formación y evolución de pigmentos de tipo piranoantociano
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1 Dora Blanco Vega 2013
Formación y Evolución de Pigmentos de Tipo
Piranoantociano en la Elaboración de Vinos
Tintos y Rosados
Tesis Doctoral
Dora Blanco Vega
Octubre 2013
Justifiación y Objetivos.
2 Dora Blanco Vega 2013
Justifiación y Objetivos.
3 Dora Blanco Vega 2013
ÍNDICE
1. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS PAG 3
2. ANTECEDENTES PAG 7
2.I. El vino rosado PAG 9
2.I.1. Definición PAG 11
2.I.2. Formas de elaboración PAG 12
2.I.2.1. Vinificación en blanco PAG 12
2.I.2.2. Vinificación parcial PAG 12
2.I.2.2. Elaboración de Clarete PAG 13
2.I.3. Mezclas de tintos y blancos PAG 14
2.II. Compuestos fenólicos PAG 15
2.II.1. Transferencia de antocianos PAG 17
2.II.2. Clasificación PAG 20
2.II.2.1 Compuestos fenólicos no flavonoideos PAG 21
2.II.2.1.1. A. Fenólicos PAG 21
2.II.2.1.1.1. A. Hidroxibenzóicos PAG 21
2.II.2.1.1.2. A. Hidroxicinámicos PAG 22
2.II.2.1.2. Estilbenos PAG 23
2.II.2.2. Compuestos fenólicos flavonoideos PAG 26
2.II.2.2.1. Antocianos PAG 26
2.II.2.2.2. Taninos PAG 28
2.II.2.2.2.1. Degradación PAG 32
2.II.2.2.3. Flavonoles PAG 33
2.II.2.2.4. Flavononoles y Flavonas PAG 35
2.III. El color del vino tinto PAG 37
2.III.1 Los antocianos y sus propiedades PAG 39
2.III.2. Color y Copigmentación PAG 46
2.III.2.1. Descripción PAG 46
2.III.2.2. Copigmentación intermolecular PAG 49
2.III.2.2.1. C. Homomolecular PAG 49
2.III.2.3. Copigmentación intramolecular PAG 50
2.III.2.4. Factores que afectan a la copig. PAG 51
2.III.2.4.1. Concentración PAG 51
2.III.2.4.2. Temperatura PAG 52
2.III.2.4.3. pH PAG 52
2.III.2.4.4. Disolvente PAG 52
Justifiación y Objetivos.
4 Dora Blanco Vega 2013
2.III.2.4.5. Sales y fuerza iónica PAG 53
2.III.2.4.6. Naturaleza del copigmento PAG 53
2.III.3. Formación de nuevos compuestos PAG 53
2.III.3.1. Condensación A-F PAG 53
2.III.3.2. Condensación mediada por aldehido PAG 56
2.III.3.3. Condensación con otros aldehidos PAG 60
2.III.3.4. Condensación con ácido glioxílico PAG 61
2.III.4. Piranoantocianos PAG 62
2.IV. Los piranoantocianos y el color del vino PAG 63
2.IV.1. Definición PAG 65
2.IV.2. Tipos PAG 65
2.IV.2.1. T. Vitisinas PAG 66
2.IV.2.2. T. Vinilfenol-piranoantociano PAG 70
2.IV.2.3. T. Vinilflavanol-piranoantociano PAG 74
2.IV.2.4. T. Portisinas PAG 76
2.IV.3. Nuevas moléculas PAG 78
2.IV.4. Propiedades de los piranoantocianos PAG 79
2.V. Técnicas de análisis y espectroscópicas PAG 83
2.V.1. HPLC PAG 85
2.V.2. Espectroscópia UV-Vis PAG 87
2.V.3. Espectroscópia Masas PAG 91
2.V.4. Espectroscópia RMN PAG 96
2.V.4.1. Heteronucleares 2 D. PAG 98
2.V.4.2. Efecto NOE. PAG 99
3. BIBLIOGRAFÍA PAG 103
4. INDICE DE FIGURAS PAG 123
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN PAG 127
CAPÍTULO I. PAG 129
CAPÍTULO II PAG 169
CAPÍTULO III PAG 205
CAPÍTULO IV PAG 235
CAPÍTULO V PAG 275
DISCUSIÓN GENERAL PAG 321
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS PAG 341
6. CONCLUSIONES PAG 351
Justifiación y Objetivos.
5 Dora Blanco Vega 2013
JUSTIFICACIÓN Y
OBJETIVOS
6 Dora Blanco Vega 2013
Justifiación y Objetivos.
7 Dora Blanco Vega 2013
1.-JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS DE NUESTRO ESTUDIO
La evaluación de las propiedades organolépticas de los vinos, es decir, todo lo
que se puede percibir por los sentidos acerca de sus cualidades determina su grado de
aceptación o rechazo por el consumidor.
El vino es una bebida que se elabora para el disfrute de los sentidos y dentro de
las propiedades organolépticas, el color es una de las primeras por las que el
consumidor juzga la calidad de un vino, ya que el primer sentido que interviene en
esta valoración es la vista y da una impresión acerca de él que va a influir sobre las
siguientes apreciaciones. Por tanto, el color es un factor muy importante, que tiene
muy en cuenta la industria vitivinícola.
Actualmente cualquier bodega sabe que esa primera impresión es muy
importante y cada vez se cuida más la imagen del vino en todos sus aspectos, antes
de abrirlo en el exterior, en la botella, con su aspecto, color, tamaño, se elige la forma
de “vestirla” con etiquetas, contra etiquetas y capsulas. Y más adelante una vez
abierta la botella, es cuando tendremos el primer contacto con el vino, empezando por
el color, si vemos un vino con un color oscuro y profundo nos hará pensar en un vino
recio y fuerte, con sensaciones astringentes en boca, y una permanencia y un
retrogusto largo. Si el vino tiene poco color nos llevará a pensar en una estructura
más ligera y un retrogusto más corto y suave.
Cuando el catador prueba el vino, relaciona estos colores estableciendo un
paralelismo con los sabores, así un color rojo recordará a cerezas, fresas, frambuesas
o un color ocre a especias o frutas desecadas, sí esta asociación entre colores y sabor
siempre ha sido importante, en los últimos años, el color del vino tinto ha despertado
un interés aún mayor, por un lado por su contribución al disfrute del vino por el
sentido de la vista, y por su asociación con el gusto, y en segundo lugar porque al
estar relacionada la cantidad de materia colorante con ciertas propiedades
beneficiosas del vino para la salud, (compuestos cardiosaludables como el resveratrol
y otros antioxidantes y la recuperación de la importancia de la dieta mediterránea) el
consumidor identifica un vino con mucho color con un vino saludable.
Además y muy importante está el factor económico, actualmente el precio de la
uva en las bodegas y cooperativas ya no se asigna solo por el grado alcohólico sino
que también interviene la intensidad de su coloración, esto hace que el interés para
Justifiación y Objetivos.
8 Dora Blanco Vega 2013
saber que factores intervienen en el color del vino, y si es posible controlar y modificar
estos factores para que nos permitan saber que evolución en el color del vino se
puede esperar según la variedad, edad y tipo de elaboración, ha logrado que se haya
incrementado el interes y que aumente el número de investigaciones así como el
desarrollo tecnológico en este campo.
El vino tinto es un medio muy complejo, que evoluciona durante su
almacenamiento y envejecimiento. Con el tiempo, el color del vino joven cambia de
rojo-azulado hacia el color rojizo de vinos maduros y la astringencia decrece. Los
cambios de color son debido a la conversión gradual de los pigmentos de antocianos
extraídos del hollejo de las uvas en diversos derivados a través diferentes
mecanismos de reacción. Los antocianos están sujetos a equilibrios entre diversas
formas estructurales en medios acuosos, de manera que sólo a pH bastante ácidos
predominan las formas catiónicas flavilio, de color rojo, mientras que a valores bajos
de acidez, como los que existen en el vino y en otros alimentos, se encuentran
fundamentalmente en forma de estructuras hidratadas incoloras.
los antocianos en forma de catión flavilio son pigmentos muy reactivos y sus
propiedades de color son modificadas de manera significativa por reacciones de
oxidación y envejecimiento, por reacción con bisulfito que produce un blanqueamiento
y por los cambios de pH,
Por otro lado solo una pequeñísima parte de los antocianos de la uva son
detectadas en vinos envejecidos, detectándose otras nuevas moléculas que también
contribuyen al color. En primer lugar los pigmentos poliméricos, macromoléculas que
resultan de las interacciones entre las antocianinas y otros compuestos, especialmente
flavan-3-oles como catequinas y procianidinas (taninos condensados) y en segundo
lugar los piranoantocianos resultado de la adición nucleófila de algunas moléculas a las
antocianinas seguidas de ciclación y oxidación. Estos producen un cambio de color en
los vinos envejecidos hacia el rojo-naranja y además estabilizan el color del vino.
En los últimos años está cobrando importancia también la elaboración de vinos
rosados, son quizá uno de los tipos de vinos más delicados, cuya calidad aromática y
cromática decaen con mayor celeridad, siendo escasos los casos de vinos rosados que
resistan un envejecimiento de más de 1-2 años. Entre las características que más
Justifiación y Objetivos.
9 Dora Blanco Vega 2013
rápido evolucionan en los vinos rosados se encuentra su color, con una tendencia a
virar hacia tonos anaranjados con el tiempo. Esta tonalidad anaranjada se puede
relacionar con la formación de pigmentos antociánicos de naturaleza polimérica (las
uniones entre antocianos y taninos) y también con la formación de pigmentos del tipo
piranoantociano, generados por reacción entre los antocianos originales de la uva con
derivados del ácido hidroxicinámico, existen bastantes indicios de que pueden jugar un
papel importante en el color de los vinos rosados, incluso al poco tiempo de su
elaboración, sin esperar un envejecimiento prolongado.
En vista del interés, que el color del vino en general y la presencia y aportación
que a este hacen los pigmentos piranoantociánicos en particular, planteamos esta
Tesis Doctoral, con el fin de contribuir a la demanda de datos que existe actualmente
sobre la composición en piranoantocianos en vinos rosados y tintos comerciales, que
nos permita constituir una amplia base de datos de referencia sobre estas sustancias,
y así poder evaluar su contribución al color mostrado por estos pigmentos, y estudiar
cómo influye su presencia para estabilizar el color durante el envejecimiento del vino,
también nos permitirá evaluar la efectividad de algunas técnicas de elaboración
encaminadas a favorecer la formación de piranoantocianos en el vino.
Así mismo, se pretende contribuir al estudio de los factores que afectan a la
formación y evolución de piranoantocianos en vinos tintos y rosados, estudiando vinos
experimentales a lo largo del proceso de elaboración y de almacenamiento hasta llegar
al momento de su consumo, para lograr esto hemos enfocado la investigación desde
varios puntos:
De forma específica, los objetivos que se pretenden alcanzar con esta Tesis
son:
1. Determinar el contenido de los distintos tipos de piranoantocianos en los
vinos tintos y rosados elaborados en Castilla-La Mancha, para crear una amplia base
de datos sobre el contenido de estas sustancias en los vinos.
2. Evaluar las posibles diferencias en el contenido de piranoantocianos de los
vinos en función de la variedad de uva.
3. Investigar la evolución del contenido y tipología de los piranoantocianos en
los vinos a lo largo del tiempo de elaboración y almacenamiento de éstos.
Justifiación y Objetivos.
10 Dora Blanco Vega 2013
4. Analizar cualitativa y cuantitativamente el contenido en antocianos, y
piranoantocianos presentes en un amplio grupo de muestras de vinos tintos
comerciales.
5. Realizar un estudio pormenorizado en el laboratorio sobre la formación de
los piranoantocianos del tipo vitisina y los hidroxifenilpiranoantocianos.
11 Dora Blanco Vega 2013
ANTECEDENTES
12 Dora Blanco Vega 2013
Apartado I
“EL VINO ROSADO”
Antecedentes: Vinos Rosados.
15 Dora Blanco Vega 2013
APARTADO I. LOS VINOS ROSADOS
2.I.1 DEFINICIÓN DE VINO ROSADO
El vino rosado se define por su color. Es un tipo intermedio entre el vino blanco
y el vino tinto, entre el vino elaborado sin maceración y el elaborado con maceración.
Del vino tinto tiene las variedades de uva empleadas en una pequeña cantidad de
pigmentos, Del vino blanco tiene la constitución general, su ligereza, su afrutado y una
cierta analogía en las técnicas de la vinificación.
Por otra parte, algunos vinos rasados se parecen bastante a los vinos tintos;
carnosos y bastante coloreados, se elaboran con maceración de hollejos limitada y se
suavizan con la fermentación maloláctica. Otros se parecen más a los vinos blancos, y
al estar menos macerados, son más frescos y conservan su acidez málica. Los
primeros contienen taninos y carecen de ácido málico, mientras que los segundos
contienen ácido málico y pocos taninos.
Es difícil establecer una definición tecnológica de los vinos rosados. No se
puede basar exclusivamente en su origen o en los métodos de vinificación.
Teóricamente pueden proceder de la extracción parcial de uva tinta o de la extracción
total de uva gris o rosada.
La mayoría de los vinos rosados son secos, pero algunas regiones producen
también vinos rosados dulces muy apreciados.
La fama de los vinos rosados se explica por su apariencia atractiva, por el gusto
de las bebidas frescas, por la búsqueda de vinos más afrutados, por el hecho además
de que el vino rosado puede acompañar toda una comida. Pero se debe matizar, ya
que si bien hay grandes vinos tintos o blancos sólo algunos vinos rosados adquieren el
calificativo de gran clase. Puede ser a causa de las dificultades de su elaboración y de
su débil comportamiento frente al envejecimiento. No obstante, el vino rosado es uno
de los tipos de vino que más se podrían beneficiar de los progresos de la tecnología
enológica. Los diferentes vinos rosados se beben jóvenes; raramente se mejoran
envejeciéndolos.
Antecedentes: Vinos Rosados.
16 Dora Blanco Vega 2013
2.I.2. FORMAS DE ELABORACIÓN DE VINOS ROSADOS
Los vinos rosados se elaboran siguiendo dos tipos genéricos y tecnologías:
2.I.2.1 Vinos rosados por vinificación en blanco de uvas tintas
Se elaboran con uvas tintas tratadas como si fueran blancas en las operaciones
de estrujado, escurrido y prensado, pero sin las precauciones de limitación de la
maceración que, por lo general, se toman cuando se trata de la vinificación en blanco.
Por otra parte, casi siempre es necesario, para conseguir una intensidad colorante
suficiente, emplear el mosto de prensa. Se practica un sulfitado moderado, de acuerdo
con el estado de la uva y para no reducir demasiado la intensidad del color, pero el
desfangado apenas se emplea si la vendimia es sana. El resto de las operaciones no
plantea problemas especiales y reúne las preocupaciones generales de la elaboración
de los vinos blancos, es decir, baja temperatura de fermentación y protección contra
las oxidaciones. La fermentación maloláctica, total o parcial, puede interesar o no.
2.I.2.2. Vino rosados de maceración parcial (sangrado)
Son los llamados “vinos de café” o “vinos de una noche”. Su elaboración se inicia
como la de un vino tinto, se carga una cuba de vendimia estrujada, despalillada o no,
y sulfitada. La fermentación se inicia después de algunas horas y los orujos se elevan.
Al mismo tiempo, el color se intensifica por extracción de los antocianos, extracción
más o menos rápida según las variedades y el contenido en antocianos da las uvas
debido al grado de maduración y condiciones climatológicas o/y edafológicas. Cuando
se considera que el color es suficiente, sin olvidar la tendencia a disminuir por
polimerización durante la fermentación y después del sulfitado, se procede al descube
parcial o sangrado. El sangrado suele realizarse veinticuatro horas después del
encubado, cuando la densidad relativa aún es de 1.050- 1.070. Por rebla general sólo
se trasiega una parte del depósito, el resto continúa vinificándose en tinto. A veces el
depósito se recarga con vendimia fresca sobre los orujos, práctica que no es muy
recomendable, ya que produce vinos tintos duros (vinos de doble pasta).
Antecedentes: Vinos Rosados.
17 Dora Blanco Vega 2013
La fermentación del mosto rosado continúa después del descube, un poco lenta
debido a la separación de los orujos, y se termina con el depósito. Antes de trasegar
casi siempre se intenta conseguir la fermentación maloláctica.
2.I.2.3. Elaboración de vinos claretes
Este sistema de vinificación se puede considerar un sistema intermedio entre la
vinificación en blanco y la vinificación en tinto, pero no exactamente como una
vinificación en rosado como anteriormente se ha descrito. El vino denominado
“clarete” o “aloque” es típico de Castila-La Mancha, sobre todo de la zona de
Valdepeñas, en cuya D.O. aparece recogido bajo el nombre de “Tinto Valdepeñas”,
diferenciándose de los vinos rosados.
Se trata de vinos con una graduación entre 11-13% (11-14% para tintos; 10-
13% para blancos: 10.5-13% para rosados en la D.O. Valdepeñas) que se pueden
obtener:
a partir de mostos con mezcla de uvas tintas (Cencibel) y
blancas(Airén)
o de sus mostos cuya fermentación se hace parcialmente en presencia
de los orujos de la uva tinta
El porcentaje mínimo de la uva de la variedad Cencibel debe ser del 25%. Este
tipo de vinos obedece al hecho de que en estas zonas la uva blanca Airén es la
mayoritaria (en torno al 80% tras la última reconversión del viñedo) y al hecho de que
la vendimia de la variedad tinta Cencibel es anterior a la vendimia de la variedad
blanca Airén, con la cual se solapa. Cuando se reciben ambos tipos de uva en la
bodega, el mosto de uva blanca se mezcla con uvas tintas estrujadas y despalilladas, o
bien al finalizar la elaboración de los vinos tintos, se aprovechan los orujos de la uva
tinta añadiéndole mosto de uva blanca. De esta mezcla surgen unos vinos ligeros,
neutros, de aroma sutil, cuyas cualidades se aprecian mejor durante su juventud.
Antecedentes: Vinos Rosados.
18 Dora Blanco Vega 2013
2.I.3. Mezcla de vinos blancos y tintos para la elaboración de vinos rosados
La Comisión Europea pretende dar vía libre a la elaboración de vinos rosados
mezclando vinos tintos y blancos, donde será aplicable a los vinos que procedan al
menos en un 25% de uvas de variedades tintas. Procedimiento que hasta la fecha
estaba prohibido en la mayoría de países comunitarios salvo en Francia, sólo para
elaborar el famoso champagne rosé.
Esta nueva normativa cuya finalidad era poder hacer frente a la competencia de
los vinos del Nuevo Mundo, no ha sido bien recibida por los bodegueros que elaboran
vinos rosados de calidad con los métodos tradicionales. Los bodegueros italianos,
franceses y españoles manifiestan que la elaboración de vino rosado conlleva un
proceso muy específico con el que se obtiene un producto genuino y nada tiene que
ver con los vinos rosados obtenidos por la mezcla de vinos tintos y blancos.
La denuncia que realizan los bodegueros es que se va a adulterar el mercado y los
consumidores que adquieran vino rosado no sabrán qué procedimiento se ha
empleado para su desarrollo, algo que no ha ocurrido hasta ahora, ya que las mezclas
estaban prohibidas. Frente a la competencia del Nuevo Mundo se debe trabajar en la
relación calidad-precio y mostrar al consumidor las diferencias entre un vino rosado
desarrollado mediante métodos tradicionales y un vino fruto de la mezcla de vinos
blancos y tintos.
Los bodegueros creen que se trata de un paso atrás, la Unión Europea pretende
potenciar la competitividad y aumentar mercado a costa de la calidad y la tradición. En
cualquiera de los magníficos vinos rosados que se elaboran se han utilizado las más
avanzadas técnicas de vinificación pero siempre han mantenido su parte rústica, una
conjugación que da lugar a vinos muy expresivos en boca y en nariz. De hecho,
durante los últimos años los vinos rosados han ido adquiriendo un papel más
importante que podría truncarse con la nueva normativa.
Apartado II
“COMPUESTOS FENÓLICOS”
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
21 Dora Blanco Vega 2013
2.II. COMPUESTOS FENÓLICOS.
2.II.1. TRANSFERENCIA DE COMPUESTOS FENÓLICOS DE LA UVA AL VINO.
Para estudiar el color del vino es fundamental conocer el contenido de
compuestos fenólicos de las uvas con las que se ha elaborado.
En la mayoría de las variedades de uva tinta utilizadas para la elaboración de
vinos (Vitis vinifera, L.), los pigmentos que proporcionan el color se encuentran de
forma exclusiva en las pieles u hollejos, y ocasionalmente también se encuentran en la
pulpa de las variedades denominadas tintoreras. En el caso de los vinos tintos y
rosados, el color guarda una estrecha relación con su composición en compuestos
fenólicos: de manera directa, con los pigmentos rojos originales de la uva, los cuales
dependerán a su vez, de factores como la variedad, estado de madurez en el
momento de la recolección, condiciones de cultivo, condiciones climáticas, etc. Y de
forma indirecta, ya que en el vino aparecerán nuevos pigmentos procedentes de las
etapas fermentativas y otra serie de compuestos que resultan de la evolución durante
la vinificación y el envejecimiento, de los materiales fenólicos presentes originalmente
en la uva.
Dentro de los compuestos fenólicos los antocianos son los que tienen una mayor
importancia en el color del vino, se puede considerar que la transferencia de
antocianos monómeros de la uva al vino es un equilibrio de reparto de estas
sustancias entre dos fases inmiscibles, una sólida (el hollejo de las uvas) y otra líquida
(el mosto-vino en fermentación). Como en todo proceso de reparto entre fases, el
equilibrio alcanzado dependerá de la afinidad de las sustancias a repartir por las dos
fases entre las que se transfieren.
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
22 Dora Blanco Vega 2013
Figura 1 Perfiles de antocianos monómeros (cromatografía HPLC) característicos de las uvas tintas de la variedad Cencibel (A) y de los vinos varietales elaborados con ellas (B). Las siglas DEL, CIA, PET, PEO y MAL se corresponden con los 3-monoglucósidos de delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina y malvidina, respectivamente, mientras que A- y C- hacen referencia a los derivados acetilados y cumarílicos, respectivamente, de los 3-monoglucósidos de antocianidinas anteriores.
La solubilidad de los antocianos monómeros en el medio acuoso que es el
mosto-vino en fermentación, es la fuerza motriz que inicialmente determina su
transferencia durante la vinificación. Puesto que esta solubilidad no es la misma para
los distintos grupos de antocianos monómeros (no acilados, acetilados y cumarílicos),
se entiende por qué la proporción en que se encuentran los antocianos monómeros en
las uvas (los llamados perfiles de antocianos monómeros), que es una característica
varietal, no se transfiere exactamente a los vinos, en los que se suele observar una
disminución significativa de la proporción de los derivados cumarílicos de los
DEL
DEL
CIA
CIA
PET
PET
PEO
PEO
MAL
MAL
A-DEL
A-DEL
A-CIA
A-CIA
A-PET
A-PET
A-PEO
A-PEO
C-DEL
C-DEL
A-MAL
A-MALC-
CIA
C-PET
C-PET
C-PEO
C-PEO
C-MAL
C-MAL
C-CIA
A) HOLLEJOS CENCIBEL
B) VINOS CENCIBEL
DEL
DEL
CIA
CIA
PET
PET
PEO
PEO
MAL
MAL
A-DEL
A-DEL
A-CIA
A-CIA
A-PET
A-PET
A-PEO
A-PEO
C-DEL
C-DEL
A-MAL
A-MALC-
CIA
C-PET
C-PET
C-PEO
C-PEO
C-MAL
C-MAL
C-CIA
DEL
DEL
CIA
CIA
PET
PET
PEO
PEO
MAL
MAL
A-DEL
A-DEL
A-CIA
A-CIA
A-PET
A-PET
A-PEO
A-PEO
C-DEL
C-DEL
A-MAL
A-MALC-
CIA
C-PET
C-PET
C-PEO
C-PEO
C-MAL
C-MAL
DEL
DEL
CIA
CIA
PET
PET
PEO
PEO
MAL
MAL
A-DEL
A-DEL
A-CIA
A-CIA
A-PET
A-PET
A-PEO
A-PEO
C-DEL
C-DEL
A-MAL
A-MALC-
CIA
C-PET
C-PET
C-PEO
C-PEO
C-MAL
C-MAL
C-CIA
A) HOLLEJOS CENCIBEL
B) VINOS CENCIBEL
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
23 Dora Blanco Vega 2013
antocianos monómeros (Figura 1). Ello no es obstáculo para que los perfiles de
antocianos monómeros mostrados por los vinos tintos varietales aún continúen siendo
una herramienta válida para la diferenciación varietal, al menos durante los 3-4
primeros años de envejecimiento de los vinos en los que aún es posible encontrar
antocianos monómeros en cantidades suficientes para su cuantificación.
La transferencia de los demás compuestos fenólicos también está sometida a
este tipo de equilibrios de reparto. En término promedio, se consigue transferir al vino
un 60% de los compuestos fenólicos totales presentes en las uvas, mientras que sólo
se consigue transferir un 38% de antocianos monómeros, y el porcentaje disminuye
hasta el 20% para los taninos, que son los compuestos fenólicos menos solubles en
medio acuoso.
Son numerosos y muy diversos los factores que se han probado a modificar y
que aún se prueban, para intentar mejorar los porcentajes de transferencia de los
antocianos monómeros durante la vinificación:
a) Factores prefermentativos:
- Disminución del pH del mosto
- Aumento de la cantidad de SO2 añadido
- Variación de la temperatura previa a la fermentación (criomaceración,
termovinificación, flash-expansión)
- Adición de enzimas pectolíticos
b) Factores fermentativos:
- Duración y tipo de maceración (bazuqueos, remontados, deléstage,
fermentadores rotatorios, fermentadores Ganimede, etc)
- Uso de agentes clarificantes
Pero a pesar de la diversidad de factores ensayados, hasta la fecha no se ha
podido establecer un método universal para la mejora del color del vino tinto. Puede
ser por la falta de conocimiento que aún existe sobre todo lo que ocurre, a nivel
molecular, en los procesos implicados en la transferencia de color del vino y en otros
procesos que interfieren con éstos y que implican a los pigmentos y otros compuestos
fenólicos en disolución, una vez que se encuentran en el mosto-vino en fermentación.
Además, muchos de los factores ensayados no son selectivos en cuanto a la
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
24 Dora Blanco Vega 2013
transferencia de antocianos monómeros, y aunque consiguen un aumento efectivo del
color del vino, pueden provocar efectos secundarios indeseables, como un aumento de
la astringencia por una transferencia excesiva de cierto tipo de taninos de las pepitas
de las uvas.
2.II.2. CLASIFICACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS.
Los compuestos fenólicos son unos metabolitos secundarios de la uva, cuya
biosíntesis parece responder a una serie de necesidades específicas de la viña, como
pueden ser la protección frente a la radiación UV, la defensa frente a ataques fúngicos,
o el rechazo/reclamo para animales. Estos compuestos fenólicos de la uva juegan un
papel fundamental en la calidad del futuro vino, sobre todo en la calidad sensorial
(color, astringencia, cuerpo), en las posibilidades de crianza del vino en barricas de
roble y de envejecimiento en botella, así como en las propiedades cardiosaludables
asociadas al consumo moderado de vino.
Estos compuestos pueden ser clasificados en compuestos no flavonoideos y
flavonoideos (Boulton y col., 1998; Cheynier y col., 2003; Jackson, 2000; Ribéreau-
Gayon y col., 2000; Hidalgo Togores, 2003).
2.II.2.1. Compuestos fenólicos no flavonoideos:
2.II.2.1.1. Ácidos fenólicos:
2.II.2.1.1.1. Ácidos hidroxibenzoicos
2.II.2.1.1.2. Ácidos hidroxicinámicos
2.II.2.1.2. Estilbenos
2.II.2.2. Compuestos fenólicos flavonoideos:
2.II.2.2.1. Antocianos
2.II.2.2.2. Flavan-3-oles (taninos)
2.II.2.2.3. Flavonoles
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
25 Dora Blanco Vega 2013
2.II.2.1.1. ÁCIDOS FENÓLICOS
Estos ácidos fenólicos, en la uva y en el vino, se pueden encontrar en forma
tanto de ácidos hidroxibenzoicos (C6-C1), como de ácidos hidroxicinámicos (C6-C3),
diferenciándose entre sí por la sustitución del anillo bencénico.
2.II.2.1.1.1. ACIDOS HIDROXIBENZOICOS
Ácidos hidroxibenzoicos R2 R3 R4 R5
Ácido p-hidroxibenzoico H H OH H
Acido protocatéquico H OH OH H
Acido vainíllico H OCH3 OH H
Acido Gálico H OH OH OH
Acido Siríngico H OCH3 OH OCH3
Acido Salicílico OH H H H
Acido Gentísico OH H H OH
Figura 2. Estructura de los principales ácidos hidroxibenzoicos presentes en la uva y el vino.
Dentro de los ácidos hidroxibenzoicos, los ácidos Salicílico y Gentísico se
encuentran solo como traza, pero el ácido Gálico está en gran proporción 95mg/L
(Cabanis et al. 2003). Estos ácidos no están libres sino que normalmente se
encuentran combinados con azucares o formando esteres con los flavonoles. El ácido
Gálico y su dímero el ácido Pelágico también se encuentran en la madera del género
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
26 Dora Blanco Vega 2013
Quercus pudiendo pasar al vino si se hace crianza en barrica, esto también ocurre con
los ácidos Vainíllico y Siríngico en vinos criados en madera de roble (Puech et al
2003).
En la uva los ácidos fenólicos son generalmente hidroxicinámicos, encontrándose
en las células del hollejo y en menor medida en la pulpa, en general en forma de
ésteres tartáricos.
2.II.2.1.1.2. ÁCIDOS HIDROXICINÁMICOS
Figura 3. Ácidos hidroxicinamoil tartáricos.
Durante el proceso de vinificación estos esteres se pueden hidrolizar
coexistiendo tanto las formas libres como combinadas, en el vino. También el uso de
enzimas en la vinificación puede producir esta hidrólisis (Dugelay y col., 1993). La
presencia de los ésteres tartáricos y la ausencia de ésteres del ácido quínico (los
denominados ácidos clorogénicos) son unas de las características más específicas del
género Vitis y nos podría ayudar a diferenciarlo de otros géneros.
El análisis comparado de los contenidos en ésteres hidroxicinámicos, muestra
concentraciones en la uva más elevadas en el hollejo que en la pulpa (de 2 a 100 más
según la cepa), de forma que en el hollejo, las concentraciones varían de 0.06 a 0.78
mg/g de hollejo, para el ácido caftárico, y de 0 a 0.3 mg/g para el ácido cutárico,
mientras que el ácido fertárico se encuentra en escasa cantidad (< 0.06 mg/g),
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
27 Dora Blanco Vega 2013
aunque estas cantidades también variarán según las cepas en el género Vitis. La
concentración de los ésteres hidroxicinámicos disminuye durante el desarrollo de la
baya y se estabiliza en la madurez enológica.
El estudio de estos ácidos es muy importante por que aunque no aportan
directamente color ni sabor al vino son los precursores, por un lado, de muchos
compuestos volátiles que se obtienen por la acción enzimática de la descarboxilasa,
que transforma los ácidos p-Cumárico y Ferúlico en 4-vinilfenol y 4-vinilguayacol, los
cuales pueden conferir al vino olores calificados como poco agradables, “a farmacia”,
ligados a notas de ahumado, de bosque, caucho quemado, pimienta, almendra tostada
(Bayonove y col., 2003), también olores a clavo, especiado, caucho (Boido, 2002;
Bayonove y col., 2003) y a disolventes o medicinas (Dugelay y col., 1993). Y Además
la presencia de estos vinilfenoles influye indirectamente en las propiedades
organolépticas del vino, puesto que dan lugar a la formación de etil-fenol y etil-
guayacol por efecto de la actividad vinil-reductasa presente en ciertas levaduras como
Brettanomyces, o en algunas bacterias lácticas normalmente del género Lactobacillus;
aportando al vino aromas a cuero, animal, olor a sudor de caballo (Chatonet y col.,
1995; Couto y col.; 2006).
Y por otro lado y mucho más importante para nuestro trabajo, los ácidos
hidroxicinámicos y sus derivados 4-vinilfenoles pueden influir en el color de los vinos
tintos, puesto que son capaces de reaccionar con los antocianos y originar algunos
compuestos de tipo piranoantociánico objeto de este estudio, estos compuestos
aportan tonalidades naranjas a los vinos (Rentzsch et al., 2007a y 2007b). Estas
interacciones son de tipo covalente, pero también se pueden producir interacciones no
covalentes (fenómenos de copigmentación) entre los antocianos y los ácidos
hidroxicinámicos que también tienen importancia en el color de los vinos tintos,
2.II.2.1.2. ESTILBENOS
Destaca la presencia en la uva de otros compuestos fenólicos como el
resveratrol (3, 5, 4’-trihidroxiestilbeno), principalmente en su configuración trans, y de
su derivado glucosilado, conocido con el nombre de piceido (Figura 4).
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
28 Dora Blanco Vega 2013
Figura 4. Resveratrol.
En Vitis vinifera y Vitis lanbrusca, la presencia de resveratrol se observa en el
hollejo mientras que no se encuentra en las semillas. El contenido de trans-resveratrol
en el hollejo, en la madurez, es del orden de 20 μg por g de materia fresca. Esta
concentración en el hollejo varía según las cepas, siendo la Pinot Noir particularmente
rica en este compuesto. El resveratrol juega un papel muy importante en la resistencia
de ciertas bayas de uva a los ataques fúngicos.
También existen otros compuestos derivados del resveratrol, uno es un
homólogo superior del resveratrol, con un grupo OH más en la posición 3´; su
nombre es piceatannol y su 3-O-glucósido se denomina astringin. El grupo OH extra
hace que estos compuestos muestren sus máximos de absorción UV a 302 y 321 nm
(Püssa et al., 2006), mientras que el resveratrol los muestra a 306 y 316 nm. Otro
compuesto importante es el derivado glucosilado del reveratrol aislado en vinos
Reisling en el año 2000, trans-resveratrol-2-C-glucósido (Baderschneider y
Winterhalter, 2000), y que se diferencia del piceido en que la posición del glucósido es
en el C-2. Por último, el resveratrol tiene capacidad de formar oligómeros
(Baderschneider y Winterhalter, 2000; Vitrac et al., 2001; Püssa et al., 2006), y se
han encontrado algunos dímeros (pallidol, ε y δ-viniferin, parthenocissin), y más
recientemente un trímero (α-viniferin) (Cantos y col., 2002) y un tetrámero
(hopeaphenol) (Guebailia et al., 2006).
Todos estos compuestos están siendo muy estudiados por sus efectos
anticancerígenos y cardio saludables.
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
29 Dora Blanco Vega 2013
Figura. 5 Estilbenos y sus derivados.
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
30 Dora Blanco Vega 2013
2.II.2.2. COMPUESTOS FENÓLICOS FLAVONOIDEOS
Los compuestos flavonoideos están caracterizados por un esqueleto base de 15
átomos de carbono (C6-C3-C6) de tipo 2-fenilbenzopirona o 2-fenilbenzopirano (Figura
6).
Figura 6. Estructuras de la 2-fenilbenzopirona y 2-fenilbenzopirano.
Esta gran familia está dividida en varias subclases que se distinguen por el
grado de oxidación de su anillo de pirano. Los compuestos flavonoideos en sentido
estricto, basados en la estructura 2-fenilbenzopirona, están principalmente
representados en la uva por los flavonoles, mientras que en un sentido más amplio
comprenden igualmente a los antocianos y a los flavan-3-oles. Se encuentran también
en la uva otros grupos de menor importancia, como los dihidroflavonoles
(flavanonoles), y en las hojas, las flavonas.
2.II.2.2.1. LOS ANTOCIANOS
Los antocianos (3-monoglucósidos de antocianidinas), acilados o no en la
posición 6 de la glucosa; (Figura 7.) son unos compuestos fenólicos, que se
encuentran localizados en el hollejo y en las 3 ó 4 primeras capas celulares del
hipodermo, contribuyendo al color de las especies tintas. Estos pigmentos se
encuentran también en la pulpa en las cepas tintoreras. A nivel subcelular, se
encuentran en la vacuola, dónde pueden estar incluidas en los orgánulos
“especializados” definidos como antocianoplastos.
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
31 Dora Blanco Vega 2013
Estos compuestos son los principales responsables del color de los vinos tintos.
Y se trata quizá de la clase de compuestos fenólicos de la uva más estudiados y mejor
conocidos.
La estructura de los antocianos comprende dos anillos bencénicos unidos por un
heterociclo oxigenado, insaturado y catiónico denominado ión flavilio. Bajo la forma
glicosídicas se denominan antocianinas, bastante más estables que la forma aglicona o
antocianidinas.
Figura 7 Antocianos monómeros (3-monoglucósidos de antocianidinas) presentes en las uvas y vinos de las variedades de Vitis vinifera.
En la naturaleza el 90 por ciento de todos los antocianos pertenecen a una de las
seis antocianidinas (pelargonidina, cianidina, peonidina, petunidina, delfinidina y
malvidina) que difieren primero en el número de hidroxilos (OH) y grupos metoxilos
(OCH3) en el anillo B, segundo por el número la posición y la naturaleza de las osas y
tercero por el número de ácidos que esterifican los azucares (Figura 7.). Según
algunos estudios realizados en diferentes cepas de Vitis vinífera sobre la composición
antociánica, el contenido global varía desde 500 mg/kg hasta 3000 mg/kg y los
niveles de cada antociano cambian individualmente para cada variedad.
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
32 Dora Blanco Vega 2013
La distribución de las seis antocianidinas más comunes en las plantas es la
siguiente: cianidina (50 %), pelargonidina (12 %), delfinidina (12 %), peonidina
(12 %), petunidina (7 %) y malvidina (7 %). El antociano más ampliamente
distribuido en la mayoría de las frutas es la cianidina-3-glucósido (Kong, 2003). Sin
embargo, los glicósidos de malvidina son los antocianos característicos de la uva tinta
y de sus productos derivados (vino, zumo etc.) (Mazza et al., 1993).
Hasta hace poco tiempo en Vitis vinífera solo se distinguían cinco tipos de estas
moléculas (cianidina, peonidina, petunidina, delfinidina y malvidina) No obstante,
estudios recientes han revelado la presencia de antocianos con esqueleto de
pelargonidina (R1 = R2 = H) en zumos elaborados con uvas híbridas y americanas
(Wang y col., 2003a) encontrándose estos antocianos en cantidades bastante menores
que los que derivan de las otras cinco antocianidinas, y también se encuentran en
vinos de la variedad Garnacha Tintorera (Noelia Castillo y col. 2009).
También, en contra de lo que se pensaba de que en la V vinifera solo se
encuentraban los 3-monoglucósidos mientras que en otras especies del mismo
género, como Vitis Riparia, Vitis Lambrusca o Vitis Rupestris, los antocianos también
aparecían como diglucósidos, con dos moléculas de glucosa en las posiciones 3 y 5, y
que predominan sobre los 3-glucósidos presentes (Ribérau-Gayon, 1982), el empleo
de técnicas analíticas cada vez más sensibles, como la cromatografía HPLC acoplada a
un detector de espectrometría de masas, está permitiendo encontrar trazas de
antocianos del tipo 3,5-diglucósido en uvas de variedades V. vinifera y en sus vinos
(Alcalde-Eon y col., 2006) (Noelia Castillo y col. 2009)
2.II.2.2.2. TANINOS
Los taninos naturales de la uva y del vino son principalmente procianidinas. Su
estructura se basa en polímeros más o menos complejos de los flavan-3-oles o 3-
flavanoles.
Los flavan-3-oles monómeros están formados por dos anillos bencénicos unidos
por un heterociclo oxigenado saturado, pudiendo encontrarse cuatro isómeros: (+)-
catequina, (-)-epicatequina, (-)-catequina y (+)-epicatequina. Los más
abundantes son los dos primeros, así como también los derivados de la epicatequina
en forma de éster gálico. Los taninos son complejos derivados de los compuestos
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
33 Dora Blanco Vega 2013
anteriores, como las procianidinas dímeras, oligoméricas y polímeras. Las
procianidinas oligoméricas son moléculas de 3 a 10 unidades de flavanoles y las
polímeras están formadas por más de 10 unidades de flavanoles, alcanzando un peso
molecular superior a 3000.
Figura 8. Estructura de los flavan-3-oles monómeros de la uva.
Los taninos u oligómeros y polímeros de flavan-3-oles, tienen una característica
principal que es su capacidad para unirse a sustancias como las proteínas,
polisacáridos, alcaloides, radicales libres e iones metálicos. Se han realizado distintos
estudios para ver la capacidad que tienen estos compuestos para combinarse con
proteínas y se ha visto que esta aumenta con la polimerización de los taninos de
dímeros a heptámeros, grado a partir del cual, esta capacidad comienza a disminuir
(Lea, 1992), aunque otros estudios más recientes realizados por Vidal et al (2003)
parecen sugerir que al menos la capacidad para unirse a proteínas salivares, que son
las responsable de la sensación de astringencia, aumenta con el peso molecular del
tanino sin límite de tamaño.
También son importantes por su capacidad de interactuar con las proteínas, y
otros polímeros de los vegetales como celulosa, peptinas y otros polisacáridos
precipitándolos, tal como ocurre en el curtido de pieles; además, estos taninos son
capaces de liberar antocianidinas, por ruptura de las uniones intermonoméricas
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
34 Dora Blanco Vega 2013
(interflavan), de los polímeros de taninos, en medio ácido y en caliente, lo que es el
origen del término proantocianidinas, con el que también se les denomina.
Figura 9. Estructura de las proantocianidinas de la uva (R=H, OH).
En las siguientes figuras podemos ver una representación de taninos
condensados, los cuales tienen la capacidad de dar lugar a antocianidinas por
calentamiento en medio ácido mineral. En estas condiciones, el enlace interflavánico
se rompe, liberando el compuesto sencillo correspondiente a la unidad inferior
mientras que la superior forma un carbocatión muy reactivo, que puede ser captado
por un nucleófilo o por oxidación dar una antocianidina
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
35 Dora Blanco Vega 2013
Figura 10. Reacción de hidrólisis de un tanino condensado, liberando la unidad inferior
intacta y la superior o superiores en forma de carbocatión.
Los grupos mayoritarios que están presentes en las uvas son las procianidinas
procedentes de la catequina y la epicatequina y las prodelfinidinas derivada de la
epigalocatequina. Estas formas polímeras pueden comprender un número muy elevado
de unidades, ya que los grados medios de polimerización medidos son del orden de 10
en las semillas y de 30 en el hollejo de ciertas variedades de uva. Los contenidos en
flavan-3-oles de las semillas son habitualmente superiores a los de los hollejos, ya se
trate de monómeros, oligómeros o de polímeros. Pero según las distintas variedades
de uva analizadas, la contribución del hollejo al contenido global de la baya puede ser
más importante que la de las semillas y los contenidos globales, al igual que los
grados medios de polimerización y las proporciones de las diferentes unidades
constitutivas también pueden variar. Sin embargo, los taninos que provienen de los
hollejos se distinguen de los de semillas por la presencia de unidades de
epigalocatequina, con un grado medio de polimerización más elevado y una menor
proporción de unidades galoiladas.
El efecto que tienen los antocianos sobre los alimentos es el de conferirles
amargor y astringencia. El amargor es una sensación del sentido del gusto, las
proantocianidinas mas amargas son las tetrámeras al ir aumentado o disminuyendo su
grado de polimerización disminuye el amargor (Lea, 1992). La astringencia es una
sensación táctil en la cual se percibe sequedad y rugosidad en toda la cavidad bucal.
Pero ya hemos visto que existen diferencias entre las observaciones realizadas por
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
36 Dora Blanco Vega 2013
distintos autores con relación al grado de tamaño de los taninos que podría causar la
máxima astringencia. En el vino los antocianos son responsables directos de
propiedades sensoriales como el cuerpo, y la astringencia, e indirectos de otras como
el color.
2.II.2.2.2.1. Procesos de degradación de los flavan-3-oles.
De manera general, los mecanismos de degradación oxidativa de polifenoles
transcurren a través de la formación de quinonas de gran reactividad como productos
intermedios, independientemente de que la reacción oxidativa tenga carácter químico
o enzimático, facilitada por la acción de polifenoloxidasas (Singleton, 1987; Cheynier
et al., 1988, 1989; Macheix et al., 1991; Nicolas et al., 1993). En los fenoles se
produce la migración parcial de la densidad electrónica del átomo de oxígeno de los
grupos hidroxilos hacia el anillo aromático, aumentando la acidez de los grupos
hidroxilos y facilitando la pérdida del protón (H+), de esta forma, resulta un anión
fenolato cuya autooxidación es muy rápida, el producto de oxidación del fenolato, por
pérdida de un solo electrón, es un radical libre de estructura semiquinona. Cuando dos
grupos hidroxilos están en carbonos adyacentes del anillo aromático en compuestos
fenólicos, se producirá una segunda oxidación por pérdida del otro electrón hacia una
ortoquinona (figura 11.), este patrón de hidroxilación se encuentra en el anillo B de los
flavanoles (catequinas y proantocianidinas derivadas), compuestos especialmente
dados a sufrir este tipo de reacciones.
A pH ligeramente ácidos, como los existentes en el vino, estas reacciones de
oxidación ocurrirán muy lentamente, ya que las cantidades de fenolato formado serán
mínimas.
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
37 Dora Blanco Vega 2013
Figura 11. Oxidación de ortodifenoles.
Las quinonas son especies muy reactivas altamente oxidantes, por lo que si no
son rápidamente reducidas son capaces de intervenir en reacciones de condensación
con compuestos nucleofílicos, en las que pueden estar implicados otros polifenoles
(figura 12.).
Figura 12. Reducción y condensación de las quinonas (Hua Li 2008).
2.II.2.2.3. Flavonoles
Los flavonoles son una clase de compuestos fenólicos localizados en los hollejos
de las uvas Vitis vinifera, implicados también en mecanismos de protección de la
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
38 Dora Blanco Vega 2013
planta frente a la radiación UV, tienen una fuerte absorbancia a las longitudes de
onda propias de la radiación UV-A (325-400 nm) y UV-B (280-325 nm) (Figura 13).
En lo que respecta al color de los vinos, los flavonoles son pigmentos amarillos
que contribuyen directamente en el color de los vinos blancos, pero en vinos tintos los
flavonoles son enmascarados por los pigmentos rojos, los antocianos. Sin embargo, la
importancia de los flavonoles es que son unos de los compuestos fenólicos
involucrados en el fenómeno de copigmentación del vino tinto (Boulton y col., 2001). Y
además, los flavonoles han sido identificados como unos de los mejores compuestos
fenólicos con actividad antioxidante del vino, especialmente en vinos blancos (Burda y
Olezsek, 2001; De Beer y col., 2005; Montoro y col. 2005), este efecto antioxidantes
no es tan importante en vinos tintos, en los que son superados normalmente por
otros compuestos fenólicos mas abundantes, tales como flavan-3-oles y antocianos
(Gardner y col., 1999; Fernández-Pachón y col., 2004; De Beer y col., 2006).
Los más importantes que se han encontrado en vinos de uvas V. vinifera son los
derivados 4’-hidroxi, 3’,4’-dihidroxi y 3’,4’,5’- trihidroxi, conocidos como kaempferol,
quercetina, y miricetina, y también la isoramnetina, producto de la metoxilación de el
3’-hidróxido de quercetina. De la misma manera que isoramnetina es el producto de la
metoxilación de quercetina, el producto de metoxilación en el C-3’ de miricetina es
conocido como laricitrina, al igual que el 3’, 5’-dimetoxil derivado de miricetina es
denominado siringetina.
En la uva, los flavonoles sólo existen como 3-O-glicósidos; sin embargo, en los
vinos se pueden hallar junto con los flavonoles 3-O-glicósidos, las agliconas libres
correspondientes, como resultado de la hidrólisis ácida que ocurre durante la
elaboración del vino y su envejecimiento.
Antecedentes: Compuestos Fenólicos.
