKROFAGACH UZYSKANYCH Z LINII KOMÓREK MONOCYTARNYCH THP-1

• MAKROFAGI HODOWANO Z ROZTWORAMI FLUORKÓW O STĘŻENIU 1,3 i 10 μΜ

• STRES OKSYDACYJNY OZNACZANO POPRZEZ POMIAR WEWNĄTRZKOMÓRKOWEGO UTLENIANIA DCFH-DA PRZY UŻYCIU CYTOMETRU PRZEPŁYWOWEGO

• SYNTEZĘ ATP OZNACZANO PRZY UŻYCIU KITU I CZYTNIKA PŁYTEK ELIZA

1. Inkubacja makrofagów z roztworami fluorków spowodowała istotne obniżenie ilości ATP w komórkach wraz ze wzrostem stężenia dodanego roztworu fluorku,

Ilość syntetyzowanego ATP

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

% fl

uore

scen

cji

K neg H2O F 1μM F 3μM F 10μM

44%44%

96%96%92%92%

- Różnice w odniesieniu do kontroli pozytywnej.

2. W tym samym czasie rosła produkcja wolnych rodników tlenowych (ROS) wraz ze wzrostem stężenia dodanego roztworu fluorku

Ilość syntetyzowanych ROS

0

50

100

150

200

250

300

350

% f

luor

esce

ncji

K neg H2O F 1μM F 3μM F 10μM

P< 0,05

P< 0,05

3. Dodanie do hodowli inhibitorów łańcucha oddechowego spowodowało istotne, ale nie całkowite obniżenie ilości syntetyzowanych ROS

Ilość syntetyzowanego ROS przy dodaniu

inhibitorów łańcucha oddechowego

0

50

100

150

200

250

300

350

% f

luor

esce

ncji

K neg H2O F 1μM F 3μM F 10μM

93%93%92%92% 94%94%94%94%94%94%

- Różnice w odniesieniu do syntezy ROS bez inhibitorów

4. Dodanie do hodowli apocyniny (inhibitora oksydoreduktazy NADH) spowodowało nieznaczne obniżenie syntezy ROS w makrofagach.

0

50

100

150

200

250

300

350

% f

luor

esce

ncji

K neg H2O F 1μM F 3μM F 10μM

Ilość syntetyzowanego ROS

przy dodaniu apocyniny 3%3%

25%25%5%5%

25%25%29%29%

- Różnice w odniesieniu do syntezy ROS bez inhibitorów

• FLUOREK SODU DODANY DO MAKROFAGÓW PRAWDOPODOBNIE STYMULUJE STRES OKSYDACYJNY

• OBJAWIA SIĘ TO WZROSTEM SYNTEZY ROS ORAZ OBNIŻENIEM ILOŚCI SYNTETYZOWANEGO ATP

• PRAWDOPODOBNIE DZIAŁANIE FLUORKU POLEGA NA ROZPRZĘGANIU ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO

• ZASTOSOWANIE APOCYNINY POTWIERDZIŁO UDZIAŁ KOMPLEKSU I ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO W SYNTEZIE ROS

• WZRASTAJĄCE STĘŻENIE FLUORKU BYŁO ISTOTNIE SKORELOWANE ZE WZROSTEM SYNTEZY ROS ORAZ ZE SPADKIEM STĘŻENIA ATP