39 Dora Blanco Vega 2013
Figura 13. Estructura del esqueleto flavonoide de los flavonoles hallados en uvas Vitis
Vinifera.
2.II.2.2.4. Flavanonoles y Flavonas
Los compuestos pertenecientes a esta familia han sido identificados en el hollejo
de la uva blanca, como son la astilbina (3-ramnosido del dihidroquercetina) y la
engelatina (3-ramnosido del dihidrokaempferol). Sus concentraciones son del orden de
9 mg/kg de materia fresca para la astilbina y0.6 mg/kg para la engelatina. Estas
mismas moléculas han sido igualmente descubiertas en los raspones, por
espectrometría de masas.
Apartado III
“EL COLOR DEL
VINO TINTO”
Antecedentes: El color del vino.
43 Dora Blanco Vega 2013
2. III. EL COLOR DEL VINO TINTO
2.III.1. LOS ANTOCIANOS Y SUS PROPIEDADES
Los antocianos en las uvas se encuentran únicamente como antocianos
monómeros, no ligados a otras moléculas. Pero en cuanto la uva es prensada y
empieza a fermentar se ponen en contacto, todos los compuestos fenólicos en un
medio acuoso; Por un lado y debido al pH del vino (3-4), van a coexistir una gran
cantidad de isomeros de los antocianos monómeros originales, dependiendo de
factores como el pH, SO2, temperatura etc., y por otro lado está la presencia de
otros compuestos fenólicos como taninos, ácidos hidroxicinámicos y otras
moléculas producidas por las levaduras y/o bacterias, y por último puede haber
otros compuestos extraídos de la madera en el caso de los vinos que tienen
crianza en barrica, esta gran cantidad de variables hace que se vayan a producir
muchos cambios de propiedades y color durante la elaboración y envejecimiento
del vino, dependiendo de las reacciones químicas que predominen y las
condiciones en el medio, y que además este color evolucione a lo largo del tiempo.
En el vino se van a dar tres tipos de equilibrios: el acido-base o
transferencia de protones, el de hidratación y el de tautomería de ciclo-cadena
(Brouillard y Delaporte 1977), citados por (Brouillard 1982), siendo todas estas
reacciones reversibles (Ribéreau Gayon et al., 1998a), según las condiciones del
medio.
Antecedentes: El color del vino.
44 Dora Blanco Vega 2013
Figura 14. Color y equilibrios en disolución acuosa de los antocianos monómeros.
La coloración roja la producen principalmente los cationes flavilio. En función
de las condiciones del medio, estos cationes están en equilibrio con diferentes
isomeros y este equilibrio se encontrara desplazado hacia unas formas u otras, sí el
Ph es ácido predomina el catión flavilio (AH+), a pH cercano a la neutralidad la forma
que predomina es la anhidrobase quinoidal (A) de color azulado violáceo, y con un pH
entre 3 y 6 se forman las pseudobases carbinol incoloras, y en equilibrio con estas, las
pseudobases calconas incoloras o ligeramente amarillentas, y que cuando sufren
oxidación pasan de manera irreversible hacia ácidos fenólicos incoloros, produciéndose
una destrucción del color.
O
OH
HO
OH
OGlu
R
R'
OH
CALCONA cis (amarillo)
H2O
H+
H2O
H+
O
OH
HO
OH
OGlu
OH
R
R'
BASE CARBINOL (H-4) (incoloro)
HO
OH
OGlu
O
OH
R
R'
OH
CALCONA trans (amarillo)
H+
H+
O
OH
O
OH
OGlu
R
R'
BASE QUINOIDAL (azul)
O
OH
HO
OH
OGlu
R
R'
CATIÓN FLAVILIO (rojo)
O
OH
HO
OH
OGlu
OH
R
R'
BASE CARBINOL (H-2) (incoloro)
H2O
H+H
+
H2O
(SO3H)
O
OH
HO
OH
OGlu
R
R'
OH
CALCONA cis (amarillo)
O
OH
HO
OH
OGlu
R
R'
OH
CALCONA cis (amarillo)
O
OH
HO
OH
OGlu
R
R'
OH
CALCONA cis (amarillo)
H2O
H+
H2O
H+
O
OH
HO
OH
OGlu
OH
R
R'
BASE CARBINOL (H-4) (incoloro)
H2O
H+
H2O
H+
O
OH
HO
OH
OGlu
OH
R
R'
BASE CARBINOL (H-4) (incoloro)
O
OH
HO
OH
OGlu
OH
R
R'
BASE CARBINOL (H-4) (incoloro)
HO
OH
OGlu
O
OH
R
R'
OH
CALCONA trans (amarillo)
HO
OH
OGlu
O
OH
R
R'
OH
CALCONA trans (amarillo)
HO
OH
OGlu
O
OH
R
R'
OH
CALCONA trans (amarillo)
H+
H+
O
OH
O
OH
OGlu
R
R'
BASE QUINOIDAL (azul)
H+
H+
O
OH
O
OH
OGlu
R
R'
BASE QUINOIDAL (azul)
O
OH
O
OH
OGlu
R
R'
BASE QUINOIDAL (azul)
O
OH
HO
OH
OGlu
R
R'
CATIÓN FLAVILIO (rojo)
O
OH
HO
OH
OGlu
R
R'
CATIÓN FLAVILIO (rojo)
O
OH
HO
OH
OGlu
OH
R
R'
BASE CARBINOL (H-2) (incoloro)
H2O
H+H
+
H2O
O
OH
HO
OH
OGlu
OH
R
R'
BASE CARBINOL (H-2) (incoloro)
H2O
H+H
+
H2O
(SO3H)
Antecedentes: El color del vino.
45 Dora Blanco Vega 2013
Además de estas perdidas o cambios de color debidas a las condiciones del
medio, los antocianos del vino también sufren reacciones de degradación originadas
por distintos agentes y que provocarían una perdida de coloración.
En primer lugar debido al catión flavilio, este al ser un híbrido de resonancia, en
el cual la carga positiva está deslocalizada por todo el heterociclo aromático, da lugar
a un catión oxonio heteroaromático, en el que la mayor densidad relativa de carga
positiva se localiza sobre los carbonos C2 y C4 (Brouillard et al., 1982; Strack et al.,
1994). Por eso, estas dos posiciones son las más reactivas y por tanto particularmente
susceptibles al ataque nucleofílico de compuestos como el SO2, el ácido ascórbico, el
peróxido de hidrógeno y el agua (Markaids, 1982; Delgado-Vargas et al. 2000; Bridle
y Timberlake, 1997).
En segundo lugar por la presencia de anhídrido sulfuroso en los vinos tintos, que
produce también una fuerte decoloración de los antocianos, mediante una reacción
totalmente reversible, que puede suponer una pérdida temporal de la intensidad de
color. Al pH del vino, la mayor parte del anhídrido sulfuroso libre se encuentra bajo la
forma de anión SO3H-, que se combina con los antocianos bajo la forma de catión
flavilio, produciéndose un complejo incoloro, pero transcurrido un cierto tiempo se
produce una descombinación de este compuesto cuando tiene lugar una reducción de
la fracción anhidro sulfuroso libre.
En tercer lugar se puede producir degradación térmica en los antocianos
monómeros; es importante señalar que todos estos factores están interrelacionados,
de echo, el proceso de degradación térmica se ve también influido por el pH del
medio, siendo más acusado a valores de pH más altos (Havlikova et al., 1985). La
radiación luminosa también acelera la degradación de los antocianos, probablemente
debido a la existencia de reacciones de tipo autooxidativo (Iacobucci et al., 1983;
Shenoy, 1993), pero este efecto degradativo de la luz parece ser inferior al del pH y
de la temperatura (Markakis et al., 1986; Sapers et al., 1987), y llega a ser
inapreciable cuando los valores de la temperatura son elevados (Attoe et al., 1981).
Antecedentes: El color del vino.
46 Dora Blanco Vega 2013
Figura 15. Mecanismo de degradación térmica de los antocianos. (1) Ácido Siríngico, (2)
ácido 2,4,6 trihidroxibenzoico (Salas et al., 2005)
Y por último la degradación de los antocianos debida a procesos oxidativos da
lugar a la apertura del heterociclo para formar, en medios neutros, un derivado
cumarínico, por la separación adicional del anillo B; en medios ácidos se ha propuesto
Antecedentes: El color del vino.
47 Dora Blanco Vega 2013
una reacción de tipo Baeller-Villiger, que llevaría a la ruptura del heterociclo, dando
lugar a productos incoloros (Hrazdina et al 1974) (figura 15). (Furtado et al., 1993;
Piffaut et al., 1994). De esta forma, se obtienen como productos principales 2,4,6
trihidroxibenzaldehído y un ácido fenólico correspondiente al ciclo B de la antocianidina
(p.ej., ácido siríngico si se trata de la malvidina)
Figura 16. Reacciones oxidativas de la degradación del 3-monoglucósido de Malvidina.
Antecedentes: El color del vino.
48 Dora Blanco Vega 2013
El principal mecanismo de degradación de los antocianos transcurre a través de
la formación del aglicón, mucho más inestable debido a la ausencia de sustitución en
posición C3. La acción de determinadas enzimas (glucosidasas) produce la separación
del azúcar, liberando el aglicón, que sufre una rápida degradación hacia productos
incoloros, favorecida por la acción del calor o de agentes oxidantes comunes como el
H2O2.
Vamos a ver ahora que factores influyen en la estabilidad de los antocianos:
primero se ha demostrado que la estabilidad en los antocianos aumenta con el número
de metoxilos en el anillo B, ya que protegen al carbono C2, de ataques nucleofilos
debido a un impedimento estérico, y por tanto disminuye al aumentar el número de
hidroxilos, y también que el grado de glicosilación aumenta la estabilidad.
Por otro lado también la presencia de acilación aumenta la estabilidad ya que
estos antocianos tienen mayor resistencia a la temperatura, a la luz, y a la
decoloración por SO2, se cree que esto es debido a la conformación plegada que
adoptan sobre todo los grupos acilos de longitud grande y que les protege de la
degradación, también influye la posición del resto de azúcar y la disposición espacial
del grupo acilo con el azúcar y el aglucón (Bridle y Timberlake 1997).
Una característica muy importante de los antocianos de la uva en los géneros
Vitis vinifera y que los distingue del resto de los antocianos de otras especies
vegetales, es que tienen libre el grupo OH de la posición 5 de su estructura de
antocianidina (señalado en la Figura 17.), esto permite la formación de los pigmentos
de piranoantocianos durante la elaboración, maduración y crianza del vino. En otros
géneros con esa posición ocupada por un azúcar (diglucósidos) la estabilidad del color
y la variación de este, evoluciona mucho peor pues no se pueden dar las reacciones
de cicloadición que originan estos piranoantocianos y que nos permiten estabilizar el
color.
Antecedentes: El color del vino.
49 Dora Blanco Vega 2013
Figura 17. Antociano monómero.
En cuanto a su aportación al color del vino, los antocianos monómeros son unos
pigmentos de color rojo y poseen unos cromóforos muy potentes (el coeficiente de
absorción molar a 520 nm para el 3-monoglucósido de malvidina, a pH 1.5, es de
27000 g-1Lcm-1) y además incrementan su intensidad colorante al formar complejos
de copigmentación.
Junto con los antocianos monómeros, la uva también aporta al vino otros
compuestos fenólicos, en su mayoría incoloros, en lo que respecta al color del vino
tinto, pero que están implicados en los fenómenos de transferencia de color de la uva
al vino durante la vinificación, y en la posterior evolución del color del vino tinto
durante su envejecimiento
Antecedentes: El color del vino.
50 Dora Blanco Vega 2013
2.III.2. COLOR Y COPIGMENTACION
2.III.2.1. Descripción
La copigmentación es un fenómeno que se da típicamente en medio acuoso y
que afecta a los antocianos monómeros en su forma de catión flavilio a la vez que a
otros compuestos fenólicos, normalmente no pigmentados (los copigmentos o
cofactores de copigmentación). Desde un punto de vista molecular, este fenómeno
consiste en la formación de un complejo de copigmentación de estequiometría 1:1, en
el que un pigmento (con estructura plana) se apila con un copigmento (también
necesita tener una estructura plana para ello), estableciéndose entre los anillos
aromáticos de ambos unas débiles interacciones por puentes de hidrogeno del tipo ∏-
∏ (Figura 18.) esto hace que el antociano quede protegido de la hidratación y que se
desplace el equilibrio hacia la formación del ión flavilio.
Figura 18. Formación de un complejo de copigmentación a partir de un pigmento (antociano monómero en su forma de catión flavilio) y de un copigmento (flavonol).
ANTOCIANO
OHO
OH
OH
R
R'
O Glu
OHO
OH
OH
R
R'
O Glicosa
O
COPIGMENTO
OHO
OH
OH
R
R'
OGlicosaO
OHO
OH
OH
R
R'
O
Glu
ANTOCIANO
OHO
OH
OH
R
R'
O Glu
OHO
OH
OH
R
R'
O Glicosa
O
COPIGMENTO
OHO
OH
OH
R
R'
OGlicosaO
OHO
OH
OH
R
R'
O
Glu
Antecedentes: El color del vino.
51 Dora Blanco Vega 2013
Se ha visto que estos complejos reaccionan con mucha facilidad con constantes
del orden 102-103, pero que también se pueden disociar muy fácilmente cuando
diluimos un vino (simplemente a una dilución de 1/20), o cuando aumentamos la
proporción de ciertos cosolventes en el medio acuoso, como el etanol o el ácido
acético.
Las moléculas que mejor actúan como copigmentos son los flavonoles, pero en
las uvas y por tanto en los vinos se encuentran en pequeñas cantidades (Bakowska et
al., 2004). Otros copigmentos de naturaleza fenólica, son los derivados del ácido
hidroxicinámico (ácidos caféico y p-cumárico), que también están en pequeñas
cantidades en el vino, mientras que los compuestos fenólicos más abundantes de los
vinos tintos, los flavan-3-oles (monómeros como la (+)-catequina y la (-)-
epicatequina, oligómeros como las proantocianidinas tipo B, y polímeros como los
taninos), son copigmentos poco efectivos, salvo quizás la (-)-epicatequina que puede
adoptar en disolución una disposición casi plana.
Figura 19. Efectos de la copigmentación de los antocianos monómeros en un vino joven de la variedad Cencibel. El efecto hipercrómico hace que el vino muestre un 20-40% más
1.7
(b) 530 nm
(a) 526 nm
400
1.4
1.1
0.8
0.5
0.2
500 600
Wavelength (nm)
AU
1.7
(b) 530 nm
(a) 526 nm
400
1.4
1.1
0.8
0.5
0.2
500 600
Wavelength (nm)
AU
VINO DILUIDO
(SIN COPIGMENTACIÓN)
VINO SIN DILUIR
(CON COPIGMENTACIÓN)
20-40% AUMENTO (13% alc.)
530 nm
526 nm
1.7
(b) 530 nm
(a) 526 nm
400
1.4
1.1
0.8
0.5
0.2
500 600
Wavelength (nm)
AU
1.7
(b) 530 nm
(a) 526 nm
400
1.4
1.1
0.8
0.5
0.2
500 600
Wavelength (nm)
AU
VINO DILUIDO
(SIN COPIGMENTACIÓN)
VINO SIN DILUIR
(CON COPIGMENTACIÓN)
20-40% AUMENTO (13% alc.)
20-40% AUMENTO (13% alc.)
530 nm
526 nm
530 nm530 nm
526 nm526 nm
Antecedentes: El color del vino.
52 Dora Blanco Vega 2013
de intensidad del color rojo (medido a 520 nm), y el desplazamiento batocrómico provoca que la longitud de onda del máximo de absorción visible aumente en 4 nm.
La formación del complejo de copigmentación provoca dos efectos que
habitualmente se observan asociados al fenómeno de la copigmentación:
a) Un efecto hipercrómico, es decir, un incremento de la intensidad del color
rojo mostrado por el vino tinto con copigmentación.
b) Un efecto batocrómico, es decir, un viraje hacia tonalidades más azuladas
del color rojo del vino tinto. (Brouillard, 1982; Liao y col., 1992; Davies y Mazza,
1993; Boulton y col., 2001). (Darías-Martín et al., 2001 y 2002; Schwarz et al., 2005)
Ambos efectos se suelen manifestar simultáneamente en los vinos tintos, sobre
todo en los jóvenes, en diverso grado según la composición fenólica y las relaciones
molares de copigmento/pigmento que de forma particular se den en un vino (Figura
19.).
La variación en el tono dependerá del antociano y del copigmento implicados,
lográndose una importante variedad de colores por la asociación entre un antociano y
diferentes copigmentos.
Como copigmentos pueden actuar moléculas distintas del antociano,
generalmente otros compuestos fenólicos, pero también otros antocianos o incluso
partes de la estructura del propio antociano. Se distinguen así tres tipos de
mecanismos de copigmentación.
Copigmentación intermolecular:
Son asociaciones que tiene lugar entre dos moléculas diferentes puede ser
Homomolecular o auto-asociación, cuando se produce entre distintas
moléculas de antociano.y Heteromolecular, sí tiene lugar entre antocianos y
otros compuestos (flavonoides no antocianos, aminoácidos, ácidos orgánicos…),
es la denominada simplemente copigmentación.
Copigmentación intramolecular:
Antecedentes: El color del vino.
53 Dora Blanco Vega 2013
Son asociaciones que se producen entre antocianidinas y sus residuos ácidos
aromáticos.
Un caso particular sería la complejación con metales. Ésta es sólo posible para
antocianos con grupos OH libres en posición orto del anillo B, tal es el caso de
cianidina, delfinidina y petunidina. Dado que malvidina 3-glucósido, antociano
mayoritario en el vino, no puede formar esos complejos, este tipo de copigmentación
no debería jugar un papel relevante en el color de la mayoría de los vinos.
2.III.2.2. Copigmentación intermolecular
En la mayoría de los casos, el proceso de copigmentación conduce a la
estabilización de las formas coloreadas del antociano, el catión flavilio y la base
quinoidal. Mazza et al. (1989) observaron que el efecto de copigmentación es mayor
cuando aumenta el grado de metoxilación y glicosilación en el antociano. Por tanto de
todos los antocianos monómeros la malvidina presenta el mayor efecto de
copigmentación al compararlo con otros antocianos (Mazza et al., 1990; Davies et al.,
1993; Eiro et al., 2002). El grado de hidroxilación también afectaría a la
copigmentación, ya que ésta es mayor para la cianidina que para la pelargonidina
(Eiro et al., 2002).
La diferente eficacia de los copigmentos puede deberse a diversos factores
estructurales, entre los que cabe mencionar el tipo de sustituyentes presentes y la
diferencias en la configuración o estereoquímica que se requieren para tener próximos
el copigmento y el pigmento. Baranac et al. (1996, 1997) determinaron que la
constante de copigmentación es mayor con morina que con quercetina y rutina, lo que
puede deberse a la posición de los grupos OH en el anillo B, que están en posición
meta en la morina (2´ y 4´) y en posición orto en quercetina y rutina (3´ y 4´).
2.III.2.2.1. Homomolecular o Auto-asociación
Asen et al. (1972) observaron por primera vez la existencia de fenómenos de
auto-asociación entre moléculas de antocianos. En medio acuoso y pH 3,16
observaron que al aumentar de la concentración de cianidina 3,5 diglucósido 100
veces (de 10-4 a 10-2M) aumentaba la absorbancia 300 veces y el espectro de la
disolución sufría un desplazamiento de la λ máxima de 507 a 502 nm.
Antecedentes: El color del vino.
54 Dora Blanco Vega 2013
Con concentraciones bajas de malvidina 5*10-5 M a pH neutro, la interacción
entre moléculas de antocianos es mínima, pero con concentraciones mayores 5* 10-3
M, se produce una fuerte interacción entre formas quinoidales del antociano, que
además aumentan su estabilidad en las disoluciones más concentradas, al hacerse
más lento el proceso de hidratación. Como consecuencia, en las disoluciones se
produce un marcado efecto hipercrómico que, dependiendo del antociano implicado,
en ocasiones se acompaña de un efecto batocrómico (en el caso de las disoluciones de
cianina, por ejemplo) o bien hipsocrómico (malvidina). El fenómeno debe ser de gran
importancia en la expresión del color de las flores, donde los antocianos se encuentran
en concentraciones mayores de 10-2 M (Hoshino et al., 1981a). Hoshino et al. (1982)
estudiaron la auto-asociación mediante RMN observando que la resonancia de los
protones de los núcleos aromáticos se vuelve más alta al aumentar la concentración
del antociano en la disolución. De esta forma demuestran las interacciones verticales
entre núcleos aromáticos.
Figura 20 Estructura de auto-asociación entre dos moléculas de antociano head to head (izq.) y head to tail (dcha.).
2.III.2.3. Copigmentación intramolecular
Este proceso tiene lugar en antocianos con estructuras complejas, en los que
uno o más azúcares están esterificados con ácidos generalmente cinámicos. En la
Antecedentes: El color del vino.
55 Dora Blanco Vega 2013
copigmentación intramolecular no va a haber molécula de copigmento sino que, una
parte de la molécula del antociano reacciona con la estructura plana del ión flavilio,
por lo que va a depender de los sustituyentes que posea dicho antociano.
El pKh de estos antocianos aumenta al ir los sustituyentes del antociano de
pequeños a grandes, especialmente en antocianos con cadenas más largas y lineales
que permiten mayor flexibilidad de la molécula. Cuanto más grande sea el
sustituyente mayor efecto batocrómico se observa. Otra característica de estas
moléculas altamente sustituidas es que se produce un aumento en el ε (coeficiente de
extinción molar) de la forma flavilio al compararla con los correspondientes derivados
mono y diglucósidos (Figueiredo et al., 1995).
Este tipo de antocianos es el más estable. La protección de la copigmentación
intramolecular es tal que algunos de los antocianos en medios ácidos débiles no se
hidratan. En ellos las posiciones 3´y 7 se encuentran sustituidas con cadenas que
favorecen una fuerte interacción Π-Π con el cromóforo central. Se forma así una
estructura de tipo sándwich, en el que la cadena del C-3´ se encuentra plegada sobre
la cadena en posición 7, y en medio de ellos se encuentra el cromóforo. Esta
estructura permite más protección frente a la hidratación del antociano que cuando las
cadenas están en posición 3 y 5, ya que el ácido se dobla sobre el cromóforo,
protegiendo las posiciones 2 y 4 del ataque del agua (Figueiredo et al., 1999).
2.III.2.4. Factores que afectan a la copigmentación
El efecto de copigmentación está influido por el pH, la temperatura, las
concentraciones de pigmento y de copigmento, el disolvente y las estructuras
moleculares de todos los compuestos implicados.
2.III.2.4.1. La Concentración.
Existe una concentración de antocianos mínima a partir de la cual se puede
observar el efecto de la copigmentación, que es de 3,5*10-5M (Asen, 1996). Sin
embargo en los copigmentos aunque no se han encontrado unos valores mínimos de
concentración para que interaccionen con el antociano, si se observa que la interacción
aumenta cuando aumenta su concentración (Asen et al., 1972; Scheffeldt et al.,
1978). Influye también la relación que exista entre las dos concentraciones .
Antecedentes: El color del vino.
56 Dora Blanco Vega 2013
2.III.2.4.2. La Temperatura.
Como en otros procesos exotérmicos en la copigmentación (Dangles et al.,
1992b), sucede que al aumentar la temperatura, los complejos que se forman son
menos estables, y se dan en una menor proporción (Cai et al., 1990; Wilska-Jeska et
al., 1996), ya que este aumento de temperatura da lugar a una rotura de la red
tetraédrica del agua y por tanto el número de puentes de hidrógeno se reduce,
haciendo el fenómeno de copigmentación menos eficiente (Brouillard et al., 1994).
2.III.2.4.3. El pH.
La copigmentación se produce de forma más eficaz con la forma hemiacetal de
los antocianos por tanto el pH más adecuado para que se produzca será entre 2 y 5,
(Williams et al., 1979). Si el pH es demasiado ácido entre 1 y 2 predomina el catión
flavilio, pero la alta concentración de protones hace que no se produzca la
copigmentación tan fácilmente aunque se sigue formando (Dangles, 1992a). Esta
interacción se manifiesta como un fuerte desplazamiento batocrómico (Alluis et al.,
2000) y como un descenso de la absorbancia en la longitud de onda de máxima
absorción, debido a que el coeficiente de extinción molar (ε) del complejo copigmento-
antociano es menor que el del antociano libre (Dangles, 1992b).
2.III.2.4.4. El Disolvente.
La reacción de copigmentación necesita un medio altamente organizado para
que está se produzca de forma eficaz, el medio acuoso permite las mejores
condiciones e influye directamente por la cohesión que presenta la red tetraédrica de
moléculas de agua unidas por puentes de hidrógeno;
Por tanto si introducimos otros disolventes en el medio que provoquen la
ruptura parcial de esta red, la eficacia de la copigmentación disminuirá
apreciablemente (Brouillard et al., 1989; Mazza et al., 1990; Brouillard et al., 1991).
Aun así, el proceso de copigmentación sigue produciéndose en mezclas mixtas donde
el agua permanece como el componente principal del medio.
Antecedentes: El color del vino.
57 Dora Blanco Vega 2013
2.III.2.4.5. Las Sales y la fuerza iónica.
La presencia en el medio de distintos iones como K+, Na+, Cl- etc., compiten
con el ión flavilio por las moléculas de agua, y pueden evitar la hidratación de éste
(Dangles et al., 1992). La adición de sales iónicas (NaCl, NaBr, NaI, NaClO4) a una
disolución con antocianos, aumenta el color de ésta debido a la formación de pares
iónicos entre el catión flavilio cargado positivamente y el anión, lo que hace que el
equilibrio se desplace hacia la formación de más iones flavilio y por tanto se produce
un efecto hipercrómico proporcional a la concentración de sales añadidas (Figueiredo
et al., 1994). Este efecto se percibe cuando la concentración de sales es mayor de 1
mol*L-1.
2.III.2.4.6. La Naturaleza del copigmento.
Los copigmentos pueden ser de naturaleza diversa: flavonoides, alcaloides,
aminoácidos, ácidos orgánicos, nucleótidos, polisacáridos, metales etc. En general, los
mejores copigmentos son aquellos que contienen núcleos aromáticos y poseen cierta
planaridad, para poder acercarse y apilarse con los antocianos (Dangles et al., 1992).
2.III.3. Formación de nuevos compuestos
Otras reacciones que se pueden producir durante la elaboración y crianza de los
vinos tintos y que también modifican el color son: Condensación directa entre
antocianos y flavanoles, condensación mediada por acetaldehído, Condensación F-F
mediada por Glioxilico, y la formación de Piranoantocianos.
A continuación, se describen los diferentes mecanismos de reacción y los
productos resultantes de las mismas que se han descrito en los vinos o en disoluciones
modelo.
2.III.3.1. Condensación directa entre antocianos y flavanoles
Existen dos tipos posibles de reacciones de condensación determinadas por las
características de reactividad de antocianos y flavanoles:
A) Condensación antociano-flavanol (A-F).
Se produce por un ataque de las posiciones nucleofílicas C8 o C6 de un flavanol
sobre la posición electrofílica C4 del catión flavilio de un antociano, esto da lugar
xantilio
Antecedentes: El color del vino.
58 Dora Blanco Vega 2013
de color amarillo inicialmente a un flaveno, que puede luego deshidratarse y oxidarse
para dar un derivado (Jurd et al., 1965; Jurd, 1967; Jurd et al., 1970; Baranowski et
al., 1983; Liao et al., 1992; Santos-Buelga et al., 1995, 1999) o un producto incoloro
de condensación bicíclica (Bishop et al., 1984).
Figura 21. Mecanismo de condensación directa antociano-flavanol (A-F) (Cheynier, 2001).
La primera evidencia de formación de un producto incoloro de tipo A-F unido
bicíclicamente fue aportada por (Bishop y Nagel (1984), quienes en disoluciones
modelo lograron detectar e identificar por RMN un dímero malvidina 3,5- diglucósido
(C2-O-C7, C4-C8)-epicatequina. La formación de un producto similar en ensayos
realizados en disoluciones modelo que contenían malvidina 3-glucósido y (epi)
catequina fue posteriormente constada por Remy-Tanneau et al. (2003), realizando su
identificación mediante HPLC-ESI/MS y procedimientos de tiolisis.
Antecedentes: El color del vino.
59 Dora Blanco Vega 2013
B) Condensación flavanol-antociano (F-A):
Los enlaces interflavánicos de las proantocianidinas condensadas se pueden
romper en medio ácido, dando lugar a carbocationes que actúan como electrófilos y
que pueden reaccionar con las posiciones nucleofílicas C6 o C8 de la forma carbinol de
un antociano (figura 22).
Estos carbocationes también pueden reaccionar con otros flavanoles, generando
nuevas moléculas de proantocianidinas, que pueden conducir a un aumento del grado
medio de polimerización (Vidal et al., 2002).
Los compuestos de condensación F-A muestran un espectro de absorción
característico de antocianos, con λ máxima en la región del visible desplazada
batocrómicamente con respecto a los antocianos originales (Fossen et al., 2004;
González-Paramás et al., 2006).
Figura 22. Mecanismo de condensacion directa flavanol-antociano (F-A) (Cheynier,
2001).
Antecedentes: El color del vino.
60 Dora Blanco Vega 2013
La reacción de condensación no afecta a las posiciones C2 o C4 del antociano
por lo que los nuevos pigmentos F-A no están más protegidos frente al ataque del
agua que la forma monomérica del antociano (Salas et al., 2004).
El pH parece jugar un papel destacado en la formación de uno u otro tipo de
condensados. Salas et al. (2003) en soluciones modelo de pH 2,0 y 3,8 estudiaron la
reacción entre procianidina B2-3´´Ο-galato (Epicatequina-(4-8)-epicatequina-3´´Ο-
galato) y malvidina 3-glucósido. A pH 2,0 observaron que se producía la ruptura
interflavánica de la procianidina y la adición nucleofílica del flavanol o del antociano al
carbocatión liberado, formándose derivados de tipo (Ec)n-EcG (condensación FF) y
(Ec)n-malvidina 3-glucósido (condensación F-A). A pH 3,8, sin embargo, se producía la
adición nucleofílica de la procianidina al antociano generando el compuesto malvidina
3-glucósido–(Ec-EcG) (condensación A-F). La presencia de condensados de los tipos
anteriores ha sido puesta de manifiesto tanto en sistemas modelo como en vinos,
mediante tiolisis y espectrometría de masas (Remy et al., 2000; Salas et al., 2004;
Alcalde-Eon et al., 2004, 2006). En general, los productos tanto de tipo A-F como F-A
parecen estar más asociados a estructuras oligoméricas que a poliméricas (Remy et
al., 2000), aunque (Hayasaka y Kennedy (2003) detectaron masas moleculares de
polímeros de ambos tipos hasta un nivel de octámeros.
Recientemente este tipo de pigmentos ha sido encontrado en algunas frutas y
verduras, como fresas (Fossen et al., 2004), grosella (McDougall et al., 2005), maíz
morado, judías y uvas (González-Paramas et al., 2006), sugiriendo por tanto, que no
son sólo productos formados durante la vinificación y el envejecimiento, sino que
podrían encontrarse en las plantas de forma natural.
2.III.3.2. Condensación mediada por acetaldehído
El acetaldehído puede estar presente en el vino debido al metabolismo de las
levaduras durante la fermentación alcohólica (Romano et al., 1994) y/o a la oxidación
del etanol generalmente acoplada a reacciones de oxido-reducción de polifenoles
(Wildenradt et al., 1974).
Antecedentes: El color del vino.
61 Dora Blanco Vega 2013
El acetaldehído en forma de carbocatión reacciona con el flavanol en la posición
C6 o C8. Este producto flavanolacetaldehído pierde una molécula de agua y da lugar a
un nuevo carbocatión que puede atacar a otro flavanol o a un antociano en posición
C8 (figura 23). La condensación entre flavanoles puede ser a través de los carbonos
C6 y C8 y se obtienen 4 productos principales, C6-C8 (R y S), C6-C6, y C8-C8
(Fulcrand et al., 1996b; Saucier et al., 1997; Es-Safi et al., 1999ª). Los antocianos
sólo parecen estar ligados a este tipo de estructuras a través de su C8 (Es-Safi et al.,
1999b). En el caso de la reacción entre flavanoles se producen condensados incoloros
(Fulcrand et al., 1996b; Cheynier et al., 1997ª; Saucier et al., 1997ª, b, c; Es-Safi et
al., 1999ª, b), mientras que en la reacción con antocianos se forman pigmentos con
espectros de absorción cuya λmax en el visible se encuentra desplazada
batocrómicamente con relación a la de los antocianos originales, lo que les confiere un
tono más violáceo.
Esta tonalidad, puede ser debida a una mayor tendencia del núcleo antocianidina
a estabilizarse por desprotonación hacia la formación de la base quinoidal (Timberlake
et al., 1976).
Estos nuevos pigmentos resultan más estables al efecto del pH y a la
decoloración por SO2 que los antocianos libres, pero no son muy estables en
soluciones acuosas, produciéndose la ruptura del puente etilo entre la antocianina y el
flavanol, lo que da lugar a reorganizaciones estructurales de los compuestos
(Escribano-Bailón et al., 2001).
En disoluciones modelo de malvidina 3-monoglucósido y catequina en presencia
de acetaldehído se encontró que en la reacción se formaban dos pigmentos
mayoritarios (Roggero et al., 1987) de m/z[M]+ 809 (Bakker et al., 1993), que se
propuso que correspondían a dos enantiómeros por la existencia del carbono
asimétrico en el grupo etilo (Rivas-Gonzalo et al. 1995).
Antecedentes: El color del vino.
62 Dora Blanco Vega 2013
Figura 23. Mecanismo de las reacciones flavanol-antociano y flavanol-flavanol inducidas por el acetaldehído (Cheynier, 2001).
Los dímeros A-etil-F han sido detectados en vinos mediante ESI-MS. Se han
detectado señales de masas correspondientes a los dímeros etil-(epi) catequina de los
glucósidos y glucósidos acilados de malvidina, delfinidina, cianidina, peonidina,
petunidina. (Cheynier et al., 1997; Revilla et al., 1999; Vivar. Quintana, 1999, 2002;
Antecedentes: El color del vino.
63 Dora Blanco Vega 2013
Dante et al., 2002; Atanasova et al. 2002; Mateus et al., 2002; Alcalde-Eon et al.,
2006; Wang et al., 2003). También se ha descrito en el vino señales de dímeros y
trímeros del tipo flavanol-etil-flavanol (Cheynier et al., 1997ª; Saucier et al., 1997c).
Los compuestos dímeros pueden dar lugar a nuevos pigmentos más
polimerizados, por la incorporación de nuevas unidades que pueden llegar a precipitar
(Bakker et al., 1993; García Viguera et al., 1994; Escribano-Bailón et al., 1996; Es
Safi et al., 1999b). Los pigmentos polímeros pueden estar constituidos por varias
unidades de flavanol, pero no pueden estar constituidos por más de dos unidades de
antociano. Esto es debido a que sólo se produce la reacción en la posición C8 de los
antociano, por lo tanto, este proceso se detiene cuando los dos extremos de la cadena
se encuentran ocupados por una unidad de antociano (Es-Safi et al., 1999b).
Sin embargo, Atanasova et al. (2002b) demostraron que la reacción de
condensación por mediación de acetaldehído se puede dar implicando exclusivamente
antocianos, dando lugar a la formación de dímeros, trímeros y tetrámeros unidos por
puentes de etilo en sus formas flavilio, pseudobase carbinol y quinoidal, lo que sugiere
que no sólo la posición C8 del antociano es reactiva.
La velocidad de esta reacción es mayor en presencia de oxígeno y a pH ácido,
debido a que se favorece la formación del acetaldehído a partir del etanol y de su
catión respectivamente (García- Viguera et al., 1994; Rivas- Gonzalo et al., 1995; Es-
Safi et al., 1999ª; Atanasova et al., 2002ª). A temperaturas bajas (15ºC) los
polímeros se acumulan más lentamente que a temperaturas mas altas (32ºC), pero
son más estables en relación a su degradación y precipitación (Baranowski et al.,
1993; Rivas-Gonzalo et al., 1995).
En presencia de malvidina 3 monoglucósido, acetaldehído y diferentes
flavanoles, la velocidad de reacción de estos es mayor para la procianidina C1<
procianidina B1< procianidina B2< procianidina B2-3´´O-galato< procianidina B3<
epicatequina< catequina (Dallas et al., 1996; Es-Safi et al., 1996).
Antecedentes: El color del vino.
64 Dora Blanco Vega 2013
2.III.3.3. Reacciones mediadas por otros aldehídos
Otros aldehídos, como el isovaleraldehído, benzaldehído, propionaldehído,
isobutiraldehído, formaldehído o 2-metilbutiraldehído pueden dar lugar a pigmentos de
tipo antociano-alquil/aril-flavanol y a dímeros incoloros de tipo flavanolalquil/ aril-
flavanol. El espectro visible de los pigmentos muestra una λmax desplazada
batocrómicamente respecto a los antocianos originales, por lo que producen tonos
azulados (Pisarra et al., 2003). Estos aldehídos pueden provenir de la adición de
aguardiente vínico al mosto con el fin de parar la fermentación, este aguardiente
vínico, normalmente utilizado en sector vinícola de los vinos de Oporto, tiene
contenidos altos de estos aldehídos (30-150gm/L).
Estos compuestos parecen ser inestables en los vinos y sólo se han encontrado
trazas de ellos por HPLC-MS.
Sin embargo, podrían actuar de intermediarios en la formación de pigmentos
más estables como los aductos antociano-vinilflavanol (Pisarra et al., 2004, 2005).
Más recientemente Sousa et al (2007) detectaron en disoluciones modelo un nuevo
pigmento resultante de la reacción entre la malvidina 3-monoglucósido y catequina en
presencia de vainillinaldehído (principal aldehído presente en la madera de roble), que
fue caracterizado por RMN y HPLC-MS. Este pigmento presenta una λmax de absorción
en la región del visible a 549 nm, proporcionando un color violáceo, y posee una
mayor resistencia a la hidratación y al efecto decolorante del bisulfito en comparación
con el antociano de origen.
El mecanismo de formación de todos estos pigmentos es similar al de los de
condensación mediada por acetaldehído.
2.III.3.4. Condensación flavanol-flavanol mediada por ácido glioxílico
En disoluciones de vino sintético en las que se inducía mediante la incorporación
de hierro la oxidación de la catequina, Fulcrand et al. (1997) identificaron un dímero
incoloro resultante de la condensación entre unidades de catequina a través de un
puente carboximetilo, derivado del ácido glioxílico formado, a su vez, por la oxidación
del ácido tartárico. De acuerdo con estos autores, este compuesto actuaría como
Antecedentes: El color del vino.
65 Dora Blanco Vega 2013
intermediario hacia la posterior formación de pigmentos de tonalidad amarillenta
(λmax 410-460 nm) que habían sido detectados en disoluciones de xanteno en
sistemas modelo de vino (Santos-Buelga et al., 1995).
Para este tipo de pigmentos se habían propuesto estructuras de tipo lactona
formadas tras la pérdida de una molécula de agua del dímero carboxi metilo (Francia-
Aricha et al, 1998). Sin embargo, la caracterización estructural de uno de estos
pigmentos (NJ2) llevada a cabo por Es-Safi et al. (1999) puso de manifiesto que se
trata de sustancias con estructura de tipo xantilio (figura 24.), cuyo mecanismo de
formación pasa por la deshidratación de los compuestos incoloros catequina-
carboximetil-catequina para dar lugar a un compuesto tipo xanteno, que
posteriormente se oxidaría al xantilio.
Figura 24. Reacciones de los flavanoles con el ácido glioxílico (Es-Safi et al., 1999,
Cheynier 2001)
Además del pigmento NJ2, Es-Safi et al. (1999c, 2000) encontraron también la
formación en disoluciones hidroalcohólicas de su ésteres etílico y metílico (NJ3 y NJ3´
respectivamente); con λmax de 460nm, la esterificación de estos compuestos ocurre
en el dímero incoloro antes de la formación del cromóforo xantilio. Estas sales de
xantilio pueden verse involucradas en procesos de polimerización, habiéndose descrito
trímeros de las mismas con posible estructura quinoidal y λmax de ≈ 560 nm (Es-Safi
et al., 2000, 2003).
Antecedentes: El color del vino.
66 Dora Blanco Vega 2013
En disoluciones modelo con catequina, malvidina 3-monoglucósido y ácido
glioxílico, además de los dímeros incoloros catequina- carboximetil-catequina, se han
detectado dímeros coloreados formados por unidades flavanol y el antociano unidos
por un puente carboximetilo (Es-Safi et al., 2003). Sin embargo, en sistemas modelos
que contienen ácido tartárico y etanol, pero no ácido glioxílico añadido, sólo se
detectan los compuestos incoloros de condensación de flavanoles a través de puentes
carboximetilo y los correspondientes pigmentos amarillos derivados (Santos-Buelga et
al., 1999).
Tanto los aductos carboximetilo incoloros, como los derivados de tipo Xanteño y
las correspondientes sales xantilio se han detectado en fracciones de vino tinto por
HPLC/ESI-MS (Es-Safi et al., 2000b, c, 2003).
3.III.4. Piranoantocianos
Tradicionalmente se pensaba que los cambio de color que ocurría en los vinos
durante su elaboración y envejecimiento eran debidos principalmente a la formación
de pigmentos derivados de antocianos, con un carácter oligomérico y polimérico, al
reaccionar con los taninos del vino, pero a partir de 1996, Cameira-dos-Santos et al.
(1996) descubren unas nuevas sustancias que habían quedado retenidas en las
membranas para filtrar vinos tintos consiguen aislarlas y más tarde Fulcrand et al.
(1996) elucidan su estructura, como el resultado de una cicloadición de un resto de4-
vinilfenol sobre las posiciones C4 y OH en C5 de los antocianos, principalmente
malvidina-3-glucósido. Al formarse un nuevo anillo de pirano sobre la estructura del
antociano a estos nuevos compuestos se les denomino piranoantocianos.
Este tipo de pigmentos derivados de antocianos se caracterizan por poseer un
anillo pirano adicional en la estructura del antociano y un espectro de absorción en la
región del visible con su máximo desplazado hipsocrómicamente respecto de los
antocianos monómeros de los que provienen.
Apartado IV
“PIRANOANTOCIANOS”
Antecedentes: Piranoantocianos.
69 Dora Blanco Vega 2013
2. IV . LOS PIRANOANTOCIANOS Y EL COLOR DEL VINO.
2.IV.1. DEFINICIÓN
Se denominan así a un grupo nuevo de pigmentos que poseen en su estructura
molecular una nueva molécula de pirano formada por cicloadición entre el carbono 4 y
el hidroxilo del carbono 5, fue descubierta en 1996, Cameira-dos-Santos et al. (1996)
al analizar una serie de sustancias que habian quedado retenidas al filtrar unos vinos
tintos envejecidos, esa estructura con un nuevo anillo de pirano es la que da lugar al
nombre “piranoantocianos”. Al estudiarlas se descubre que las moléculas capaces de
reaccionar con los antocianos para dar lugar a estos nuevos pigmentos, deben tener
un doble enlace que les permita formar esa cicloadición.
Después de esto empiezan a descubrirse muchos otros pigmentos derivados de
los antocianos y con un nuevo anillo piránico que se pueden agrupar según el tipo de
molécula que produce la cicloadición en:
2.IV.2. TIPOS DE PIRANOANTOCIANOS
-piranoanticianos tipo vitisina
-Fenil-piranoantocianos
-vinilflavanol- piranoantocianos
-vinil-piranoantocianos
2.IV.2.1. PIRANOANTICIANOS TIPO VITISINA
La primera estructura de estos piranoantocianos que se identificó procedía de la
reacción del 3-monoglucósido de malvidina con el ácido pirúvico (un metabolito
secundario de las levaduras), a través de la forma enólica de este último (el enol es el
doble enlace polarizado) y luego descarboxilación, este compuesto fue descrito por
primera vez por Bakker y Timberlake (1997), y fue denominado Vitisina A.
Más tarde Fulcrand et al. (1998) proponen una nueva estructura que difiere
algo de la propuesta de Bakker et al. (1997) ya que posee un núcleo de malvidina
Antecedentes: Piranoantocianos.
70 Dora Blanco Vega 2013
pero lleva unido al nuevo anillo de pirano un grupo carboxilo. Esta es la razón por la
cual a este tipo de pigmentos se les llama 5 carboxipiranoantocianos.
Figura 25. Mecanismo propuesto para la reacción entre el ácido pirúvico y la malvidina 3-glucósido (Fulcrand et al., 1998 a)
Luego fue aislado este tipo de compuestos y se caracterizo completamente su
estructura por un grupo francés compuesto por (Fulcrand, Benabdeljalil, Rigaud,
Cheynier & Moutounet, 1998 ; Benabdeljalil, Cheynier, Fulcrand, Hakiki, Mosaddak
&Moutounet, 2000). Y varios autores han confirmado la última estructura de la vitisina
A realizada por Fulcrand et al. (1998). mediante experimentos de RMN (Mateus,
Silva, Vercauteren, y De Freitas, 2001); (Schwarz, Quast, et al., 2003). En 2011 se
amplian los estudios de estos compuestos con RMN y espectrocopía UV-vis (2011
Oliveira, J.; Petrov, V.; Parola, A. J.; Pina, F.; Azevedo, J.; Teixeira, N.; Brás, N. F.;
Fernandes, P. A.; Mateus, N.; Ramos, F. J.; de Freitas).
Otro compuesto con características similares fue descubierto por (Bakker y
Timberlake 1997) que aislaron el producto de la reacción de la malvidina 3-glucósido y
el acetaldehído, y fue denominado vitisina B, y se obtuvo de vinos de Oporto. Este
pigmento tiene únicamente un hidrogeno como sustituyente del nuevo anillo de pirano
y por tanto presenta la estructura más simple de los piranoantocianos.
Antecedentes: Piranoantocianos.
71 Dora Blanco Vega 2013
Figura 26. Reacción entre la malvidina 3-glucósido y el acetaldehído para dar la Vitisina B.
(Morata, Gómez-Cordovés, Colomo, & Suárez, 2003) estudian la formación de
piranoantocianos con los metabolitos procedentes de la fermentación de las levaduras,
como pueden ser el Pirúvico o el acetaldehído, que da lugar a la Vitisina B, todos
estos compuestos se forman por un mecanismo de adición que se puede generalizar a
todos los compuestos que presenten tautomería ceto-enólica (doble enlace
conjugado), y que muchos de ellos se forman durante la fermentación alcohólica.
Uno de los ejemplos de compuestos que presenta está tautomería es el
acetaldehído, que en los vinos es producido y liberado por las levaduras durante la
etapa fermentativa (Fleet y Heard, 1992, Liu y Pilone, 2000). En algunos tintos
fortificados, tales como vinos de Oporto, el acetaldehído también es incorporado a
través de destilados (que pueden contener grandes cantidades de acetaldehído y otros
aldehídos) (Bakker, 1986). La Vitisina B es por tanto detectada en mayor cantidad en
los vinos fortificados que en cualquier otros (Bakker et al., 1997).
Más adelante se hace estudios sobre (Morata a, M.C. Gómez-Cordovés b, F.
Calderón a, J.A. Suárez a 2006) la producción de ac. Pirúvico y acetaldehído por parte
de distintas levaduras y la importancia que tiene la concentración de estas en el vino
para la formación de vitisin A y B.
En 2007(Morata, Calderón et al 2007) realizaron nuevos estudios sobre la
formación de vitinas Ay B por adicion de ac. Pirúvico y acetaldehído y describieron su
comportamiento si se adicionaba en una sola dosis, en dosis sucesivas y si se producia
sinergia entre la dos reacciones; se vió que la adición de estas moléculas
Antecedentes: Piranoantocianos.
72 Dora Blanco Vega 2013
incrementaba mucho la formación de vitisinas pero había que tener especial cuidado
con la adición de acetaldehído ya que podía hacer que disminuyese la presencia de
antocianos por la formación de compuestos de polimerización.
Más adelante (Joana Oliveira, Victor de Freitas, Nuno Mateus 2009) descubren
una nueva via de síntesis de vitisina B con el vinil-oxitrimetil-silano con un
rendimiento del 30 %.
Figura 27. propuesta de formación de vitisin B a partir del viniloxitrimetilsilano.
En estas reacciones la parte electrodonadora del doble enlace ataca a la
posición 4 del catión flavilio y este añillo se cierra por el ataque del OH del carbono 5
del catión flavilio sobre la parte electroaceptora del doble enlace, con una posterior
perdida de una molécula de agua y otra de CO2, el resultado final es la formación de
una nueva molécula con un nuevo anillo de piranosa.
Antecedentes: Piranoantocianos.
73 Dora Blanco Vega 2013
En el año 2000 se descubre que este mecanismo también ocurre con otras
moléculas presentes en el vino pero que no proceden de la actividad de las levaduras
como puede ser acido α-cetoglutárico, acetona, diacetil etc. (Fulcrand et al., 1998;
Schwarz, Wabnitz, et al., 2003). Y (Benabdeljalil et al. (2000), Lu, Sun, and Foo
(2000) y describen un nuevo tipo de piranoantocianos que poseen un grupo metilo
añadido al anillo de pirano.
Más tarde (He, Santos-Buelga, Silva, Mateus, y De Freitas (2006) sintetizan y
describen la formación de estos piranoantocianos como la reacción entre el acido
acetoacético y la malvidin-3-glucosa y miden su máximo de absorción en 478nm.
Figura 28. Mecanismo de formación del metil piranoantociano a partir del ácido
acetoacético.
La característica común a todos estos compuestos es que resultan de la
reacción entre antocianos y pequeñas moléculas con un doble enlace polarizado ,
tienen el espectro desplazado hipsocromicamente con respecto al antociano de
referencia, ≈18-20nm, los de tipo vitisina A y entre 36 y 39 nm la vitisina B, lo que se
corresponde con compuestos más anaranjados, también presentan un hombro a 352-
370 nm característico de las antocianinas sustituidas en posición C4, y esto es lo que
le confiere una mayor resistencia a la hidratación y al ataque del SO2 y, por tanto
mayor estabilidad frente a los cambios de pH y una mayor intensidad de color en
Antecedentes: Piranoantocianos.
74 Dora Blanco Vega 2013
comparación con los antocianos 3 glucósidos (Bakker et al., 1997). (Oliveira, Mateus
et al 2006)
Este tipo de compuestos no se han encontrado solo en vinos sino en zumos y
extractos de verduras y distintas frutas (Mónica Jordheim, Torgils Fossen, and øyvind
M. Andersen, 2006) (Michael Rentzsch, Peter Quast, Silke Hillebrand, Jutta Mehnert,
Peter Winterhalter, 2004)
2.IV.2.2. VINILFENOL-PIRANOANTOCIANOS
Paralelamente al descubrimiento de la Vitisina A en 1996, se detectan una nueva
clase de pigmentos (Cameira dos Santos et al. 1996). Y Un análisis más detallado
revela que estos nuevos pigmentos son los p-glucósidos y p-cumaroilglucósidos de
una aglicona desconocida con una masa molecular de m / z 447,5. La elucidación de la
estructura final de estos pigmentos de color rojo en el vino (Fulcrand et al., 1996)
mediante RMN presentaba una estructura que poseía un anillo adicional de pirano
entre C-4 y el grupo hidroxilo en C-5 de una molécula de malvidina, y que llevaba una
fracción de fenol, por eso se denominaron vinilfenolpiranoantocianos.
(Fulcrand, Benabdeljalil, Rigaud, Cheynier & Moutounet, 1998); (Benabdeljalil,
Cheynier, Fulcrand, Hakiki, Mosaddak & Moutounet, 2000) aislaron estos compuestos
y postularon la formación del 4 vinil fenol por vía de la descarboxilación del acido
cumárico que procedía de la actividad enzimática de la levadura. (Chatonnet,
Dubourdieu, Boidron, & Lavigne, 1993);(En 1981 Etievant et al), demostraron que
solo los ácidos cumárico y ferúlico se ven afectados por la actividad cinamato
descarboxilasa de las levaduras pero no así los ácidos caféico y sinápico, que también
daban lugar a reacciones de este tipo.
Antecedentes: Piranoantocianos.
75 Dora Blanco Vega 2013
Figura 29. Formación de vinilfenoles a partir de ácidos hidroxicinámicos.
Mas tarde (Schwarz, Jerz & Winterhalter, 2003) aíslan el 4 vinylcatechol al que
se denomina Pinotin A y demuestran que estos piranoantocianos que tienen un
hidroxifenil sustituyente, no provienen solo de la descarboxilación enzimática de los
ácidos hidroxicinámicos, sino que pueden reaccionar directamente con esos mismos
ácidos. Estudiando esta reacción ven que se produce de forma muy rápida y se
completa en pocas horas. Otra curiosidad por parte de este compuesto es el
incremento de Pinotin A durante el almacenamiento de los vinos incrementándose su
contenido 10 veces más que en los vinos jóvenes, entre el 5 y 6 año de
almacenamiento (Lu, Foo, and Sun 2002) Y también descubren que solo los ácidos
cinámicos con sustituyentes donadores de electrones en el anillo aromático pueden
intervenir en este tipo de reacciones (p-cumárico, ferúlico, caféico y sinápico) ya que
sus grupos donadores estabilizan al ión carbenio formado.
Después de haberlos estudiado en disoluciones modelo estos compuestos se
logran sintetizadar en 2003 (Ha°kansson, A. E.; Pardon, K.; Hayasaka, Y.; de Sa, M.;
Herderich, M. Tetrahedron Lett. 2003)
Antecedentes: Piranoantocianos.
76 Dora Blanco Vega 2013
Figura 30. Mecanismo de formación del Pinotin A.
En cuanto a la velocidad de reacción de los ácidos cinámicos frente a la
malvidina 3-monoglucósido es la siguiente: ácido caféico > ácido ferúlico ≈ ácido
sinápico > ácido p-cumárico. Se ha demostrado que la cinamato descarboxilasa no es
capaz de descarboxilar otros ácidos fenólicos distinto al p-cumárico y ferúlico
(Chatonnet et al., 1993), por lo que los piranoantocianos que contienen restos de
catecol y siringol se formarían siempre por el mecanismo propuesto por Schwarz et al.
(2003) haciendo intervenir directamente a los ácidos caféico y sinápico.
Antecedentes: Piranoantocianos.
77 Dora Blanco Vega 2013
Esta nueva vía de formación de piranoantocianos, por reacción directa con los
ácidos hidroxicinámicos explicaría su presencia durante el almacenamiento de zumos
de fruta. (Hillebrand, Schwarz & Winterhalter, 2004); (Schwarz, Wray & Winterhalter,
2004).
Más recientemente se ha comprobado que, en vinos tintos de la variedad
Garnacha, la formación de piranoantocianos derivados de los ácidos hidroxicinámicos
ocurre en dos etapas (Rentzsch y col., 2007 y 2008): durante la fermentación
alcohólica se forman pequeñas cantidades de los piranoantocianos derivados de los
ácidos p-cumárico y ferúlico, por vía enzimática que implicaría la hidrólisis de los
precursores (ácidos cutárico y fertárico, respectivamente) y la posterior
descarboxilación que originaría los muy reactivos 4-vinilfenoles; en una segunda fase,
tras la fermentación maloláctica y algunos meses de envejecimiento, se observa la
hidrólisis de los precursores de los ácidos cafeico, p-cumárico y ferúlico (ácidos
caftárico, cutárico y fertárico, respectivamente) y la reacción directa de éstos con los
antocianos. Por tanto la capacidad de cada cepa de levadura para producir mayor o
menor hidrólisis sería muy importante (Morata, A.; González, C.; Suárez-Lepe, J. A.
(2007).
El origen de los fenoles volátiles implica la acción secuencial de dos enzimas
sobre un ácido hidroxicinámico (p-cumárico, cafeico, o ácido ferúlico). En general se
supone que, primero,actua la hidroxicinamato descarboxila descarboxilando a estos
ácidos hidroxicinámicos y transformandolos en sus derivados de vinilo y, a
continuación, por una reductasa se reducen a derivados de etilo Por encima de ciertos
niveles, estos compuestos afectan negativamente a la calidad del vino, impartiendo
olores extraños a animal, cuero y sudor de "caballo".
(Blanca de las Rivas, Hector Rodriguez, Jose Antonio Curiel, Jose Maria Landete, and
Rosario Munoz J. Agric. Food Chem., 2009)
Todos estos compuestos presentan un desplazamiento hipsocrómico hacia
colores rojo anaranjados y una mayor estabilidad frente a la decoloración por So2 , y a
la hidratación que los antocianos monómeros de los que provienen (Sarni-Manchado et
al.).
Antecedentes: Piranoantocianos.
78 Dora Blanco Vega 2013
2.IV.2.3. VINILFLAVANOL PIRANOANTOCIANOS
En 1997 otro equipo de investigadores (Francia-Aricha et al., 1997), descubren
en soluciones modelo, un nuevo tipo de pigmentos de la familia de los
piranoantocianos formados a partir de la Malvidina 3 glucósido con flavanoles,
vinilcatequina, vinilepicatequina y vinil procianidinas B2, a los que se denomina
Vinilflavanol-piranoantocianos.
Estos piranoantocianos se producen por la reacción entre el antociano
monómero con una molécula de vinil-flavanol, que puede provenir de la ruptura de
oligómeros de flavanol unidos por puentes de etilo, o por la deshidratación del aducto
inicial flavanol-etanol formado tras la reacción entre un flavanol y el acetaldehído,
(Mateus et al., 2002b). Estos procesos están muy influidos por el pH, y se ven
favorecidos cuando el pH no es excesivamente ácido, en el caso de pH más ácidos se
favorecería la formación de un catión etil-flavanol y de los pigmentos derivados
antociano-etil-flavanol (Rivas-Gonzalo et al., 1995). Tampoco puede descartarse que
los mismos deriven de una reorganización estructural de este último tipo de pigmentos
(antociano-etil-flavanol), tras la constatada fácil ruptura de su puente etilo (Escribano-
Bailón et al., 2001).
Antecedentes: Piranoantocianos.
79 Dora Blanco Vega 2013
Figura 31. Formación de vinilflavanol-piranoantocianos.
Más tarde (Baker & Timberlake, 1997); (Cameira dos Santos, Brillouet,
Cheynier, & Moutounet, 1996) y (Francia-Aricha, Guerra, Rivas-Gonzalo, & Santos-
Buelga, 1997) ; (Fulcrand, Cameira dos Santos, Sarni-Manchado, Cheynier, & Favre
Bonvin, 1996), (Mateus, Silva, Santos-Buelga, Rivas-Gonzalo, Y De Freitas (2002) Y (
Mateus, Carvalho, et al. (2003). Elucidan la estructura de estos compuestos y
determinan su máximo de absorción entre 490 y 511 nm, demostrando que los
vinilflavanol piranoantocianos tienen también un desplazamiento hacia longitudes de
onda más bajas que los antocianos monómeros de los que proceden y por tanto dan
coloraciones rojo-anaranjadas en el vino.
Y en 2007 (Michael Rentzscha, Michael Schwarzb and Peter Winterhalter,2007)
consiguen sintetizar estos pigmentos a partir de la Malvidina 3 glucósido, haciéndola
reaccionar con vinilcatequina, vinilepicatequina y vinil procianidinas B2.
Antecedentes: Piranoantocianos.
80 Dora Blanco Vega 2013
Ya en 2010(Jingren He, Alexandre R.F. Carvalho, Nuno Mateus, y Victor De
Freitas 2010) estudian la estabilidad producida en el color y los diferentes tipos de
espectros de flavanol-piranoantocianos, comparándolos con los antocianos
monómeros de los que proceden. En 2010 se estudiaron los equilibrios en la formación
de distintos flavanol-piranoantocianos (2010 Cruz, L.; Petrov, V.; Teixeira, N.; Mateus,
N.; Pina, F.; de Freitas).
2.IV.2.4. PORTISINAS
En la zona de Oporto en Portugal, en la desembocadura del rio Duero un grupo
de investigadores descubren en 1997 otro tipo distinto de piranoantocianos (Francia-
Aricha et al., 1997), que presentan una diferencia de color muy acusada respecto a los
demás piranoantocianos, ya que presentan un color azulado en condiciones acidas
(frente al rojo tracidional de los demás piranoantocianos). Al ser observados por
primera vez en vino de oporto envejecido, son llamados Portisinas.
Figura 32. Reacción entre la vitisina A y los ácidos hidroxicinámicos.
Los vinos de Oporto se elaboran deteniendo la fermentación mediante una
fortificación con aguardiente vínico, cuando la concentración de azucares es
aproximadamente el 50% de la inicial y se obtienen unos vinos con una graduación
Antecedentes: Piranoantocianos.
81 Dora Blanco Vega 2013
alcohólica de 19º aproximadamente. Si analizamos estos vinos vemos que los
pigmentos predominantes y casi únicos son vitisinas, acetil-vitisinas , cumaroil-
vitisinas y además otros pigmentos derivados de estas, resultado de la unión de la
vitisina A con restos de vinil-flavanol (Romero et al 2000). o vinil-fenol
(Joana Oliveira, Victor De Freitas, Artur m. s. Silva, and Nuno Mateus,2007)
observan que las propiedades espectroscópicas de las portisinas son diferentes a los
demás piranoantocianos, el desplazamiento del máximo de absorción es hacia
longitudes de onda mayores 580 nm en el caso de la reacción con el vinil flavanol y
535 nm cuando la reacción se produce con vinil-fenol, lo que le da unos tonos
azulados característicos, y además mientras que los antocianos son constantemente
degradados durante el envejecimiento la concentración de estos piranoantocianos se
incrementa con la elaboración y el almacenamiento (Mateus, Oliveira, Haettich-Motta,
& De Freitas, 2004) ; (Mateus, Oliveira, Santos-Buelga, Silva, & De Freitas, 2004);
(Mateus, Silva, Rivas-Gonzalo, Santos-Buelga, & De Freitas, 2003); (Oliveira, Santos-
Buelga, Silva, De Freitas, & Mateus, 2006). (Romero & Bakker, 2000a); (Schwarz,
Hofmann, & Winterhalter, 2004); (Schwarz, Quast, von Baer, & Winterhalter, 2003).
Figura 33. Mecanismo propuesto para la formación de Portisina (Mateus et al 2003).
(Mateus, Silva, et al., 2003). Observan que la גmax es de 580 nm debido a la
alta densidad de electrones ∏ que les da una gran estabilidad. Más recientemente
(Mateus et al. (2006) aíslan estos compuestos en un vino tinto obteniendo el pigmento
derivado de la reacción de la vitisina A con vinilfenol, este grupo ilustra la gran
Antecedentes: Piranoantocianos.
82 Dora Blanco Vega 2013
variedad de reacciones posibles entre los piranoantocianos y algunos otros derivados y
se espera que en un futuro próximo se descubran muchos de estos pigmentos.
En 2010 (Alexandre R. F. Carvalho, Joana Oliveira, Victor de Freitas, Nuno MateuS,y
Andre´ Melo.) estudian los cambios de color producidos por estos pigmentos cuando
pasan de estado liquido a sólido al ser congelados y atribuyen estos cambios a las
diferencias que sufren en las propiedades electrónicas y vibracionales por la
congelación.
2.IV.3. NUEVAS MOLÉCULAS.
El enfoque futuro de las investigaciones probablemente irá por la investigación
de nuevas moléculas, (Mateus et al. (2006) con la investigación sobre distintos tipos
de portisinas en vino tinto dada la gran variedad de reacciones posibles y por la
aplicación de estas al uso de estas sustancias como colorantes estables de alimentos.
Recientemente se han descubierto también una nueva clase de dímeros de
piranoantocianos que presentan un color turquesa y que se han formado a partir de la
reacción de un carboxipiranoantociano y un metilpiranoantociano (oxovitisinas), por
oxidación directa entre los dos, esto abre un campo para el estudio de nuevas
moléculas relacionadas con el color del vino. (Jingren He, Joana Oliveira, Artur
MS.Silva § Nuno Mateus And Victor de Freitas 2010) (Oliveira, J.; Azevedo, J.; Silva,
A. M. S.; Teixeira, N.; Cruz, L.; Mateus, N.; de Freitas, V.2010).
Antecedentes: Piranoantocianos.
83 Dora Blanco Vega 2013
Figura 34. Mecanismo propuesto para la formación de piranoantocianos oxidados (Oxovitisinas) Jingren He, Joana Oliveira, Artur M. S. Silva, Nuno Mateus,
and Victor De Freitas 2010.
2.IV.4. PROPIEDADES DE LOS PIRANOANTOCIANOS
Con respecto al color de los piranoantocianos, este varía desde el rojo
anaranjado al azulado, dependiendo de su estructura, en compuestos tipo
hidroxifenilpiranoantocianos, vitisinas y vinilflavanol piranoantocianos, el máximo de
absorción disminuye (efecto hipsocrómico) y resultan tonos más anaranjados que el
antociano monómero del que provienen Oliveira, Mateus et al 2006. En el caso de las
portisinas las propiedades espectrocópicas son diferentes (Mateus, Oliveira, Haettich-
Motta, y De Freitas, 2004); (Mateus, Oliveira, Santos Buelga, Silva, y De Freitas,
2004) ; (Mateus, Silva, Rivas-Gonzalo, Santos Buelga, y De Freitas, 2003); (Oliveira,
Santos Buelga, Silva, De Freitas, y Mateus, 2006), Ya que poseen efecto batocrómico
es decir que el máximo de absorción se ha desplazado a la derecha y genera colores
azulados en el vino envejecido.
Otra diferencia notable frente a los antocianos de los que provienen, es que
estos disminuyen su concentración durante el procesamiento y almacenamiento (por
su reactividad y por su degradación), mientras que los piranoantocianos aumentan su
Antecedentes: Piranoantocianos.
84 Dora Blanco Vega 2013
concentración (Romero y Bakker, 2000a; Schwarz, Hofmann, y Winterhalter, 2004);
(Schwarz, Quast, von Baer, y Winterhalter, 2003).
Las investigaciones recientes sobre la contribución de los piranoantocianos al
color de los vinos tintos demuestran que existe una correlación entre la formación de
piranoantocianos y la degradación de las antocianinas con el cambio de color (Alcalde-
Eon, Escribano-Bailo'n, Santos Buelga, y Gonzalo Rivas, 2006); (García-Puente Rivas
et al, 2006; Gómez-Mıguez et al, 2006);(Medina, Boido, Dellacassa, y Carrau,
2005).sin embargo no hay que olvidar que a la vez que se degradan los antocianos y
se forman los piranoantocianos también se crean pigmentos poliméricos de echo en un
grado mucho mayor.
Los piranoantocianos también son distintos a los antocianos monómeros de los
que derivan en cuanto a su comportamiento frente al bisulfito y al pH , ya que no son
decolorables por el bisulfito y son bastante estables ante variaciones de pH. Esto es
porque tienen bloqueada la posición C-4 (zona muy reactiva) del anillo de pirano
flavonoideo. A esta posición es a la que se unen el ión bisulfito o el ión hidroxilo
(hidratación) cuando reaccionan con los antocianos monómeros. (Anders E.
Ha°kansson,a,b Kevin Pardon,a,c Yoji Hayasaka,a,c Maria de Saa,c and Markus
Herderich 2003) sintetizaron mediante la adición nucleófila de vinilfenoles a malvidina
3-glucósido.una serie de piranoantocianos yse caracterizaron por medio de
espectroscopia UV-vis las propiedades de color de los pigmentos, pudiendose
demostrar que los piranoantocianos conservan su color rojo a pH 3,6 y que fueron
resistentes al “blanqueo” por bisulfito.
Mientras que en las antocianinas se pierde casi el 80% de su intensidad de color
con el aumento de pH de 1 a 5 y dan como resultado la formación de la base incolora
carbinol (Mazza & Miniati, 1993), los piranoantocianos casi no cambian su intensidad
de color. A pH entre 1 y 2 la mayor parte de las características cromáticas son debidas
a los antocianos monómeros el color (C *), la luminosidad (L *), y el ángulo de tono
(ha, b) pero a partir de un pH de 5 esos antocianos están en su mayoría en forma
hemiacetálica o base carbinol, transparente, y gran parte del color es debido a los
compuestos piranoantocianicos (Oliveira, mateus et al 2006). Esta mayor estabilidad
se puede explicar por el efecto protector del nuevo anillo de pirano frente al ataque
nucleófilo del agua, lo que impide la formación de la base de carbinol.
Antecedentes: Piranoantocianos.
85 Dora Blanco Vega 2013
Por otro lado al contrario que los pigmentos poliméricos de alto peso molecular,
que normalmente se encuentran en estado coloidal en el vino y tienen tendencia a
precipitar, los piranoantocianos son moléculas de un tamaño determinado y similar a
la de los antocianos monómeros de los que derivan y se mantienen disueltos en el
vino, por lo que tendrán poca tendencia a perderse en los precipitados de materia
colorante que se forman en los vinos tintos envejecidos, o a quedarse retenidos en los
filtros por los que se pasan los vinos antes de su embotellado.
Mientras los antocianos monómeros son unos pigmentos de color rojo y
poseen unos cromóforos potentes (el coeficiente de absorción molar a 520 nm para el
3-monoglucósido de malvidina, a pH 1.5, es de 27000 g-1Lcm-1) y que además
incrementan su intensidad colorante al formar complejos de copigmentación, los
piranoantocianos son de color rojo-anaranjado (máximos de absorción sobre 498-512
nm en medio acuoso a pH < 2), además los piranoantocianos poseen unos cromóforos
más débiles, con unos valores de coeficientes de absorción molar a 520 nm, a pH 1.5,
del orden de la mitad (o menos aún) de los correspondientes a los antocianos
monómeros de los que derivan (Håkansson y col., 2003). Por tanto, para
concentraciones molares iguales y en un medio muy ácido, los piranoantocianos
otorgan menor intensidad colorante y una tonalidad roja más anaranjada que los
correspondientes antocianos monómeros.
Figura 35. Mesomería entre los anillos piranósicos de los piranoantocianos.
Otra característica interesante de los piranoantocianos se deriva de la posibilidad
de mesomería que presenta el nuevo anillo de pirano fusionado al catión flavilio del
O
OH
OCH3
OCH3
O
HO
OGlu(ácido)
R
O
OH
OCH3
OCH3
O
HO
OGlu(ácido)
R
Antecedentes: Piranoantocianos.
86 Dora Blanco Vega 2013
antociano original (Figura 34). La mesomería permite intercambiar la carga positiva
del catión flavilio entre los dos átomos de oxígeno de los dos anillos piranósicos, por lo
que los piranoantocianos poseen realmente un cromóforo distinto al de los antocianos
monómeros, y con distintas propiedades.
Apartado V
“TÉCNICAS
ESPECTROSCÓPICAS”
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
89 Dora Blanco Vega 2013
2. V. TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y ESPECTROSCÓPICAS
2.V.1. Cromatografía liquida de alta eficacia HPLC Actualmente la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) es la técnica
cromatográfica más utilizada para la separación y el análisis de antocianos,
especialmente desde la introducción de los espectrofotómetros de diodos como
sistemas de detección asociados a la HPLC, que permiten obtener tanto el espectro de
absorción de los compuestos detectados, como registrar los cromatogramas a
diferentes longitudes de onda. Las fases estacionarias más utilizadas para la
separación de antocianos en HPLC son las fases reversas (RP-HPLC), especialmente los
soportes de gel de sílice unidos a restos C-18. En general, se utilizan gradientes
binarios, formados por un disolvente polar (generalmente una fase acuosa acidificada)
y otro menos polar, orgánico (acetonitrilo o metanol, en ocasiones también
acidificado).
Como los antocianos son compuestos de elevada polaridad, se necesitan una
proporción importante de fase acuosa para la elución de las fases estacionarias
reversas. Para una buena resolución de los picos es necesario un pH de elución
bastante ácido, de manera que se favorezca el desplazamiento de los equilibrios entre
formas de los antocianos hacia el catión flavilio; de este modo, los valores típicos de
pH de elución se encuentran generalmente por debajo de 2. Los modificadores de la
acidez más habituales son el ácido acético y el ácido fórmico; con este último se
obtiene generalmente mejor resolución. El ácido trifluoroacético es también
ampliamente utilizado, debido a las ventajas que ofrece por ser un ácido menos
corrosivo y que mejora la reproducibilidad de los tiempos de retención (Lopes-Da-Silva
et al., 2002). Para obtener resultados reproducibles es también importante un control
de la temperatura, que debe permanecer estable durante la elución.
Tenemos varios factores que afectan a la separación de los antocianos en las
columnas de fase reversa y que están ampliamente descritos (Hebrero et al., 1988;
Hong et al., 1990a y 1990b; Strack et al., 1989). El orden de elución de los
compuestos en este tipo de columnas está íntimamente relacionado con la polaridad,
los compuestos más polares eluyen antes que los menos polares. La polaridad de los
antocianos depende de:
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
90 Dora Blanco Vega 2013
• El patrón de sustitución de la antocianidina en el anillo B. Los grupos hidroxilos
aumentan la polaridad, y por tanto la movilidad del compuesto, mientras que los
grupos metoxilo, disminuyen la polaridad y la retrasan. De tal manera que las
antocianidinas más comunes eluyen en el siguiente orden: delfinidina, cianidina,
petunidina, pelargonidina, peonidina y malvidina.
• La naturaleza, posición y número de azúcares unidos a las antocianidinas. La
glicosilación aumenta la polaridad. Si se consideran los 3-glicósidos más habituales
de una antocianidina, el orden de elución es el siguiente:
galactósido, glucósido, arabinósido, xilósido, ramnósido, en el caso de los
monoglucósidos, y soforósido, sambubiósido y rutinósido, en el caso de los
disacáridos.
Aunque los disacáridos se consideran, en general, más polares que los
monosacáridos, existen excepciones, por ejemplo, los rutinósidos son menos
polares que los glucósidos, pero más polares que los pentósidos. En general, la
movilidad aumenta al hacerlo el número de azúcares existentes en la estructura
del antociano. El orden de elución en los patrones de sustitución más habituales
es: 3,7-diglicósidos, 3,5-diglicósidos y 3-monoglicósidos.
• La acilación de los azúcares. La acilación de las moléculas de azúcar de los
antocianos implica una pérdida de la polaridad, y por tanto un aumento en los
tiempos de retención. La disminución de la polaridad depende del tipo de
sustituyente acilo. Para los residuos de ácidos alifáticos más comunes el orden es:
málico, acético, malónico, succínico. En el caso de la acilación con ácidos fenólicos
la disminución de la polaridad es mayor para los ácidos hidroxicinámicos de estos
el más polar es el acético, después el caféico y por último el cumárico. Sin
embargo en algunos de los piranoantocianos se observa un cambio en el orden de
elución del caféico y el acético, entre los piranoantocianos de tipo vitisina y los de
tipo hidroxifenil.
Los círculos corresponden a los piranoantocianos cafeilados, se puede apreciar que
en los pirnanoantocianos del tipo vitisinas el orden de elución es glucosilado,
acilado, cafeilado y cumarilado mientras que en los piranoantocianos derivados de
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
91 Dora Blanco Vega 2013
ac. Hidroxicinámicos (hidroxifenilpiranoantocianos) los derivados cafeilado y
cumarilado se han desplazado (tienen un menor tiempo de retención en la
columna), y llegan a solaparse e incluso a adelantar al derivado cafeilado.
Acetilacetato de Li
Pirúvico
Acetaldehido
Butanodiona
Caféico
Cumárico
Ferúlico
Sinápico
14.7 17.0
23.6
EIC 341
0
2
4
6
5x10
Intens.
15 20 25 30 35 40 Time [min]
18.8
20.5
21.8
24.2
EIC 399
0
1
2
7x10
15 20 25 30 35 40 Time [min]
20.2 22.3 27.3
24.2
EIC 355
0.0
0.5
1.0
6x10
15 20 25 30 35 40 Time [min]
25.3
28.3 EIC 397
0.5
1.0
6x10
15 20 25 30 35 40 Time [min]
0.5
32.034.3
36.6
EIC 463
0.0
0.5
1.07x10
15 20 25 30 35 40 Time [min]
34.9 37.3 39.4
0.436.8
EIC 447
0.0
0.5
7x10
15 20 25 30 35 40 Time [min]
36.839.0 40.7
38.6
EIC 477
0.0
0.5
7x10
15 20 25 30 35 40 Time [min]
37.5
38.8
39.5 40.6
EIC 507
0.0
0.5
1.0
7x10
15 20 25 30 35 40 Time [min]
Cromatrograma EIC de la Malvidina
Figura 36 Diagrama EIC de la pirano-malvidina formada con distintos compuestos.
2.V.1.2. Espectroscopia UV-VIS En la cromatografía en columna se coloca la fase estacionaria en el interior de un
tubo cilíndrico (columna) y se hace pasar la fase móvil (líquido o gas) a través de
ellas. Para el análisis de antocianos la fase móvil siempre es un liquido, porque estos
tienen una gran labilidad térmica y se degradarían si se calentasen para ser
volatilizados, la técnica de HPLC que es la más empleada hoy en día permite realizar
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
92 Dora Blanco Vega 2013
varios análisis en uno; Separando identificando y cuantificando los antocianos y
derivados presentes en una muestra, aunque esta no sea demasiado pura (vino
comercial). Los primero análisis con estas técnicas fueron realizados por Manley y
Shubiak (1975).aunque fue a partir de 1978 con Wolf y Nagel y con Williams y
colaboradores cuando esta técnica se desarrollo para el estudio de los antocianos. Se
emplean columnas de fase estacionarias C-18 (cadenas de 18 átomos de carbono
unidas entre si) reversas y detectores de diodos que nos proporcionan para cada
compuesto su espectro ultravioleta-visible ya que nos registran la absorbancia del
compuesto en un intervalo de longitudes de onda.
La espectroscopia de ultravioleta y visible fue una de las primeras técnicas utilizadas
de forma rutinaria para análisis de compuestos flavonoideos debido a la existencia de
dos bandas de UV / Vis característicos en flavonoides, una banda en el intervalo de
300 a 550 nm, y que surje del anillo B, y la banda II en los rangos de 240 a 285 nm,
derivados del anillo A . Por ejemplo, mientras que la banda I en flavonas y flavonoles
se encuentra en el rango 240-285 nm, en las flavanonas (sin instauración en el anillo
C) se encuentra en el rango 270 a 295 nm, por el contrario, el grupo II de flavonas y
flavanonas (sin grupo 3-OH) se encuentra a unos 303 -304 nm, y en los flavonoles 3-
hidroxilados se centra alrededor de 352 nm.
Reactivos, como el hidróxido de sodio y el tricloruro de aluminio, conducen a cambios
en la longitud de onda máxima de estas bandas debido a la desprotonación inducida
por grupos OH o Al3 en los grupos OH, y también se utilizan habitualmente para
estudiar la estructura de los flavonoides.
La espectrofotometría UV / Vis está siendo utilizada para estudiar antocianidinas,
que cambian su forma y su color según el pH, la concentración de los iones metálicos
y copigmentación (Giusti y Wrolstad, 2001), (Melo et al., 2000; Moncada et al, 2004).
Las características espectrales en el UV-Vis son muy útiles para la caracterización
de antocianos, especialmente para la caracterización de las antocianidinas. A valores
de pH ácidos, antocianos y antocianidinas presentan un máximo de absorción en la
región del visible entre 465 y 560 nm, y otro en la región de UV, alrededor de 270-
280 nm (Markham, 1982; Jackman y Smith, 1996). La absorbancia en el visible se
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
93 Dora Blanco Vega 2013
debe a la estructura central heterocíclica y a la conjugación de los dos anillos
bencénicos, además está influida por el pH y el solvente.
El número y los grupos funcionales del anillo B también presentan influencia en
dicha absorbancia. Los antocianos con menor número de sustituyentes en el anillo B
tienen el máximo de absorción a menor longitud de onda. La pelargonidina, con sólo
un grupo hidroxilo en el anillo B, es la que presenta un máximo de absorción más
bajo. Delfinidina, petunidina y malvidina, con tres grupos funcionales en dicho anillo,
tienen el máximo de absorción a una longitud de onda superior.
Figura 37. espectro UV-vis de los antocianos monómeros.
Esto ocurre tanto para los aglucones como para sus correspondientes glicósidos. A
medida que aumenta el número de grupos hidroxilo en el anillo B, el máximo de
absorción en el visible se desplaza batocrómicamente, lo que lleva, a un
desplazamiento del color hacia tonalidades más azuladas. La presencia de grupos
metoxilo en el anillo B produce un desplazamiento hipsocrómico, desplazamiento del
color hacia tonalidades rojas. (Rivas- Gonzalo et al., 2003).
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
94 Dora Blanco Vega 2013
La glicosilación también afecta a la longitud de onda del máximo en el visible, ya
que lo traslada hacia longitudes de onda más bajas, aproximadamente 10 nm, que su
respectivo aglucón. Los antocianos diglucósidos tienen sus máximos de absorción
desplazados hacia longitudes de onda menores que los correspondientes
monoglucósidos. Además, la glicosilación disminuye el coeficiente de absorción
molecular. Los 3-monoglucósidos, presentan un hombro en la región del visible
(aproximadamente 440 nm), que no aparece en los 3,5-diglucósidos. La pelargonidina
es una excepción ya que tanto el aglucón como sus mono y diglicósidos presentan un
hombro aproximadamente en esta zona. La acilación de los azúcares provoca un ligero
desplazamiento en el máximo de absorción en el visible hacia longitudes de onda más
elevadas ( Alcalde-Eon 2008).
Figura 38: Espectro UV-vis de los piranoantocianos formados por reaccion con ácido
pirúvico. Se observa la presencia de un hombro a 440 nm.
La absorbancia en la región del ultravioleta es debida a los grupos fenólicos y no
está influida por el pH. En general, la glicosilación no provoca cambios en esta zona
del espectro, aunque la presencia de grupos acilos puede provocar la aparición de un
máximo u hombro adicional en el espectro de UV-Vis. La acilación con ácidos
hidroxicinámicos (caféico, ferúlico y cumárico) produce un hombro a 310-330 nm en el
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
95 Dora Blanco Vega 2013
espectro de absorción del antociano característico del resto acilante. Los cambios en el
patrón de sustitución del anillo A tienden a reflejarse en la banda de absorción del
ultravioleta (Rivas-Gonzalo et al., 2003).
Figura 39: Cambios producidos en el espectro UV-vis de la malvidina debidos a la acilación.
2.V.3. Espectroscopia de masas Es una técnica que permite la determinación funcional y estructural de las
moléculas, con una elevada sensibilidad y límites de detección muy bajos. Una
muestra es ionizada en una fuente mediante la aplicación de elevadas energías de
ionización y los iones así formados (negativos o positivos) son separados mediante un
analizador con el objeto de determinar su relación masa/carga (m/z).
En general, para el análisis de antocianos, se utiliza el modo positivo (Lopes da
Silva et al., 2002; de Pascual-Teresa et al., 2002; Mateus et al., 2002; Alcalde-Eon et
al., 2004). A partir de la determinación de las masas de los iones moleculares [M+]
presentes en la muestra, e identificación de los fragmentos producidos por ruptura de
dichos iones, se obtiene la identificación de los compuestos de interés.
Una de las principales ventajas ofrecidas por este método es la pequeña cantidad
de muestra necesaria para el análisis. El desarrollo de una interfase de ionización a
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
96 Dora Blanco Vega 2013
presión atmosférica (API). La ionización se produce a través de una descarga en el
solvente en forma de aerosol, produce iones primarios derivados del disolvente que, a
su vez, ionizan el soluto (Prasain et al., 2004; de Hoffmann & Stroobant, 2007),
supuso un gran avance para el análisis de antocianos, debido a que facilitaba el
acoplamiento del detector de masas a un equipo HPLC, que permite la separación de
los compuestos. Es una técnica de gran utilidad en la identificación de taninos
condensados
Las antocianidinas en su forma catión flavilio son relativamente estables, por lo que no
es frecuente encontrar, en condiciones suaves de ionización, fragmentos de sus
estructura. Para provocar la fragmentación, se recurre a la CID (disociación inducida
por colisión) que permite la obtención de espectros masas-masas (MS-MS) (Rivas-
Gonzalo, 2003), que corresponden a fragmentos resultantes de la disociación del ión
molecular aislado previamente de modo selectivo en la cámara de ionización.
Así, es posible obtener espectros MSn, que facilitaran la elucidación de la identidad
de los compuestos en estudio. Por otra parte la mayoría de los espectrómetros de
masas permite el registro de un intervalo de masas deseado, en el modo full scan, o la
monitorización selectiva de un ión (modo SIM), e incluso es posible desarrollar un
modo MS-MS, monitorizando la reacción seleccionada (SRM) de tal manera que
aumenta la sensibilidad del método.
En los últimos años han aparecido diversos estudios sobre la fragmentación de los
antocianos en espectrometría de masas y se ha observado que se produce de acuerdo
a patrones que se repiten, lo cual resulta muy útil a la hora de identificar el compuesto
original. El aglucón antociánico es muy estable y no posee ningún enlace en el que la
ruptura se pueda realizar fácilmente, por eso cuando se trabaja en modo positivo, su
espectro presenta un catión intenso y muy poca fragmentación. Los antocianos, por su
parte, sufren la ruptura de los enlaces glicosídicos entre el anillo del ión flavilio y los
azúcares directamente unidos a él. Hay transferencia de un átomo de hidrógeno desde
un grupo OH del azúcar hasta los iones formados, y en función de que la sustancia sea
monoglucósido, diglucósido o biósido, el número y los tipos de fragmentos serán
diferentes. En el caso de los antocianos acilados, no se produce la ruptura de los
enlaces tipo éster y se pierde conjuntamente el azúcar y el ácido (Giusti et al., 1999).
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
97 Dora Blanco Vega 2013
En este sentido, la técnica más empleada es la que recurre a la ionización por
electrospray (ESI). Esta consiste en hacer pasar una solución del analito a través de
un capilar que es mantenido con un elevado potencial. El campo eléctrico que se
genera, provoca la formación de pequeñas gotas cargadas que pasan, a través de una
zona sometida a elevados potenciales y presión, hacia el analizador del
espectofotómetro, se puede aplicar directamente, por infusión de la muestra con una
jeringa con control de flujo, una corriente de líquido constante entra en el sistema, lo
que permite múltiples análisis que deben realizarse durante un período relativamente
grande de tiempo. Las gotitas disminuyen de tamaño por evaporación del solvente o
por “explosión coulombica” (subdivisión de las gotas debido a la elevada densidad de
carga). Se usa un gas envolvente para favorecer la nebulización de la solución. Se
produce una ionización suave, dando lugar a iones intactos a partir de moléculas
grandes y complejas, incluyendo los compuestos polares termolábiles y no volátiles. La
aplicación de HPLC-DAD-MS utilizando la ionización con electrospray ha facilitado la
identificación de los antocianos en numerosas fuentes, como por ejemplo uva tinta
(Favretto et al., 2000, citado en Rivas-Gonzalo, 2003), fresas (Lopes da Silva et al.,
2002, 2007), maíz morado (de Pascual-Teresa et al., 2002) y vinos tintos (Mateus et
al., 2002; Alcalde-Eon et al., 2004).
Este tipo de ionización no produce la fragmentación del compuesto, como ocurre
en otras ionizaciones. La elección de polaridad, negativa o positiva, está determinada
por la polaridad de los iones en disolución. Moléculas ácidas dan lugar a iones
negativos y molecular básicas a iones positivos. Esta técnica permite asignar
estructuras de compuestos de elevado grado de polimerización mediante la
interpretación de los esquemas de fragmentación de las molecular y de la carga de los
iones, que pueden estar monocargados o aparecer con cargas múltiples, permite
obtener espectros MS2 y MS3, correspondientes a la fragmentación del ión molecular
mayoritario.
La técnica de ionización ESI para el análisis de flavan-3-oles permite identificar el
compuesto además de por su señal m/z, (ión pseudomolecular) por el patrón de
fragmentación de la molécula, MSn. Generalmente la señal más abundante
corresponde a la pérdida de 152 unidades de masa (a.m.u) que se asocia a una
ruptura retro Diels-Alder (RDA). Otras dos rupturas características corresponden a la
fisión del heterociclo (heterociclic ring fission, HRF) y la del enlace interflavánico en el
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
98 Dora Blanco Vega 2013
caso de los oligómeros. En los polímeros es también frecuente la aparición de señales
correspondientes a los compuestos con cargas múltiples. Aunque bastantes
investigadores han recurrido a la MS en modo de ionización negativo (Cheynier et al.,
1997), en nuestro laboratorio se han obtenido buenos resultados empleando el modo
positivo.
Tabla 1. Perdidas de masa asociado con posibles reacciones metabólicas de los flavonoides adaptado de Prasain y Barnes, 2007
Un aspecto importante es establecer la posición relativa de la subunidades en los
oligómeros. Se ha indicado que la ruptura RDA tiene lugar de forma preferente en las
subunidades superiores (de Pascual-Teresa et al., 2000; Friedrich et al., 2000). De
esta forma, la identificación de los oligómeros puede conocerse a través de su ión
molecular y el patrón de fraccionamiento.
La mayoría de los equipos permiten el registro de un intervalo de masas deseado,
en el modo full scan, o la monitorización selectiva de un ión (modo SIM), e incluso
son capaces de desarrollar
la detección en modo MS-MS, monitorizando la reacción seleccionada (SRM), de tal
manera que se incrementa la sensibilidad.
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
99 Dora Blanco Vega 2013
La principal desventaja de estas dos técnicas es que algunos disolventes HPLC
interfieren con el proceso de ionización, y por lo tanto las separaciones
cromatográficas necesitan estar específicamente diseñadas para cada compuesto
(Prasain et al., 2004).
Combinando los datos del espectro uv-vis con los datos de masas tenemos una
asignación mucho más fiable de cada uno de los compuestos obtenidos.
En este ejemplo de formación de vinilcatecolpiranoantocianos por reacción en el
laboratorio de ácido caféico con extracto de hollejos podemos identificar y asignar
cada uno de los picos obtenidos, comprobando la fragmentación correspondiente a
cada uno de ellos.
Figura 40: Cromatograma de los vinilcatecolpiranoantocianos.
En el primer pico que asignamos como vinilcatecolpiranomalvidin-3-glucosa se
puede observar que el fragmento que se produce es la perdida de la glucosa 162
umas, en el segundo pico el fragmento pierde 204 umas propio de la perdida de
acetilglucosa, el cuarto pico asignado correspondería al derivado cafeoilado y se ve la
perdida del resto cafeilglucosa de 324 umas y el último pico asignado al derivado
cumarilado en el que se observa que la perdida corresponde a la cumaroilglucosa con
un peso molecular de 308 umas.
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
100 Dora Blanco Vega 2013
Figura 41: Espectro Ms/Msn de los vinilcatecolpiranoantocianos.
2.V.4. Resonancia Magnética Nuclear (RMN)
Es una técnica ampliamente utilizada en la dilucidación estructural de compuestos
químicos. Se empezaron los estudios de las estructuras flavonoides usando 1H-RMN
en 1960 (Markham y Mabry, 1975) y más tarde se aplicó también 13C-RMN, esta
técnica ha sido utilizada para la identificación completa de antocianos, a pesar de ello,
hay que tener en cuenta la complejidad de esos compuestos, debido sobre todo a la
presencia de azucares en la molécula, lo que hace necesario el uso de aparatos con
una buena resolución, para asignar correctamente las señales del protón y del carbono
al espectro de RMN. El método RMN se basa en el estudio del 1H hidrógeno y / o los
isótopos de carbono 13C, y depende de la intensidad de las interacciones entre los
diferentes átomos dentro de una molécula colocada en un campo magnético de alta
intensidad. Para que la interpretación del espectro obtenido en el análisis, en el caso
de utilizar la RMN de protón, no sea realmente complicada, es necesario utilizar un
medio ácido como DCl o CF3COOD, para desplazar el equilibrio, de tal manera que
sólo esté presente la forma flavilio (Rivas-Gonzalo, 2003).
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
101 Dora Blanco Vega 2013
Las técnicas de RMN bidimensionales, como COSY, TOCSY, NOESY, HMQC y HMBC,
sí las moléculas tienen interacciones homonucleares [correlación espectroscopía
(COSY) y el efecto Overhauser espectroscopia nuclear (NOESY)] y sí las interacciones
son heteronucleares [heteronuclear con una única correlación cuántica (HSQC) y
heteronuclear con correlación entre enlaces múltiples (HMBC)] para facilitar la
adquisición de la totalidad de la información estructural sobre una aglicona y el azúcar
sustituido correspondiente. En el caso de los diglicósidos, se obtiene la información
sobre la colocación de los enlaces interglicosídicos y las posibles sustituciones de
grupos acilo en los anillos de azúcar, y también se puede obtener la posición del
protón anomérico.
En estos espectros podemos ver que se producen distintas señales o “picos” entre
los protones que están acoplados el uno al otro, por lo general (2JHH), pero a veces
también cuando están separados tres y cuatro enlaces (3JHH y 4JHH); la intensidad
del acoplamiento afecta a la intensidad del pico. El experimentos DQF-COSY (Doble
Quantum Filtro COSY) es una mejora del experimento COSY en el que no acoplan las
señales de protones del disolvente, ya que estas podrían superponerse a las señales
producidas por el analito (Claridge, 1999).
Otra mejora es la espectroscopia de correlación total, el experimento TOCSY, que
crea correlaciones entre todos los protones en un sistema, siempre y cuando haya
acoplamientos entre todos los protones que intervienen, lo que es muy útil para
identificar los protones en anillos de azúcares. Todos los protones de un anillo de
azúcar tendrán una correlación con el resto de protones del mismo anillo, pero no con
los de otros anillos. La magnetización se transfiere a través de hasta 5 o 6 enlaces, y
es interrumpido por acoplamientos 1H-1H pequeños o nulos y por la presencia de
heteroátomos; también, el número de pasos de la transferencia se puede ajustar
cambiando el tiempo de bloqueo del giro (Fossen y Andersen, 2005). (Gheysen et al.,
2008). El experimento 1D TOCSY (también conocido como HOHAHA, homonuclear
Hartman-Hahn) es particularmente útil en compuestos con más de un resto de azúcar,
en el que se produce un solapamiento de estas señales, en este experimento, se
selecciona un pico y se estudia la magnetización es producida en cada paso para los
protones en el mismo sistema de giro, así se evitan las señales cruzadas, y se obtiene
la estructura de la muestra por el aumento de intensidad de la señal multiplete
(Fossen y Andersen, 2005).
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
102 Dora Blanco Vega 2013
1.V.4.1. Experimentos Heteronucleares en dos dimensiones 2D RMN
En los experimentos de RMN 2D heteronucleares se correlacionan los núcleos de
diferentes elementos. Las técnicas de mayor alcance son, sin duda, los experimentos
de protones de carbono 2D HMQC / HSQC (Heteronuclear Multiple Quantum
Coherencia / Heteronuclear Individual Coherencia cuántica) y HMBC (Heteronuclear
Correlación Múltiple Bond), ya que proporcionan los datos de protones y los datos de
RMN de carbono directamente.
HMQC y HSQC establecen una correlación entre los enlaces de los protones de la
molécula y los carbonos a los que están unidos (1JCH). Ambos métodos son mucho
más sensibles que los correspondientes experimentos en una dimensión de carbono 13
(1D 13C), mientras que en el experimento 1D la escasa concentración del isótopo
conduce a una baja relación señal-ruido, en el experimento 2D heteronuclear la
magnetización inicial se produce en los núcleos 1H altamente sensibles y se transfiere
luego a los átomos de 13C que están conectados a los protones, esto hace que la
señal sea mucho más intensa. Un experimento de RMN similar es 1H-13C HMBC
(heteronuclear Correlación enlace múltiple), en el que se analizan las interacciones de
largo alcance (normalmente 2JCH y 3JCH); HMBC suele ser más sensibles a las
correlaciones de 3 enlaces que a las correlaciones de 2 enlaces, pero esto depende de
las relaciones totales de señal-ruido y a los parámetros ajustables de cada uno de los
experimentos. Un experimento reciente, 2JCH, 3JCH-HBMC, fue diseñado para
diferenciar estos dos tipos de correlaciones (Claridge, 1999; Krishnamurthy, 2000;
Fossen y Andersen, 2005).
La aplicación de HBMC a los flavonoides, por lo general se ocupa de asignación de
átomos de C no protonados, tanto de las agliconas como de grupos acilo. A diferencia
de TOCSY, la transferencia HMBC no se detiene por heteroátomos, por lo que también
se puede utilizar para determinar los puntos de enlace de grupos tales como residuos
de azúcar. HMBC También es útil diferenciar a algunas clases de flavonoides, como
flavonas de auronas, que tienen similares los espectros 1H y 13C RMN pero muy
diferentes los espectros HMBC. Actualmente, sólo se utilizan las variantes mejoradas
de los experimentos de HSQC y HMBC, con mejora de gradiente (GE), debido a su
mayor sensibilidad y la capacidad de elucidación. Estos experimentos se han utilizado
para establecer la existencia de una fuerte unión intramolecular entre H los grupos 4-
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
103 Dora Blanco Vega 2013
oxo y 5-hidroxi en flavonoides (Exarchou et al, 2002;.. Kozerski et al, 2003).
Otros experimentos de RMN, usando nuevas técnicas 2D y 3D, han sido
desarrollado en los últimos años, y están empezando a ser utilizados para el análisis
de flavonoides. En particular, los experimentos 2D y 3D HSQC-TOCSY son capaces de
asignar todas las señales de 13C de los glucósidos de flavonoides poliglicosilados
(Fossen y Andersen, 2005).
2.V.4.2. Conectividad a través del espacio - el efecto Overhauser nuclear
(NOE)
Mientras que las técnicas de 2D son útiles para establecer la conectividad entre los
distintos átomos a través de los enlaces, el efecto de Overhauser nuclear (NOE), que
se pueden resumir como “El cambio de intensidad de la señal de RMN en un núcleo,
cuando un núcleo vecino está saturado", es útil en el establecimiento de
conectividades de átomos no unidos directamente pero conectados a través del
espacio. Los picos en un espectro NOESY 1H-1H (NOE espectroscopía) corresponden a
las correlaciones entre los protones que están cerca uno del otro en el espacio (hasta
4 $ Å $) pero no necesariamente conectados a través de enlaces, estas correlaciones
pueden surgir de las interacciones intermoleculares de protones, y ha sido utilizado
con éxito para establecer diferencias en confórmeros rotacionales, y establecer
asociaciones intermoleculares e incluso resolver estructuras del tipo proteinas-ligando
y ADN-ligando. Un experimento NOE 2D, ROESY (Rotating Overhauser
Espectroscopía Efect), se ha usado para establecer la estereoquímica de diversos
flavonoides (Claridge, 1999; Fossen y Andersen, 2005). (Jordheim et al., 2006).
son comúnmente utilizadas para la identificación de antocianos y sus derivados
tanto en fuentes naturales como en productos procesados. El acoplamiento de HPLC
con RMN es un buen método para la separación y la elucidación estructural de los
compuestos desconocidos en las mezclas, representa una potencial e interesante
técnica complementaria al HPLC-UV-MS en el análisis de polifenoles. Aplicaciones
recientes han demostrado la utilidad de esta técnica (Wolfender et al., 1998, 2002;
Bobzin et al., 2000).
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
104 Dora Blanco Vega 2013
La limitación de los métodos de RMN es que tienen menor sensibilidad en
comparación con otros métodos instrumentales. Para la obtención de espectros de
buena calidad que contengan toda la información estructural, se necesitan cantidades
relativamente altas de compuesto (más de 1 mg) por tanto son necesarias técnicas de
purificación, especialmente cuando se utilizan imanes de frecuencia media (300 MHz).
Los espectrómetros de RMN se pueden conectar en línea a los cromatógrafos de
líquidos (LC-RMN), dando así una poderosa herramienta para el estudio de mezclas
naturales de compuestos presentes en muestras complejas. Los datos estructurales
obtenidos a partir de espectros de masas también pueden ser importantes (MS), para
ayudar en la elucidación.
Los principales problemas en los inicios de está técnica se debían a una baja
sensibilidad de la RMN, a la presencia de disolventes protonados, que son utilizados en
la fase inversa del HPLC y que coincidían con algunas señales de protones de los
analitos, y a la posibilidad de realizar sólo experimentos de 1H-RMN.
La mayoría de estos problemas se han resuelto parcialmente en la última década.
La baja sensibilidad de las técnicas de RMN han sido abordadas de varias maneras.
Por un lado el uso de imanes de alto campo (desde 500 y hasta 750 a 900 MHz) en los
espectrómetros conectados al HPLC da unos resultados satisfactorios (Wolfender et al.,
2001). Otro método para aumentar la sensibilidad es un modo de "parada de flujo" del
sistema de LC-RMN, lo que permite un tiempo prolongado de adquisición de datos en
los espectros de RMN, de hasta varios días. En este método, el software de control de
todo el sistema apaga la bomba de HPLC en el momento en que un pico
cromatográfico es registrado por el detector (frecuentemente UV), y llega a la sonda
de RMN (Holt et al., 1998). Otra mejora han sido los diferentes experimentos de RMN
que se pueden realizar, incluyendo dos dimensiones 1H-13C HSQC y HMBC, estos
espectros se podrían obtener incluso utilizando 10 g de muestra (Wolfender et al.,
2001). También se ha mejorado en la preconcentración de la muestra, utilizando la
mayor fuerza de campo del RMN y la optimización de los parámetros de la columna,
esto ha permitido mejorar aún más el límite de detección, en un orden de magnitud
(Hansen et al., 1999). Las señales de los disolventes utilizados con mayor frecuencia
en los sistemas cromatográficos de fase inversa (CH3CN-D2O y CH3OD-D2O) puede
ser suprimida mediante el (agua WET supresión-mejorado a través de efectos t1)
técnica (Smallcombe et al., 1995).
Antecedentes: Técnicas Espectroscópicas.
105 Dora Blanco Vega 2013
La técnica LC-RMN se ha aplicado con éxito en varios laboratorios para los
estudios de compuestos flavonoides de diferentes especies de plantas (Wolfender et
al, 1997;. Hansen et al, 1999;. Lommen et al, 2000;. Vilegas et al, 2000;. Andrade
et al, 2002;. Queiroz et al, 2002;. Le Gall et al, 2003;. De Rijke y otros, 2004a;.
Waridel et al., 2004). En la mayoría de los casos, los datos de LC-RMN son apoyados
por los resultados obtenidos con diferentes tipos de experimentos LC-MS. Sin
embargo, a pesar de que la conexión directa de un HPLC con ambos espectrómetros
es posible, no se hace habitualmente por que se necesita agua deuterada como
disolvente para las técnicas de RMN, y en estas condiciones, algunos protones de las
moléculas de flavonoides (especialmente los grupos hidroxilo de la aglicona, y los
restos glicosídicos) se intercambian fácilmente con los átomos de deuterio, causando
un aumento aparente de la pesos moleculares de los analitos y produciendo
diferencias en los espectros de masas MS. En estos casos, se trabaja con H2O en lugar
de en el D2O en la fase móvil del LC-MS (Hansen et al., 1999).
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109 Dora Blanco Vega 2013
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ÍNDICE DE
FIGURAS
129 Dora Blanco Vega 2013
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Perfiles de antocianos monómeros (cromatografía HPLC) característicos de las uvas tintas de la variedad Cencibel (A) y de los vinos varietales elaborados con ellas (B).
Figura 2 Estructura de los principales ácidos hidroxibenzoicos presentes en la uva y el vino. Figura 3 Ácidos hidroxicinamoil tartáricos. Figura 4 Resveratrol. Figura. 5 Estilbenos y sus derivados Figura 6 Estructuras de la 2-fenilbenzopirona y 2-fenilbenzopirano. Figura 7 Antocianos monómeros (3-monoglucósidos de antocianidinas) presentes en
las uvas y vinos de las variedades de Vitis vinifera. Figura 8. Estructura de los flavan-3-oles monómeros de la uva Figura 9. Estructura de las proantocianidinas de la uva (R=H, OH). Figura 10. Reacción de hidrólisis de un tanino condensado, liberando la unidad
inferior intacta y la superior o superiores en forma de carbocatión. Figura 11. Oxidación de ortodifenoles. Figura 12. Reducción y condensación de las quinonas (Dangles et al., 2006)
Figura 13. Estructura del esqueleto flavonoide de los flavonoles hallados en uvas Vitis Vinifera. Figura 14. Color y equilibrios en disolución acuosa de los antocianos monómeros. Figura 15. Mecanismo de degradación térmica de los antocianos. (1) Ácido Siríngico, (2) ácido 2,4,6 trihidroxibenzoico. Figura 16. Reacciones oxidativas de la degradación del 3-monoglucósido de
Malvidina. Figura 17. Antociano monómero. Figura 18. Formación de un complejo de copigmentación a partir de un pigmento (antociano monómero en su forma de catión flavilio) y de un copigmento (flavonol). Figura 19. Efectos de la copigmentación de los antocianos monómeros en un vino joven de la variedad Cencibel Figura 20 Estructura de auto-asociación entre dos moléculas de antociano head to
head (izq.) y head to tail (dcha.). Figura 21. Mecanismo de condensación directa antociano-flavanol (A-F). Figura 22. Mecanismo de condensacion directa flavanol-antociano (F-A). Figura 23. Mecanismo de las reacciones flavanol-antociano y flavanol-flavanol inducidas por el acetaldehído. Figura 24. Reacciones de los flavanoles con el ácido glioxílico. Figura 25. Mecanismo propuesto para la reacción entre el ácido pirúvico y la
malvidina 3-glucósido. Figura 26. Reacción entre la malvidina 3-glucósido y el acetaldehído para dar la Vitisina B. Figura 27. propuesta de formación de vitisin B a partir del viniloxitrimetilsilano. Figura 28. Mecanismo de formación del metil piranoantociano a partir del acido acetoacético.
Figura 29. Formación de vinilfenoles a partir de ácidos hidroxicinámicos. Figura 30. Mecanismo de formación del Pinotin A.
Figura 31. Formación de vinilflavanol-piranoantocianos. Figura 32. Reacción entre la vitisina A y los ácidos hidroxicinámicos. Figura 33. Mecanismo propuesto para la formación de Portísina (Mateus et al 2003).
130 Dora Blanco Vega 2013
Figura 34. Mecanismo propuesto para la formación de piranoantocianos oxidados
(Oxovitisinas).
Figura 35. Mesomería entre los anillos piranósicos de los piranoantocianos. Figura 36 Diagrama EIC de la pirano-malvidina formada con distintos compuestos. Figura 37. espectro UV-vis de los antocianos monómeros Figura 38: Espectro UV-vis de los piranoantocianos formados por reacción con ácido pirúvico.
Figura 39: Cambios producidos en el espectro UV-vis de la malvidina debidos a la acilación. Figura 40: espectro de los vinilcatecolpiranoantocianos Figura 41: Espectro Ms/Msn de los vinilcatecolpiranoantocianos.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
CAPÍTULO I
Resultados y Discusión. Capítulo I.
135 Dora Blanco Vega 2013
CAPÍTULO I ANÁLISIS DE ANTOCIANOS Y PIRANOANTOCIANOS
EN VINOS ROSADOS
JUSTIFICACIÓN
Los vinos rosados basan su calidad en la conjunción de una serie de
características que quedan a medio camino entre un vino blanco y un vino tiento. Por
una parte, la presencia de aromas afrutados propios de vinos jóvenes elaborados a
baja temperatura (igual que en el caso de los vinos blancos afrutados), junto con el
aporte de aromas varietales a frutas de baya procedentes e los hollejos de las uvas
tientas con que se elaboran. Por otro lado, la característica coloración de estos vinos,
con una gama que pueden ir desde tonos rojo-violeta hasta naranjas.
Los vinos rosados son quizá uno de los tipos de vinos más delicados, cuya
calidad aromática y cromática decaen con mayor celeridad, siendo escasos los casos
de vinos rosados que resistan un envejecimiento de más de 1-2 años. Entre las
características que más rápido evolucionan en los vinos rosados se encuentra su color,
con una tendencia a virar hacia tonos anaranjados con el tiempo. Esta tonalidad
anaranjada se puede relacionar con la formación de pigmentos antociánicos de
naturaleza polimérica (las uniones entra antocianos y taninos) y también con la
formación de pigmentos del tipo piranoantociano, generados por reacción entre los
antocianos originales de la uva con derivados del ácido hidroxicinámico.
La formación de piranoantocianos en vinos tintos ha sido estudiada de una
forma más exhaustiva y parece cobrar gran importancia en vinos tintos muy
envejecidos. No obstante, la formación de este tipo de pigmentos en vinos rosados
apenas si se ha estudiado, y existen bastantes indicios de que pueden jugar un papel
importante en el color de los vinos rosados, incluso al poco tiempo de su elaboración,
sin esperar un envejecimiento prolongado.
Resultados y Discusión. Capítulo I.
136 Dora Blanco Vega 2013
Por eso en este capitulo se va a estudiar el contenido en pigmentos
antociánicos, con especial énfasis en los piranoantocianos, de vinos rosados
elaborados en Castilla La Mancha en las vendimias de 2006 y 2007 mediante análisis
cromatográfico por HPLC. Así mismo, se va a medir el color de estos vinos, en el
sistema CIELAB, y se va a indagar si existe alguna relación entre el color de un vino
rosado y su composición en pigmentos antociánicos.
Con el estudio del contenido en compuestos fenólicos y de las características
cromáticas en los vinos rosados elaborados en Castilla-La Mancha, se pretende
alcanzar los siguientes objetivos.
-Profundizar en el conocimiento de la composición fenólica de los vinos de
Castilla-La Mancha
-Analizar la posible relación del color de vinos rosados de Castilla-La Mancha con
su composición en compuestos fenólicos que pueden influir en éste.
-Evaluar la influencia de la variedad de uva y de la vendimia en las características
cromáticas y la composición fenólica de los vinos rosados.
EL COLOR DE LOS VINOS TINTOS Y ROSADOS Y MEDIDA DE ESTE
El color del vino es un factor de calidad muy importante, para todo tipo de
vinos (blancos, rosados y tintos). El color es uno de los aspectos organolépticos más
importantes de un vino, no sólo porque es la primera e inmediata imagen de éste,
sino también porque es un indicador de otros aspectos organolépticos, como su aroma
y su sabor. El color del vino también es indicativo de la edad de éste y de los procesos
a los que se ha visto sometido a lo largo de su elaboración y almacenamiento.
El color del vino se define mediante una serie de términos basados en medidas
de radiación, energía luminosa o en la sensación de color que se forma en la mente.
Conforme se fue desarrollando la espectrofotometría, la técnicas de medida de color
se fueron mejorando, culminando con las conclusiones de la Comisión internacional de
Resultados y Discusión. Capítulo I.
137 Dora Blanco Vega 2013
Iluminación (CIE) que proporcionaron los medios para definir el color de cualquier
líquido (medio transparente) de una forma mucho más exacta.
Las características cromáticas de un vino están definidas por su LUMINOSIDAD
y su CROMATICIDAD, cuya medida en las condiciones del método de referencia del
CIE supone realizar un barrido espectral amplio, midiendo las absorbancias a muchos
valores de longitud de onda y empleando complejas ecuaciones. No obstante la
Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV) propuso para los vinos una
simplificación del método de referencia, basado en los valores de absorbancia de sólo
cuatro longitudes de onda discretas. Recientemente investigadores españoles han
propuesto una mejora del método simplificado, con otras longitudes de onda a las que
medir las absorbancias y nuevas ecuaciones de transformación, que pretenden
resolver las discrepancias observadas con el método OIV en vinos tintos muy
intensamente coloreados, Sin embargo, siguen utilizando habitualmente en bodega
otros parámetros como la Intensidad Colorante (IC) y la Tonalidad (T) para vinos
tintos, y la medida de la absorbancia a 420 nm para vinos blancos
Sistema CIE
Se trata del sistema estándar de medida del color con el cual se deben
comparar el resto de los sistemas. Fue propuesto por la CIE en 1931, basándose en la
teoría de la percepción tricromática. El sistema CIE especifica el color definido por tres
parámetros (X; Y; Z) llamados parámetros triestímulo, que representan la cantidad de
los tres colores primarios: rojo, verde y azul. Para calcularlos, la CIE recomienda
registrar el espectro entre 380 y 700 nm a intervalos de 1, 5 ó 10 nm y aplicar las
siguientes ecuaciones:
X = k∑τλLλyλΔλ
Y = k∑τλLλyλΔλ
Z = k∑τλLλyλΔλ
Resultados y Discusión. Capítulo I.
138 Dora Blanco Vega 2013
En el caso de que el color se deba a la transmisión de luz por un objeto, como
en el vino (τλ) es una transmitancia espectral de la muestra para cada longitud de
onda, (Lλ)
la emisión espectral de la muestra para esa misma λ, (xλ, yλ, zλ) son funciones
matemáticas de color relacionadas con el observador estándar elegido, y (Δλ) el
intervalo de medida. Para los vinos, la CIE propuso un método aproximado más simple
que permitía calcular los parámetros triestímulo (Tλ = transmitancia a una λ
determinada):
X= 0.42 T625 + 0.35 T550 + 0.21 T445
Y= 0.20 T625 + 0.63 T550 + 0.17 T495
Z= 0.24 T495 + 0.94 T445
Una vez obtenidos estos parámetros se calcula la proporción de cada uno de ellos:
X = X / (X+Y+Z)
Y = Y / (X+Y+Z)
Z = Z / (X+Y+Z)
Los valores resultantes (x, y, z) se denominan coordenadas tricromáticas. El
diagrama cartesiano donde se representa (x) e (y) se denomina diagrama de
cromaticidad donde cada punto (x, y) proporciona la cromaticidad de la muestra,
definida por la longitud de onda dominante (correspondiente a la percepción sensorial
del matiz) y por la pureza (correspondiente a la percepción de saturación). La tercera
dimensión la proporciona (z) que corresponde al porcentaje de luminosidad.
Sistema CIELAB
En el año 1971 la CIE desarrolló un nuevo espacio cromático a partir de
transformaciones no lineales de los valores triestímulo del sistema CIE de 1931. En
este nuevo sistema el espacio se define mediante coordenadas rectangulares (L*, a*,
Resultados y Discusión. Capítulo I.
139 Dora Blanco Vega 2013
b*) junto con otro espacio de coordenadas cilíndricas (L*, C*, h*). Las relaciones
entre las coordenadas CIELAD y las CIE son:
Los parámetros (x, y, z) son los valores triestímulo de la muestra y los valores
(x0, y0, z0) lo son del iluminante. El eje L*, representa la luminosidad. El eje a*, una
medida del componente rojo (valores positivos) y verde (valores negativos). El eje b*,
mide el componente amarillo (positivo) y azul (negativo). A partir de los valores de a*
y b* se calculan los valores psicométricos C* (cromaticidad) y h* (ángulo de tono),
relacionado con el término tonalidad o matiz de color:
C* = (a*2 + b*2)½
h* = arctg (b*/a*)
En este sistema las diferencias de color global entre dos muestras (∆E) se
calculan con la expresión:
∆E = [(∆L*)2 + (∆a*)2 + (∆b*)
161163
1
0
*
y
yL
3
1
0
3
1
0
* 500
y
y
x
xa
3
1
0
3
1
0
* 200
z
z
y
yb
Resultados y Discusión. Capítulo I.
140 Dora Blanco Vega 2013
PARTE EXPERIMENTAL
Muestras de vinos rosados
Las muestras de vinos comerciales fueron proporcionadas por el Consejo
Regulador de la Denominación de Origen “Mancha”, procedentes de las muestras que
se someten a cata para poder acogerse a esta D.O. Y también muestras de vinos de
bodegas colaboradoras.
Una vez recogidas las muestras, se tomó una alícuota que fue congelada hasta el
momento de su análisis, anotando todos los datos necesarios para identificar la
muestra, así como la fecha en que se guardó congelada.
Otras muestras fueron proporcionadas por el IVICAM (Instituto de la Vid y el Vino
de Castilla-La Mancha); las muestras fueron entregadas congeladas, en botes de
plástico de 25 ml las cuales procedían de las catas que habitualmente se realizaron en
esta institución a lo largo de los años 2006 y 2007.
Muestras
D.O.
Mancha
Variedad Año Localidad Provincia
1 TEMPRANILLO 2006 La Roda Albacete
2 no lo pone 2006 Pedro Muñoz Ciudad Real
3 no lo pone 2006 Santa cruz de la zarza Toledo
4 CABERNET SAUVIGNON 2006 Quintanar de la Orden Toledo
5 CABERNET SAUVIGNON 2006 Alcazar de San Juan Ciudad Real
6 CABERNET SAUVIGNON 2006 Villarrobledo Ciudad Real
7 TEMPRANILLO 2006 Noblejas Toledo
8 CABERNET SAUVIGNON 2006 Quintanar de la Orden Toledo
9 TEMPRANILLO 2006 Quintanar de la Orden Toledo
10 TEMPRANILLO 2006 Almagro Ciudad Real
11 TEMPRANILLO 2006 Tarazona de la mancha Albacete
12 TEMPRANILLO 2006 Manzanares Ciudad Real
13 TEMPRANILLO 2006 Villarrubia de los ojos Ciudad Real
14 CABERNET SAUVIGNON 2006 Tomelloso Ciudad Real
15 TEMPRANILLO 2006 Campo de Criptana Ciudad Real
Resultados y Discusión. Capítulo I.
141 Dora Blanco Vega 2013
16 TEMPRANILLO 2006 Socuéllamos Ciudad Real
17 TEMPRANILLO 2006 Las Mesas Cuenca
18 TEMPRANILLO 2005 Pedro Muñoz Ciudad Real
19 CENCIBEL/CABERNET
SAUVIGNON (50:50) 2006 Carrión Ciudad Real
20 TEMPRANILLO/SYRAH 2006 Villarrobledo Albacete
21 TEMPRANILLO 2006 Tomelloso Ciudad Real
22 no lo pone tradicional Villarrobledo Albacete
23 no lo pone tradicional Noblejas Toledo
24 no lo pone tradicional Noblejas Toledo
25 no lo pone 2006 Puebla de Almoradiel Toledo
26 no lo pone tradicional Cinco Casas Ciudad Real
27 CENCIBEL tradicional Campo de Criptana Ciudad Real
28 TEMPRANILLO 2006 Villacañas Toledo
29 TEMPRANILLO 2006 Quintanar de la Orden Toledo
30 TEMPRANILLO 2006 Campo de Criptana Ciudad Real
31 TEMPRANILLO 2006 La Roda Albacete
32 no lo pone tradicional Noblejas Toledo
33 no lo pone 2006 Pedro Muñoz Ciudad Real
34 TEMPRANILLO 2006 Manzanares Ciudad Real
35 TEMPRANILLO-SYRAH 2006 Villarrobledo Albacete
36 CABERNET SAUVIGNON 2006 Alcazar de San Juan Ciudad Real
37 CABERNET SAUVIGNON 2006 Quintanar de la Orden Toledo
38 no lo pone 2006 Corral de Almaguer Toledo
39 TEMPRANILLO 2006 Villacañas Toledo
40 GARNACHA 2006 Villasequilla Toledo
41 no lo pone 2006 Socuéllamos Ciudad Real
42 CENCIBEL 2006 San Clemente Cuenca
43 SYRAH 2006 Tomelloso Ciudad Real
44 CENCIBEL 2006 Corral de Almaguer Toledo
45 CENCIBEL 2006 Socuéllamos Ciudad Real
46 CENCIBEL 2006 Socuéllamos Ciudad Real
47 CENCIBEL 2006 Manzanares Ciudad Real
48 CENCIBEL 2006 Tarazona de la mancha Albacete
49 CENCIBEL 2006 Socuéllamos Ciudad Real
50 GARNACHA 2006 Villarrobledo Albacete
51 MERLOT 2006 Yepes Toledo
52 CENCIBEL 2006 Socuéllamos Ciudad Real
53 CENCIBEL 2006 Fuente de Pedro Naharro Cuenca
54 CENCIBEL 2006 Fuente de Pedro Naharro Cuenca
55 CENCIBEL 2006 Quintanar de la Orden Toledo
Resultados y Discusión. Capítulo I.
142 Dora Blanco Vega 2013
56 CABERNET SAUVIGNON 2006 Quintanar de la Orden Toledo
57 CENCIBEL 2006 Pedro Muñoz Ciudad Real
58 MERLOT 2006 Yepes Toledo
59 GARNACHA 2006 Villasequilla Toledo
60 CENCIBEL 2006 Quintanar de la Orden Toledo
61 GARNACHA 2006 Manzanares Ciudad Real
62 CENCIBEL (no está claro en la
etiqueta) 2006 Tomelloso Ciudad Real
63 CABERNET SAUVIGNON 2006 Alcazar de San Juan Ciudad Real
64 CABERNET SAUVIGNON 2006 Tomelloso Ciudad Real
65 CENCIBEL 2006 Socuéllamos Ciudad Real
66 CENCIBEL 2006 Almagro Ciudad Real
67 CENCIBEL 2006 Noblejas Toledo
68 CENCIBEL 2006 Socuéllamos Ciudad Real
69 TEMPRANILLO 2006 Tomelloso Ciudad Real
70 CENCIBEL 2006 Tarazona de La Mancha Albacete
71 GARNACHA 2006 Socuéllamos Ciudad Real
72 TEMPRANILLO 2006 Quintanar de la Orden Toledo
73 GARNACHA 2006 Villasequilla Toledo
74 CENCIBEL 2006 La Roda Albacete
75 CENCIBEL 2006 Almagro Ciudad Real
76 CENCIBEL 2006 La Roda Albacete
77 CENCIBEL 2006 Villarrobledo Ciudad Real
78 CABERNET SAUVIGNON 2006 Socuéllamos Ciudad Real
79 MERLOT 2006 Yepes Toledo
80 CENCIBEL 2006 Tomelloso Ciudad Real
81 CENCIBEL 2006 Socuéllamos Ciudad Real
82 TEMPRANILLO 2006 Villarrobledo Albacete
83 CABERNET SAUVIGNON 2006 Socuéllamos Ciudad Real
84 GARNACHA 2006 Villarta de San Juan Ciudad Real
85 GARNACHA 2006 Las Mesas Cuenca
86 GARNACHA 2006 Manzanares Ciudad Real
87 semidulce (no pone variedad) 2007 Santa Cruz de la Zarza Toledo
88 GARNACHA 2007 Manzanares Ciudad Real
89 no lo pone 2007 Pedro Muñoz Ciudad Real
90 CENCIBEL 2007 Villarrubia de los Ojos Ciudad Real
91 GARNACHA 2007 Manzanares Ciudad Real
92 no lo pone 2007 Socuéllamos Ciudad Real
93 TEMPRANILLO 2007 Villacañas Toledo
94 CENCIBEL 2007 Herencia Ciudad Real
95 no lo pone 2007 Corral de Almaguer Toledo
Resultados y Discusión. Capítulo I.
143 Dora Blanco Vega 2013
96 TEMPRANILLO 2007 Manzanares Ciudad Real
97 TEMPRANILLO-C.SAUVIGNON
(50:50) 2007 Carrión Ciudad Real
98 no lo pone 2007 Villalgordo del Júcar Albacete
99 CENCIBEL 2007 Villalgordo del Júcar Albacete
100 SYRAH 2007 Tomelloso Ciudad Real
101 TEMPRANILLO 2007 Ontur Albacete
102 GARNACHA 2007 El Povencio Cuenca
103 CABERNET SAUVIGNON 2007 Villarrobledo Albacete
104 no lo pone 2007 Puebla de Almoradiel Toledo
105 GARNACHA (agricultura
ecológica) 2007 Socuéllamos Ciudad Real
106 TEMPRANILLO 2007 Quintanar de la Orden Toledo
107 no lo pone 2007 Tomelloso Ciudad Real
108 TEMPRANILLO 2007 Campo de Criptana Ciudad Real
109 CABERNET SAUVIGNON 2007 Tomelloso Ciudad Real
110 TEMPRANILLO 2007 Noblejas Toledo
111 GARNACHA 2007 La Villa de don Fadrique Toledo
112 GARNACHA (agricultura
ecológica) 2007 Socuéllamos Ciudad Real
113 CENCIBEL 2007 Almagro Ciudad Real
114 no lo pone 2007 Villarta de San Juan Ciudad Real
115 TEMPRANILLO-SYRAH 2007 Villarrobledo Albacete
116 TEMPRANILLO 2007 Villarrobledo Albacete
117 no lo pone 2007 Noblejas Toledo
118 CENCIBEL 2007 Daimiel Ciudad Real
119 TEMPRANILLO 2007 Quintanar de la Orden Toledo
120 CABERNET SAUVIGNON 2007 Quintanar de la Orden Toledo
121 sin varietal 2007 El Toboso Toledo
Resultados y Discusión. Capítulo I.
144 Dora Blanco Vega 2013
Muestras
IVICAM
Variedad Año Localidad Provincia
238 CABERNET SAUVIGNON 2006 Tomelloso Ciudad Real
239 GARNACHA-TEMPRANILLO 2006 Socuellamos Ciudad Real
240 BOBAL-TEMPRANILLO Villamalea Albacete
241 MONASTRELL 2006 Fuenteálamo Albacete
242 CABERNET SAUVIGNON-
SHIRAZ-GARNACHA 2006 Almansa Albacete
243 TEMPRANILLO 2006 Villarrobledo Albacete
245 CENCIBEL Tarazona Albacete
246 SHYRAZ 2006 Ontur Albacete
248 SHYRAH 2006 Tomelloso Ciudad Real
249 TEMPRANILLO 2006 Valdepeñas Ciudad Real
250 BOBAL 2006 Villamalea Albacete
251 TEMPRANILLO 2006 Valdepeñas Ciudad Real
252 TEMPRANILLO 2006 Qintanar de la Orden Toledo
253 BOBAL 2006 Iniesta Cuenca
254 CENCIVEL-CABERNET
SAUVIGNON 2006 Carrión de Calatrava Ciudad Real
255 2006 Socuellamos Ciudad Real
256 TEMPRANILLO 2006 Socuellamos Ciudad Real
258 GARNACHA 2006 Manzanares Ciudad Real
262 TEMPRANILLO 2006 Tomelloso Ciudad Real
263 TEMPRANILLO 2006 Valdepeñas Ciudad Real
264 TEMPRANILLO 2006 Valdepeñas Ciudad Real
265 TEMPRANILLO 2006 La Roda Albacete
284 BOBAL 2006 Granja de Iniesta Cuenca
285 BOBAL 2006 Motilla del Palancar Cuenca
286 GARNACHA 2006 Casas de Fernando Alonso Cuenca
287 BOBAL 2006 Casas de Benitez Cuenca
288 BOBAL 2006 Iniesta Cuenca
289 2006 Sisante Cuenca
290 TEMPRANILLO 2006 Motilla del Palancar Cuenca
291 BOBAL 2006 Quintanar del Rey Cuenca
292 BOBAL 2006 Villarta Cuenca
293 BOBAL 2006 Castilleja de Iniesta Cuenca
294 MERLOT 2006 Monreal del llano Cuenca
Resultados y Discusión. Capítulo I.
145 Dora Blanco Vega 2013
Características cromáticas, Parámetros del Sistema CIELAB
Se calcularon las coordenada que describen el color (a*, b*, L*, C*, h*) a partir de
los valores triestímulo (X, Y, Z). Sin embargo no se van a utilizar las ecuaciones
simplificadas propuestas por la CIE en 1931 con iluminante C y observador estándar de 2º,
y aprobadas por la OIV, ya que Negueruela y Echávarri (1983) han confirmado que con
dicho método se pueden cometer importantes errores en el cálculo de las coordenadas del
color, especialmente en vinos de color intenso. Además la OIV ya expuso (1994) la
necesidad de cambiar dicho método usando el espacio CIELAB. Por ello se ha adoptado el
método propuesto por Ayala y col. (1997) para vinos tintos utilizando el iluminante D65 y
observador estándar de 10º, y que está en estos momentos siendo objeto de estudio por la
OIV para establecerlo como método de referencia internacional.
Las ecuaciones para el cálculo de los valores triestímulo propuestas por este autor
son:
X = 14.172 T440 + 28.583 T540 + 52.727610 – 0.462
Y = 9.005 T440 + 62.965 T540 + 28.168610 – 0.063
Z = 94.708 T440 + 15.889 T540 + 5.233610 + 1.777
El método consistiría en medir la absorbancia del vino a 440, 540 y 610 nm en
cubetas de 2 mm de espesor frente a agua como blanco. Las absorbancias obtenidas se
corregirían para 10 mm de espesor, se calcularían las transmitancias y se aplicarían las
expresiones anteriores para obtener los valores triestímulo.
A partir de éstos, y aplicando las ecuaciones correspondientes, se calcularían los
parámetros del sistema CIELAB.
Para realizar lo anterior debemos haber calibrado previamente los valores de pH de
los vinos al mismo nivel (en nuestro caso, pH = 3.6) ya que el color del vino (sobre todo del
tinto) depende del pH al que esté.
Resultados y Discusión. Capítulo I.
146 Dora Blanco Vega 2013
No obstante, este grupo de investigación está acumulando más medidas
experimentales de los parámetros CIELAB en vinos y cada cierto tiempo proponen unas
nuevas longitudes de onda de medida y unas nuevas expresiones mejoradas para el cálculo
de los valores triestímulo (Ayala y col, 1999). Así mismo, estos autores han puesto a punto
un programa (disponible en http://www.unizar.es/negueruela) que permite, a partir de las
absorbancias medidas a las longitudes de onda 450, 520, 570 y 630 nm, en cubetas de 2
mm para vinos tintos y rosados, y de 10 mm para vinos blancos y brandies, efectuar todos
los cálculos de manera rápida. Este será el método que emplearemos.
Antocianos decolorables por sulfurosos
El método de decoloración por SO2 se obtuvo mediante la preparación de dos
muestras (do y d ), para ello teníamos preparado anteriormente una muestra (A*) que
contenía 1 ml de vino, 1 ml de HCl 0,1% en etanol al 96% y 20 ml de HCl.
La primera muestra (do) se preparó añadiendo 10 ml de la muestra A* a 18 ml de
agua destilada.
Para la segunda muestra (d) tomamos otros 10 ml de A* a la que añadimos 14 ml
de agua destilada y 4 ml de SO2 en forma de bisulfato sódico (Na2 S2 O5) de densidad 1.24.
Ambas muestras (do y d ) se analizaron por espectrofotometría a 520 nm para los
cálculos posteriores.
Calculos:
Antocianos decolorables por sulfurosos.
Concentración (mg/l) = (do – d ) x 875
% Antocianos no decolorables por sulfurosos.
% A. no decolorables = (d/do) x 100
Resultados y Discusión. Capítulo I.
147 Dora Blanco Vega 2013
Análisis por HPLC
La separación, identificación y cuantificación fue llevada a cabo en un equipo
HPLC Agilent 1100 Series System (Agilent, Waldbronn, Germany), equipado con detector
DAD (Agilent G1315B) y acoplado a un espectrómetro de masas-masas con trampa iónica
(Agilent, G2445C VL), con un sistema de ionización por electroespray (ESI-MSn), todo ello
acoplado a un software de procesamiento de datos (Agilent Chem Station versión B.01.03).
Los datos de espectros de masas fueron procesados con el software del Trap Agilent LC/MS
(versión 5.3).
El análisis de antocianos de los diferentes vinos no tuvieron ningún tratamiento
previo a la inyección en el cromatógrafo de líquidos de alta resolución, únicamente las
muestras fueron pasadas por filtros de membrana de poliéster con tamaño de poro de 0.20
-Nagel, Düren, Germany) y diluidas a la mitad con agua
Milli-Q, con el fin de disminuir el porcentaje de metanol contenido en el extracto de hollejo
de uva tinta y así mejorar la simetría de los picos cromatográficos.
Reactivos y eluyentes
Fase estacionaria: Se utilizó una columna cromatográfica de 250 mm de longitud x
4.6 mm de diámetro interno, con un relleno de fase inversa Zorbax Eclipse XDB-C18
(Agilent), con un tamaño de partícula de 5 nm; se utilizó una precolumna de 4.6 x
10 mm del mismo relleno. Durante el proceso cromatográfico la columna estuvo
termostatizada a 40º C.
Fase móvil: Se utilizaron dos disolventes diferentes:
Eluyente A: 3% acetonitrilo (Scharlau Analytical Sciences, HPLC) + 87% agua
bidestilada + 10% ácido fórmico (Panreac).
Eluyente B: 50% acetonitrilo (Scharlau Analytical Sciences, HPLC) + 40% agua
bidestilada + 10% ácido fórmico (Panreac).
Cada eluyente preparado se desgasificó con ultrasonidos durante unos minutos, con
el fin de eliminar las posibles burbujas que pudieran interferir en el cromatógrafo de
Resultados y Discusión. Capítulo I.
148 Dora Blanco Vega 2013
líquidos. No obstante, el equipo de HPLC dispone de una cámara de desgasificación previa a
las bombas de flujo.
Condiciones cromatográficas
Las condiciones cromatográficas fueron adaptadas del método de la OIV para
análisis de antocianos (OIV, 2003).
El gradiente utilizado se indica en la Tabla 3.
El volumen de inyección fue de 50 μL. El rango de longitudes de onda para la
detección fue de 200-600 nm.
Como patrón para la cuantificación de los picos cromatográficos, se utilizó
malvidina 3-glucósido (Extrasynthese, Genay, Francia).
La cuantificación de los antocianos se realizó usando los cromatogramas
obtenidos por el detector DAD a 520 nm de longitud de onda y empleando la curva de
calibrado del patrón mencionado.
Para la identificación, se utilizó un detector de masas-masas con ionización por
electroespray en modo positivo y con analizador de masas de trampa iónica (ESI-
MSn). El nitrógeno fue usado como gas nebulizador y de secado.
El modo de adquisición de datos se realizó en SCAN, entre 100 y 1200 m/z.
Los parámetros del detector de espectrometría de masas fueron los siguientes:
Flujo de N2: 11 mL/min
Temperatura de secado: 350º C
Presión del nebulizador: 65 psi
Voltaje del capilar: –2500V
Voltaje a la salida del capilar: 70V
Skimmer 1: 20 V
Skimmer 2: 6 V
Resultados y Discusión. Capítulo I.
149 Dora Blanco Vega 2013
La identificación de los diferentes compuestos se basó en las características
espectroscópicas en el UV-Vis y en los espectros de masas registrados, así como en el
orden de elución descrito en la bibliografía.
Análisis estadístico de los resultados obtenidos
El tratamiento estadístico de los datos se realizó empleando el Análisis de
Componentes Principales cuando no se impuso ningún criterio de clasificación previo a
las muestras. Los perfiles de antocianos según la variedad de uva empleada se abordó
por un análisis de comparación de medias ANOVA según el test de Student-Neuman-
Keuls, mientras que la estudio de diferenciación de los vinos de las variedades
Cencibel o Tempranillo, o en función de las vendimias 2006 o 2007, se realizó con un
análisis de comparación de medias de la “t” de Student. Se empleó el paquete de
programas de estadística SPSS 15.0 para Windows.
Resultados y discusión
En primer lugar, se van a presentar los resultados obtenidos para todos los
vinos analizados (130 muestras) con idea de obtener una visión global de cómo es el
color de los vinos rosados elaborados en La Mancha, así como su composición fenólica
relativa al color, debido a la escasez de datos que se dispone al respecto. A
continuación se explorará la posibilidad de diferenciar los vinos rosados, en cuanto a la
variedad de uva utilizada, en función de su color y de su composición fenólica; para
ello sólo se van a analizar los resultados obtenidos para 110 muestras de vinos
rosados, aquellas para las que la etiqueta indicaba claramente que eran vinos de una
sola variedad y para los que había más de una muestra. Por último, se va a estudiar si
las denominaciones varietales “Cencibel” o “Tempranillo”, en principio
correspondientes a sinonimias de la misma variedad de uva, realmente tiene un reflejo
en el color o en la composición fenólica de los vinos rosados, así como si la vendimia
en que los vinos fueron elaborados (2006 y 2007) supuso alguna diferencia en estos
vinos rosados.
Resultados y Discusión. Capítulo I.
150 Dora Blanco Vega 2013
Caractarísticas cromáticas y composición fenólica de los vinos rosados
elaborados en la mancha
Se han analizado un total de 130 vinos rosados elaborados en La Mancha.
Puesto que el vino rosado es un tipo de vino que no responde a una única definición
desde el punto de vista tecnológico y ya que no sabemos los detalles de elaboración
de cada uno de los vinos analizados, los primeros resultados que se van a exponer son
los valores medios (con sus desviaciones típicas) de los parámetros analíticos
relacionados con el color mostrado por estos vinos.
Las características cromáticas, en términos globales, de los vinos rosados
analizados fueron las siguientes:
a) En términos promedios los vinos rosados fueron bastante claros (L* = 93.94 ±
2.34), aunque algunos vinos individuales tuvieron un color bastante oscuro o
casi tan claro como algunos vinos blancos (rango de valores de L* entre
85.70-98.40).
b) El colorido (término que se relaciona con la predominancia de un único tipo de
pigmento) de estos vinos no fue muy alto (C* = 7.12 ± 2.33) y además osciló
dentro de un rango muy amplio (entre 2.66 y 14.03)
c) El ángulo de tono (una medida relacionada con el matiz o tono del color) osciló
dentro de un rango muy amplio de valores, encontrándose en un extremo
vinos rosados de un color rojo con tonos púrpuras (valor mínimo de h* =
6.99) y en el otro extremo, vinos rosados con un color naranja (valor máximo
de h* = 68.23), si bien la mayoría de los vinos rosados mostraron un color
netamente rojo (h* entre 15 y 45), con ligeros matices púrpuras o
anaranjados, según el caso (h* = 33.81 ± 11.77).
d) Las grandes diferencias observadas en el colorido de estos vinos rosados se
debieron fundamentalmente al amplio rango de valores mostrado por su
componente roja del color (valores de a* > 0), entre 1.00 y 13.92. De hecho,
estos dos parámetros cromáticos correlacionaron muy bien (Figura V.1).
Resultados y Discusión. Capítulo I.
151 Dora Blanco Vega 2013
e) Análogamente, las grandes diferencias encontradas para el ángulo de tono de
estos vinos rosados se debieron en parte a la gran variabilidad mostrada por la
componente amarilla del color (b* > 0), que osciló entre 0.60 y 7.52; no
obstante, la correlación entre estos dos parámetros cromáticos no fue muy
buena (Figura V.2), por lo que en la variación del valor de h* también tuvo
una influencia considerable el valor de a*.
Figura I.1. Correlación entre los parámetros cromáticos “colorido” (C*) y “componente roja del color” (a*) correspondientes a los vinos rosados analizados.
y = 0,9561x + 1,4714
R2 = 0,9146
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0
Componente roja del color (a*)
Co
lori
do
(C
*)
Resultados y Discusión. Capítulo I.
152 Dora Blanco Vega 2013
Figura I.2. Correlación entre los parámetros cromáticos “ángulo de tono” (h*) y “componente amarilla-azul del color” (b*) correspondientes a los vinos rosados analizados.
En cuanto a las distintas fracciones de pigmentos antociánicos rojos, los
resultados obtenidos para los vinos rosados fueron:
a) El contenido en antocianos totales (AT) estuvo dentro del rango 7.33-116.35
mg/L (como malvidina 3-glucósido), con un valor medio de 36.63 ± 19.17
mg/L, que es un valor normal en vinos rosados (no suele superar los 50 mg/L;
Boulton, 2001).
b) Del total de antocianos presentes en los vinos rosados analizados, una
cantidad de entre 5.39-109.49 mg/L (como malvidina 3-glucósido), con un
valor medio de 31.96 ± 19.43 mg/L, fueron antocianos decolorables por
sulfuroso (ADS), es decir, no estables.
c) Entre los ADS se encuentran los antocianos monómeros (AM) procedentes de
la uva, que se encontraron en cantidades entre 2.27-99.82 mg/L (como
malvidina 3-glucósido), con un valor medio de 28.01 ± 21.54 mg/L.
d) Estos AM suponen en términos generales tres cuartas partes (76.47 %) de los
AT, un valor que se correspondió bastante bien con el porcentaje de
Resultados y Discusión. Capítulo I.
153 Dora Blanco Vega 2013
antocianos no decolorables por sulfuroso (%ANDS), con un valor medio de
16.00 ± 11.23 % y un rango de 1.11-51.54 %.
Los AM originarios de la uva aún son el grupo más numeroso de pigmentos de
color rojo que hay en los vinos rosados analizados. Así, el contenido en AM
correlacionó en general muy bien con el contenido en AT, salvo unos pocos casos
(Figura V.3.a). Pero esto no significa necesariamente que el color del vino rosado se
deba mayoritariamente a los AM, ya que conviene recordar en qué condiciones se
realizan las medidas de las distintas fracciones de antocianos (todas a pH muy ácido,
estando todos los antocianos en forma roja) y cuál es su contribución real al color del
vino rosado (se realiza a pH 3.6, un valor de referencia dentro del rango habitual de
3.5-4.0, al cual no todos los antocianos tienen por qué encontrarse en su forma roja).
El porcentaje de AM que están en la forma roja de catión flavilio es de tan sólo un 8-
10 % (Boulton, 1996), por lo que su contribución real al color del vino rosado está
muy mermada. En cambio, los pigmentos antociánicos son más estables y se ven
mucho menos afectados por las variaciones de pH y la decoloración por sulfuroso
(precisamente en esta última propiedad se basan las medidas de ADS y %ANDS), por
lo que puede afirmarse que este tipo de pigmentos contribuye en su totalidad al color
del vino sea cual sea el valor de pH al que se realice la medida. La suma del
porcentaje de AM, en relación al contenido en AT, y de %ANDS queda algo lejos del
100 % (76.47 + 16.00 = 92.47 %), ya que algunos de los nuevos pigmentos
formados en el vino, aunque son algo más estables que los AM, aún siguen siendo
decolorables por el sulfuroso como los AM (es el caso de las uniones tanino-
antociano). Conviene recordar que los AM fueron medidos por HPLC, una técnica que
no separa bien pigmentos derivados de antocianos por su unión con taninos. No
obstante, el contenido en AM correlacionó muy bien con el contenido en ADS (Figura
I.3.b), corroborando que la mayoría de los antocianos decolorables de los vinos
rosados eran antocianos monómeros originales de las uvas.
Resultados y Discusión. Capítulo I.
154 Dora Blanco Vega 2013
Figura I.3. Correlación entre los contenidos de distintas fracciones de antocianos a) Antocianos Monómeros vs. Antocianos Totales; b) Antocianos Monómeros vs.
Antocianos Decolorables por Sulfuroso. Se han marcado las muestras que no correlacionan bien.
En los vinos rosados analizados pudieron detectarse piranoantocianos
derivados de la reacción de los AM con ácido pirúvico (un metabolito secundario de la
fermentación alcohólica) y con ácidos hidroxicinámicos (ácidos cafeico y p-cumárico).
Se sabe que la formación de la vitisina A ocurre en los primeros días de la elaboración
del vino, durante la fermentación alcohólica, y que suele ser el piranoantociano
mayoritario en vinos jóvenes y su cantidad se mantiene o disminuye lentamente
durante el envejecimiento, mientras que los piranoantocianos derivados del ácido
cumárico mv-3-glc-4-VP, se encuentran en pequeñas cantidades en los vinos jóvenes,
en los que no suele encontrase el derivado del ácido cafeico, mv-3-glc-4-VC, y ambos
van aumentando su concentración por vía química durante el almacenamiento.
Puesto que los vinos rosados son vinos jóvenes, no es de extrañar que en las
muestras analizadas el piranoantociano predominante fuese la vitisina A, detectándose
en todas las muestras analizadas, en una cantidad promedio de 0.46 ± 0.28 mg/L
(rango de 0.11-1.34). En cambio, los piranoantocianos derivados de ácidos
hidroxicinámicos no se encontraron en todas las muestras de vino analizadas: en 62
vinos de los 130 analizados se encontraron estos piranoantocianos, estando los dos
mayoritarios (mv-3-glc-4-VP y mv-3-glc-4-VC) en 44 de las muestras, mientras que
11 muestras sólo contenían mv-3-glc-4-VP y 7 muestras sólo contenían mv-3-glc-4-
VC. En las muestras de vino en que se hallaron estos piranoantocianos, el contenido
Resultados y Discusión. Capítulo I.
155 Dora Blanco Vega 2013
medio fue de: mv-3-glc-VP, 0.20 ± 0.20 mg/L (rango de 0.05-1.07); mv-3-glc-4-VC,
0.35 ± 0.50 mg/L (rango de 0.07-2.95). En 9 las muestras con mayor contenido en
piranoantocianos de este tipo, también pudieron detectarse los derivados acetilados de
ambos piranoantocianos (mv-3-acglc-4-VC y mv-3-acglc-4-VP) y el cumaroilado del
derivado del ácido cafeico (mv-3-cmglc-4-VC), en cantidades inferiores a las de sus
correspondientes derivados no acilados (mv-3-glc-4-VP y mv-3-glc-4-VC). Cabe
destacar que, al contrario de lo habitual en vinos tintos jóvenes, en los vinos rosados
no sólo se encontraron piranoantocianos derivados del ácido cafeico, sino que además
éstos fueron generalmente los mayoritarios (en 38 de las 44 muestras en que se
encontraron mv-3-glc-4-VC y mv-3-glc-4-VP, más las 7 muestras en que sólo se
encontró mv-3-glc-4-VC) frente a los derivados del ácido p-cumárico. Una posible
explicación de este comportamiento diferente puede basarse en dos hipótesis:
- En primer lugar, los vinos rosados, al elaborarse sin que en ellos se desarrolle
la fermentación maloláctica (reduce la acidez al descarboxilar al ácido málico
para dar ácido láctico) y tener un periodo muy corto de maceración con los
hollejos (en ellos hay iones potasio que hacen perder moléculas de ácido
tartárico por precipitación de sales insolubles de bitartrato de potasio, con la
consiguiente disminución de acidez) tienen un pH más ácido que los vinos
tintos, por lo que la hidrólisis de los ácidos hidroxicinamoil-tartáricos, que
libera a los ácidos hidroxicinámicos que luego reaccionarán con los AM, puede
ocurrir con más rapidez y en mayor extensión.
- En segundo lugar, la formación de piranoantocianos por reacción de los ácidos
hidroxicinámicos con los AM en vinos tintos está en competencia con la
reacción de estos mismos AM con los taninos, mayoritarios frente a los ácidos
hidroxicinámicos, por lo que en vinos tintos se suele observar un retraso en la
formación de estos piranoantocianos aún cuando la cantidad de ácidos
hidroxicinámicos libres sea importante. En cambio, en los vinos rosados
apenas hay taninos por su forma de elaboración (no se extraen taninos de las
pepitas y la extracción de taninos de los hollejos es muy limitada por el escaso
tiempo de maceración empleado).
Se encontró que la correlación entre los contenidos en ácidos cafeico y p-
cumárico respecto a sus correspondientes ésteres etílicos (Figura I.4) fue bastante
mejor que la encontrada entre los ácidos cafeico y p-cumárico respecto a los
correspondientes piranoantocianos a que dan lugar (Figura I.5). Puede sugerirse, por
Resultados y Discusión. Capítulo I.
156 Dora Blanco Vega 2013
tanto, que los ácidos cafeico y p-cumárico libres en los vinos rosados tienen una
mayor tendencia a reaccionar con el etanol para formar ésteres etílicos (cafeoato y
cumarato de etilo, respectivamente) que con los antocianos para formar
piranoantocianos (mv-3-glc-4-VC y mv-3-glc-4-VP, respectivamente). Y ello a pesar
de que en los vinos rosados los antocianos tienen pocos taninos con los que reaccionar
(¾ partes de los AT son aún AM); quizá la baja concentración en que se encuentran
los AM en los vinos rosados (no superior a 0.1 g/L) respecto al etanol (del orden de
80-100 g/L) haga que predomine la reacción de los ácidos cafeico y p-cumárico con el
etanol.
Figura I.4. Correlación entre los contenidos de: a) Ácido cafeico vs. cafeoato de etilo; b) Ácido p-cumárico vs. cumarato de etilo.
Figura I.5. Correlación entre los contenidos de: a) Ácido cafeico vs. mv-3-glc-4-VC;b) Ácido p-cumárico vs. mv-3-glc-4-VP.
y = 1,5174Ln(x) + 5,1305
R2 = 0,4194
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50
Ácido cafeico (mg/L)
mv-3
-glc
-4-V
C (
mg
/L)
y = 0,7298Ln(x) + 3,1482
R2 = 0,2031
y = 2,3429x + 1,2857
R2 = 0,1702
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
Ácido p-cumárico (mg/L)
mv-3
-glc
-4-V
P (
mg
/L)
a) b)
y = 1,5174Ln(x) + 5,1305
R2 = 0,4194
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50
Ácido cafeico (mg/L)
mv-3
-glc
-4-V
C (
mg
/L)
y = 0,7298Ln(x) + 3,1482
R2 = 0,2031
y = 2,3429x + 1,2857
R2 = 0,1702
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
Ácido p-cumárico (mg/L)
mv-3
-glc
-4-V
P (
mg
/L)
y = 1,5174Ln(x) + 5,1305
R2 = 0,4194
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50
Ácido cafeico (mg/L)
mv-3
-glc
-4-V
C (
mg
/L)
y = 0,7298Ln(x) + 3,1482
R2 = 0,2031
y = 2,3429x + 1,2857
R2 = 0,1702
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
Ácido p-cumárico (mg/L)
mv-3
-glc
-4-V
P (
mg
/L)
a) b)
y = 0,2362x - 0,0653
R2 = 0,5286
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00
Ácido cafeico (mg/L)
Cafe
oato
de e
tilo
(m
g/L
)
y = 0,2846x + 0,0585
R2 = 0,5727
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00
Ácido p-cumárico (mg/L)
Cu
marato
de e
tilo
(m
g/L
)
a) b)
y = 0,2362x - 0,0653
R2 = 0,5286
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00
Ácido cafeico (mg/L)
Cafe
oato
de e
tilo
(m
g/L
)
y = 0,2846x + 0,0585
R2 = 0,5727
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00
Ácido p-cumárico (mg/L)
Cu
mara
to d
e e
tilo
(m
g/L
)
y = 0,2362x - 0,0653
R2 = 0,5286
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00
Ácido cafeico (mg/L)
Cafe
oato
de e
tilo
(m
g/L
)
y = 0,2846x + 0,0585
R2 = 0,5727
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00
Ácido p-cumárico (mg/L)
Cu
mara
to d
e e
tilo
(m
g/L
)
a) b)
Resultados y Discusión. Capítulo I.
157 Dora Blanco Vega 2013
Se estudió la posible correlación entre los valores de algunos de los
parámetros cromáticos y las distintas fracciones de antocianos presentes en los vinos
rosados. En general, estas correlaciones fueron muy pobres o inexistentes, y sólo se
observó cierta tendencia al aumento de la componente amarilla del color (b* > 0) para
aumentos en los valores del % ANDS (Figura I.6.a); muchos de los ANDS son uniones
antociano-tanino o piranoantocianos que muestran un color más anaranjado que rojo.
Como todos los ANDS son rojos al valor de pH del vino (el color se midió a pH = 3.6),
y la mayoría de ADS son AM que a pH 3.6 están sólo en un 8% en la forma roja de
catión flavilio, se encontró una correlación aceptable entre la suma de pigmentos rojos
a pH 3.6 (del tipo ANDS, multiplicando el % ANDS por el contenido en AT, más el 8%
de los del tipo ADS) y el valor de la componente roja del color (a*) a ese valor de pH
(Figura I.6.b).
Figura I.6. Correlación entre: a) %ANDS y componente amarilla del color; b) Suma de ANDS y
ADS (8% en forma roja a pH 3.6) y componente roja del color.
Diferenciación varietal en vinos rosados
Un total de 108 muestras de vinos rosados analizados correspondían a vinos
monovarietales, elaborados con una sola variedad de uva según se declaraba en su
etiqueta. De estos:
- Bobal: 9 muestras
- Cabernet Sauvignon: 13 muestras
- Cencibel: 24 muestras
- Garnacha: 14 muestras
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0
Componente amarilla-azul del color (b*)
AN
DS
(%
)
a)
y = 0,6606x + 3,1739
R2 = 0,4148
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
18,0
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0
Componente roja del color (a*)
AN
DS
+ 8
%A
DS
(m
g/L
)
b)
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0
Componente amarilla-azul del color (b*)
AN
DS
(%
)
a)
y = 0,6606x + 3,1739
R2 = 0,4148
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
18,0
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0
Componente roja del color (a*)
AN
DS
+ 8
%A
DS
(m
g/L
)
b)
Resultados y Discusión. Capítulo I.
158 Dora Blanco Vega 2013
- Merlot: 4 muestras
- Syrah: 6 muestras
- Tempranillo: 38 muestras
El conjunto de muestras, junto con sus parámetros analizados (características
cromáticas, fracciones de antocianos, perfil de antocianos monómeros,
piranoantocianos y derivados hidroxicinámicos) fue sometido al Análisis de
Componentes Principales (CP), para evaluar si las distintas muestras de vinos rosados
tenían alguna tendencia a agruparse según la variedad de uva de procedencia. El
resultado no fue muy satisfactorio, ya que con los 3 primeros CP sólo se pudo explicar
el 34.43 % de la varianza total del conjunto de datos (Tabla I.1).
Tabla I.1. Resultados del Análisis de Componentes Principales aplicado al conjunto de los vinos rosados monovarietales.
CP Variables más correlacionadas Loadings % Varianza Explicada
Acumulada
1 Luminosidad (L*) -0.914 11.53
Colorido (C*) 0.906
Componente roja del color (a*) 0.901
Vitisina A 0.759
2 Malvidina-3-t-cm-glucósido 0.862 22.98
Petunidina-3-t-cm-glucósido 0.821
Delfinidina-3-t-cm-glucósido 0.768
Ácido c-cutárico 0.740
Malvidina-3-c-cm-glucósido 0.712
3 ADS 0.939 34.43
AM 0.933
AT 0.925
% ANDS -0.721
Cuando las muestras de vinos rosados se representaron en el plano formado por
las dos primeras Componentes Principales (CP), se observó cierto grado de
diferenciación en función de la variedad de uva empleada (Figura V.7). En el Análisis
de CP no se hace una distinción previa de los vinos de una determinada variedad de
Resultados y Discusión. Capítulo I.
159 Dora Blanco Vega 2013
uva, pero al representar las muestras en el espacio definido por CP-1 y CP-2 sí se han
marcado los vinos de una misma variedad, para observar si se agrupaban o no.
Figura I.7. Representación de las muestras de vinos rosados, marcadas por variedad de uva empleada, en el plano formado por los Componentes Principales 1 y 2. Se han representado los centroides de cada grupo de vino (letra mayúscula) y
se ha encerrado en una elipsoide el grupo más homogéneo de muestras de un mismo vino monovarietal (en algunos casos, las muestras más alejadas se han separado de la agrupación más homogénea). Variedades de uva: B, Bobal; C,
Cencibel; CS, Cabernet Sauvignon; G, Garnacha; M, Merlot; S, Syrah; T, Tempranillo.
Los vinos rosados de las variedades francesas (Cabernet Sauvignon, Merlot y
Syrah) se distinguieron entre sí fundamentalmente por sus características cromáticas,
que fueron las variables más correlacionadas con el CP-1: los vinos rosados de
Cabernet Sauvignon fueron más oscuros (menores valores de L*), con mayor colorido
BB CSCS
CCTT
MM
SS
GG
BB CSCS
CCTT
MM
SS
GG
BB CSCS
CCTT
MM
SS
GG
Resultados y Discusión. Capítulo I.
160 Dora Blanco Vega 2013
(C*) y una mayor componente roja del color (a*), mientras que los de Merlot fueron
más claros, con menor colorido y menor componente roja del color; en una situación
intermedia quedaron los vinos rosados de la variedad Syrah. La vitisina A también
contribuyó a separar estos vinos según su variedad, pero al ser un producto
relacionado con la fermentación alcohólica (el ácido pirúvico que reacciona con la
malvidina 3-glucósido es un producto secundario de la fermentación alcohólica) su
influencia debe tener más relación con las diferentes cantidades de malvidina 3-
glucósido que haya en estos vinos durante su fermentación. Un ligera diferencia en las
variables más correlacionadas con el CP-2 (fundamentalmente las proporciones
molares de ciertos antocianos monómeros individuales) permitieron distinguir los vinos
de Syrah de los de Merlot y Cabernet Sauvignon: los vinos de Syrah tuvieron mayores
proporciones de derivados trans-cumaroilados de los 3-glucósidos de malvidina
(también del minoritario isómero cis), petunidina y delfinidina, así como mayor
contenido en ácido t-cutárico. Como es bien sabido, los distintos vinos tintos
monovarietales pueden diferenciarse por sus perfiles característicos de antocianos
(Hermosín Gutiérrez y García Romero, 2004) y estos resultados sugieren que también
pueden hacerlo en los vinos rosados. Los vinos rosados de Cabernet Sauvignon
pudieron diferenciarse algo de los de Merlot y Syrah respecto a las variables más
correlacionadas con el CP-3 (Figura I.8), mostrando un menor contenido en AT, AM y
ADS, pero un mayor valor de %ANDS, por lo que puede afirmarse, aunando
resultados, que en los vinos rosados de Cabernet Sauvignon hay menos antocianos
pero éstos están más polimerizados y por ello son vinos de un color más oscuro y con
mayor contribución de la componente roja del color, que los vinos rosados de Merlot y
Syrah.
Los vinos rosados las variedades de uva españolas Bobal y Garnacha
presentaron unas características cromáticas bastante similares entre sí, y a su vez
muy similares a los de la variedad francesa Merlot, pero sí pudieron diferenciarse muy
bien de los vinos de las otras variedades francesas, Syrah y Cabernet Sauvignon,
sobre todo de los de Cabernet Sauvignon, que es la variedad francesa más extendida
por el mundo: los vinos rosados de variedades españolas fueron más claros, de menor
colorido y con menor contribución al color de la componente roja. Comparando los
vinos rosados de Garnacha y Bobal, los primeros tuvieron mayor proporción de
antocianos cumaroilados (variables asociadas al CP-2) que los primeros; en cambio los
Resultados y Discusión. Capítulo I.
161 Dora Blanco Vega 2013
vinos rosados de Bobal tuvieron un mayor contenido en antocianos y una proporción
menor de antocianos polimerizados, no decolorables por sulfuroso (variables asociadas
al CP-3; Figura I.8).
Figura I.8. Representación de las muestras de vinos rosados, marcadas por variedad de uva empleada, en el plano formado por los Componentes
Principales 1 y 3.
BB
CSCSCC
TT
MM
SSGG
BB
CSCSCC
TT
MM
SSGG
Resultados y Discusión. Capítulo I.
162 Dora Blanco Vega 2013
Se han representado los centroides de cada grupo de vino (letra mayúscula) y se ha
encerrado en una elipsoide el grupo más homogéneo de muestras de un mismo vino
monovarietal (en algunos casos, las muestras más alejadas se han separado de la
agrupación más homogénea). Variedades de uva: B, Bobal; C, Cencibel; CS, Cabernet
Sauvignon; G, Garnacha; M, Merlot; S, Syrah; T, Tempranillo.
Los vinos rosados de las variedades españolas Cencibel y Tempranillo
mostraron unas características cromáticas y una composición fenólica muy
heterogéneas, dispersándose por toda la representación gráfica de las muestras en el
plano definido por CP-1 y CP-2 (Figura I.7), por lo que sólo pudieron diferenciarse bien
de los vinos de la variedad Cabernet Sauvignon, sobre todo en las variables asociadas
al CP-1 y en el mismo sentido que los vinos de las otras variedades españolas. Sus
centroides estuvieron muy próximos, corroborando que los nombres “Cencibel” y
“Tempranillo” son realmente sinónimos de una misma variedad. En todo caso, podrían
tratarse de clones diferentes (Cencibel, originario de La Mancha; Tempranillo,
originario de La Rioja) pero las diferencias a nivel de clon no suelen manifestarse
apenas en cuanto a la composición química de las uvas y de los vinos resultantes. No
obstante, los vinos rosados de Tempranillo mostraron un ligera tendencia a contener
mayores proporciones de antocianos cumaroilados (variables asociadas al CP-3; Figura
I.8) que los de Cencibel.
Volviendo a la utilidad de los perfiles de antocianos monómeros de la uva
como criterio de diferenciación varietal de los distintos vinos rosados, los resultados
obtenidos sugieren que no son tan concluyentes como han demostrado serlo para
vinos tintos (Hermosín Gutiérrez y García Romero, 2004). Los perfiles de antocianos
(cromatogramas de HPLC; detección a 520 nm) mostrados por los distintos vinos
rosados estuvieron claramente dominados por la malvidina 3-glucósido entre los
antocianos no acilados (Figura I.9) y, con la salvedad de los vinos de Merlot y de
Syrah, las proporciones de antocianos acilados (por ejemplo, los derivados acetilado y
cumaroilado de la malvidina 3-glucósido) fueron bajas. Ello explicaría la escasa
capacidad diferenciadora del origen varietal mostrada por los perfiles de antocianos de
los vinos rosados. Está bien establecido que los perfiles de antocianos son muy útiles
en la diferenciación varietal en el caso de uvas tintas y hay numerosos estudios que
así lo demuestran (Hermosín Gutiérrez y García Romero, 2004; y numerosas
Resultados y Discusión. Capítulo I.
163 Dora Blanco Vega 2013
referencias citadas en este artículo). Cuando el perfil de antocianos se aplica a la
diferenciación varietal de vinos tintos se siguen obteniendo buenos resultados, pero
los perfiles varietales de los vinos muestran diferencias con los obtenidos de las uvas
de la variedad correspondiente, con un aumento generalizado de la proporción de
malvidina 3-glucósido y una disminución importante de las proporciones de antocianos
cumaroilados (Hermosín Gutiérrez y García Romero, 2004); ello se ha explicado en
base a la mayor estabilidad de la malvidina respecto de las otras antocianidinas
(delfinidina, cianidina, petunidina y peonidina) y a la menor solubilidad en el medio
hidroalcohólico que es el vino, de los antocianos cumaroilados (eluyen mucho más
tarde en columnas de HPLC de fase inversa).
Resultados y Discusión. Capítulo I.
164 Dora Blanco Vega 2013
Figura I.9. Perfiles de antocianos monómeros (HPLC, detección a 520 n) característicos de los vinos rosados analizados. Dp, delfinidina; Cy, cianidina; Pt,
Resultados y Discusión. Capítulo I.
165 Dora Blanco Vega 2013
petunidina; Pn, peonidina; Mv, malvidina; glc, glucósido; acglc, acetilglucósido; cmglc, cumaroilglucósido.
Lo que ha podido ocurrir en los vinos rosados es algo similar a lo que sucede
con los vinos tintos en relación a las uvas, pero acentuado por el escaso tiempo de
maceración empleado en la elaboración de vinos rosados y porque en el medio no hay
prácticamente etanol al no haberse iniciado la fermentación alcohólica, o ser sólo
incipiente, en el momento en que se separa los orujos para continuar vinificando en
blanco el mosto coloreado obtenido tras esta corta maceración. Al ser muy corto el
periodo de maceración en la elaboración de vinos rosados, la transferencia de los
antocianos mayoritarios de la uva (en variedades de Vitis vinifera suele ser la
malvidina 3-glucósido) al mosto puede verse favorecida en relación a los antocianos
minoritarios (la cinética de extracción predomina en los momentos iniciales, frente a
los equilibrios de reparto sólido/líquido); además, como el medio es acuoso
prácticamente al 100 %, los antocianos cumaroilados habrán visto disminuida su tasa
de transferencia al mosto. Por tanto, es previsible que en los vinos rosados, cualquiera
que sea la variedad de uva tinta empleada, el antociano mayoritario siempre sea la
malvidina 3-glucósido, y que las diferencias varietales de los perfiles de antocianos de
las uvas se transmitan en muy poca medida a los vinos rosados, resultando éstos
difícilmente diferenciables por sus perfiles de antocianos.
De forma más detallada, un análisis ANOVA de los perfiles de antocianos de los
vinos rosados clasificados por la variedad de uva de elaboración (Tabla I.2) permitió
establecer las siguientes conclusiones:
El antociano mayoritario de todos los perfiles fue la malvidina 3-glucósido
(media del 63.3 %); la proporción de este antociano en los vinos rosados de la
variedad Merlot fue la más baja (51.6 %), mientras que en los de la variedad Bobal
fue la más alta (69.4 %).
Los vinos rosados de Merlot también mostraron las menores proporciones de
delfinidina 3-glucósido (2.2 %) y de petunidina 3-glucósido (4.4 %), mientras que las
mayores proporciones de estos antocianos se encontraron en los vinos de Cencibel,
Tempranillo y Garnacha (4.8-5.1 % y 7.3-8.0 %, respectivamente).
Resultados y Discusión. Capítulo I.
166 Dora Blanco Vega 2013
Los vinos rosados de Merlot y de Syrah fueron los que mayor porcentaje de
antocianos acetilados mostraron (17.7-17.9 % para el derivado mayoritario, el de la
malvidina 3-glucósido; 5.4-9.7 % en el resto de variedades).
Los vinos rosados de variedades españolas de uva fueron los que mayores
proporciones en antocianos cumaroilados tuvieron, en especial los de Garnacha (4.6-
6.1 % para el derivado mayoritario, el de la malvidina 3-glucósido); los vinos de
variedades francesas, con la mitad que los españoles (2.2-3.6 %).
Efecto de la vendimia en la composición fenólica y las características
cromáticas de los vinos rosados de cencibel/tempranillo
La diferenciación que se hace entre vinos rosados de las variedades Cencibel y
Tempranillo no parece tener mucho fundamento en cuanto a que los vinos posean
unas características cromáticas o una composición fenólica muy distintas. No obstante,
realmente puede tratarse de dos diferentes clones de la misma variedad, habida
cuenta que cuando se ha llevado a cabo la última reestructuración de viñedo, un gran
número de nuevas plantaciones de uva tinta lo han sido de plantones de Tempranillo
procedente de viveros riojanos, ya que en nuestra región no había apenas viveristas
que dispusieran de plantones de Cencibel. Puesto que los diferentes clones de una
misma variedad pueden diferir en parámetros como vigor o productividad, algunas
diferencias pueden encontrarse a nivel de los compuestos fenólicos, en concreto los
antocianos, ya que se trata de productos del metabolismo secundario de la vid que
pueden afectarse por parámetros como los anteriormente citados.
Es por ello, que se decidió realizar un estudio más detallado de las muestras
de vino rosado de las variedades Cencibel y Tempranillo (62 muestras). El conjunto de
datos de estas muestras se sometió a un Análisis de Componente Principales y
también a un análisis de comparación de medias de la “t” de Student, para ver si
había diferencias significativas según la denominación varietal (Cencibel o
Tempranillo) o de la vendimia (2006 o 2007) en que fueron elaborados los vinos
rosados.
Resultados y Discusión. Capítulo I.
167 Dora Blanco Vega 2013
Como puede verse en la Figura I.10 (a), los centroides de los grupos de vinos
rosados de Cencibel y de Tempranillo estaban ligeramente separados a lo largo del eje
en el que se representa la CP-1, que tiene que ver fundamentalmente con las diversas
fracciones de antocianos (Tabla I.3). Aparentemente, los vinos rosados de Cencibel
tenían menor contenido en antocianos totales (AT) a la vez que menor contenido en
antocianos monómeros (AM) y decolorables por sulfuroso (ADS), por lo que la
proporción de antocianos no decolorables por sulfuroso (% ANDS) era lógicamente
mayor. No obstante, puede observarse cómo hubo una superposición importante de
muestras de ambos tipos de supuestamente distintas variedades (Cencibel y
Tempranillo).
Figura I.10. Representación de las muestras de vinos rosados de las variedades sinónimas Cencibel y Tempranillo, en el plano formado por los Componentes Principales 1 y 2: a) Muestras marcadas por nombre de variedad (rojo, Cencibel; azul, Tempranillo); b) Muestras marcadas por vendimia (verde 2006; amarillo, 2007).
a) b)a) b)
Resultados y Discusión. Capítulo I.
168 Dora Blanco Vega 2013
Tabla I.2. Resultados del Análisis de Componentes Principales aplicado al conjunto de los vinos rosados de las variedades sinónimas Cencibel y Tempranillo.
CP Variables más correlacionadas Loadings % Varianza Explicada
Acumulada
1 ADS 0.954 13.54
AT 0.942
AM 0.941
% ANDS -0.756
2 Cafeoato de etilo 0.894 24.88
Cumarato de etilo 0.856
Ácido cafeico 0.825
Ácido p-cumárico 0.750
3 Malvidina-3-t-cm-glucósido 0.892 36.00
Petunidina-3-t-cm-glucósido 0.833
Delfinidina-3-t-cm-glucósido 0.789
El test de la “t” de Student corroboró los resultados anteriores (Tabla V.4);
además de en los parámetros anteriormente citados (AT, AM, ADS y %ANDS), otras
diferencias significativas fueron:
Mayor componente roja del color y menor ángulo de tono, para los vinos
rosados de Tempranillo.
Mayores proporciones molares de los derivados acetilados de los 3-glucósidos
de peonidina y malvidina, en los vinos rosados de Tempranillo.
Menor contenido de vitisina A, pero mayor contenido del piranoantocianos
derivado del ácido cafeico (mv-3-glc-4-VC), en los vinos rosados de Cencibel.
Menor contenido de ácido t-cutárico, pero mayor contenido de ácido ferúlico,
en los vinos rosados de Cencibel.
Resultados y Discusión. Capítulo I.
169 Dora Blanco Vega 2013
Tabla I.3. Parámetros de los vinos rosados de Cencibel o de Tempranillo que han resultado significativamente diferenciables (α = 0.05) según el test de la “t” de
Student.
Parámetro Cencibel
(n = 25)
Tempranillo
(n = 37)
h* 41.89 30.60
a* 4.77 5.99
AT (mg/L)1 28.80 39.70
AM (mg/L)1 18.59 32.22
ADS (mg/L)1 24.44 35.54
% ANDS 19.90 13.91
Pn-3-acglc (% molar) 0.58 0.97
Mv-3-acglc (% molar) 5.33 7.39
Vitisina A (mg/L) 0.35 0.51
Mv-3-glc-4-VC (mg/L) 0.15 0.06
Ácido t-cutárico (mg/L) 6.90 8.79
Ácido ferúlico (mg/L) 0.57 0.37
1Como malvidina 3-glucósido. Pn, peonidina; Mv, malvidina; glc, glucósido; ac, acetilglucósido; VC,
vinilcatecol. La vendimia de elaboración tuvo un efecto diferenciador en los vinos rosados
de las variedades Cencibel y Tempranillo, que fueron consideradas la misma variedad
para este análisis estadístico. Los vinos de la vendimia 2007 mostraron en general un
contenido en antocianos mayor (tanto AT como AM y ADS), y una menor proporción
de antocianos no decolorables por sulfuroso (% ANDS). Estas diferencias se evidencian
muy bien en la Figura V.10 (b), y el test de la “t” de Student corroboró estos
resultados, junto con otros adicionales que se comentan a continuación (Tabla V.5), y
que son bastante acordes con la mayor edad de los vinos rosados de la vendimia de
2006 y la evolución que sufren los pigmentos antociánicos con el tiempo:
La componente amarilla del color fue inferior en los vinos de la vendimia 2007.
Las proporciones molares de la petunidina 3-glucósido y su derivado
cumaroilado, y del derivado acetilado de la delfinidina 3-glucósido, fueron superiores
en los vinos de la vendimia 2007.
Los vinos rosados de la vendimia de 2006 tuvieron mayor contenido en ácido
cafeico libre y, consecuentemente mayores contenidos del piranoantociano que deriva
Resultados y Discusión. Capítulo I.
170 Dora Blanco Vega 2013
de este ácido (mv-3-glc-4-VC) y de su éster etílico; también el contenido en el éster
etílico del ácido p-cumárico fue superior en los vinos de la vendimia 2006.
Tabla I.4. Parámetros de los vinos rosados de Cencibel y Tempranillo, clasificados por vendimia (2006 o 2007) que han resultado significativamente diferenciables (α = 0.05) según el test de la “t” de Student.
Parámetro Vendimia 2006
(n = 48)
Vendimia 2007
(n = 14)
b* 3.98 2.60
AT (mg/L)1 29.59 54.80
AM (mg/L)1 19.94 50.01
ADS (mg/L)1 25.06 51.66
% ANDS 19.22 6.38
Pt-3-glc (% molar) 7.77 8.93
Dp-3-acglc (% molar) 0.63 0.80
Pt-3-t-cmglc (% molar) 0.87 1.21
Mv-3-glc-4-VC (mg/L) 0.12 0.02
Ácido cafeico (mg/L) 1.87 1.06
Cafeoato de etilo (mg/L) 0.39 0.18
Cumarato de etilo (mg/L) 0.46 0.22
1Como malvidina 3-glucósido. Pt, petunidina; Dp, delfinidina; Mv, malvidina; glc, glucósido; ac, acetilglucósido; VC, vinilcatecol.
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Resultados y Discusión. Capítulo I.
171 Dora Blanco Vega 2013
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of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in Grenache wines: precursor levels and
evolution during aging. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 4883-4888.
CAPÍTULO II
Resultados y Discusión. Capítulo II.
175 Dora Blanco Vega 2013
CAPITULO II . IDENTIFICATION, CONTENT AND DISTRIBUTION OF
ANTHOCYANINS AND LOW MOLECULAR ANTHOCYANIN-DERIVED PIGMENTS
IN COMMERCIAL RED WINES.
JUSTIFICACIÓN : En este capítulo vamos a realizar un estudio cualitativo y
cuantitativo en una muestra de 286 vinos comerciales, centrándonos en el contenido
en distintos pigmentos, antocianos monómeros, y todos los pigmentos derivados
producidos durante la fermentación y el envejecimiento, como son los
piranoantocianos tipos vitisina, los hidroxifenilpiranoantocianos,
flavanolpiranoantocianos, así como otros productos de condensación directa,
antociano-flavanol y de los aductos formados con puentes de etiliden-antociano-
flavanol.
Los vinos comerciales fueron donados por el Instituto de la Vid y el Vino de
Castilla la Mancha IVICAM y otras muestras se obtuvieron durante la Exposicion
Nacional de Vino (Fenavin 2009). Estas muestras de los años 2008 y 2009 se
congelaron a -20º C hasta su analisis. A partir de aquí contabamos con 199 vinos
jovenes de los años 2007-2009 y 87 vinos con más de tres años, con los que se ha
realizado el studio.
Resultados y Discusión. Capítulo II.
176 Dora Blanco Vega 2013
CAPITULO II . Identification, Content and Distribution of Anthocyanins and Low Molecular Anthocyanin-Derived Pigments in Commercial Red Wines
DORA BLANCO-VEGA†, SERGIO GÓMEZ-ALONSO‡§, AND ISIDRO HERMOSÍN-GUTIÉRREZ†‡*
† Escuela de Ingenieros Agrónomos de Ciudad Real, Universidad de Castilla-La Mancha, Ronda de Calatrava 7, 13071 Ciudad Real, Spain.
‡ Instituto Regional de Investigación Científica Aplicada, Universidad de Castilla-La Mancha, Campus Universitario s/n, 13071 Ciudad Real, Spain.
§ Fundación Parque Científico y Tecnológico de Albacete, Paseo de la Innovación,
1, 02006, Albacete, Spain. *Corresponding author (Tel: +0034926295253; Fax: +0034926295351; E-mail:
isidro.hermosin@uclm.es) ABSTRACT
A set of 286 red wine commercial samples has been analyzed with regard to
their content and distribution of red wine pigments: grape anthocyanins and low
molecular anthocyanin-derived pigments formed during winemaking and aging,
namely, direct and ethylidene-bridged flavanol-anthocyanin adducts, and several types
of pyranoanthocyanins (A- and B-type vitisins, hydroxyphenyl-, dihydroxyphenyl-,
methoxyhydroxyphenyl-, and flavanol-pyranoanthocyanins). Both young (1-2 years
old) and aged wines (up to 10 years old) were analysed and corresponded to both
single-cultivar and blend wines made from seven grape cultivars, four of them being
the widespread Tempranillo, Cabernet Sauvignon, Merlot, and Syrah cultivars. A total
of 90 low molecular red wine pigments were identified and up to 68 of them quantified
in most of the wine samples. The content of the different classes of red wine pigments
accounted for wide ranges of values, because of the diversity of the commercial wines
with regard to grape cultivar and age. Within youngest wines, those of Garnacha
cultivar were prone to account for high hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin
concentrations, being those pigments important contributors to their pool of low
molecular weight pigments. On the other hand, Cencibel and Tempranillo are clones of
the same grape cultivar and the similarity of the results obtained for both young wine
Resultados y Discusión. Capítulo II.
177 Dora Blanco Vega 2013
groups confirmed this narrow relationship. The aging had an effect of making uniform
the concentrations and molar percentages of every type of low molecular weight
pigments, and only slight differences among wine groups were found for B-type vitisins
(highest values for Syrah wines) and 10-hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (highest
values for Merlot wines). For the aging series of Tempranillo wines, the ethylidene-
bridged flavanol-anthocyanin adducts were the most affected by disappearance during
aging. In contrast, hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins increased their contribution in
most of those aged wines.
Keywords: anthocyanin, flavanol-anthocyanin adduct, pyranoanthocyanin, red
wine pigment, vitisin
INTRODUCTION
Red wine colour has been, and still is, a matter of great interest for researchers
and a wide knowledge concerning the chemistry behind red wine colour has been
accumulated in the last three decades (Waterhouse & Kennedy, 2004; Monagas &
Bartolomé, 2009). Grape native anthocyanins are the original red colouring molecules
in red wine but they are very reactive (de Freitas & Mateus, 2006) and their
transformation into anthocyanin-derived pigments begins as soon as they are
extracted to fermenting must. The earliest anthocyanin-derived compounds that were
suggested were polymeric adducts formed by reaction between anthocyanins and
tannins, by both, direct reaction (direct adducts) and mediated by acetaldehyde
(ethylidene-bridged adducts). In addition, other structures of anthocyanin-derived
pigments have been discovered, especially those called pyranoanthocyanins, a class of
red wine pigment formed as early as during alcoholic fermentation and also over the
aging of the wine. Besides the first reported pyranoanthocyanins derived from some
yeast metabolites (vitisin A, from pyruvic acid, and vitisin B, from acetaldehyde), other
reported pyranoanthocyanin-forming reactants include non-phenolic (acetoacetic acid,
diacetyl) and phenolic compounds (hydroxycinnamic acids, 8-vinyl-flavan-3-ols)
(Rentzsch, Schwarz & Winterhalter, 2007a). Finally, some simple pyranoanthocyanins
(A-type vitisins or 10-carboxy-pyranoanthocyanins, and 10-methyl-
pyranoanthocyanins) can be transformed into more complex pyranoanthocyanins
(Mateus, Silva, Rivas-Gonzalo, Santos-Buelga & de Freitas, 2003; Mateus, Oliveira,
Resultados y Discusión. Capítulo II.
178 Dora Blanco Vega 2013
Santos-Buelga, Silva & de Freitas, 2004; Mateus, Oliveira, Pisarra, González-Parmás,
Rivas-Gonzalo, Santos-Buelga, Silva & de Freitas, 2006; Oliveira, de Freitas, Silva &
Mateus, 2007; Oliveira, Azevedo, Silva, Teixeira, Cruz, Mateus & de Freitas, 2010), or
give rise to other kinds of non-red pigments (He, Oliveira, Silva, Mateus & de Freitas,
2010a; He, Silva, Mateus & de Freitas, 2011).
Therefore, the actual colour shown by a red wine is the result of the summation
of many kinds of anthocyanins and anthocyanin-related pigments with different colour
properties (Rentzsch et al., 2007a). In a previous paper (Rentzsch, Schwarz,
Winterhalter, Blanco-Vega & Hermosín-Gutiérrez, 2010) a survey of the content of
vitisin A and hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in Tempranillo wines revealed a great
variability in pyranoanthocyanin concentrations that were affected not only by the wine
age, but also by the addition of fresh young red wine just before bottling of aged
wines. However, there is scarce data about the complete contribution of each kind of
red wine pigment to its colour, mainly due to the difficulty in analyzing such a diversity
of chemical structures. The very detailed description of red wine pigments seems to be
still an analytical challenge as they involves at least the previous fractionation of
different kinds of pigments and the use of HPLC-MS/MS for the accurate analysis of
separated fractions (Alcalde-Eon, Escribano-Bailón, Santos-Buelga & Rivas-Gonzalo,
2004; Alcalde-Eon, Escribano-Bailón, Santos-Buelga & Rivas-Gonzalo, 2006). In
addition, HPLC analysis of red wine pigments based on the use of C-18 and other
reversed-phase stationary phases only offer good separations for anthocyanins and
low molecular anthocyanin-derived pigments, whereas the polymeric pigments appear
as an unresolved broad peak (a hump) and they are usually estimated by non-specific
spectrophotometric methods. In this context, the recent report on the
chromatographic and spectral properties for complete series of the expected vitisin-
type and hydroxyphenyl-type pyranoanthocyanins could help in the identification and
quantification of such kind of low molecular anthocyanin-derived red wine pigments
(Blanco-Vega, López-Bellido, Alía-Robledo & Hermosín-Gutiérrez, 2011).
The aim of our work has been the analysis of a wide set of Spanish red wines by
HPLC-DAD-ESI-MS/MS with regard to identification and quantification of different red
pigments, including native grape anthocyanins and low molecular anthocyanin-derived
pigments formed during winemaking and aging, namely, several types of
pyranoanthocyanins (A- and B-type vitisins, hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins, and
Resultados y Discusión. Capítulo II.
179 Dora Blanco Vega 2013
flavanol-pyranoanthocyanins), and both direct and ethylidene-bridged flavanol-
anthocyanin adducts. The selected samples were both young (1-2 years old) and aged
wines (up to 10 years old) and corresponded to both single-cultivar and multi-cultivar
wines made from ten grape cultivars, four of them being the widespread Tempranillo,
Cabernet Sauvignon, Merlot, and Syrah cultivars. The data were processed in order to
ascertain the content and distribution of such pigments in commercial red wines
according to grape cultivar and age.
MATERIALS AND METHODS
Chemicals
All solvents were of HPLC supergradient quality and water was of MilliQ® quality.
Malvidin 3-glucoside (PhytoLab, Vestenbergsgreuth, Germany) was used as standard
for quantification of anthocyanins and flavanol-anthocyanin adducts. Some previously
obtained standards of pyranoanthocyanins were available for quantification (Rentzsch
et al., 2010): vitisin A (10-carboxy-pyranomalvidin 3-glucoside) and vitisin B
(pyranomalvidin 3-glucoside) were used for quantification of A- and B-type vitisins,
respectively; pinotin A (10-(3”,4”-dihydroxyphenyl)-pyranomalvidin 3-glucoside, or
10-DHP-pymv-3-glc) was used for 10-hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins derived
from both caffeic and ferulic acids (10-DHP- and 10-MHP-pyranoanthocyanins,
respectively); and 10-(4”-hydroxyphenyl)-pyranomalvidin 3-glucoside (10-HP-pymv-3-
glc) was used for quantification of 10-HP-pyranoanthocyanins derivatives and also for
10-flavanol-pyranoanthocyanins.
Red Wine Samples
Commercial red wine samples (n = 286) were all from Controlled Origin
Appellations and were supply by the Institute for Vine and Wine of Castilla-La Mancha
(IVICAM, Castilla-La Mancha Regional Government), and also collected from the
Spanish National Wine Exposition (FENAVIN, 2009). The wines were collected during
the years 2008 and 2009, and immediately frozen at -20 ºC until analysis. Samples
from years 2006 and 2007, collected in 2008, and samples from years 2007 and 2008,
collected in 2009, were considered as young wines (n =199). Aged wine samples were
those 3 or more years old (n = 87, although only 84 samples were considered for
ANOVA). The analysis of all the samples was developed between October 2009 and
March 2010.
Resultados y Discusión. Capítulo II.
180 Dora Blanco Vega 2013
Analysis of Low Molecular Red Wine Pigments by HPLC-DAD-ESI-MS/MS
HPLC separation and identification of anthocyanins and low molecular
anthocyanin-derived red wine pigments were performed on an Agilent 1100 Series
system (Agilent, Germany), equipped with DAD (G1315B) and LC/MSD Trap VL
(G2445C VL) electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS/MS) system, and
coupled to an Agilent Chemstation (version B.01.03) data-processing station. The
mass spectra data were processed with the Agilent LC/MS Trap software (version 5.3).
The wine samples were injected (50 μL) after filtration (0.20 nm, polyester membrane,
Chromafil PET 20/25, Macherey-Nagel, Düren, Germany) on a reversed-phase column
Zorbax Eclipse XDB-C18 (4.6 x 250 mm; 5 nm particle; Agilent, Germany),
thermostated at 40 ºC. We used the same chromatographic system and conditions
previously described (15). Briefly, the solvents were water/acetonitrile/formic acid
(87:3:10, v/v/v, solvent A; 40:50:10, v/v/v, solvent B), and the flow rate was 0.63
mL/min. The linear gradient for solvent B was: zero min, 6%; 15 min, 30%; 30 min,
50%; 35 min, 60%; 38 min, 60%; 46 min, 6%. For identification, ESI-MS/MS was
used employing the following parameters: positive ion mode; dry gas, N2, 11 mL/min;
drying temperature, 350 ºC; nebulizer, 65 psi; capillary, -2500 V; capillary exit offset,
70 V; skimmer 1, 20 V; skimmer 2, 6 V; scan range, 50-1200 m/z. Identification was
mainly based on MS/MS data but also on the comparison of chromatographic and
spectral (UV-vis and MS/MS) data with those previously reported in the same
chromatographic system (Rentzsch et al., 2010; Blanco-Vega et al., 2011; Cejudo-
Bastante, Hermosín-Gutiérrez & Pérez-Coello, 2011a) and also obtained with authentic
standards. Quantification was performed using DAD-chromatograms extracted at 520
nm and calibration curves of the above mentioned standards; in the case of co-eluting
compounds, extracted ion chromatograms at m/z values of their corresponding
molecular ions were obtained for helping quantification.
Statistical Data Analysis
The total content and the distribution of each kind of red wine pigment
(anthocyanins, pyranoanthocyanins, and anthocyanin-flavanol adducts) were subjected
to ANOVA test (Student-Newman-Keuls test, α = 0.05; SPSS version 17.0, SPSS Inc.)
looking for significant differences. On one hand, the young and aged red wine samples
were separately compared after grouping by grape cultivar (Cabernet Sauvignon,
Cencibel, Garnacha, Merlot, Petit Verdot, Syrah, Tempranillo, and blends of Cabernet
Resultados y Discusión. Capítulo II.
181 Dora Blanco Vega 2013
Sauvignon and Tempranillo). On the other hand, wines of the grape cultivar
Tempranillo were also compared with regard to their age (ANOVA, Student-Newman-
Keuls test, α = 0.05).
RESULTS AND DISCUSSION
Identification of Low Molecular Weight Red Wine Pigments
Native grape anthocyanins (anthocyanidin 3-glucosides, acylated or not)
together with 6 types of anthocyanin-derived red pigments formed in wine were
identified. The latter anthocyanin-derived pigments belonged to the main low
molecular red wine pigment groups known as flavanol-anthocyanin adducts and
pyranoanthocyanins.
Resultados y Discusión. Capítulo II.
182 Dora Blanco Vega 2013
(A) anthocyanins (B) vitisin-type pyranoanthocyanins
O+HO
O-(acyl)glucose
OH
R1
O
R3
R2
O+HO
O-(acyl)glucose
OH
R1
O
R2
OH
R3
O+HO
O-(acyl)glucose
OH
R1
OH
R2
(C) hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins
O+HO
O-glucose
OH
R1
OH
R2
OHO
OH
OH
OH
OH
(D) (4→8)-f lavanol-anthocyanin adducts
O+HO
O-(acyl)glucose
OH
R1
OH
R2
O HO
OH
OH
OH
OH
HC-CH3
(E) 8,8-ethylidene f lavanol-anthocyanin adducts
(F) 10-f lavanol-pyranoanthocyanins
O+HO
O-(acyl)glucose
OH
R1
O
R2
OHO
OH
OH
OH
OH
R3
Figure II. 1. Structures of anthocyanins and anthocyanin-derived low molecular red wine pigments found in analysed wine samples: A) grape native anthocyanins; B) vitisin-type anthocyanins (R3 = COOH, A-type vitisins or 10-carboxy-
Resultados y Discusión. Capítulo II.
183 Dora Blanco Vega 2013
pyranoanthocyanins; R3 = H, B-type vitisins or simply pyranoanthocyanins); C) hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (R3 = H, 10-(4’’’-hydroxyphenyl)-pyranoanthocyanins or 10-HP-pyranoanthocyanins; R3 = OH, 10-(3’’’,4’’’-dihydroxyphenyl-pyranoanthocyanins or 10-DHP-pyranoanthocyanins; R3 = OCH3, 10-(3’’’-methoxy-4’’’-hydroxy)phenyl-pyranoanthocyanins or 10-MHP-
pyranoanthocyanins); D) (4 →8)-flavanol-anthocyanin adducts (direct adducts); E)
8,8-ethylidene-flavanol-anthocyanin adducts (acetaldehyde-mediated or ethylidene-bridged adducts); F) flavanol-pyranoanthocyanins (R = H, from monomeric flavanols; R = 8-flavanyl, from B-type procyanidin dimers). For all structures: R1 and R2 = H, OH, OCH3; acyl = acetyl, p-coumaroyl, caffeoyl
Specifically, direct adducts formed by linkage between the 4 position of one
monomeric flavanol unit and the 8 position of an anthocyanin unit ((4 →8)-flavanol-
anthocyanin adducts), as well as the acetaldehyde-mediated adducts formed by
linkage of the 8 positions of both flavanol and anthocyanin units (8,8-ethylidene-
flavanol-anthocyanin adducts) were found.
With regard to pyranoanthocyanins, the following types were identified: A-type
vitisins (10-caboxy-pyranoanthocyanins) derived from the reaction between
anthocyanins and pyruvic acid produced by yeast during alcoholic fermentation; B-type
vitisins (pyranoanthocyanins, in a strict sense) formed by reaction of anthocyanins
with acetaldehyde, produced by both yeast metabolism and over aging in the presence
of oxygen (e.g., oak barrel aging but also microoxygenation aging); 10-
hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins produced by reaction of anthocyanins with
hydroxycinnamic acids or their decarboxylation products (4-vinyl-hydroxyphenols);
and 10-flavanol-pyranoanthocyanins, very likely formed by reaction of 8-vinyl-
flavanols (the breaking products of polymerized flavanols mediated by acetaldehyde)
with anthocyanins. The identification of all the above mentioned types of low molecular
red wine pigments was mainly based on their UV-vis and MS spectral data (Table 2),
that matched with those obtained from authentic standards or previously reported
data (Rivas-Gonzalo, Bravo-Haro & Santos-Buelga, 1995; Francia-Aricha, Guerra,
Rivas-Gonzalo & Santos-Buelga, 1997; Es-Safi, Fulcrand, Cheynier & Moutounet,
1999; Salas, Atasanova, Poncet-Legrand, Meudec, Mazauric & Cheynier, 2004;
Alcalde-Eon et al., 2006; He, Santos-Buelga, Mateus & de Freitas, 2006; Cruz,
Teixeira, Silva, Mateus, Borges & de Freitas, 2008; He, Carvalho, Mateus & de Freitas,
2010b; Nixdorf & Hermosín-Gutiérrez, 2010; Cejudo-Bastante et al., 2011a; Cejudo-
Bastante, Hermosín-Gutiérrez & Pérez-Coello, 2011b; Blanco-Vega et al., 2011).
Resultados y Discusión. Capítulo II.
184 Dora Blanco Vega 2013
Table II. 2. Concentrations (mg/L) of red wine pigments of low molecular weight (monomeric anthocyanins and anthocyanin-derived pigments) found in the whole set of studied samples of commercial wines (n = 286). Results are given as value ranges, mean values (MV), and standard deviations (SD) corresponding to the summation of all pigments of the same type. Wine samples are grouped according to grape variety: CBSV, cabernet sauvignon; CEN, cencibel; GAR, garnacha; MER, merlot; PV, petit verdot; SYR, syrah; TEMP, tempranillo; TEMP/CBSV, blends of tempranillo and cabernet sauvignon. Different letters after MV in the same row mean significant differences according to ANOVA (Student-Newman-Keuls test; α = 0.05).
Resultados y Discusión. Capítulo II.
185 Dora Blanco Vega 2013
Assignation of well-known anthocyanins, vitisin-type pyranoanthocyanins and
hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins did not represent a challenge.
A total of 68 low molecular red wine pigments were identified and quantified in
most of the wine samples, although not all compounds were detected in each wine
sample. Thus, young and aged red wine chromatographic profiles corresponding to red
pigments (DAD-chromatograms obtained at 520 nm) showed remarkable differences
(Figure II.2). In young red wines, the main pigments were the native grape
anthocyanins and the occurrence of vitisin-type pyranoanthocyanins was easily
detected, especially vitisin A and their derivatives; in addition, some direct and
acetaldehyde-mediated flavanol-anthocyanin adducts were found.
Resultados y Discusión. Capítulo II.
186 Dora Blanco Vega 2013
mAU
0
250
500
750
1000
1250
min5 10 15 20 25 30 35 40
A) Syrah, 1 year old
1
2
34
5
6 8 9
10
1112
13 14
1615
717
26
18
36 38 39
B) Cabernet Sauvignon, 3 years oldmAU
0
50
100
150
200
min5 10 15 20 25 30 35 40
1 34
68
9
10
14 16
2618
36 38 39
5
37
2524
21
40
19
4120
43
45
29 30
35
31
32 33 34
47
46
4849 50
D) Merlot,3 years oldmAU
0
50
100
150
200
250
min5 10 15 20 25 30 35 40
1
34 10
16
26
18
36
3839
5
37
25
24 2140
19
41
20
43
45
29 30
35
31
32 33 34
47
46
4849 50
28
65 66
55 56
67
27
68
42
44
51 52
5453
57 58
6059
61 62
6463
22
23
C) Garnacha, 3 years oldmAU
0
20
40
60
80
100
120
min5 10 15 20 25 30 35 40
1
3
4
10
16
26
18
36
38
39
5
37
25
2421
40
19 41
20 43
45
29 30
35
31
32 33 34
47
46
48
49 5028
65 66
55 56
44
61
52
57
27
23
Figure II 2. Chromatographic profiles of anthocyanins and anthocyanin-derived pigments (DAD, detection at 520 nm) of different red wines: A) young Syrah wine; B) three-years old Cabernet Sauvignon wine; C) three-years old Garnacha wine; D) three-years old Merlot wine. Peak numbering (Table 2): 1-17, anthocyanins; 18-25, A-type vitisins; 26-28, B-type vitisins; 29-35, hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins; 36-37, direct flavanol-anthocyanin adducts; 38-44, ethylidene-bridged flavanol-anthocyanin adducts; 45-68, flavanol-pyranoanthocyanins.
In aged wines, the relevance of anthocyanins was decreased in very variable
proportions and an increasing formation of acetaldehyde-mediated flavanol adducts
was observed, in addition, the loss of linearity of the base line accompanied the
decrease of anthocyanins, thus appearing a broad chromatographic hump occupying
the most of running time that usually is attributed to polymeric pigments.
Resultados y Discusión. Capítulo II.
187 Dora Blanco Vega 2013
mAU
0
250
500
750
1000
1250
min5 10 15 20 25 30 35 40
A) Syrah, 1 year old
1
2
34
5
6 8 9
10
1112
13 14
1615
717
26
18
36 38 39
B) Cabernet Sauvignon, 3 years oldmAU
0
50
100
150
200
min5 10 15 20 25 30 35 40
1 34
68
9
10
14 16
2618
36 38 39
5
37
2524
21
40
19
4120
43
45
29 30
35
31
32 33 34
47
46
4849 50
D) Merlot,3 years oldmAU
0
50
100
150
200
250
min5 10 15 20 25 30 35 40
1
34 10
16
26
18
36
3839
5
37
25
24 2140
19
41
20
43
45
29 30
35
31
32 33 34
47
46
4849 50
28
65 66
55 56
67
27
68
42
44
51 52
5453
57 58
6059
61 62
6463
22
23
C) Garnacha, 3 years oldmAU
0
20
40
60
80
100
120
min5 10 15 20 25 30 35 40
1
3
4
10
16
26
18
36
38
39
5
37
25
2421
40
19 41
20 43
45
29 30
35
31
32 33 34
47
46
48
49 5028
65 66
55 56
44
61
52
57
27
23
No doubt, the most remarkable feature shown by many of the aged wines was
the almost complete disappearance of anthocyanins and the increasing detection of
hydroxyphenyl- and flavanol-pyranoanthocyanins, giving rise to a high number of
chromatographic peaks over the aforementioned chromatographic hump (peaks 29-35
and 45-68, respectively). Unfortunately, some of the anthocyanin-derived pigments
partially co-eluted or were very minor, thus a complete identification and quantification
really need time-consuming previous separation steps (Alcalde-Eon et al., 2006). An
exhaustive list of tentatively identified red wine pigments comprised up to 90
compounds and is given Table 1.
Resultados y Discusión. Capítulo II.
188 Dora Blanco Vega 2013
Table II. 1.Chromatographic (peak number as in Figure 2; retention times) and mass spectral (MS, molecular ion; MS/MS, fragment ions) data corresponding to the low molecular red pigments identified in commercial red wine samples.
Resultados y Discusión. Capítulo II.
189 Dora Blanco Vega 2013
Resultados y Discusión. Capítulo II.
190 Dora Blanco Vega 2013
Direct adducts between flavanol monomers and malvidin 3-glucoside were
detected at m/z 781 (Table 2). The MS2 fragmentation pattern showed that loss of
glucose was the main fragmentation (m/z 619), together with less probable
fragmentations: the loss of water (m/z 601); the Retro-Diels-Alder fission of flavanol
unit (RDA, m/z 467); the Heterocycle-Ring-Fission (HRF, m/z 493); and a fragment
ion at m/z 373 that has been previously reported but its origin still remains unknown
(Salas et al., 2004; Alcalde-Eon et al., 2006). According to previous data (Salas et al.,
2004), the occurrence of the HRF fragment ion confirmed that adduct linkage involved
the C-4 position of the flavanol unit and the C-8 position of the anthocyanin unit and
that tentative assignation of peaks 1 and 2 could be (4 →8)-(–)-epicatechin-malvidin 3-
glucoside and (4 →8)-(+)-catechin-malvidin 3-glucoside, respectively.
In the case of acetaldehyde-mediated adducts between flavanols and
anthocyanins, the four possible isomers of 8,8-ethylidene-(epi)catechin-malvidin
glucoside (m/z 809) were detected, together with one acetylated and two p-
coumaroylated derivatives (m/z 851 and 955, respectively). For non-acylated
derivatives, the loos of the flavanol unit and subsequent loss of the glucose give rise to
the most intense signals in MS2 experiments (m/z 357), whereas for acylated
derivatives the most intense signal corresponded to the loss of only the flavanol unit
(m/z at 561 and 665, respectively) and subsequent loss of acylated glucose was
relatively handicapped (signal at m/z 357 was the second most intense). The
aforementioned data were in agreement with previous works (Rivas-Gonzalo et al.,
1995; Alcalde-Eon et al., 2006; Cruz et al., 2008; Cejudo-Bastante et al., 2011a and
Resultados y Discusión. Capítulo II.
191 Dora Blanco Vega 2013
2011b). Trace of acetaldehyde-mediated flavanol-anthocyanin adducts involving
flavanol dimers (B-type procyanidins) and/or non-malvidin based anthocyanins were
also observed, but their occurrence was mainly punctual and we decided not to
consider them in this study. Similarly, we did not quantify other series of ethylidene-
bridged flavanol-anthocyanin adducts derived from anthocyanidins other than
malvidin, which were found in some wine samples but they accounted as very minor
and co-eluting compounds.
27.6
29.6 30.731.3
31.8
19.520.020.818.6
A) UV Chromatogram, 520 nm
27.631.3B) EIC 805 +All MS
29.6
31.8C) EIC 847 +All MS
30.7
31.8
D) EIC 951 +All MS
18.6
19.5
F) EIC 1135 +All MS20.020.8
E) EIC 1093 +All MS
50
100
150
200
Intens.
mAU
0
1
2
3
4
x106
0.5
1.0
1.5
x106
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0x106
2
4
6
x105
0
1
2
3x105
16 18 20 22 24 26 28 30 32 34Time [min]
10-(epi)catechin-pymv-3-glc
10-(epi)catechin-pymv-3-acglc
10-(epi)catechin-pymv-3-cmglc
10-(B-type-procyanidin-dimer)-pymv-3-glc
10-(B-type-procyanidin-dimer)-pymv-3-acglc
Figure II . 3. Expanded chromatograms of the elution zone corresponding to 10-flavanol-pyranoanthocyanins of aged Merlot wine: A) DAD-chromatogram (detection at 520 nm); Extracted Ion Chromatograms (EIC) at the m/z values corresponding to: B) 10-
Resultados y Discusión. Capítulo II.
192 Dora Blanco Vega 2013
(epi)catechin-pymv-3-glc; C) 10-(epi)catechin-pymv-3-acglc; D) 10-(epi)catechin-pymv-3-cmglc; E) 10-(B-type-procyanidin-dimer)-pymv-3-glc; F) 10-(B-type-procyanidin-dimer)-pymv-3-acglc. Abbreviations: (epi)catechin, both (–)-epicatechin or (+)-catechin; pymv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6’’-acety-glucoside; cmglc, 6’’-p-coumaroyl-glucoside.
With regard to flavanol-pyranoanthocyanins, there is very little scientific data
dealing with the occurrence and concentration of this type of anthocyanin-derived
pigments in wine samples (Alcalde-Eon et al., 2006). We were able to tentatively
identify 21 compounds of this type, comprising the following compounds (Figure 3):
the complete series of derivatives involving (+)-catechin and (–)-epicatechin with the
non-acylated, acetylated, and p-coumaroylated derivatives of three anthocyanidins
(malvidin, peonidin, and petunidin); the partial series formed from (+)-catechin and (–
)-epicatechin with delphinidin 3-glucoside; and four derivatives involving flavanol
dimers (B-type procyanidins) and non-acylated and acetylated malvidin.
The MS2 spectra of 10-flavanol-pyranthocyanins (Figure 4) from flavanol
monomers showed as main signal that coming from the loss of the sugar moiety (m/z
643 in the case of malvidin-based derivatives), together with the less probable RDA
fragment ions from the flavanol residue (direct fragmentation form molecular ions:
m/z 653, 695 and 799 for non-acylated, acetylated and p-coumaroylated malvidin-
derivatives, respectively; subsequent fragmentation after sugar loss: m/z at common
value of 491) in agreement with reported data (He et al., 2006; Cruz et al., 2008) that
also helped in the assignation of the elution order as (–)-epicatechin and (+)-catechin
derivatives. The UV-vis data of these compounds (Figure 5) gave additional evidence
to the suggested structure: firstly, their respective UV-vis resembled very much those
of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (Blanco-Vega et al., 2011), because they
shared very similar chromophores; secondly, their maximum absorbance wavelength
matched with reported data for non-acylated derivatives (He et al., 2010b) and
showed the expected coincidence in the case of non-acylated and acetylated
derivatives; finally, p-coumaroylated derivatives showed an expected additional
absorbance band attributable to the p-coumaroyl residue around 314 nm.
Resultados y Discusión. Capítulo II.
193 Dora Blanco Vega 2013
491.2
643.2
653.2
+MS2(805.7), 31.3 min
491.2
643.2
695.2
+MS2(847.8), 29.6 min
491.2
643.1
799.2
+MS2(951.8), 30.7 min
641.2803.2
931.3+MS2(1093.8), 18.6 min
641.2
845.2
931.2+MS2(1135.8), 20.0 min
2
4
x106
Intens.
0.5
1.0
1.5
2.0
x106
0.5
1.0
1.5
x106
1
2
3
4
5x105
0.0
0.5
1.0
1.5
x105
200 400 600 800 1000 m/z
-162 (glc)-152 (RDA)
-162 (glc) -152 (RDA)
-204 (acglc)
-204 (acglc) -152 (RDA)
-308 (cmglc)
-308 (cmglc) -152 (RDA)
-162 (glc)
-162 (glc) -290 (terminal flavanol)
-290 (terminal flavanol)
-152 (RDA)
-152 (RDA)
-204 (acglc)
-290 (terminal flavanol)
-290 (terminal flavanol)
-204 (acglc)
A)
B)
C)
D)
E)
Figure II. 4. MS/MS fragmentation patterns of: A) 10-epicatechin-pymv-3-glc; B) 10-catechin-pymv-3-acglc; C) 10-catechin-pymv-3-cmglc; D) 10-flavanol-dimer-pymv-3-glc; E) 10-flavanol-dimer-pymv-3-acglc. Abbreviations: pymv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6’’-acety-lglucoside; cmglc, 6’’-p-coumaroyl-glucoside.
Resultados y Discusión. Capítulo II.
194 Dora Blanco Vega 2013
nm250 300 350 400 450 500 550
Norm.
0
10
20
30
40
50
C) 10-catechin-pymv-3cmglc (lmax = 507 nm)
262
285 295314
400
470
A) 10-epicatechin-pymv-3glc (lmax = 506 nm)
B) 10-catechin-pymv-3acglc (lmax = 506 nm)
Figure II. 5. On-line DAD spectra of : A) 10-epicatechin-pymv-3-glc; B) 10-catechin-pymv-3-acglc; C) 10-catechin-pymv-3-cmglc. Visible maximum absorbance is indicated for each compound. Abbreviations: pymv,
pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6’’-acety-lglucoside; cmglc, 6’’-p-coumaroyl-glucoside.
In contrast, the flavanol-pyranoanthocyanin derivatives involving B-type
procyanidins did not show the RDA fragment ions but those coming from the loss of
the terminal flavanol unit (loss of 290 amu). The latter compounds were firstly
proposed on the basis of their molecular ions (Francia-Aricha et al., 1997) and further
confirmed by MS2 data (He et al., 2006) that matched with our results. Together with
previously reported fragment ions corresponding to the independent losses of the
sugar and the terminal flavanol units (m/z 931 and 803 for non-acylated derivatives;
m/z 931 and 845 for acetylated derivatives) we also observed the signal corresponding
to the combined losses of both units (common fragment ion at m/z 641).
Content and Distribution of Different Classes of Red Wine Pigments
The content of the nine different classes of red wine pigments considered in this
work accounted for wide ranges of values (Table 2), because of the diversity of the
selected set of commercial wines with regard to grape cultivar and age. It was usual to
find wine samples where low molecular weight anthocyanin-derived pigments were
Resultados y Discusión. Capítulo II.
195 Dora Blanco Vega 2013
very minor and even some of them were not detected. The average values (range and
mean values ± standard deviation) found for the whole samples set (n = 286) were:
native grape monomeric anthocyanins, 0.3-505.0 and 93.3 ± 80.2 mg/L, as malvidin
3-glucoside equivalents (mv-3-glc); flavanol-anthocyanin direct adducts, 0.00-3.19
and 1.24 ± 0.59 mg/L, as mv-3-glc; flavanol-anthocyanin ethylidene-bridged adducts,
0.00-8.70 and 1.14 ± 1.20 mg/L, as mv-3-glc; A-type vitisins, 0.71-49.16 and 7.84 ±
6.25 mg/L, as vitisin A; B-type vitisins, 0.00-16.44 and 1.31 ± 1.87 mg/L, as vitisin B;
10-DHP-pyranoanthocyanins, 0.00-21.24 and 1.54 ± 2.58 mg/L, as 10-(3’,4’-
dihydroxyphenyl-pyranomalvidin-3-glucoside (10-DHP-pymv-3-glc); 10-HP-
pyranoanthocyanins, 0.00-6.82 and 0.71 ± 0.89 mg/L, as 10-(4´-hydroxyphenyl)-
pyranomalvidin-3-glucoside (10-HP-pymv-3-glc); 10-MHP-pyranoanthocyanins, 0.00-
1.27 and 0.11 ± 0.24 mg/L, as 10-DHP-pymv-3-glc; and 10-flavanol-
pyranoanthocyanins, 0.00-12.36 and 0.74 ± 1.45 mg/L, as 10-HP-pymv-3-glc.
Resultados y Discusión. Capítulo II.
196 Dora Blanco Vega 2013
Tabla II. 3. Concentrations (mg/L) of red wine pigments of low molecular weight (monomeric anthocyanins and anthocyanin-derived pigments) found in the set of studied samples ofyoung commercial wines (1-2 years old; n = 199). Results are given as value ranges, mean values (MV), and standard deviations (SD) corresponding to the summation of all pigments of the same type. Wine samples are grouped according to grape variety: CBSV, cabernet sauvignon; CEN, cencibel; GAR, garnacha; MER, merlot; PV, petit verdot; SYR, syrah; TEMP, tempranillo. Different letters after MV in the same row mean significant differences according to ANOVA (Student-Newman-Keuls test; α = 0.05).
Resultados y Discusión. Capítulo II.
197 Dora Blanco Vega 2013
With regard to the youngest wines (1 and 2 years old), the average content of
monomeric anthocyanins reached 122.6 ± 78.7 mg/L (as mv-3-glc). In spite of the
great variability shown by the content of monomeric anthocyanins, some significant
differences were found according to the grape variety (Table 3): the lowest content
was for Garnacha wines (71.2 ± 56.4 mg/L) and the highest one for Petit Verdot wines
(160.8 ± 94.1 mg/L). Concentrations of different pigments were re-calculated as
μmol/L for comparison.
Resultados y Discusión. Capítulo II.
198 Dora Blanco Vega 2013
0%
20%
40%
60%
80%
100%
mo
lar
pe
rce
nta
ge
10-flavanol-pyant
10-MHP-pyant
10-HP-pyant
10-DHP-pyant
B-type vitisins
A-type vitisins
ethylidene adducts
direct adducts
0
50
100
150
200
250
300
350
con
cen
trat
ion
(mm
ol/
L)
monomeric anthocyanins
anthocyanin-derived pigments
A)
B)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
mo
lar
pe
rce
nta
ge
10-flavanol-pyant
10-MHP-pyant
10-HP-pyant
10-DHP-pyant
B-type vitisins
A-type vitisins
ethylidene adducts
direct adducts
0
50
100
150
200
250
300
350
con
cen
trat
ion
(mm
ol/
L)monomeric anthocyanins
anthocyanin-derived pigments
A)
B)
FigureII. 6. Low molecular weight pigment content of 1 and 2 years old red wines grouped by grape cultivar: A) concentrations (μmol/L) of monomeric anthocyanins
and anthocyanin-derived pigments; B) molar percentage of different types of anthocyanin-derived pigments. Abbreviations: CBSV, Cabernet Sauvignon; CEN, Cencibel; GAR, Garnacha; MER, Merlot; PV, Petit Verdot; SYR, Syrah; TEMP, Tempranillo; pyant, pyranoanthocyanins.
Resultados y Discusión. Capítulo II.
199 Dora Blanco Vega 2013
On this molar basis (Figure 6A), monomeric anthocyanins contributed to low
molecular red pigments with the significantly lowest percentage in Garnacha wines
whereas the significantly highest percentages were reached in Tempranillo wines (77.5
and 90.3 %, respectively). The other single-variety wines showed intermediate
pigment distribution, although Merlot (79.1 % of monomeric anthocyanins) and
Cencibel (88.5 % of monomeric anthocyanins) wines were closer to Garnacha and
Tempranillo wines, respectively. A detailed analysis of the content and contribution of
each type of anthocyanin-derived pigments (Table 3 and Figure 6B) revealed the
following significant findings: direct flavanol-anthocyanin adducts accounted for the
highest concentrations and molar percentages in Cencibel wines, whereas the lowest
concentrations were found in Garnacha and Petit Verdot wines, the latter also showing
the lowest molar percentage of that pigment type; ethylidene-bridged flavanol-
anthocyanin adducts reached the highest concentration and molar percentage in Petit
Verdot and, although some differences were evidenced in the concentrations found in
the other wines (Cencibel and Garnacha wines accounting for the lowest contents), no
significant differences were shown by their respective molar percentages; the contents
of A-type vitisins were not significantly different among wines grouped by grape
cultivar, however, molar percentages of these pigments were lower in Garnacha wines
and higher in Cencibel, Merlot, Syrah and Tempranillo wines; nor concentrations nor
molar percentages of B-type vitisins significantly differed among single-cultivar wines;
with regard to hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins, Garnacha wines stood out by the
highest concentration and molar percentage, especially for the major 10-DHP-
pyranoanthocyanins and, in a lesser extent, 10-HP-pyranoanthocyanins; finally, 10-
flavanol-pyranoanthocyanins accounted for the highest concentrations in the French
varieties Cabernet Sauvignon, Merlot, Petit Verdot, and Syrah wines, the highest molar
percentages being found in Merlot wines.
All these results suggested, in one hand, that Garnacha wines are prone to
account for high hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin concentrations, being those
pigments important contributors to low molecular weight pigments in the young wines
from this grape cultivar. This conclusion is in agreement with the fact that Garnacha is
one of the grape cultivars richer in hydroxycinnamic acid derivatives, which are the
precursor reactants to form hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (Rentzsch, Schwarz,
Winterhalter & Hermosín-Gutiérrez, 2007b). On the other hand, Cencibel and
Resultados y Discusión. Capítulo II.
200 Dora Blanco Vega 2013
Tempranillo are clones of the same grape cultivar and the similarity of the results
obtained for both wine groups confirmed this narrow relationship.
Aged wines (3 or more years old) accounted for expected low concentrations of
monomeric anthocyanins (Table 4; average of 25.5 ± 22.9 mg/L, as mv-3-glc). In
addition, the molar percentages of these native grape red wine pigments decreased up
to 56.6-82.0 % without significant differences among diverse grape cultivars (Figure
7A). The aging had an effect of making uniform the concentrations and molar
percentages of every type of low molecular weight pigments, and only slight
differences among wine groups (Table 4 and Figure 7B) were found for B-type vitisins
(highest values for Syrah wines) and 10-HP-pyranoanthocyanins (highest values for
Merlot wines). As for youngest wines, aged wines from Cencibel and Tempranillo
presented quite similar content and distribution of red pigments.
In the case of Tempranillo wines, the significant decrease of monomeric
anthocyanins in aged wines was accompanied by the parallel decrease in the
concentration of total low molecular weight pigments and the increase of molar
percentage of anthocyanin-derived pigments within them, reaching an average molar
percentage of 55 % of the total pigment content in wines aged for seven or more
years.
Resultados y Discusión. Capítulo II.
201 Dora Blanco Vega 2013
Table II. 4. Concentrations (mg/L) of red wine pigments of low molecular weight (monomeric anthocyanins and anthocyanin-derived pigments) found in the set of studied samples ofaged commercial wines (2 or more years old; n = 84). Results are given as value ranges, mean values (MV), and standard deviations (SD)corresponding to the summation of all pigments of the same type. Wine samples are grouped according to grape variety: CBSV, cabernet sauvignon; CEN, cencibel; MER, merlot; SYR, syrah; TEMP, tempranillo. Different letters after MV in the same row mean significant differences according to ANOVA (Student-Newman-Keuls test;α= 0.05).
Resultados y Discusión. Capítulo II.
202 Dora Blanco Vega 2013
Resultados y Discusión. Capítulo II.
203 Dora Blanco Vega 2013
0%
20%
40%
60%
80%
100%
mo
lar
pe
rce
nta
ge
10-flavanol-pyant
10-MHP-pyant
10-HP-pyant
10-DHP-pyant
B-type vitisins
A-type vitisins
ethylidene adducts
direct adducts
0
20
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80
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con
cen
trat
ion
(mm
ol/
L)
monomeric anthocyanins
anthocyanin-derived pigments
A)
B)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
mo
lar
pe
rce
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ge
10-flavanol-pyant
10-MHP-pyant
10-HP-pyant
10-DHP-pyant
B-type vitisins
A-type vitisins
ethylidene adducts
direct adducts
0
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con
cen
trat
ion
(mm
ol/
L)
monomeric anthocyanins
anthocyanin-derived pigments
A)
B)
Figure II. 7. Low molecular weight pigment content of 3 or more years old red wines grouped by grape cultivar: A) concentrations (μmol/L) of monomeric
anthocyanins and anthocyanin-derived pigments; B) molar percentage of different types of anthocyanin-derived pigments. Abbreviations: CBSV, Cabernet Sauvignon; CEN, Cencibel; MER, Merlot; SYR, Syrah; TEMP, Tempranillo; TEMP/CBSV, blends of Tempranillo and Cabernet Sauvignon; pyant, pyranoanthocyanins.
Resultados y Discusión. Capítulo II.
204 Dora Blanco Vega 2013
(Figure 8A). Ethylidene-bridged flavanol-anthocyanin adducts were the most
affected by disappearance during aging (Figure 8B), maybe due to the reported
instability of the ethylidene linkage (Escribano-Bailón, Álvarez-García, Rivas-Gonzalo,
Heredia & Santos-Buelga, 2001; Mateus, Pascual-Teresa, Rivas-Gonzalo, Santos-
Buelga & de Freitas, 2002; Cejudo-Bastante et al., 2011a). In contrast,
hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins increased their contribution in most aged wines
(Figure 8B), in agreement with reported data suggesting their continuous formation
over aging and their higher stability compared to monomeric anthocyanins (Rentzsch
et al., 2007a, 2007b and 2010.
A)
B)
0
15
30
45
60
75
0
100
200
300
400
500
600
mo
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pe
rce
nta
ge (%
)
con
cen
trat
ion
(mm
ol/
L)
Total pigment concentration
% Anthocyanin-derived pigments
0
10
20
30
40
50
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100
mo
lar
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rce
nta
e (%
)
Flavanol-pyant
MHP-pyant
HP-pyant
DHP-pyant
B-type vitisins
A-type vitisins
Ethyliden adducts
Direct adducts
Resultados y Discusión. Capítulo II.
205 Dora Blanco Vega 2013
A)
B)
0
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30
45
60
75
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300
400
500
600
mo
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ge (%
)
con
cen
trat
ion
(mm
ol/
L)
Total pigment concentration
% Anthocyanin-derived pigments
0
10
20
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40
50
60
70
80
90
100
mo
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e (%
)Flavanol-pyant
MHP-pyant
HP-pyant
DHP-pyant
B-type vitisins
A-type vitisins
Ethyliden adducts
Direct adducts
Figure II. 8. Low molecular weight pigment content of Tempranillo wines according to their age: A) concentrations (μmol/L) of total pigments and molar percentage of
anthocyanin-derived pigments; B) molar percentage of different types of anthocyanin-derived pigments. Abbreviations: pyant, pyranoanthocyanins.
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Acknowledgements
The authors thank Spanish Ministerio de Economía y Competitividad for financial support (project AGL2011-29708-C02-02). Author Gómez-Alonso, S., thanks the
Fondo Social Europeo and the Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha for co-funding his contract through the INCRECYT program.
CAPÍTULO III
Resultados y Discusión. Capítulo III.
211 Dora Blanco Vega 2013
CAPÍTULO III. Survey on the Content of Vitisin A and
Hydroxyphenyl-Pyranoanthocyanins in Tempranillo Wines.
1. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
Los cambios de color que se producen durante la elaboración y el envejecimiento
del vino, son debidos a la concentración de antocianos y otros compuestos fenólicos
derivados de la uva, pero también a la presencia de otras moléculas de bajo peso
molecular producidas en la fermentación o extraídas de las barricas en la crianza.
Con el descubrimiento en 1996, Fulcrand, H.; Cameira dos Santos, P. -J.;
Sarni-Manchado, P.; Cheynier, V.; Favre-Bonvin, J. (1996), de la existencia de unos
nuevos pigmentos en vinos envejecidos y la importancia que estos tenían en cuanto al
color y a la estabilidad de ese color en el tiempo se habían empezado a estudiar estos
compuestos de forma exhaustiva. Mientras que los antocianos (que ya habían sido
muy estudiados y se disponían de muchos datos) de la uva empiezan rápidamente a
disminuir su concentración y desaparecen casi completamente después de 5 o 6 años,
los piranoantocianos aumentaban su concentración después de la fermentación y se
podían detectar en vinos envejecidos.
Estos nuevos pigmentos están mucho menos estudiados en cuanto a su
contenido y desarrollo, y por tanto la finalidad del presente trabajo ha sido determinar
la concentración de estos pigmentos en series de vinos comerciales durante 29 años,
en distintas bodegas de la zona, sobre todo en la variedad tempranillo que es la
mayoritaria de Castilla la Mancha.
Se han analizado vinos de nueve bodegas con añadas que van desde 1979 y
2007 y encontramos una gran variabilidad en cuanto a la concentración de
piranoantocianos.
Resultados y Discusión: Capítulo III.
212 Dora Blanco Vega 2013
Vitisin A, 0-10.76 mg/L ; pinotin A, 0-4.26 mg/L; y malvidin 3-glucoside-4-
vinylphenol, 0.03-1.37 mg/L . Vitisin A y malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol ya están
presentes en vinos con uno o dos años de crianza, pero pinotin A solo es detectable en
los dos primeros años y luego desaparece. Vitisin A tiende a disminuir su
concentración y sin embargo hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins aumentan la
concentración durante la crianza.
Por otro lado se había visto la tendencia en el aumento y el descenso de la
concentración, parecía sufrir saltos bruscos en algunos vinos comerciales y se pensó
en la posibilidad de que esos vinos hubieran sufrido un “refresco” por parte de vinos
jóvenes. Estos “refrescos” están permitidos siempre que la adición no sea mayor del
15%.
Como objetivo de este trabajo se planteo el hacer un seguimiento de la
concentración de los antocianos, piranoantocianos y ácidos hidroxicinámicos en vinos
tintos de la variedad tempranillo, estos fueron cedidos por distintas bodegas
colaboradoras de Castilla la Mancha y se logró contar con muestras desde el año 1979
al año 2007.
Las muestras de cada bodega tenían un tipo de elaboración similar a lo largo
del tiempo y esto nos permitiría evaluar y comparar los datos de las concentraciones
de las distintas moléculas y relacionar esto con el color, la estabilidad de ese color y la
edad del vino.
También se hicieron una serie de experimentos de “refrescos” para ver como
modificaban estos la concentración de los distintos pigmentos y la evolución del color
que se podría esperar, además de comprobar si esos refrescos podrían explicar esas
variaciones anómalas en cuanto a la concentración de antocianos y piranoantocianos
en algunos vinos comerciales.
Resultados y Discusión: Capítulo III.
213 Dora Blanco Vega 2013
TOMA DE MUESTRAS
El ensayo para el análisis de las series verticales, que nos permitan hacer un
estudio sobre los cambios de color observados en un mismo vino (variedad, forma de
elaboración etc) a lo largo del tiempo, se llevó a cabo con las bodegas Vinícola de
Castilla (Manzanares) con botellas desde el año 79 al 2007, con distintos vinos
proporcionados por la D.O. Rivera del Jucar, con vinos de Casa Gualda desde el año 98
al 2005, con muestras de Los Teatinos del 94 al 2007,vinos de Cinco Almudes del 97 al
2004, Con vinos de Valdepeñas Corcovo del 96 al 2007, Ojos del Guadiana (Villarrubia
de los Ojos)del 99 al 2007, y Señorío de Guadianeja (Manzanares) del 93 al 2006.
Estas botellas fueron cedidas por todas las bodegas para el estudio y contamos con
dos botellas disponibles por cada año. Se hicieron muestras por duplicado de cada
una de ellas.
Para determinar el contenido en antocianos y piranoantocianos tanto de las
series de vino como de los experimentos de refresco elaborados, se prepararon unos
viales de dos ml, que fueron pasados por filtros de membrana de poliéster con tamaño
de poro de 0.20 μm (Chromafil PET 20/25, Machery-Nagel, Düren, Germany) antes de
la inyección en el HPLC.
Por último, y con el fin de evaluar la importancia y la evolución de la formación
de piranoantocianos en los vinos tintos cuando se le añaden refrescos de vinos más
jóvenes, se elaboraron algunos vinos experimentales mezclando vinos de distintas
variedades o/y de distinta edad: mezclas Cencibel joven con Garnacha (rico en ácidos
hidroxicinámicos) de 1 año; mezclas Cencibel envejecido (reserva) con Cencibel joven.
Para los refrescos se utilizaron vinos de Petit Verdot y Cencibel de la cooperativa
Aquilices de Miguelturra del año 2007.
Estos vinos se irán analizando a lo largo del tiempo (toma de muestra
cuatrimestral). Se someten a fermentación acelerada y se toman medidas cada
semana.
Resultados y Discusión: Capítulo III.
214 Dora Blanco Vega 2013
Keywords: ageing, hydroxycinnamic acids, malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol,
red wine colour, Tempranillo, pyranoanthocyanin, pinotin A, vitisin A
1. Introduction
The actual colour of a red wine is the result of a combination of different physical
and chemical processes which sometimes overlap, and begin to develop as soon as
anthocyanins are extracted from grape skins to fermenting must. After the maceration
period, and also during and after alcoholic fermentation, anthocyanins and other
phenolic wine constituents react to a great variety of new monomeric, oligomeric and
polymeric compounds. Next to the physical phenomenon of copigmentation, which is
Resultados y Discusión: Capítulo III.
215 Dora Blanco Vega 2013
partly responsible for colour enhancement, the contribution of polymeric anthocyanin-
derived pigments to the colour of red wine is very important, especially in aged wines.
The study of the pigments contributing to red wine colour emerged around fifty years
ago and has attracted a great attention especially within the last decade. The initially
suggested anthocyanin-derived wine pigments were tannin-anthocyanin polymeric
pigments that could explain the precipitation of colouring matter observed during red
wine storage and ageing. However, wine polymeric pigments represent a
heterogeneous and not well-characterized group of reaction products. Another group
of anthocyanin-derived wine pigments correspond to monomeric and oligomeric
pigments that are formed in great numbers by the reaction of anthocyanins and
molecules of low molecular weight. The latter pigment group is easier to study, and
nowadays the following classification can be suggested: non-acylated and acylated
native anthocyanins; anthocyanins acylated with lactic acid; dimeric anthocyanins;
flavanol-anthocyanin direct and acetaldehyde-mediated reaction pigments; flavanol-
dimeric anthocyanin direct reaction pigments; and pyranoanthocyanins (Alcalde-Eon,
Escribano-Bailón, Santos Buelga & Rivas-Gonzalo, 2004 and 2006; Alcalde-Eon, Boido,
Carrau, Dellacassa & Rivas-Gonzalo, 2006; Alcalde-Eon, 2008).
Among the newly formed red wine pigments, the class of pyranoanthocyanins
plays an increasing role during wine ageing because these relatively small molecules
remain in solution, in contrast to the classical flavanol-anthocyanin polymeric pigments
that tend to precipitate. In addition, most pyranoanthocyanins differ from their
anthocyanin precursors, especially in their colour. With the exception of the so-called
portisins, most pyranoanthocyanins show a hypsochromically shifted maximum of
absorption in comparison to native grape anthocyanins (Rentzsch, Schwarz &
Winterhalter, 2007a). This shift causes a red-orange colour of pyranoanthocyanins in
contrast to the red-purple colour of genuine anthocyanins, like malvidin 3-glucoside.
Moreover, the newly formed pyran ring stabilizes the colour of pyranoanthocyanins at
varying pH values, and hardly any loss of red colour intensity is observed within the
pH range 1 to 5. Under the same conditions the genuine grape anthocyanins lose up
to 90% of their initial colour (Mazza & Miniati, 1993). A further difference between
grape anthocyanins and pyranoanthocyanins is related to their development during
storage. Anthocyanins reach a maximum in concentration after 2-3 days of skin
maceration and, afterwards, they are constantly degraded until an almost complete
Resultados y Discusión: Capítulo III.
216 Dora Blanco Vega 2013
disappearance after several years of ageing. In contrast to this, the greatest amount
of pyranoanthocyanins is produced during processing and storage of red wines
(Romero & Bakker, 2000; Schwarz, Hofmann & Winterhalter, 2004; Schwarz, Quast,
von Baer & Winterhalter, 2003a; Rentzsch, Schwarz, Winterhalter & Hermosín-
Gutiérrez, 2007b).
Pyranoanthocyanins result from the reaction of a native grape anthocyanin and
molecules bearing a polarizable double bond. Pyranoanthocyanin structures are diverse
and several pathways have been proposed for their formation (Rentzsch et al., 2007a).
Some relevant pyranoanthocyanins emerge from the reaction of anthocyanins and
yeast metabolites, such as pyruvic acid (e.g. vitisin-type pyranoanthocyanins; 1 in
Figure 1) or hydroxycinnamic acids (e.g. hydroxyphenyl-type pyranoanthocyanins; 2 in
Figure 1).
O
OCH3
OCH3
OH
O
HO
R1
OGlc
O
OCH3
OCH3
OH
O
HO
OH
OGlc
R2
1 2
R3
Figure III.1. Chemical structure of wine pyranoanthocyanins derived from malvidin 3-glucoside: 1, vitisin-type pyranoanthocyanins (R1 = COOH, vitisin A; R1 = H, vitisin B); 2, hydroxyphenyl-type pyranoanthocyanins (R2 = R3 = H, malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol or mv-3-glc-4-VP; R2 = H and R3 = OH, malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol or pinotin A; R2 = H and R3 = OCH3, malvidin 3-glucoside-4-vinylguaiacol or mv-3-glc-4-VG).
Resultados y Discusión: Capítulo III.
217 Dora Blanco Vega 2013
In the latter case, formation of these hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins seems
to develop in part during fermentation through yeast-mediated decarboxylation of
hydroxycinnamic acids (Fulcrand, Cameira dos Santos, Sarni-Manchado, Cheynier &
Favre-Bonvin, 1996) and, more prominent, by direct reaction of free hydroxycinnamic
acids (Schwarz, Wabnitz & Winterhalter, 2003; Schwarz, Picazo-Bacete, Winterhalter &
Hermosín-Gutiérrez, 2005) after release from their respective tartaric acid esters
(Rentzsch et al., 2007b).
Published data about the content and development of pyranoanthocyanins in
commercial wines is scarce (Schwarz et al., 2004; Schwarz et al., 2003a; Rentzsch et
al., 2007b). The initial aim of this work was to make a survey on the concentrations of
some of the most occurring pyranoanthocyanins (vitisin A and the hydroxyphenyl-
pyranoanthocyanins pinotin A and malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol) in a wide set of
commercial wines elaborated using grapes of the Vitis vinifera Tempranillo variety, the
most common Spanish red grape variety. As a consequence of the preliminary results
we obtained, a second objective of our work was to evaluate the effect of ageing (a
period of 1-10 years was covered) in the content of pyranoanthocyanins in wines,
paying special attention to some factors that can influence the levels of
hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in aged Tempranillo wines, namely, the occurrence
of their respective precursor molecules (free hydroxycinnamic acids) and the addition
of young red wines to aged wines (the enological practice known as “refreshment”). To
help achieving the latter objective, a vertical series of Tempranillo wines elaborated in
the same cellar over a period of 29 years was considered as reference for anthocyanin
evolution during ageing, and also experiments of refreshment and further accelerated
ageing were performed.
2. Materials and Methods
2.1. Chemicals and Wine Samples
All solvents were of HPLC quality and all chemicals of analytical grade (> 99%).
Water was of MilliQ® quality. The HPLC commercial standards used for quantification
were: malvidin 3-glucoside (PhytoLab, Vestenbergsgreuth, Germany); and caffeic and
p-coumaric acids (Merck, Darmstadt, Germany). Wine samples were divided into two
Resultados y Discusión: Capítulo III.
218 Dora Blanco Vega 2013
sets: the first was a vertical series of wines supplied by one individual cellar (Vinícola
de Castilla S. A., Manzanares, located in the southern middle Spanish region called La
Mancha) elaborated with similar quality grapes and winemaking conditions and
covering the vintages period 1979-2007 (48 samples with the exception of years 1981,
1982, 1985, 1988 and 1992); the second wine set corresponded to commercial wines
purchased at local wine stores which were produced also in the winemaking region of
La Mancha. The sampling of the commercial wines (106 samples) covered a wide
range of ageing times, from the youngest wines (1 year old) up to the oldest available
wines (10 years old). Owing that the set of commercial wines were collected and
analyzed at three different times (September 2005, September 2006, and November
2008) the wine samples were grouped by age, that is, by calculating the difference in
years between analysis time and vintage of elaboration.
Only red wines subjected to Origin Denomination control with a declaration as
“Tempranillo (or its synonym Cencibel) wines” were selected; a control which implies
that at least 85% of the wine has to be made from Tempranillo grapes.
Table III.1. Mean values and standard deviations (MV±SD) for the content (mg/L) of pyranoanthocyanins and related compounds (their precursors, malvidin
3-glucoside, free and bound hydroxycinnamic acids) in commercial Tempranillo wines grouped by age.
a,b Different letters in the same row indicate significant differences according to the test of Student-Newman-Keuls (α =0.05
Resultados y Discusión. Capítulo III.
219 Dora Blanco Vega 2013
2.2. Wine Refreshment Experiments
Young wine (vintage 2007; 150 mL) was added to old Tempranillo wine (vintage
2002; 850 mL) and then were gently homogenized. Two different young wines were
assayed, one was a Tempranillo wine and the other was a Petit Verdot wine. After that,
the resulting refreshed Tempranillo wine was distributed in 25 mL dark glass bottles,
flushed with nitrogen for avoiding air in the headspace, and sealed. The refreshed
wines were submitted to an accelerated ageing process following a described
procedure (Ugliano, Siebert, Mercurio, Capone & Henschke, 2008), consisting in
maintaining them in darkness at 30ºC in an oven set at this temperature. Samples for
HPLC analysis were taken in triplicate each week for HPLC analysis.
2.3. Identification and Quantitative Analysis of Anthocyanins,
Pyranoanthocyanins, and Hydroxycinnamic Acid Derivatives by HPLC with
Electrospray Ionization Multiple Mass Spectrometry (HPLC-ESI-MSn)
HPLC separation, identification and quantification of Tempranillo wine phenolics
were performed on an Agilent 1100 Series system (Agilent, Germany), equipped with
DAD (G1315B) and LC/MSD Trap VL (G2445C VL) electrospray ionization mass
spectrometry (ESI-MSn) system, and coupled to an Agilent Chem Station (version
B.01.03) data-processing station. The mass spectra data were processed with the
Agilent LC/MS Trap software (version 5.3). The wine samples were injected (50 μL)
after filtration (0.20 μm, polyester membrane, Chromafil PET 20/25, Macherey-Nagel,
Düren, Germany) on a reversed-phase column Zorbax Eclipse XDB-C18 (4.6 x 250
mm; 5 μm particle; Agilent, Germany), thermostatized at 40 ºC. The chromatographic
conditions were adapted from the OIV method for analysis of anthocyanins in red
wines (Office International de la Vigne et du Vin, 2003). The solvents were
water/acetonitrile/formic acid (87:3:10, v/v/v, solvent A; 40:50:10, v/v/v, solvent B),
and the flow rate was 0.63 mL/min. The linear gradient for solvent B was: zero min,
6%; 15 min, 30%; 30 min, 50%; 35 min, 60%; 38 min, 60%; 46 min, 6%. For
identification, ESI-MSn was used employing the following parameters: positive ion
mode; dry gas, N2, 11 mL/min; drying temperature, 350ºC; nebulizer, 65 psi;
capillary, -2500 V; capillary exit offset, 70 V; skimmer 1, 20 V; skimmer 2, 6 V; scan
Resultados y Discusión: Capítulo III.
220 Dora Blanco Vega 2013
range, 50-1200 m/z. For quantification, different DAD-chromatograms were extracted
at 520 nm (malvidin 3-glucoside, mv-3-glc), 510 nm (vitisin A and hydroxyphenyl-
pyranoanthocyanins), and 320 nm (hydroxycinnamic acid derivatives). Vitisin A and
pinotin A used as reference standards were prepared as previously described, by
reaction of mv-3-glc with pyruvic acid (Schwarz et al., 2003a) or isolation from
Pinotage wine (Schwarz, Jerz & Winterhalter, 2003), respectively. Malvidin 3-
glucoside-4-VP (mv-3-glc-4-VP) used as standard was isolated from the reaction
mixture of mv-3-glc with p-coumaric acid using similar conditions as described for the
synthesis of pinotin A (Schwarz & Winterhalter, 2003).
2.4. Statistical Data Analysis
ANOVA analysis of the wine data grouped by age was performed (Student-
Newman-Keuls test, α = 0.05; SPSS version 10.0, SPSS Inc.) in order to look for
significant differences. The wine data were also submitted to Principal Components
Analysis (SPSS version 10.0, SPSS Inc.) to test the possibility of grouping, paying
attention to its composition in pyranoanthocyanins and also their precursors.
Resultados y Discusión. Capítulo III.
221 Dora Blanco Vega 2013
3. Results and Discussion
3.1. Tempranillo Wine Vertical Series
Reversed-phase HPLC can successfully separate red wine pigments which are not
of polymeric nature. Usually, the HPLC-chromatogram at 520 nm of a young
Tempranillo red wine is strongly dominated by native grape anthocyanins. Additionally
some minor peaks that correspond to pyranoanthocyanins, especially those derived
from pyruvic acid (vitisin A) and acetaldehyde (vitisin B), are detectable.
Figure III.2. Changes in anthocyanins and pyranoanthocyanins of Tempranillo
wines during aging: a), 2 years old wine; b), 4 years old wine; c), 7 years old wine. Peak assignation: mv, malvidin; glc, glucoside; ac, acetyl; cm, p-coumaroyl; VP,
vinylphenol; VG, vinylguaiacol.
Resultados y Discusión: Capítulo III.
222 Dora Blanco Vega 2013
The ageing induces a decrease in the anthocyanin concentration in Tempranillo
wines while, simultaneously, an increasing importance of hydroxyphenyl-
pyranoanthocyanins can be observed (Figure 2b). It is common that, after an ageing
time of 5-7 years, the anthocyanins are completely degraded and the chromatogram is
usually dominated by pyranoanthocyanins (Figure 2c). Analyzing a vertical series of
wines elaborated in the same winery over 29 years, the native malvidin 3-glucoside
(mv-3-glc) almost disappeared in wines 6 or more years old (Figure 3a), accounting
for 55-57 mg/L in the first year of ageing (vintage 2007) and then strongly decreasing
its concentration below 15 mg/L for wines 2-5 years old (vintages 2006 to 2002).
However, relatively high concentrations of mv-3-glc were found for some wines of the
vintage 2003 and all the wine samples of the vintage 2002 which could be very likely
explained by the typical variations found in biological materials and also as a result of
the many conditions that can influence the content of anthocyanins in wine (for
instance, some years the same vineyards can notably vary in the content of grape
anthocyanins due to unexpected variations in grape maturation process). Regarding
the content of pyranoanthocyanins in the wines of this vertical series, the general
trend found for vitisin A was a decrease over ageing of its content that was frequently
interrupted by various temporary maxima and minima (Figure 3b), in close accordance
to the behaviour reported for a similar vertical series of Chilean Cabernet Sauvignon
wines (Schwarz et al., 2003a). In the case of the hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins
malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol (mv-3-glc-4-VC, or pinotin A; Figure 3c) and
malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP; Figure 3d), their concentrations
initially tended to show a strong increase within the first two years of ageing (wines
from vintages 2007 and 2006) reaching the highest values found for pinotin A (17.7
mg/L) and mv-3-glc-4-VP (3.8 mg/L), and continued with an abrupt decrease over the
next two years of ageing (wines from vintages 2005 and 2004) that further tended to
a new increase during the next 11 years of ageing (wines from vintages 2003 to 1993;
concentrations increased up to 9.9 and 2.9 mg/L for pinotin A and mv-3-glc-4-VP,
respectively), although this trend suffered two interruptions with minima values (wines
from the vintages 1999 and 1995).
Resultados y Discusión: Capítulo III.
223 Dora Blanco Vega 2013
FigureIII.3. Tempranillo wine vertical series. Variation with wine age of the concentrations (mg/L) of: a) malvidin 3-glucoside (mv-3-glc); b) vitisin A; c) pinotin A (malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol); d) malvidin 3-glucoside-4-
vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).
Finally, wines older than 15 years showed the lowest concentrations of both
hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (around 1-2 mg/L and 0.3-0.7 mg/L for pinotin A
and mv-3-glc-4-VP, respectively) and they did not change so much over the rest of the
next 14 years of ageing (wines from vintages 1992 to 1979). The trend shown by the
content of both pinotin A and mv-3-glc-4-VP over the ageing was quite similar, but a
remarkable difference was the relative initial value of their concentrations: pinotin A
was almost a trace compound (less than 1 mg/L) in 1 year old wines (vintage 2007),
whereas mv-3-glc-4-VP already accounted in the first year of ageing for remarkable
concentrations (mean value of 1.6 mg/L) and only a few wines (vintages 2006, 2005,
1997, 1994 and 1993) showed higher values than this initial concentration.
0
10
20
30
40
50
60
19791983198719911995199920032007
vintage
mv-3
-glc
(m
g/L
)
0
1
2
3
4
5
19791983198719911995199920032007
vintage
viti
sin
A (
mg/L
)
0
5
10
15
20
19791983198719911995199920032007
vintage
pin
otin
A (
mg/L
)
0
1
2
3
4
19791983198719911995199920032007
vintage
mv-3
-glc
-4-V
P (
mg/L
)
a)
d)c)
b)
0
10
20
30
40
50
60
19791983198719911995199920032007
vintage
mv-3
-glc
(m
g/L
)
0
1
2
3
4
5
19791983198719911995199920032007
vintage
viti
sin
A (
mg/L
)
0
5
10
15
20
19791983198719911995199920032007
vintage
pin
otin
A (
mg/L
)
0
1
2
3
4
19791983198719911995199920032007
vintage
mv-3
-glc
-4-V
P (
mg/L
)
a)
d)c)
b)
Resultados y Discusión: Capítulo III.
224 Dora Blanco Vega 2013
3.2. Vitisin A Content in Tempranillo Wines
Commercial Tempranillo wines showed a great variability in the content in
pyranoanthocyanins (Table 1). Concentrations of the different pyranoanthocyanins
detected were (range and mean value, in mg/L): vitisin A, 0-10.76 (2.43); pinotin A,
0-4.26 (0.92); and mv-3-glc-4-VP, 0.03-1.37 (0.32). These wide concentration ranges
led to no significant differences when the content of pyranoanthocyanins were
statistically analyzed by the ANOVA test of Student-Newman-Keuls with regard to the
wine age (Table 1). Also the Principal Component Analysis of the data failed in
grouping of the wine samples by age (data not shown).
The pyranoanthocyanin vitisin A is formed during alcoholic fermentation by a
reaction of pyruvic acid with malvidin 3-glucoside (mv-3-glc). Although the occurrence
of vitisin A in wine was first reported in 1997 (Bakker et al., 1997; Bakker &
Timberlake, 1997), there is still very little data available on its content in commercial
wines and also its evolution during ageing. In the case of Tempranillo wines, only a
few papers have reported concentrations of vitisin A around 0.5-6.0 mg/L in 6-30
months old wines (Revilla & González-San José, 2001a and b). The reported vitisin A
content for other commercial and experimental wines is usually within the
aforementioned range (Schwarz et al., 2003a; Asenstorfer, Markides, Illand & Jones,
2003), with exception of young Port wines that reached up to 9.5-15.4 mg/L of vitisin
A, due to a special winemaking technique (Romero & Bakker, 2001; Mateus & de
Freitas, 2001). Therefore, the content of vitisin A in most of the wines that were
analyzed in our investigation (the 48 samples of the vertical series, and 96 commercial
samples out of 106) was within a typical range (i.e. between 0-5.61 mg/L), while only
10 of the commercial wine samples showed unexpected high values (6.38-10.76
mg/L).
With regard to the degradation rate of vitisin A during wine ageing, the results
reported for a vertical row of Chilean Cabernet Sauvignon wines (wines from the same
cellar covering 16 years of ageing) showed that maximum concentrations of vitisin A
were reached within the first year of storage, when pyruvic acid is still available as
only was produced during alcoholic fermentation by yeast. After this period, vitisin A
concentration slowly decreased from 5 to 1 mg/L (Schwarz et al., 2003a). The results
Resultados y Discusión: Capítulo III.
225 Dora Blanco Vega 2013
found for the vertical series of Tempranillo wines were in this line, although the vitisin
A concentration range was lower than that found for Chilean Cabernet Sauvignon
wines, starting around 3 mg/L for 1 year old wines and finishing around 0.2 mg/L after
29 years of ageing. In contrast, the set of commercial Tempranillo wines did not show
clearly this trend (Table 1) and relative maximum concentrations of vitisin A were
detected not only in 1 year old wines (mean value of 3.21 mg/L), but also in 4 year
(mean value of 3.99 mg/L) and 8 year (mean value of 2.99 mg/L) old wines. However,
in the aforementioned study the general decline of vitisin A in Chilean Cabernet
Sauvignon wines was also interrupted by various temporary fluctuations (Schwarz et
al., 2003a) as also observed in our Tempranillo vertical series of wines (Figure 3b).
With the exception of the maxima found in 4 and 8 years old commercial Tempranillo
wines, the concentration of vitisin A showed a slight tendency to decrease over three
ageing periods, i.e. 1-3, 4-7 and 8-10 years of ageing (Table 1), although the
observed high standard deviations suggest the need of further confirmation. One likely
explanation for this observation is that the commercial Tempranillo wines were
produced in different cellars using different yeast strains and winemaking techniques,
resulting in different amounts of pyruvic acid which is required for the formation of
vitisin A (Monagas, Gómez-Cordovés & Bartolomé, 2007). Together with variations in
the initial contents of native grape anthocyanins, these different conditions result in
different initial concentrations of vitisin A that can explain the observed maxima. In
relation to the latter, the attempt to correlate the content of vitisin A to the
concentration of mv-3-glc in the wines of our study was not successful (R2 value of
0.2661), as the initial concentration of vitisin A and mv-3-glc remained unknown. This
indicates that the current content of vitisin A in a wine is the result of several factors.
A correlation of the vitisin A content with wine age appears to be inherently hampered
by the varying initial composition of wines. In addition, the lack of an extensive
database of vitisin A content in wines and the necessary studies dealing with the
factors affecting the kinetics of degradation of vitisin A (i.e. temperature, redox
potential, interaction with other wine constituents) makes the interpretation of the
significance of vitisin A content in a single wine not yet possible.
3.3. Hydroxyphenyl-Pyranoanthocyanins Content in Tempranillo Wines
Resultados y Discusión: Capítulo III.
226 Dora Blanco Vega 2013
In relation to hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins, it is noticeable that pinotin A
was not detectable in many of the one year old wines and only traces appeared in
several of the one and two years old wines (Table 1). Most of the Tempranillo wine
samples contained pinotin A in concentration below 2.5 mg/L (100 samples of
commercial wines and 27 samples of the vertical series wines), and the rest of the
samples showed higher concentrations, ranging within 2.6-5.7 mg/L (6 samples of the
commercial wines and 13 samples of the vertical series wines); moreover, 8 of the
wines of the vertical series contained very high amounts of pinotin A, within the range
of 6.1-17.8 mg/L. The only data available for comparison is that of commercial
Pinotage wines (Schwarz et al., 2004). In these wines high contents of pinotin A within
the range 0.15-17.93 mg/L and mean values of 2.6-5.3 mg/L were detected that were
explained by the naturally high contents of caffeic acid in this grape variety. The
results obtained for the analyzed Tempranillo wines supported the hypothesis that
pinotin A is almost exclusively produced after the release of caffeic acid from its
tartaric ester (Rentzsch et al., 2007b), as an acceptable linear correlation was found
for the contents of both pinotin A and its precursor, caffeic acid, a similar correlation
was found for the vertical series wines (R2=0.6804;)
Figure III.4. Correlation of free hydroxycinnamic acid concentration (mg/L) to the corresponding concentration (mg/L) of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in Tempranillo wines: a) caffeic acid vs. malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol (mv-3-
R2 = 0,6232
0
10
20
30
40
0 1 2 3 4 5
pinotin A (mg/L)
caffe
ic a
cid
(mg/
L)
R2 = 0,4641
0
10
20
30
0,0 0,5 1,0 1,5
mv-3-glc-4-VP (mg/L)
p-c
oum
aric
aci
d (m
g/L)
a)
b)
R2 = 0,6232
0
10
20
30
40
0 1 2 3 4 5
pinotin A (mg/L)
caffe
ic a
cid
(mg/
L)
R2 = 0,4641
0
10
20
30
0,0 0,5 1,0 1,5
mv-3-glc-4-VP (mg/L)
p-c
oum
aric
aci
d (m
g/L)
a)
b)
Resultados y Discusión: Capítulo III.
227 Dora Blanco Vega 2013
glc-4-VC, or pinotin A); b) p-coumaric acid vs. malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).
This confirmed the results of previous studies carried out with Pinotage wines,
that pointed out that the formation of pinotin A in aged wines (≤ 5 years) largely
depends on the caffeic acid concentration (Schwarz et al., 2004). It is also important
to note that, despite the similar mean concentrations found for caffeic acid in
commercial Tempranillo wines over the ageing time (9-18 mg/L; Table 1), the
formation of pinotin A was not remarkable in the first and second year of ageing.
Unlike p-coumaric acid, caffeic acid is not decarboxylated by an enzymatic side activity
of the yeast (Chatonnet, Dubordieu, Boidron & Lavigne, 1993), which is the main
reaction pathway for formation of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in young wines;
however, Morata, González and
Suárez-Lepe (2007) recently reported on the formation of pinotin A in red musts
supplemented with caffeic acid which were fermented by selected yeast strains
possessing intermediate and high hydroxycinnamate decarboxylase activity and the
formation of pinotin A by the enzymatic pathway during alcoholic fermentation must
be carefully revised. The observed slow development of pinotin A could be due to the
fact that the reaction partner of caffeic acid to form pinotin A, i.e. the anthocyanin mv-
3-glc, is likely involved in other competing reactions like pigment polymerization. This
may be one reason why the correlation of the concentration of pinotin A with the
combined concentrations of caffeic acid and mv-3-glc did not improve so much (data
not shown), as compared to the correlation of pinotin A to caffeic acid concentration
alone.
In contrast to pinotin A, mv-3-glc-4-VP was already present in the youngest
Tempranillo wines. To our knowledge, this is the first time that data on the
concentration of mv-3-glc-4-VP has been reported for commercial Tempranillo wines.
Previously reported data mainly corresponded to experimental wines. Concentration of
mv-3-glc-4-VP in commercial Tempranillo wines rarely exceeded 1.0 mg/L (only 3
samples out of the 106 commercial samples contained mv-3-glc-4-VP within the range
1.1-1.4 mg/L) and the most of the youngest wines (1 and 2 years old) showed
concentrations below 0.3 mg/L, a value rather similar to the 0.30-0.36 mg/L reported
Resultados y Discusión: Capítulo III.
228 Dora Blanco Vega 2013
for Grenache wines after completion of malolactic fermentation (Rentzsch et al.,
2007b). However, the Tempranillo wines of the vertical series showed higher contents
of mv-3-glc-4-VP (29 samples contained less than 1.0 mg/L, and the content of the
other 19 samples ranged within 1.1-3.8 mg/L), as also observed for the content of
pinotin A. These results can be explained by an initial formation of this
pyranoanthocyanin via enzymatic decarboxylation of p-coumaric acid during the
alcoholic fermentation, followed by a direct reaction of released p-coumaric acid over
the ageing time (its mean concentration significantly increased from 2.3-4.5 mg/L to
4.6-9.5 mg/L; Table 1). Our results suggest that mv-3-glc-4-VP is formed after
enzymatic decarboxylation of p-coumaric acid, during alcoholic fermentation, reaching
concentrations not higher than 0.3 mg/L. This concentration is increased during ageing
by the pure chemical formation of mv-3-glc-4-VP when p-coumaric acid is released
from coutaric acid. However, the maximum concentration of mv-3-glc-4-VP detected is
around 3.8 mg/L in Tempranillo wines, an amount significantly lower than the
maximum value found for pinotin A (17.7 mg/L) in the same wines. These values
correspond to the proportions of the precursor p-coumaric and caffeic acids and their
bound forms (coutaric and caftaric acids, respectively) that are present in these wines
(Table 1). Due to the two different pathways of formation of mv-3-glc-4-VP, the
correlation between the concentrations of this hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin and
its precursor, the p-coumaric acid, was poor in both sets of commercial wines (Figure
4b) and vertical series wines (R2 = 0.4580; data not shown). The formation of mv-3-
glc-4-VP in aged wines seems, obviously, not to be solely under the control of p-
coumaric acid concentrations, as its initial concentration is determined by enzymatic
activity. As found for pinotin A, the formation of mv-3-glc-4-VP was poorly influenced
by mv-3-glc concentration (data not shown).
3.4. Refreshment Experiments of Aged Tempranillo Wine
On the basis of the hypothesis of formation of hydroxyphenyl-
pyranoanthocyanins by direct reaction of hydroxycinnamic acids with anthocyanins,
their content in Tempranillo wines is expected to increase with ageing time, as it has
been demonstrated for Pinotage wines (Schwarz et al., 2004). This was the initial
trend shown in commercial Tempranillo wines, but unexpected maxima content of
hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins appeared in 4 years old wines, followed by a new
Resultados y Discusión: Capítulo III.
229 Dora Blanco Vega 2013
decrease and a further slight increase (Table 1). Associated with this unexpected
maxima, there was a high content of mv-3-glc in 4 years old wines and, in a lesser
extent, in 7 years old wines (Table 1), opposite to the normal trend of evolution for
anthocyanins during wine ageing as indicated the study of the vertical series of
Tempranillo wines (Figure 3a). The latter results can partly be explained by higher
initial values of the precursors, but more likely is the use of a winemaking technique
referred as to the “refreshment” of old wines; that is the addition of young red wines
to aged wines with the aim of improving some sensory properties. This assumption is
backed up by the observed high concentration of mv-3-glc (more than 50 mg/L) found
in several of the wines of 4 year old, or older.
For supporting the refreshment hypothesis, we carried out experiments of
addition of young wine (vintage 2007) to Tempranillo aged wines (vintage 2002). The
aged Tempranillo wine contained mv-3-glc in trace amounts and only free caffeic and
p-coumaric acids were observed.
Table III. 2. Composition (mg/L) in pigments and hydroxycinnamic acids
of the aged and young wines used in the experiments of refreshment.
Wine Tempranillo
2002
Tempranillo
2007
Petit Verdot
2007
mv-3-glc 0.90 52.90 50.80
vitisin A 0.79 6.49 13.90
pinotin A 25.44 0.99 7.64
mv-3-glc-
4-VP 1.74 1.36 1.55
caftaric
acid n.d. 23.11 5.87
coutaric
acid n.d. 8.41 1.60
caffeic acid 13.94 9.99 41.52
p-coumaric acid 8.90 5.59 13.23
Resultados y Discusión: Capítulo III.
230 Dora Blanco Vega 2013
this wine already contained vitisin A and also important amounts of pinotin A
and mv-3-glc-4-VP. No further formation of pinotin A and mv-3-glc-4-VP was
expectable in this aged wine due to the lack of one of the reactants, the grape native
anthocyanins (e.g., mv-3-glc). Two different young wines were assayed, one was a
Tempranillo young wine and the other was a Petit Verdot young wine, because a
single-variety wine subjected to Origin Denomination must contain at least 85% (v/v)
of the wine of the respective grape variety, but there is no restriction about the rest of
15% of wine volume. Both young wines contained high amounts of mv-3-glc, and their
contents in free hydroxycinnamic acids and also in pyranoanthocyanins was the
expected for young wines, especially in the case of Tempranillo young wine (Table 2).
Figure III.5. Refreshment of aged Tempranillo wine (vintage 2002) with 15% of young Tempranillo wine (vintage 2007). Variation during accelerated aging at 30ºC of the concentrations (mg/L) of: a) malvidin 3-glucoside (mv-3-glc); b) vitisin A; c)
pinotin A (malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol); d) malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).
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P (
mg/L
)
a)
d)c)
b)
Resultados y Discusión: Capítulo III.
231 Dora Blanco Vega 2013
To accelerate the ageing process, refreshed wines were kept in darkness at
30ºC in an oven for several weeks. In both cases a constant decline in mv-3-glc
concentration was observed during ageing (Figures 5a and 6a). It could be expected
that the disappeared mv-3-glc were reacted with the free caffeic and p-coumaric acids,
but no immediate increase of the contents of pinotin A and mv-3-glc-4-VP were
observed. Moreover, a characteristic delay in the increase of the content of these two
hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins were observed, two weeks in the case of aged
Tempranillo wine refreshed with young Tempranillo (Figures 5c and 5d) and up to four
weeks in the case of the wine refreshed with young Petit Verdot wine (Figures 6c and
6d), thus suggesting a different response of the refreshment treatment according to
the compositional differences (regarding competing substances reacting with mv-3-glc)
between the added young wines.
Figure III.6. Refreshment of aged Tempranillo wine (vintage 2002) with 15% of young Petit Verdot wine (vintage 2007). Variation during accelerated aging at 30ºC of the concentrations (mg/L) of: a) malvidin 3-glucoside (mv-3-glc); b) vitisin A; c)
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d)c)
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-glc
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P (
mg/L
)a)
d)c)
b)
Resultados y Discusión: Capítulo III.
232 Dora Blanco Vega 2013
pinotin A (malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol); d) malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).
After this delay, the concentrations of pinotin A and mv-3-glc-4-VP increased
during ageing, reaching a maximum after 5-6 weeks of ageing (the concentrations at
this moment were two-fold of the initial ones for each hydroxyphenyl-
pyranoanthocyanins).
The subsequent evolution of the concentration of both hydroxyphenyl-
pyranoanthocyanins was different according to the added young wine: They were
decreasing in the case of the wine refreshed with young Tempranillo wine, whereas
remained almost constant in the case of wine refreshed with young Petit Verdot. The
aforementioned results were in agreement with the results reported for Pinotage wines
(Schwarz et al., 2004), which clearly indicated that high amounts of mv-3-glc present
in young wines are rapidly consumed by various competing reactions (i.e. formation of
polymeric flavanol-anthocyanin pigments) and only a very small percentage is
converted into hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (i.e. pinotin A). The over-
proportional production of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins commences when
interfering reactions become less likely due to a lower concentration of the reactants,
such flavanols and anthocyanins, while the hydroxycinnamic acids concentrations
remains rather stable, or even increases, throughout the ageing process. An increase
of mv-3-glc concentration in Tempranillo aged wines by means of the previously
mentioned “refreshment”, introduces a very efficient competitor in the formation of
polymeric pigments, thus helping to maintain the current concentrations of pinotin A
and mv-3-glc-4-VP present in wines. The refreshment treatment and its influence on
pyranoanthocyanin development make it impossible to use the hydroxyphenyl-
pyranoanthocyanin concentration for the determination of the age of commercial
Tempranillo wines, as reported for Pinotage wines (Schwarz et al., 2004). Finally,
vitisin A content in refreshed wines was also affected by the addition of the young wine
(Figures 5b and 6b), as occurred to pinotin A and mv-3-glc-4-VP. However, a slight
decrease in vitisin A content was observed in the first week of ageing and the
maximum contents reached were only one and a half of the initial concentrations. The
results suggest that added young wine can also be a source of pyruvic acid that can
lead to the formation of vitisin A, as discussed for the formation of pinotin A and mv-3-
glc-4-VP. Free pyruvic acid is present in wines and is very likely that this alcoholic
Resultados y Discusión: Capítulo III.
233 Dora Blanco Vega 2013
fermentation metabolite accounted for higher concentrations in young wines as
compared to aged wines. Moreover, the increase of the concentration of vitisin A in red
wines by means of pyruvic acid addition has been reported (Romero et al., 2000;
Mateus et al., 2001). The initial decrease in vitisin A content could be connected to the
formation of portisin-type pigments, a class of pyranoanthocyanin pigments formed by
reaction of vitisin A with both flavanols in the presence of acetaldehyde and free
hydroxycinnamic acids, as it has been recently reported (Mateus, Silva, Rivas-Gonzalo,
Santos-Buelga & de Freitas, 2003; Mateus, Oliveira, Santos-Buelga, Silva & de Freitas,
2004; Oliveira, de Freitas, Silva & Mateus, 2007).
4. Conclusion
In this survey we have contributed to the so far only scarce data available for
pyranoanthocyanin contents in 1-10 year old commercial wines elaborated using
grapes of the Vitis vinifera Spanish Tempranillo variety. The results show a great
variability in the concentrations found for the most common pyranoanthocyanins
(vitisin A, pinotin A and mv-3-glc-4-VP).
Vitisin A is formed from pyruvic acid, a yeast metabolite only produced during
alcoholic fermentation, and malvidin 3-glucoside (mv-3-glc). Vitisin A was already
present in high amounts in youngest wines (1-3 years old) and its concentration
tended to decrease with wine age, although various temporary maxima at 4 and 8
years interrupted this trend. In addition, no correlation of vitisin A content with the
concentration of mv-3-glc was found. These results suggest that the current content of
vitisin A in a wine is the result of several factors which still remain unclear, making the
interpretation of the significance of the vitisin A content in a single wine not yet
possible.
No pinotin A was detectable in many of the 1 year old wines and several of the 2
year old wines. In contrast, mv-3-glc-4-VP was already present in 1 year old wines.
Both hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins increased their concentration during the
ageing period as a consequence of not only the releasing of their respective precursors
(i.e. caffeic and p-coumaric acids), but also the availability of anthocyanins which were
not involved in competing reactions (i.e. polymeric pigment formation). Supporting the
Resultados y Discusión: Capítulo III.
234 Dora Blanco Vega 2013
latter was the unexpected high concentrations of pinotin A and mv-3-glc-3-VP found in
several of the detected “refreshed” wines (more than 4 year old wines having a mv-3-
glc concentration higher than 50 mg/L due to the addition of younger wine in order to
improve their sensory properties after a long ageing period). Confirmation of the
effects of refreshment on wine pyranoanthocyanins contents were obtained by model
refreshment experiments consisting in the addition of young wines to aged wines (ratio
of 15:85, v/v) and submitting the refreshed wines to an accelerate ageing. A
characteristic delay was observed previous to the increase in the content of not only
pinotin A and mv-3-glc-4-VP, but also vitisin A.
Acknowledgments
This work was financially supported by the Instituto de la Viña y el Vino de
Castilla-La Mancha (Project PREG-05-024).
Abbreviations
mv-3-glc, malvidin 3-glucoside
mv-3-glc-4-VP, malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (pyranoanthocyanin resulted
from the reaction of malvidin 3-glucoside and p-coumaric acid)
pinotin A or mv-3-glc-4-VC, malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol
(pyranoanthocyanin resulted from the reaction of malvidin 3-glucoside and caffeic
acid)
vitisin A (pyranoanthocyanin resulted from the reaction of malvidin 3-glucoside
and pyruvic acid).
Resultados y Discusión: Capítulo III.
235 Dora Blanco Vega 2013
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CAPíTULO IV
CAPÍTULO IV. HPLC-DAD-ESI-MS/MS Characterization of
Pyranoanthocyanins Pigments Formed in Model Wine.
JUSTIFICACIÓN
A partir del descubrimiento en 1996 de una nueva clase de pigmentos formados
durante la elaboración y envejecimiento de los vinos y su importancia en cuanto al
color final y la contribución a la estabilidad de este, se han realizado numerosos
experimentos para conocer y cuantificar estas nuevas moléculas. Sin embargo se
habían centrado en las vías de reacción y no se tenian muchos datos para caracterizar
en profundidad cada uno de ellos.
En este trabajo vamos a intentar monitorizar por HPLC_DAD_ESI-MS/MS, la
formación de distintos piranoantocianos, en concreto los del tipo vitisina y los
derivados de ácidos hidroxicinámicos, a partir de un extracto de hollejo de Shiraz, por
un lado con diferentes metabolitos productos de la fermentación como son el
acetaldehído, ácido pirúvico, ácido acetoacético y diacetilo, para obtener los
piranoantocianos del tipo vitisina . Y por otro lado con distintos acidos hidroxicinámicos
como el ácido p-cumárico, ácido ferúlico, ácido caféico y ácido sinápico para obtener
los hidroxifenil-piranoantocianos.
El ácido pirúvico y el acetaldehído reaccionan rápidamente. El primero está
presente en una concentración alta y es un subproducto de la fermentación por
levaduras y reacciona rapidamente para dar lugar a pigmentos de tipo
piranoantociano, el segundo reacciona rápidamente pero conduce sobre todo a dar
polímeros de condensación.
Por el contrario el ácido acetoacético y el diacetilo reaccionan muy despacio y con
un rendimiento muy bajo a la hora de producir piranoantocianos.
Los ácidos hidroxicinámicos reaccionan progresivamente y no favorecen la
formación de pigmentos poliméricos.
La formación de hidroxifenil-piranoantocianos se incrementa con el número de
grupos hidroxilos/metoxilos presentes. Los sustituyentes del C-10 afectan mucho al
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
242 Dora Blanco Vega 2013
máximo de absorción en el visible de estos compuestos, por otro lado los sustituyentes
del anillo B o la acilación tienen un efecto mucho menor.
El 10-metil-piranoantocianin formado a partir del ácido acetoacético se encontró
también como producto secundario de la formación de los 10-carboxipiranoantocianos.
Por último se probó con la molécula de diacetilo, que es un subproducto de la
fermentación maloláctica y consta de un doble enlace, para comprobar la posibilidad
de que reaccionara con los antocianos monómeros dando un pigmento del tipo
piranoantociano, se pudo observar la formación del 10-acetilpiranoantociano por
análisis UV-VIS y MS y también se constato su presencia en vinos comerciales.
Se hacía necesario profundizar en el conocimiento y estudio de estos nuevos
pigmentos, los piranoantocianos, ver cómo y en qué condiciones se formaban, cuales
aparecían primero y como contribuía cada uno de ellos al color final en los vinos, que
modificaciones en el color era posible esperar según predominara un pigmento u otro,
que estabilidad tenían a los largo del tiempo etc.
Nos centramos, en este trabajo, en dos tipos de piranoantocianos los del tipo
vitisina y los hidroxifenilpiranoantocianos en un intento de caracterizarlos y conseguir
una base de datos que permita un análisis cualitativo y cuantitativo de cada uno de
ellos.
METODO DE TRABAJO
El análisis de los piranoantocianos por HPLC presentaba ciertos problemas de
índole técnico. En primer lugar, se trata de sustancias que se producen en pequeñas
cantidades (normalmente del orden de algunos mg/L), y en segundo lugar los
cromatogramas típicos de antocianos aparecen mezclados con los antocianos
monómeros. Normalmente, las vitisinas aparecen en la zona en la que también eluyen
los antocianos monómeros acilados, mientras que los hidroxifenil-piranoantocianos
suelen hacerlo algo después de sus correspondientes antocianos acilados. Además, los
piranoantocianos eluyen en la misma zona en la que lo hacen los pigmentos
poliméricos, lo que originan picos con poca definición, apareciendo una “joroba” o
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
243 Dora Blanco Vega 2013
“montaña” cromatográfica que desvirtúa la línea base del cromatograma, y que
dificulta la obtención de espectros UV-Vis y de MS/MS limpios.
Por esa razón, lo primero que se hizo fue examinar y experimentar con los
diferentes métodos de aislamiento de la fracción de piranoantocianos que se conocían,
algunos de ellos modificados, y evaluar cual era más eficaz en la separación de las
distintas fracciones, para su posterior análisis.
Entre los métodos más recientes y de mayor eficacia, cabe destacar la
cromatografía en columna con relleno de Toyopearl HW-40S con elución mediante
alcohol o acetona, estas columnas han sido utilizadas para la separación de catequinas
y proantocianidinas en extractos de plantas (Lea et al., 1974; Morimoto et al., 1986).
Estos métodos son efectivos para separar polifenoles de bajo peso molecular. La
separación tiene lugar por adsorción y por tamaño de partícula, exclusión, y se basa
en el establecimiento de puentes de hidrógeno entre los grupos hidroxilo y carbonilo
de los polifenoles y los grupos aceptores en el gel. La fuerza de interacción depende
del número de hidroxilos fenólicos de la molécula, así los polifenoles polímeros se
absorben más fuertemente que los monómeros.
Como desorbente se usa la acetona que es mejor desorbente que el alcohol.
Partimos de la muestra de vino previamente acidificada (pH = 1) y decolorada con
bisulfito sódico y la eluimos con etanol (95%): agua (80:20) y metanol: agua (80:20)
(Alcalde Eon, 2008).
Otra variante de este método que se ensayó y que se intentó poner a punto, es el
empleo de los cartuchos de extracción en fase sólida MCX (que combina fase reversa e
intercambio iónico) empleados en el aislamiento de la fracción de flavonoles del vino,
pero adaptando las condiciones empleadas por Alcalde Eon (2008) al uso de este tipo
de cartuchos. Así, la muestra acidificada y decolorada con bisulfito se inyectará en los
cartuchos MCX, que se eluirán con metanol para eliminar los compuestos fenólicos
neutros y ácidos, más los pigmentos antociánicos decolorados (carácter neutro); se
espera que queden retenidos en estas condiciones los piranoantocianos, que más
tarde se recuperarán empleando metanol alcalinizado con amoniaco.
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
244 Dora Blanco Vega 2013
MUESTRAS
Se elabora un vino experimental sintético con el extracto de hollejos de uvas
tintas para intentar eliminar todos los compuestos fenólicos excepto los antocianos
monómeros. De esta forma podemos controlar mucho mejor las reacciones que tienen
lugar y lograr que no existan interferencias con otros compuestos de manera que los
cromatogramas sean lo más claro posibles.
Extracción de los compuestos fenólicos de los hollejos de uvas tintas.
Se procedió a la extracción de compuestos fenólicos de los hollejos, de uvas de
la variedad Syrah, consiguiendo extraer el total de los antocianos monoméricos sin
provocar la hidrólisis de sus derivados acetilados.
Se tomaron de 100 a 150 gramos de uvas sanas que se prensaron entre los
dedos para eliminarles la pulpa y la granilla correspondiente. Posteriormente, los
hollejos obtenidos se lavaron con agua (Milli-Q) y se secaron dos veces prensándolos
suavemente entre papel de filtro. De los hollejos secos obtenidos se pesaron 20 g, a
los que se les añadieron 150 ml de una mezcla extractora compuesta por
CH3OH/H2O/HCOOH (50:48.5:1.5) (Gao y col., 1997). A continuación, los hollejos se
homogeneizaron con trituradora durante dos minutos, tras lo cual se centrifugó a
2500g durante 10 minutos a 5º C. Una segunda extracción de los hollejos de la uva
supuso la recuperación de al menos el 99% del contenido fenólico de la uva, como se
confirmó por HPLC tras realizar extracciones sucesivas (hasta cinco). El sobrenadante
fue guardado a -18º C hasta proceder a su inyección en el cromatógrafo de líquidos de
alta eficacia (HPLC).
Los hollejos de vino tinto se analizaron posteriormente, por inyección directa del
extracto de hollejos, tras diluir éste a la mitad con agua Milli-Q.
Aislamiento de los antocianos en los extractos de hollejo de uva tinta
Con el fin de separar los antocianos de los flavonoles en los extractos de hollejo
de uva tinta y poder caracterizar sin interferencias cada uno de los compuestos
formados, se recurrió a la técnica de extracción en fase sólida con cartuchos Oasis
MCX (Waters Corp., Milford, MA; cartuchos de 6 cm3 de capacidad y rellenos con 500
mg de adsorbente) que contienen una mezcla de fase inversa y material de
intercambio catiónico, permitiendo el aislamiento de los flavonoles del extracto de
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
245 Dora Blanco Vega 2013
hollejo de las variedades tintas. Para facilitar el tratamiento de varias muestras
simultáneamente, se usó un colector de vacío (Supelco).
Las muestras necesitaron alguna preparación previa a la separación. Así, se
tomaron 1.5 ml y se diluyó con HCl 0.1 M hasta un volumen final de 12.5 ml, con el
fin de llevar el extracto de hollejo desde un 50% hasta un 6% de metanol. Se eligió
diluirlo con HCl 0.1 M porque permite conseguir en la muestra de extracto fenólico un
pH suficientemente bajo en el cual se favorece la forma de catión flavilio de los
antocianos, y de este modo se asegura una eficaz retención de todos los compuestos
fenólicos en el relleno mencionado anteriormente.
El procedimiento de separación fue adaptado de González-Manzano y col. (2006)
para permitir la reutilización de los cartuchos. El proceso fue el que se indica a
continuación:
Acondicionamiento del cartucho: Se pasó a través del cartucho 5 ml de
metanol para arrastrar compuestos de polaridad intermedia que pudieran estar
contaminando el relleno del cartucho. A continuación, se lavó con 5 ml de agua
bidestilada.
Carga de la muestra: La muestra de extracto diluida se hizo pasar a través del
cartucho, controlando el flujo gota a gota, para asegurar la retención de todos
los compuestos fenólicos, que son medianamente apolares. De forma adicional,
los antocianos quedaron retenidos por intercambio iónico. A continuación, se
realizó un lavado pasando 5 ml de HCl 0.1 M y 5 ml de agua bidestilada.
Extracción de flavonoles: La fracción de flavonoles fue eluida pasando 3 x 5
ml de metanol. Esta fracción también contiene otros polifenoles neutros o ácidos
(flavan-3-oles o taninos y derivados de ácidos hidroxicinámicos,
respectivamente).
Extracción de antocianos: Los antocianos, fijados al cartucho por intercambio
catiónico, fueron extraídos usando 3 x 5 ml de amoniaco al 2% en metanol al
80%.
Regeneración del cartucho: El material de intercambio catiónico fue
regenerado pasando 3 x 5 ml de ácido clorhídrico al 2% en 80% de metanol.
Posteriormente, se acondicionó el cartucho con metanol y agua, permitiendo su
reutilización al menos cuatro o cinco veces más.
Elaboración del vino experimental.
El eluato que contiene los antocianos fue llevado hasta sequedad en un
rotavapor a 40º C y luego elaboramos un vino sintético con un 14% de etanol, una
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
246 Dora Blanco Vega 2013
concentración de tartárico de 5gr/l y una concentración de antocianos de 800gr/l, se
filtra y se lleva a pH 3.6 y se congela hasta su utilización.
Se van a investigar distintos factores que pueden tener incidencia en la
formación de piranoantocianos, en especial hidroxifenilpiranoantocianos y
piranoantocianos tipo vitisina. Por un lado, efectos como el pH y el de la temperatura
de almacenamiento y también se estudiaran la rapidez y el grado de la reacción a lo
largo del tiempo.
Con estos vinos experimentales no se pretende esclarecer qué factores
enológicos pueden influir en la formación de cierta gama de piranoantocianos como la
formación de vitisinas, que exigiría probar distintas cepas de levaduras que se
diferenciaran en su capacidad de producción de metabolitos como el acetaldehído, el
ácido pirúvico o el acetilacetato. No obstante, esta idea se tratará con el grupo de
microbiología enológica para planear futuros experimentos en este sentido
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
247 Dora Blanco Vega 2013
Keywords: pyranoanthocyanins, red wine, fermentation metabolites, diacetyl,
hydroxycinnamic acids, LC-MS, UV-vis, vitisina
INTRODUCTION
In the last two decades the knowledge on anthocyanin-related red wine colour
chemistry has been importantly increased (1). The earliest anthocyanin-derived
compounds that were proposed and further found to occur in wine were polymeric
pigments formed by reaction between anthocyanins and tannins. In addition, other
structures of anthocyanin-derived pigments have been discovered, especially those
called pyranoanthocyanins. Pyranoanthocyanins are a class of red wine pigment
formed as early as during alcoholic fermentation and also over the ageing of the wine.
The general pathway of formation of pyranoanthocyanins involves an anthocyanin and
a compound having a polarisable double bound (pyranoanthocyanin precursor) that
react to give rise to a new pyrano ring fused to the anthocyanin molecule (2).
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
248 Dora Blanco Vega 2013
Figure IV.1. General structures of vitisin-like pyranoanthocyanins (A) and hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (B). Structure features: labeling of aromatic
rings; substituent at C-10 (R4 in D-ring for vitisin-like pyranoanthocyanins; R4 and R5 in E-ring for hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins); B-ring substituent (R1 and
R2); and type of acylation of the glucosidic moiety.
The first reported pyranoanthocyanins were those derived from some yeast
metabolites (vitisin A from pyruvic acid, and vitisin B from acetaldehyde) but the list of
possible non-anthocyanin reactants has notably increased including non-phenolic and
phenolic compounds. In recent years, some pyranoanthocyanins with the simplest
structures (A-type vitisins or 10-carboxy-pyranoanthocyanins, and 10-methyl-
pyranoanthocyanins) have been identified as the starting point for the formation of
more complex pyranoanthocyanins (3-7), or their transformation into other kinds of
non-red pigments (8,9).
The contribution of pyranoanthocyanin to total red wine colour is still a matter of
controversy, and one of the reasons for that is only few pyranoanthocyanins have been
usually detected and quantified and there are only scarce data about their
(A) vitisin-like pyranoanthocyanins (B) hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins
R4 = R5 = H
R4 = OH; R5 = H
R4 = OCH3; R5 = H
R4 = R5 = OCH3
10-p-hydroxyphenyl:
10-catechyl:
10-guaiacyl:
10-syringyl:
R4 = H
R4 = CH3
R4 = COOH
R4 = COCH3
10-H:
10-methyl:
10-carboxy:
10-acetyl:
pyranocyanidin (pyrcy):
pyranopeonidin (pyrpn):
pyranodelphinidin (pyrdp):
pyranopetunidin (pyrpt):
pyranomalvidin (pyrmv):
R1 = OH; R2 = H
R1 = OCH3; R2 = H
R1 = R2 = OH
R1 = OH; R2 = OCH3
R1 = R2 = OCH3
pyranoanthocyanidin
structure
A
B
C
D
A
B
C
D
E
3
10 10
glucosidic moiety: R3 = H, acetyl, p-coumaroyl, caf feoyl
9
4
2
5
6
7
8
4a
8a
3’’’
4’’’
5’’’
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
249 Dora Blanco Vega 2013
concentrations in wine (10). Moreover, the unambiguous identification of the different
pyranoanthocyanin types has been usually confirmed after isolation of the reaction
product between only the main grape and wine anthocyanin (malvidin 3-glucoside)
and the corresponding precursor, following the most favourable reaction conditions.
However, the best pH and solvent conditions for the aforementioned synthesis
reactions did not necessarily match to those of real wine (11-13). Because of the
complex mixture of anthocyanins occurring in red wine, it is expected the formation of
a great diversity of wine pyranoanthocyanins, and interesting identification data for
many of them is available (14,15). However, as far as we know, there is not a
systematic study of the chromatographic and spectral properties covering all the
expected pyranoanthocyanin series according to the reactant precursor.
The aim of our work has been the contribution to a database of chromatographic
(HPLC) and spectroscopic (DAD-UV-vis and MS/MS) data for a wide variety of most
known kinds of pyranoanthocyanins that can be formed in wine. We developed the
reactions between red grape skin extracts and pyranoanthocyanin precursors in a
model wine medium (13% alcohol, v/v, and pH 3.5). We selected Syrah grapes
because their comparable proportions of both non-acylated and different acetylated
and p-coumaroylated anthocyanins. With regard to pyranoanthocyanin precursors, we
tried the reaction with known compounds of both non-phenolic (pyruvic acid,
acetaldehyde, and acetoacetic acid) and phenolic (p-coumaric, caffeic, ferulic and
sinapic acids) types. Finally, we also assayed a non-previously reported possible
precursor, diacetyl, a secondary product of lactic acid bacteria metabolism.
MATERIALS AND METHODS
Chemicals
All solvents were of HPLC quality and water was of MilliQ® quality. Malvidin 3-
glucoside (PhytoLab, Vestenbergsgreuth, Germany) was used as standard for
quantification of anthocyanins in red grape skin extracts. The following reagents were
used as precursors for the formation of wine pyranoanthocyanins in model reactions:
pyruvic acid (≥ 97%, Aldrich), acetaldehyde (≥ 99.5%, Fluka), lithium acetoacetate (≥
90%, Fluka), 2,3-butanedione (≥ 99.0%, Fluka), caffeic acid (≥ 95%, Merck), p-
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
250 Dora Blanco Vega 2013
coumaric acids (≥ 98.0%, Fluka), ferulic acid (≥ 99.0%, Fluka), and sinapic acid (≥
99.5%, Phytolab, Vestenbergsgreuth, Germany).
Red Grape Skin Extracts
An amount of 1500 g of healthy red grapes (V. vinifera Cabernet Sauvignon, Petit
Verdot, and Syrah cultivars), collected at technological maturity (estimated alcoholic
strength of 13%, v/v), was finger pressed to remove the pulp and the seeds. The
remaining skins were washed three times in water (Milli-Q) and softly dried twice by
patting them between sheets of filter paper. The dried skins were extracting with 1000
ml of a mixture 50:48.5:1.5 (v/v) of methanol/water/formic acid (16), using a
homogenizer (Heidolph DIAX 900) for 2 min and the resulting slurry was centrifuged at
2500g at 5 ºC for 15 min. After evaporation of methanol under reduced pressure (40
ºC) the remaining aqueous solution was freeze-dried and the dried extract was stored
(-18 ºC) until use.
Model Reactions of Formation of Wine Pyranoanthocyanins
Wine pyranoanthocyanins formation was mimicked in model reactions using the
grape skin extract containing anthocyanins and the corresponding reagent. Freeze-
dried grape skin extract was dissolved in model wine (13% ethanolic water with 5 g/L
of tartaric acid) up to reach an anthocyanin concentration of 800 mg/L (as malvidin 3-
glucoside) and the pH was then adjusted to 3.5. Syrah grape skin extract was used for
all the model reactions, whereas Cabernet Sauvignon and Petit Verdot grape skin
extracts were only used for repetitions of the reaction with pyruvic acid. The different
reagents for inducing the formation of wine pyranoanthocyanins were individually
added in a molar ratio 10:1 with regard to anthocyanins. Every model reaction was
maintained at 30 ºC in 60 mL screw-cap amber-glass bottles without headspace and
was performed in triplicate. All the reactions were performed in triplicate. Monitoring of
the reactions was extended over 9 weeks and samples of 2.5 mL were weekly picking
for HPLC analysis. For avoiding oxidation, after each sampling small glass balls were
added to replace the taken volume of reaction mixture, thus eliminating bottle
headspace.
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
251 Dora Blanco Vega 2013
Analysis of Pyranoanthocyanins by HPLC-DAD-ESI-MS/MS
HPLC separation and identification of pyranoanthocyanins were performed on an
Agilent 1100 Series system (Agilent, Germany), equipped with DAD (G1315B) and
LC/MSD Trap VL (G2445C VL) electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS/MS)
system, and coupled to an Agilent Chem Station (version B.01.03) data-processing
station. The mass spectra data were processed with the Agilent LC/MS Trap software
(version 5.3). The wine samples were
polyester membrane, Chromafil PET 20/25, Macherey-Nagel, Düren, Germany) on a
reversed-phase column Zorbax Eclipse XDB-
Agilent, Germany), thermostated at 40 ºC. The chromatographic conditions were
adapted from the OIV method for analysis of anthocyanins in red wines (17) and the
detection wavelength was 510 nm. The solvents were water/acetonitrile/formic acid
(87:3:10, v/v/v, solvent A; 40:50:10, v/v/v, solvent B), and the flow rate was 0.63
mL/min. The linear gradient for solvent B was: zero min, 6%; 15 min, 30%; 30 min,
50%; 35 min, 60%; 38 min, 60%; 46 min, 6%. For identification, ESI-MS/MS was
used employing the following parameters: positive ion mode; dry gas, N2, 11 mL/min;
drying temperature, 350 ºC; nebulizer, 65 psi; capillary, -2500 V; capillary exit offset,
70 V; skimmer 1, 20 V; skimmer 2, 6 V; scan range, 50-1200 m/z. Some previously
obtained (10) standards of vitisin A (10-carboxy-pyranomalvidin 3-glucoside), pinotin
A (10-catechyl-pyranomalvidin 3-glucoside) and 10-p-hydroxyphenyl-pyranomalvidin
3-glucoside were available for comparison and identification.
RESULTS AND DISCUSSION
Formation of Pyranoanthocyanins
Figure 1 show the different pyranoanthocyanin structures formed in the studied
model reactions. It is possible to classify these pyranoanthocyanins into two basic
types of structures: on one hand, those pyranoanthocyanins having non-phenolic
substituent at C-10, the so-called vitisin-like pyranoanthocyanins derived from the
reaction of fermentation metabolites (acetaldehyde, pyruvic acid, acetoacetic acid, and
diacetyl) with anthocyanins; on the other hand, hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins or
pyranoanthocyanins having an hydroxyphenyl-like moiety linked to C-10 as they were
formed by reaction between anthocyanins and hydroxycinnamic acids present in wine
(p-coumaric, caffeic, ferulic, and sinapic acids). Common names have been given to
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
252 Dora Blanco Vega 2013
some pyranoanthocyanins (e.g. vitisin A, vitisin B and pinotin A for the compounds
formed by reaction of malvidin 3-glucoside with pyruvic acid, acetaldehyde and caffeic
acid, respectively). We suggest the following rules for naming these compounds: the
basic structure formed by the rings A-B-C-D could be named as the pyrano-derivative
of a given anthocyanidin (pyranoanthocyanidin; for instance, pyranomalvidin); the
glucosidic moiety linked to the C-3 position (ring C; 3-glucoside or 3-(6”-
acyl)glucosides) and the residue linked to the C-10 position (ring D) are then indicated
as substituent of the basic pyranoanthocyanidin structure (e.g., 10-carboxy-
pyranomalvidin 3-glucoside for the aforementioned vitisin A, or pyranomalvidin 3-
glucoside for vitisin B); in the case of pyranoanthocyanins derived from
hydroxycinnamic acids the substituent at C-10 could be named as p-hydroxyphenyl
(from p-coumaric acid; with 4´´´-hydroxyphenyl as the C-10 substituent), catechyl
(from caffeic acid; the residue resembles cathecol, with 3’’’,4’’’-dihydroxyphenyl as the
C-10 substituent), guaiacyl (from ferulic acid; the residue resembles guaiacol, with a
3’’’-methoxy-4’’’-hydroxyphenyl as the C-10 substituent), and syringyl (fron sinapic
acid; the residue resembles syringol, with 3’’’,5’’’-dimethoxy-4’’’-hydroxyphenyl as the
C-10 substituent); following these rules, pinotin A could be named as 10-guaiacyl-
pyranomalvidin 3-glucoside.
With the exception of the vitisin-like pyranoanthocyanins derived from diacetyl (10-
acetyl-pyranoanthocyanins), all the aforementioned types of compounds have been
previously detected in model reactions and wines, especially those structures based on
malvidin 3-glucoside. We are now reporting on the chromatographic and spectral (UV-
vis and ESI-MS/MS) characteristics of almost all the possible structures that can be
formed from each individual anthocyanin on the basis of the anthocyanidin B-ring
substitution pattern and also the acylation or not of the glucosidic moiety. The
selection of Syrah grape skin extract facilitated our objective because this grape
cultivar contained high proportions of acylated anthocyanins (malvidin-based
anthocyanins showed a molar distribution of 41.4% non-acylated, 21.4% acetylated,
33.2% p-coumaorylated, and 1.0% caffeoylated derivatives).
The formation of pyranoanthocyanins in model red wine followed two different
trends: vitisin-like pyranoanthocyanins reached maximum yields in the first 1-2 weeks
of reaction and further decayed, the initial anthocyanins being continuously decreasing
until total disappearance; in contrast, the formation of hydroxyphenyl-
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
253 Dora Blanco Vega 2013
pyranoanthocyanins was progressively increasing over time and parallel to
anthocyanin decreasing that not always totally disappeared after 9 weeks. In addition,
remarkable differences in the yield of the reactions were observed in both cases.
Moreover, the pyranoanthocyanin set formed from the same anthocyanidin structure
(e.g., malvidin-type in their non-acylated and acylated forms) showed similar
proportions than that initially found for the set of non-acylated and acylated
anthocyanin precursors in grape skin extract (e.g., the set of 3-glucoside, 3-(6”-
acetyl)glucoside, 3-(6”-p-coumaroyl)glucoside, and 3-(6”-caffeoyl)glucoside of
malvidin) for all the reactions assayed. Therefore, the type of acylation of the sugar
moiety linked to the anthocyanidin did not seem to exert an appreciable effect on the
rate of formation of pyranoanthocyanins, although deeper investigation is needed to
confirm this suggestion.
In parallel, we developed a control experiment using the same model wine but in the
absence of any added reagent. We observed a disappearance of anthocyanins
following a second order polynomial evolution trend. The anthocyanin decrease was
not total after the reaction time considered (34% of the initial anthocyanins still
remained after 7 weeks of reaction) and developed without formation of any of the
studied pyranoanthocyanins (see supporting information). In this control experiment,
the decrease of anthocyanins was likely due to the formation of polymeric pigments
following condensation of anthocyanins with mainly flavan-3-ols. In fact, direct
condensation adduct of malvidin 3-glucoside and catechin were detected at m/z 781
(15), and precipitation of insoluble red-colored matter was observed.
Among vitisin-like pyranoantocyanin precursors, pyruvic acid reacted quickly and
afforded the highest yield after 1 week (around 63%, based on the peak area of 10-
carboxy-pyranomalvidin 3-glucoside with regard to the peak area corresponding to
malvidin 3-glucoside at the beginning of the reaction) and all the expected reaction
products were detected by ESI-MS/MS.
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
254 Dora Blanco Vega 2013
Table IV. 1. HPLC retention times (min) of vitisin-like pyranoanthocyanin series formed in model wine from different reactants (10-H, from acetaldehyde; 10-carboxy, from pyruvic acid; 10-acetyl, from diacetyl; 10-methyl, from acetoacetic acid).
pyranoanthocyanin structure*
10- H 10-carboxy 10-acetyl 10-methyl
pyrdp-3-glc
pyrdp-3-acglc
pyrdp-3-cfglc
pyrdp-3-cmglc
pyrcy-3-glc
pyrcy-3-acglc
pyrcy-3-cfglc
pyrcy-3-cmglc
pyrpt-3-glc
pyrpt-3-acglc
pyrpt-3-cfglc
pyrpt-3-cmglc
pyrpn-3-glc
pyrpn-3-acglc
pyrpn-3-cfglc
pyrpn-3-cmglc
pyrmv-3-glc
pyrmv-3-acglc
pyrmv-3-cfglc
pyrmv-3-cmglc
11.9
13.9
nd
20.0
14.5
nd
nd
22.5
16.3
18.4
nd
23.6
18.8
21.5
23.3
26.6
20.2
22.3
24.2
27.3
10.9
12.1
14.1
16.5
13.4
15.2
16.1
19.5
15.0
16.5
18.1
20.6
17.6
19.7
21.0
23.9
18.7
20.5
21.9
24.5
14.0
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
18.1
20.4
nd
24.8
20.2
23.1
nd
27.3
22.1
24.5
nd
28.3
14.8
17.1
nd
nd
17.5
20.1
nd
25.5
19.1
21.4
nd
26.7
21.7
24.5
26.1
29.6
23.0
25.4
27.1
30.2
*pyrdp, pyranodelphinidin; pyrcy, pyranocyanidin; pyrpt, pyranopetunidin; pyrpn, pranopeonidin;
pyrmv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6”-acetyl-glucoside; cfglc, 6”-caffeoyl-glucoside;
cmglc, 6”-p-coumaroyl-glucoside; nd, non-detected.
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
255 Dora Blanco Vega 2013
Then, the concentration of 10-carboxy-pyranoanthocyanins was decreasing up to
one fifth of the maximum yield after 9 weeks and the initial anthocyanins practically
disappeared (0.5% remaining anthocyanins).
Figure IV.2. HPLC-DAD chromatograms (detection at 520 nm) for the reaction of pyruvic acid in a model red wine made from Syrah grape skin extract, after 1 day (A), 1 week (B), and 9 weeks (C) of reaction time at 30 ºC. Peak assignations: mv-3-glc, mv-3-acglc, mv-3-cfglc, and mv-3-cmglc are the series of non-acyl, 6”-acetyl, 6”-caffeoyl, and 6”-p-coumaroyl derivatives of malvidin 3-glucoside; peaks 1-4 are the corresponding 10-carboxy-pyranoanthocyanins derived from the
reaction between pyruvic acid and the aforementioned malvidin-type anthocyanins.
Although the reactions with acetoacetic acid and diacetyl also developed with a quick
and almost total disappearance of anthocyanins (less than 1% of initial concentrations
min10 15 20 25 30
mAU
0
500
1000
1500
2000
2500
mv-3-glc
mv-3-acglc
mv-3-cmglc
mv-3
-cfg
lc
43
21
(A)
min10 15 20 25 30
mAU
0
500
1000
1500
2000 4
3
2
1(B)
min10 15 20 25 30
mAU
0
400
800
1200
1600
4
3
1
2
(C)
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
256 Dora Blanco Vega 2013
remained after 9 weeks, on the basis of peak areas at 510 nm), they gave rise to poor
yields (maximum yields around 2-3% after 1 week) and their reaction products were
almost not detectable after 9 weeks, being several of the expected compounds not
detectable if they derived from minor anthocyanins (Table 1). In the case of the
reaction with acetaldehyde, the quick and total disappearance of anthocyanins was
accompanied by an increase of polymeric pigments (broad and non-resolved
chromatographic peak eluting in the time frame of 15-35 min, similar to that found in
very old red wines; data not shown) with a scarce formation yield of B-type vitisins
(maximum of only 0.3% after 2 weeks, on the basis of peak areas at 510 nm, and
total disappearance after 8 weeks) and non-detection of some minor expected
products. The latter results could likely be connected with the using of grape skin
extracts that also contained flavan-3-ols which can easily react with anthocyanins by
mediation of acetaldehyde (1). In fact, we were able to detect the formation of some
of the possible adducts of malvidin-type anthocyanins with (epi)catechin linked by
ethyl bridge (anthocyanin-flavan-3-ol condensation adducts mediated by
acetaldehyde) in the first steps of the reaction with acetaldehyde, that originated
signals in MS conditions for their molecular ions at m/z 809 (adduct from malvidin 3-
glucoside), 851 (adduct from malvidin 3-(6”-acetyl)glucoside), and 955 (adduct from
malvidin-(6”-p-coumaroyl)glucoside), that further fragmented in the MS/MS conditions
as previously reported (19).
With regard to hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin formation reactions, the highest
yield was reached by sinapic acid (66% after 6 weeks, based on peak areas at 510
nm, that decreased to the half after 9 weeks with total disappearance of
anthocyanins), followed by caffeic acid (yield of 43% after 9 weeks, with one fourth of
initial anthocyanins still remaining), ferulic acid (maximum yield of 22% after 6 weeks
that decreased to the half after 9 weeks with total disappearance of anthocyanins),
and p-coumaric acid (maximum yield of 18% after 9 weeks with the half of the initial
anthocyanins still remaining). These results were in agreement with previously
reported moderate enhancement of kinetics of reaction of di- (caffeic and ferulic acids)
and tri-substituted (sinapic acid) hydroxycinnamic acids compared to that of the
mono-substituted one (p-coumaric acid) towards malvidin 3-glucoside (12). With the
exception of few of the very minor expected compounds (mainly 3-(6”-caffeoyl)-
glucosides), most of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins could be detected by ESI-
MS/MS, even in the case of the less reactive p-coumaric acid.
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
257 Dora Blanco Vega 2013
Table IV. 2. HPLC retention times (nm) of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin series formed in model wine from different reactants (10-p-hydroxyphenyl, from p-coumaric acid; 10-catechyl, from caffeic acid; 10-guaiacyl, from ferulic acid; 10-syringyl, from sinapic acid).
pyranoanthocyanin structure*
10-p-hydroxyphenyl 10-catechyl 10-guaiacyl 10-syringyl
pyrdp-3-glc
pyrdp-3-cfglc
pyrdp-3-acglc
pyrdp-3-cmglc
pyrcy-3-glc
pyrcy-3-cfglc
pyrcy-3-acglc
pyrcy-3-cmglc
pyrpt-3-glc
pyrpt-3-cfglc
pyrpt-3-acglc
pyrpt-3-cmglc
pyrpn-3-glc
pyrpn-3-cfglc
pyrpn-3-acglc
pyrpn-3-cmglc
pyrmv-3-glc
pyrmv-3-cfglc
pyrmv-3-acglc
pyrmv-3-cmglc
25.6
27.5
nd
30.6
28.9
nd
nd
34.0
30.5
32.8
32.9
35.5
33.9
36.2
36.6
38.8
35.0
37.3
37.5
39.5
22.5
nd
24.2
26.8
25.8
27.6
27.9
30.3
27.3
29.2
29.4
32.2
30.6
32.9
33.2
35.5
31.7
33.9
34.2
36.3
26.7
28.5
28.6
31.0
30.1
32.1
32.3
34.5
31.7
33.5
33.9
35.9
35.1
37.0
37.6
39.3
36.1
38.0
38.4
40.0
27.9
nd
29.5
31.4
31.3
nd
33.3
34.9
33.0
34.4
35.0
36.6
36.4
38.1
38.7
40.0
37.5
39.0
39.5
40.6
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
258 Dora Blanco Vega 2013
Chromatographic Behaviour of Pyranoanthocyanins
Under the reverse-phase chromatographic conditions used, the vitisin-like
pyranoanthocyanins showed the following behaviour (Table 1): the substituent at C-10
position in D-ring conditioned the polarity of the pyranoanthocyanin structure, thus
eluting in the increasing order of 10-carboxy- (A-type vitisins), 10-H- (B-type vitisins),
10-acetyl-, and 10-methyl-pyranoanthocyanins; for each kind of vitisin-like structure,
the increasing elution order according to the glucosidic moiety was the same found for
anthocyanins, namely, 3-glucoside, 3-(6”-acetyl)-glucoside, 3-(6”-caffeoyl)-glucoside,
and 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside; every vitisin-like pyranoanthocyanin derived from
6”-non-acylated anthocyanins eluted after their corresponding anthocyanidin 3-
glucoside; in contrast, the vitisin-like pyranoanthocyanins derived from 6”-acylated
anthocyanins eluted before their corresponding anthocyanidin 3-(6”-acyl)-glucoside,
being acetyl, caffeoyl or p-coumaroyl the acyl group. The aforementioned behaviour
led to the elution of all the possible vitisin-like pyranoanthcyanins derived from a
specific anthocyanidin structure within the time frame comprised between the
chromatographic peaks corresponding to the anthocyanidin 3-glucoside and its 3-(6”-
p-coumaroyl)-glucoside, thus introducing a great complication on the chromatographic
profile, as it is depicted in (Figure 2B) for the 10-carboxy-pyranoanthocyanins (A-type
vitisins) derived from malvidin-type anthocyanins. In the latter example, malvidin-type
anthocyanins eluted within the time frame of 16.8-31.3 min, whereas their
corresponding 10-carboxy-pyranoanthocyanins eluted within 18.8-24.4 min, and their
respective 10-H-, 10-acetyl- and 10-methyl-pyranoanthocyanins did within 20.2-27.3,
21.7-28.3, and 22.8-30.2 min, respectively. The accumulation of chromatographic
peaks corresponding to the vitisin-like pyranoanthocyanins was especially high
between the peaks corresponding to each pair of non-acylated and acetylated
anthocyanidin 3-glucosides.
In contrast, each hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin was always less polar and
eluted later than its corresponding anthocyanin from which derived (Table 2).
Moreover, each hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin series eluted after the anthocyanin
series from which derived; for instance malvidin-type anthocyanins eluted within the
frame time of 16.8-31.3 min whereas the 10-catechyl-pyranoanthocyanins did within
32.0-36.60 min. However, a change in the elution order according to the glucosidic
moiety was observed for all the hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin series: 3-(6“-
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
259 Dora Blanco Vega 2013
caffeoyl)-glucosides eluted earlier than 3-(6”-acetyl)-glucosides, when the elution
order was the reverse for their respective anthocyanins under the same conditions. As
seen for vitisin-like pyranoanthocyanins, the structure of the hydroxyphenyl
substituent at C-10 of D-ring (the new E-ring) importantly conditioned the polarity and
the elution order of the resulting pyranoanthocyanin: for a specific anthocyanin-
derived hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin series, the first eluting compound was
always the 10-catechyl derivative (from caffeic acid), following by the 10-p-
hydroxyphenyl (from p-coumaric acid), the 10-guaiacyl (from ferulic acid) and the 10-
syringyl (from sinapic acid) derivatives.
On-line DAD UV-vis Spectra of Pyranoanthocyanins
The two kinds of considered pyranoanthocyanins contain different chromophores
having characteristic on-line UV-vis spectra, as it is depicted in (Figure 3A) for the 3-
glucosides of 10-carboxy-pyranomalvidin and 10-catechyl-pyranomalvidin, and
showing visible absorption maxima that were hypsochromically shifted with regard to
their corresponding original anthocyanin (malvidin 3-glucoside).
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
260 Dora Blanco Vega 2013
Figure IV.3. DAD on-line UV-vis spectra of: malvidin 3-glucoside (mv-3-glc) vs. its 10-carboxy- and 10-catechyl-pyranoanthocyanin derivatives (A); different vitisin-
nm250 300 350 400 450 500 550
mAU
0
200
400
600
800
1000
mv-3-glc
10-carboxy-pyrmv-3-glc (vitisin A)
10-catechyl-pyrmv-3-glc (pinotin A)
nm250 300 350 400 450 500 550
mAU
0
200
400
600
800
1000
10-acetyl-pyrmv-3-glc
10-carboxy-pyrmv-3-glc
pyrmv-3-glc
10-methyl-pyrmv-3-glc
nm250 300 350 400 450 500 550
mAU
0
200
400
600
800
1000
10-p-hydroxyphenyl-pyrmv-3-glc
10-catechyl-pyrmv-3-glc
10-guaiacyl-pyrmv-3-glc
10-syringyl-pyrmv-3-glc
(A)
(B)
(C)
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
261 Dora Blanco Vega 2013
like pyranoanthocyanins derived from malvidin 3-glucoside (B); different hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins derived from malvidin 3-glucoside (C). Abbreviation: pyrmv-3-glc, pyranomalvidin 3-glucoside.
UV-vis spectra of vitisin-like pyranoanthocyanins were characterized in their
visible region by a maximum absorbance broad band in the red-absorption region
(475-536 nm) that was not symmetrical showing a shoulder on the left part of the
band (455-515 nm), together with secondary bands near the yellow-absorption region
(353-388 nm) and the UV-region (262-283 and 292-305 nm). The wavelength of the
maximum absorbance in the red-absorption region of vitisin-like pyranoanthocyanins
was very affected by the substituent linked to C-10
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
262 Dora Blanco Vega 2013
Table IV. 3. On-line DAD UV-vis maxima (sh, shoulder) of vitisin-like
pyranoanthocyanin series formed in model wine from different reactants (10-H,
from acetaldehyde; 10-carboxy, from pyruvic acid; 10-acetyl, from diacetyl; 10-
methyl, from acetoacetic acid).
pyrdp, pyranodelphinidin; pyrcy, pyranocyanidin; pyrpt, pyranopetunidin; pyrpn, pranopeonidin; pyrmv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6”-acetyl-glucoside; cfglc, 6”-caffeoyl-glucoside; cmglc, 6”-p-coumaroyl-glucoside; nd, non-detected.
In fact, this band showed maximum absorbance at 480 nm for the malvidin-based
derivative having the most electron-donor substituent (methyl group) whereas
bathochromic shifts up to 54 nm were observed for the corresponding derivatives
having substituent with decreasing electron-donor (and parallel increasing electron-
acceptor) capabilities, following the sequence of 10-methyl (absorption maximum in
the range 475-484 nm), 10-hydrogen (absorption maximum in the range 485-498
nm), 10-carboxy (absorption maximum in the range 504-516 nm), and 10-acetyl
(broad absorption maximum in the range 528-536 nm) groups.
Less important was the change induced by the B-ring substitution pattern on the
maximum absorbance wavelength in the visible region. The vitisin-like
pyranoanthocyanins with tri-substituted B-ring (pyranodelphinidin-, pyranopetunidin-,
and pyranomalvidin-types) showed visible maxima which were bathochromically
shifted up to 12 nm (3-12 nm according to the C-10 substituent) with regard to those
of the pyranoanthocyanins with di-substituted B-ring (pyranocyanidin- and
pyranopeonidin-types), similar to the effects reported for the anthocyanins from which
they derived (18). In addition, the acylation of the 3-glucosidic moiety only induced
expected changes in the UV-vis spectra of an individual vitisin-like pyranoanthocyanin
series when the acylating residues were 6”-p-coumaroyl and 6”-caffeoyl, thus
appearing extra shoulders at around 312-314 and 322-340 nm, respectively, as it has
been similarly reported for acylated anthocyanins (18).
In contrast, hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins showed a sharper band in the red-
absorption region (500-520 nm) together with two shoulders in the orange-brown
absorption regions of 475-486 and 415-420 nm (Figure 3C) and also other UV-region
absorption maxima or shoulders (250-263 nm; 275-280 nm; 295-301 nm).
Table IV. 4. On-line DAD UV-vis maxima (sh, shoulder) of hydroxyphenyl-
pyranoanthocyanin series formed in model wine from different reactants (10-p-hydroxyphenyl, from p-coumaric acid; 10-catechyl, from caffeic acid; 10-guaiacyl, from ferulic acid; 10-syringyl, from sinapic acid).
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
266 Dora Blanco Vega 2013
*pyrdp, pyranodelphinidin; pyrcy, pyranocyanidin; pyrpt, pyranopetunidin; pyrpn, pranopeonidin; pyrmv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6”-acetyl-
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
267 Dora Blanco Vega 2013
glucoside; cfglc, 6”-caffeoyl-glucoside; cmglc, 6”-p-coumaroyl-glucoside; nd, non-detecte
In addition, the substitution pattern of the hydroxyphenyl moiety (E-ring) affected
the wavelength of maximum absorbance in the red-absorption region, and successive
bathochromic shifts of 6-7 nm were observed following the sequence of mono-
substituted (10-p-hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins, 500-506 nm), di-substituted
(10-catechyl-pyranoanthocyanins, 506-512 nm; 10-guaiacyl-pyranoanthocyanins,
506-513 nm), and tri-substituted (10-syringyl-pyranoanthocyanins, 514-520 nm). The
shoulder at 415-420 nm was more pronounced in the case of 10-p-hydroxyphenyl-
pyranoanthocyanins. Less than described for vitisin-like pyranoanthocyanins, the B-
ring substitution pattern of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins also affected the red-
absorption region maximum: a bathochromic shift of only 3-5 nm for tri-substituted
structures (pyranodelphinidin-, pyranonopetunidin-, and pyranomalvidin-types) with
regard to di-substituted ones (pyranocyanidin- and pyranopeonidin-types). Finally, the
acylation of the glucose residue only introduced change in the UV-absorption region in
the expected cases of p-coumaroyl and caffeoyl acylating groups, similarly to that seen
for vitisin-like pyranoanthocyanins.
ESI-MS/MS Spectra of Pyranoanthocyanins
The soft positive ionization conditions provided by the electrospary ionization (ESI)
chamber together with the use of an acidic elution solvent, allowed the formation of
molecular ions for all kinds of pyranoanthocyanins in their flavylium-like form. Further
fragmentation in the ion trap (MS/MS) led to the loss of the entire glucosidic moiety,
whatever it was acylated or not (no intermediate loss of the acyl residue of the
glucosidic moiety is observed). This behaviour is typical for anthocyanins
(anthocyanidin 3-glucosides) and it has been also reported for the pyranoanthocyanins
formed from them (15).
Table IV.5. ESI-MS/MS (molecular ion; product ion) of vitisin-like pyranoanthocyanin series formed in model wine from different reactants (10-H,
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
268 Dora Blanco Vega 2013
from acetaldehyde; 10-carboxy, from pyruvic acid; 10-acetyl, from diacetyl; 10-methyl, from acetoacetic acid).
pyranoanthocyanin structure*
10- H 10-carboxy 10-acetyl 10-methyl
pyrdp-3-glc
pyrdp-3-acglc
pyrdp-3-cfglc
pyrdp-3-cmglc
pyrcy-3-glc
pyrcy-3-acglc
pyrcy-3-cfglc
pyrcy-3-cmglc
pyrpt-3-glc
pyrpt-3-acglc
pyrpt-3-cfglc
pyrpt-3-cmglc
pyrpn-3-glc
pyrpn-3-acglc
pyrpn-3-cfglc
pyrpn-3-cmglc
pyrmv-3-glc
pyrmv-3-acglc
pyrmv-3-cfglc
pyrmv-3-cmglc
489; 327
531; 327
nd
635; 327
473; 311
nd
nd
619
503; 341
545; 341
nd
649; 341
487; 325
529; 325
649
633; 325
517; 355
559; 355
679; 355
663; 355
533; 371
575; 371
695; 371
679; 371
517; 355
559; 355
679; 355
663; 355
547; 385
589; 385
709; 385
693; 385
531; 369
573; 369
693; 369
677; 369
561; 399
603; 399
723; 399
707; 399
531; 369
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
545; 383
587; 383
nd
691; 383
529; 367
571; 367
nd
675; 367
559; 397
601; 397
nd
705; 397
503; 341
545; 341
nd
nd
487; 325
529; 325
nd
633; 325
517; 355
559; 355
nd
663; 355
501; 339
543; 339
663; 339
647; 339
531; 369
573; 369
693; 369
677; 369
*pyrdp, pyranodelphinidin; pyrcy, pyranocyanidin; pyrpt, pyranopetunidin; pyrpn,
pranopeonidin; pyrmv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6”-acetyl-glucoside;
cfglc, 6”-caffeoyl-glucoside; cmglc, 6”-p-coumaroyl-glucoside; nd, non-detected.
Table IV. 6. ESI-MS/MS (molecular ion; product ion) of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin series formed in model wine (10-p-hydroxyphenyl, from p-
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
269 Dora Blanco Vega 2013
coumaric acid; 10-catechyl, from caffeic acid; 10-guaiacyl, from ferulic acid; 10-syringyl, from sinapic acid).
MS/MS 10-p-hydroxyphenyl 10-catechyl 10-guaiacyl 10-syringyl
pyrdp-3-glc
pyrdp-3-cfglc
pyrdp-3-acglc
pyrdp-3-cmglc
pyrcy-3-glc
pyrcy-3-cfglc
pyrcy-3-acglc
pyrcy-3-cmglc
pyrpt-3-glc
pyrpt-3-cfglc
pyrpt-3-acglc
pyrpt-3-cmglc
pyrpn-3-glc
pyrpn-3-cfglc
pyrpn-3-acglc
pyrpn-3-cmglc
pyrmv-3-glc
pyrmv-3-cfglc
pyrmv-3-acglc
pyrmv-3-cmglc
581
743
nd
727
565; 403
nd
nd
711
595; 433
757; 433
637; 433
741; 433
579; 417
741; 417
621; 417
725; 417
609; 447
771; 447
651; 447
755; 447
597; 435
nd
639; 435
743; 435
581; 419
743
623; 419
727; 419
611; 449
773
653; 449
757; 449
595; 433
757; 433
637; 433
741; 433
625; 463
787; 463
667; 463
771; 463
611; 449
773
653; 449
757; 449
595; 433
757
637; 433
741; 433
625; 463
787; 463
667; 463
771; 463
609; 447
771; 447
651; 447
755; 447
639; 477
801; 477
681; 477
785; 477
641; 479
nd
683; 479
787; 479
625
nd
667; 463
771; 463
655; 493
817; 493
697; 493
801; 493
639; 477
801; 477
681; 477
785; 477
669; 507
831; 507
711; 507
815; 507
Tables 5 and 6 summarized the molecular (MS conditions) and product ions detected
when possible (enough signal intensity for the molecular ion to be isolated in the ion
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
270 Dora Blanco Vega 2013
trap and fragmented under MS/MS conditions), for the studied pyranoanthocyanin
series. These data were in agreement with the expected m/z values for each
pyranoanthocyanin series and were used, in combination with UV-vis data, for
identification. By means of extracted ion chromatograms (EIC) at m/z values of the
expected pyranoanthocyanidin aglycones it was possible to identify each of the
pyranoanthocyanidin-based series for every combination of C-10 substituent and B-
ring substitution pattern.
MS detectors have high sensitivity and they allow the analysis of single compounds
in complex mixtures without previous isolation (extracted ion chromatograms).
However, our results showed the necessity of using MS/MS experiments because some
pairs of different pyranoanthocyanin structures were isomeric (the 3-(6”-p-
coumaroyl)- and the 3-(6”-caffeoyl)-glucosides of the pairs
pyranodelphinidin/pyranocyanidin and pyranopetunidin/pyranomalvidin of all the
pyranoanthocyanins studied; the 3-glucosides of 10-acetyl-pyranoanthocyanins and
the 3-(6”-acetyl)-glucosides of their respective pyranoanthocyanins) and had the same
m/z value for their molecular ions but different m/z values for their product ions.
Therefore, the use of single-quadrupole MS detectors cannot distinguish between such
pairs of compounds, especially in the case of vitisin-like pyranoanthocyanins because
their retention times were also quite close (Table 1). On the other hand, even working
under MS/MS conditions, MS detectors were not enough for unequivocal identification
of each of the very wide sort of pyranoanthocyanin structures. As can be seen in
Tables 5 and 6, many pyranoanthocyanin series (including all the non-acylated and
acylated 3-glucosides) showed the same molecular and product ions (for instance,
pyranopeonidins and 10-methyl-pyranocyanidins show the common aglycone m/z
value, 325; and 10-p-hydroxyphenyl-pyranodelphinidins and 10-catechyl-
pyranocyanidins show the common aglycone m/z value, 419). In all the
aforementioned cases, the UV-vis information afforded by DAD-detector and the
retention times obtained by the separated experiments developed with each individual
pyranoanthocyanin precursors were necessary to differentiate among the above
remarked coincidences. The use of ion trap instruments able to perform MSn
experiments with n ≥ 3 could help to the unambiguous identification of the
aforementioned pairs of compounds of identical molecular weight, really having an
add-on value for other researchers.
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
271 Dora Blanco Vega 2013
Tentative Identification of New Pyranoanthocyanin Structures.
In this work, a new kind of pyranoanthocyanin structure has been found. As far
as we know, the 10-acetyl-pyranoanthocyanins derived from diacetyl (butanedione)
has not been previously reported. We tried this compound because it was expected to
be present in red wines as a lactic acid bacteria metabolite and it presented the
chemical requisites for reacting with anthocyanins to form pyranoanthocyanins (a
polarizable double bound in its enolic form). We found that diacetyl reacted in a model
wine giving rise to the expected 10-acetyl-pyranoanthocyanins. However, the yield of
the reaction was poor and we were only able to detect by ESI-MS/MS a few of the
expected components of the complete series (Table 6). It is remarkable that the UV-
vis spectra of this new kind of pyranoanthocyanins showed a visible maximum at
around 528-536 nm (Figure 3B and Table 3), a value quite similar to that of the
anthocyanins from which was formed. Therefore, these new pigments can be described
as red-purple pigments and not as orange pigments as usually other
pyranoanthocyanins are. Despite of the low capability of diacetyl to react with
anthocyanins and the little amounts expected for this metabolite in wines, it is
noteworthy that we found MS evidence of the occurrence of 10-acetyl-pyranomalvidins
in real samples of red wines that developed malolactic fermentation, thus suggesting
their formation in red wine is possible.
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
272 Dora Blanco Vega 2013
Figure IV.4. HPLC-DAD-ESI-MS/MS analysis of a 2-years old Tempranillo commercial red wine: DAD-chromatogram at 520 nm (A); extracted ion chromatogram (EIC) at m/z 355 (pyrmv) showing the peaks assigned to the 3-glc (20.2 min), the 3-acglc (22.3 min), and the 3-cmglc (27.3 min) derivatives (B); EIC at m/z 397 (10-acetyl-pyrmv) showing the peak assigned to its 3-glc (22.1 min) derivative (C); EIC at m/z 559 corresponding to the molecular ions of the isomers 10-acetyl-pyrmv-3-glc and pyrmv-3-acglc (D); MS/MS spectra of peaks corresponding to 10-acetyl-pyrmv-3-glc (E) and pyrmv-3-acglc (G), and their overlapping zone (F). Abbreviations: pyrmv, pyranoamalvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-acglc, 3-(6”-acetyl)-glucoside; 3-cmglc, 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside.
27.322.320.2
(A) DAD, 520 nm
20.2
22.3 27.3
(B) EIC 355 +All
22.1 (C) EIC 397 +All
22.3(D) EIC 559 +All MS
0
200
Intens.
mAU
0
1
x106
0
1
2
0.0
0.5
10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 Time [min]
x104
x106
355.2
397.1 (E) +MS2(559.5), 22.1 min
0
2
4
x104
355.2
397.1 (F) +MS2(559.6), 22.2 min
0
2
4
x104
355.2
397.1
(G) +MS2(559.5), 22.3 min
0
1
2
200 400 600 800 1000 m/z
x105
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
273 Dora Blanco Vega 2013
The identification of 10-acetyl-pyranoanthocyanins in wines was difficult because
their low concentrations. In addition, the expected major 10-acetyl-pyranomalvidin 3-
glucoside partially co-eluted with its isomer 10-pyranomalvidin 3-(6”-acetyl)-glucoside
under the chromatographic conditions we used (Figures 4C and 4D) and its occurrence
was confirmed by MS/MS experiments (Figures 4E-4G): the isolated molecular ions
(m/z = 559) were fragmented into two product ions, one corresponding to 10-acetyl-
pyranomalvidin aglycone (m/z = 397) and the other to pyranomalvidin aglycone (m/z
= 355), the ratio between these two product ions varying accordingly to the elution
time.
Finally, one apparently new pyranoanthocyanin structure was found in the
experiments using pyruvic acid. In this case, a second set of signals were found in the
corresponding extracted ion chromatograms at the expected m/z values of the
pyranocyanidin and pyranopeonidin aglycones (355 and 369, respectively). These new
signals showed the same molecular and product ions than their corresponding 10-
carboxy-pyranoanthocyanins, thus indicating they were isomers. In addition, the
retention times and UV-vis spectra of these new compounds were identical to that
described for 10-methyl-pyranoanthocyanins with petunidin- and malvidin-based
structures, respectively, which showed coincident m/z values for their molecular and
product ions (Table 5). Moreover, the series of the other 10-methyl-
pyranoanthocyanins (delphinidin-, cyanidin- and peonidin-based structures) were also
found in the reaction mixture with pyruvic acid when appropriate m/z common
aglycone values (341, 325, and 339, respectively) were selected to obtain extracted
ion chromatograms. We repeated the reaction of pyruvic acid with grape skin extracts
from other grape cultivars (Cabernet Sauvignon and Petit Verdot) with similar results
(data not shown). Bearing in mind the low amounts in which acetoacetic acid occurs in
wine and the poor yield of its reaction in the model wine reaction studied in this work,
it could be also suggested that the occurrence of 10-methyl-pyranoanthocyanins in
wine could be related in an important extent to the formation of 10-carboxy-
pyranoanthocyanins. In fact, the isolation and identification of 10-methyl-
pyranoanthocyanins were made for the first time from aged Port wines (13), a type of
red wine that is characterized by high contents of pyruvic acid and 10-carboxy-
pyranoanthocyanins due to its special winemaking technique. In recent years, the
reactivity of 10-carboxy-pyranoanthocyanins has been reported, leading to the
formation of new wine pigments: the so-called portisins (reaction products of 10-
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
274 Dora Blanco Vega 2013
carboxy-pyranoanthocyanins with vinyl-flavanols, vinylphenols, and hydroxycinnamic
acids with the loss of the 10-carboxy group) (3-6); a new family of pyranoanthocyanin
dimers with a turquoise color (7); or the new yellowish pigments (called oxovitisins)
produced by oxidative decarboxylation of 10-carboxy-pyranoanthocyanins (8,9).
Supporting Information
Supporting Information Available: Control model wine evolution over the reaction
time. This material is available free of charge via the Internet at http://pubs.acs.org.
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Funding Sources
This work was financially supported by the Instituto de la Viña y el Vino de Castilla-
La Mancha (Projects PREG-05-024 and PREG-10-002).
Resultados y Discusión. Capítulo IV.
277 Dora Blanco Vega 2013
Suporting Information
Figure A. HPLC-DAD chromatograms (detection at 520 nm) for the reaction of control model red
wine made f rom Syrah grape skin extract without addition of any reagent, af ter 1 day (A), 2 weeks
(B), and 7 weeks (C) of reaction time at 30 ºC. Peak assignations: mv-3-glc, mv-3-acglc, mv-3-cfglc,
and mv-3-cmglc are the series of non-acyl, 6”-acetyl, 6”-caf feoyl, and 6”-p-coumaroyl derivatives of
malvidin 3-glucoside; mv-3-glc-catechin is the direct adduct formed by reaction between mv-3-glc
and catechin; the rest of the peaks correspond to the other original grape skin anthocyanins.
(A)
(B)
(C)
min5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
dp
-3-g
lc
cy-3
-glc
pt-
3-g
lc
pn
-3-g
lc
mv-3
-glc
mv-3
-acg
lc
mv-3
-cm
glc
min5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
200
400
600
800
1000
min5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
200
400
600
800
mv-3
-cfg
lc
dp
-3-g
lc
cy-3
-glc
pt-
3-g
lc
pn
-3-g
lc
mv-3
-glc
mv-3
-acg
lc
mv-3
-cm
glc
mv-3
-cfg
lc
dp
-3-g
lc
cy-3
-glc pt-
3-g
lc
pn
-3-g
lc
mv-3
-glc
mv-3
-acg
lc
mv-3
-cm
glc
mv-3
-cfg
lc
mv-3
-glc
-cate
chin
mv-3
-glc
-cate
chin
CAPÍTULO V
Resultados y Discusión. Capítulo V.
281 Dora Blanco Vega 2013
CAPÍTULO V. Synthesis, Isolation, Structure Elucidation,
and Color Properties of 10-Acetyl-Pyranoanthocyanin.
JUSTIFICACIÓN
Al hacer el estudio pormenorizado de los piranoantocianos tipo vitisina e
hidroxifenilpiranoantocianos, se había probado con un nuevo “candidato”, el diacetilo,
que se formaba como subproducto de las bacterias lácticas que producían la
fermentación malo-láctica, y que era una pequeña molécula con un doble enlace
polarizado, lo que hacía pensar que pudiera reaccionar con los antocianos para dar un
nuevo pigmento del tipo piranoantociano. En el laboratorio se comprobó que se
formaba un nuevo pigmento no estudiado hasta el momento el 10-
acetilpiranoantociano, con una estructura muy parecida a los piranoantocianos del tipo
vitisina. Este pigmento era similar a otros piranoantocianos del tipo de las vitisinas y
se logró encontrar en muestras de vinos comerciales de cierta edad.
Como el rendimiento de la reacción era muy bajo no se pudo caracterizar
adecuadamente a los nuevos compuestos y se propuso como tema de este capítulo
aislar y purificar el pigmento para conseguir una concentración adecuada de producto,
que nos pudiera facilitar el someterlo a análisis con métodos espectroscópicos
(UV−vis, MS/MS, y NMR). Y así poder explicar sus características y comportamiento.
La estructura del 10-acetil-piranomalvidin-3-β-O-glucosa y del 10-acetil-
piranopeonidin-3-β-O-glucosa se confirmó con estos métodos espectroscópicos. Y se
comprobó que a diferencia de otros pigmentos de tipo vitisina estos nuevos
piranoantocianos tienen colores muy diferentes a los observados anteriormente.
Muestran una tendencia importante a dar compuestos hemiacetales, incoloros al pH
del vino. Reaccionan fácilmente en condiciones ácidas pH 2.0 con el bisulfito pero no
se produce la decoloración esperada, sino que se incrementa su intensidad y además
se desplaza hipsocromicamente hacía el naranja (absorbancias máximas en 487-491
nm).
Resultados y Discusión. Capítulo V.
282 Dora Blanco Vega 2013
MÉTODO DE ANÁLISIS DE LAS CARACTERÍSTICAS CROMÁTICAS
Sistema CIE
Se trata del sistema estándar de medida del color con el cual se deben comparar
el resto de los sistemas. Fue propuesto por la CIE en 1931, basándose en la teoría de
la percepción tricromática. El sistema CIE especifica el color definido por tres
parámetros (X; Y; Z) llamados parámetros triestímulo, que representan la cantidad de
los tres colores primarios: rojo, verde y azul. Para calcularlos, la CIE recomienda
registrar el espectro entre 380 y 700 nm a intervalos de 1, 5 ó 10 nm y aplicar las
siguientes ecuaciones:
X = k∑гג LגyגΔג
Y = k∑гג LגyגΔג
Z = k∑гג LגyגΔג
En el caso de que el color se deba a la transmisión de luz por un objeto, como en el
vino (гג) es una transmitancia espectral de la muestra para cada longitud de onda, (L (ג
la emisión espectral de la muestra para esa misma ג, (x ג , y ג , z ג ) son funciones
matemáticas de color relacionadas con el observador estándar elegido, y (Δג) el
intervalo de medida. Para los vinos, la CIE propuso un método aproximado más simple
que permitía calcular los parámetros triestímulo (T ג = transmitancia a una ג
determinada):
X= 0.42 T625 + 0.35 T550 + 0.21 T445
Y= 0.20 T625 + 0.63 T550 + 0.17 T495
Z= 0.24 T495 + 0.94 T445
Una vez obtenidos estos parámetros se calcula la proporción de cada uno de
ellos:
X = X / (X+Y+Z)
Y = Y / (X+Y+Z)
Z = Z / (X+Y+Z)
Los valores resultantes (x, y, z) se denominan coordenadas tricromáticas. El
diagrama cartesiano donde se representa (x) e (y) se denomina diagrama de
Resultados y Discusión. Capítulo V.
283 Dora Blanco Vega 2013
cromaticidad donde cada punto (x, y) proporciona la cromaticidad de la muestra,
definida por la longitud de onda dominante (correspondiente a la percepción sensorial
del matiz) y por la pureza (correspondiente a la percepción de saturación). La tercera
dimensión la proporciona (z) que corresponde al porcentaje de luminosidad.
Figura V.1. Diagrama de cromaticidad CIE.
El Sistema CIELAB
En el año 1971 la CIE desarrolló un nuevo espacio cromático a partir de
transformaciones no lineales de los valores triestímulo del sistema CIE de 1931. En
Resultados y Discusión. Capítulo V.
284 Dora Blanco Vega 2013
este nuevo sistema el espacio se define mediante coordenadas rectangulares (L*, a*,
b*) junto con otro espacio de coordenadas cilíndricas (L*, C*, h*). Las relaciones
entre las coordenadas CIELAD y las CIE son:
Figura V. 2. Coordenadas rectangulares del sistema CIELAB.
Resultados y Discusión. Capítulo V.
285 Dora Blanco Vega 2013
Los parámetros (x, y, z) son los valores triestímulo de la muestra y los valores
(x0, y0, z0) lo son del iluminante. El eje L*, representa la luminosidad. El eje a*, una
medida del componente rojo (valores positivos) y verde (valores negativos). El eje b*,
mide el componente amarillo (positivo) y azul (negativo). A partir de los valores de a*
y b* se calculan los valores psicométricos C* (cromaticidad) y h* (ángulo de tono),
relacionado con el término tonalidad o matiz de color:
C* = (a*2 + b*2)½ y h* = arctg (b*/a*)
En este sistema las diferencias de color global entre dos muestras (ΔE) se
calculan con la expresión:
ΔE = [(ΔL*)2 + (Δa*)2 + (Δb*)2]
MÉTODO DE PURIFICACION Y CONCENTRACION POR FCPC
Cromatografía de reparto centrífuga es una técnica de cromatografía líquida-
líquida. El Cromatógrafo de Particionamiento centrífugo hace por lo tanto funciones
basadas en los principios de la cromatografía de partición líquido/líquido: dos fases
líquidas inmiscibles se mezclan juntas para formar un sistema de dos fases, y luego se
separan varias veces. Los solutos individuales están aislados sobre la base de los
diferentes coeficientes de reparto de cada compuesto, en este sistema de dos fases.
Una de las fases líquidas del sistema de dos fases se utiliza como una fase
líquida estacionaria: se alimenta a la columna (el rotor) mientras que la última está
girando a velocidad de rotación moderada. La fase estacionaria se mantiene dentro del
rotor por la fuerza centrífuga generada.
La segunda fase del sistema de dos fases, se utiliza como la fase móvil y
contiene los solutos que se extrajeron. Se alimenta a presión en el rotor y se bombea
a través de la fase estacionaria.
Es en ese momento cuando se produce el intercambio de moléculas entre las dos
fases La separación de los solutos se logra como una función del coeficiente de
partición específica (Kd) de cada soluto entre las fases móvil y estacionaria. La fase
móvil se decanta a continuación, en cada salida de la célula entrando así en la
siguiente celda.
Resultados y Discusión. Capítulo V.
286 Dora Blanco Vega 2013
Las fracciones eluídas de las fases móvil y estacionaria se recogen durante un
período de varios minutos a varias horas. Estas fracciones, o eluidos, contendrán los
solutos purificados individuales.
Figura V. 3. Funcionamiento del cromatógrafo FCPC.
El rotor del Cromatógrafo de FCPC se compone de varios discos celulares
individuales, cuyo número varía en función del proceso.
La cromatografía de reparto centrífuga es una técnica de cromatografía
preparativa. Es una alternativa a las técnicas de purificación clásicas tales como la
HPLC preparativa (cromatografía líquida de alto rendimiento) o cromatografía Flash.
La cromatografía de reparto centrífuga se puede utilizar para:
La purificación final (pureza> 99,5%) de las moléculas de derivados de
extractos naturales, sintéticos o mezclas de matrices biológicas.
Fraccionamiento o pre-fraccionamiento de extractos crudos altamente
complejos.
Extracción líquido-líquido utilizando los prototipos de extractores
centrífugos de particiones de nuevo desarrollo (CPE).
Resultados y Discusión. Capítulo V.
287 Dora Blanco Vega 2013
KEYWORDS: red wine, color, pyranoanthocyanins, diacetyl, LC-MS, UV−vis, NMR
Resultados y Discusión. Capítulo V.
288 Dora Blanco Vega 2013
INTRODUCTION
Red wine color chemistry has been attracted for decades the attention of many
researchers.1 In addition to the early proposed formation of polymeric pigments by
reaction between anthocyanins and tannins, a new class of non-polymeric pigments
have gained position in this field, namely the so called pyranoanthocyanins. The
general pathway of pyranoanthocyanin formation involves an anthocyanin and a
compound having a polarisable double bound (pyranoanthocyanin precursor) that react
to give rise to a new pyrano ring fused to the anthocyanin molecule.2 Many
pyranoanthocyanin precursors have been identified, including those derived from some
yeast metabolites produced during alcoholic fermentation (e.g., pyruvic acid or
acetaldehyde) and also other compounds generated from grape phenolics over wine
aging (e.g., free hydroxycinnamic acids or 8-vinyl-flavanols). Pyranoanthocyanins have
been also found in other natural sources or their processed products.2 In recent years,
some pyranoanthocyanins with the simplest structures (A-type vitisins or 10-carboxy-
pyranoanthocyanins, and 10-methyl-pyranoanthocyanins) have been identified as the
starting point for the formation of more complex pyranoanthocyanins,3-8 or their
transformation into other kinds of non-red pigments.9,10
The contribution of pyranoanthocyanins to total red wine color has been largely
suggested on the basis of their color stability in comparison to grape anthocyanins
from which they derived. Several studies on aqueous solution equilibria in which
pyranoanthocyanins are involved have demonstrated they are more resistant than
anthocyanins from which they derive with regard to both the hydration of the red
colored flavylium cation (leading to the formation of colorless hemiacetal form) and
bleaching by bisulfite.5,11-17 The aforementioned studies supported that almost all the
pyranoanthocyanins molecules present in wines really contribute to red wine color, as
they predominantly occur at wine pH conditions as red-orange colored flavylium
cations without significant variations due to changes in pH or bisulfite addition.
In a previous study dealing with the formation of diverse pyranoanthocyanins in
a model wine, we suggested the formation of a new member of this pigment family
obtained from diacetyl, a secondary product of lactic acid bacteria metabolism, which
was tentatively assigned as 10-acetyl-pyranoanthocyanins.18 In addition, we also
found evidence of the occurrence of 10-acetyl-pyranoanthocyanins in real red wine
Resultados y Discusión. Capítulo V.
289 Dora Blanco Vega 2013
samples. In order to ascertain the role in red wine color of this new kind of pigment
derived from grape anthocyanins and fermentation metabolites, the aim of our work
was the synthesis and isolation of 10-acetyl-pyranoanthocyanins in order to confirm
the suggested structure and also to study their chromatic characteristics under
variable pH conditions and resistance to bleaching by bisulfite.
MATERIALS AND METHODS
Chemicals
All solvents were of HPLC quality and water was of MilliQ® quality. Malvidin 3-
glucoside (PhytoLab, Vestenbergsgreuth, Germany) was used as standard for
quantification of anthocyanins in red grape skin extracts. Diacetyl (2,3-butanedione; ≥
99.0%, Fluka) was the reagent used for the formation of 10-acetyl-
pyranoanthocyanins from grape skin anthocyanins.
Red Grape Skin Extracts
Red grapes of V. vinifera Garnacha Tintorera variety were chosen because of its
unique anthocyanin profile: similar high proportions of peonidin- and malvidin-based
anthocyanins, mainly occurring as non-acylated derivatives. Batches of 100 g of
healthy red grapes were collected at technological maturity and finger pressed to
remove the pulp and the seeds. The remaining skins were washed in water (3 x 25
mL) and softly dried twice by patting them between sheets of filter paper. The dried
skins were extracted with 100 mL of a mixture 50:48.5:1.5 (v/v) of
CH3OH/H2O/HCOOH,19 using a homogenizer (Heidolph DIAX 900) for 2 min and then
centrifuging at 2500g at 5 ºC for 15 min. The supernatant of this crude grape skin
extract was stored at -20 ºC until using.
Purification of Red Grape Skin Extracts
Anthocyanins present in red grape skin extracts were isolated, in order to
prevent interferences during the formation reaction of 10-acetyl-pyranoanthocyanins.
The separation procedure was adapted from the SPE method developed for isolation of
grape skin flavonols,19 but this time the interest was focussed in the recovery of the
retained anthocyanins by cation exchanging. The crude grape skin extract (3 mL) was
firstly dried in a rotary evaporator (35 ºC), then re-dissolved in 0.1 N HCl (3 mL) and
Resultados y Discusión. Capítulo V.
290 Dora Blanco Vega 2013
passed through the MCX cartridges (Waters) previously conditioned with 5 mL of
methanol and 5 mL of water. After washing with 5 mL of 0.1 N HCl and 5 mL of water,
the non-anthocyanin phenolic compounds were eluted with 3 x 5 mL of methanol.
Fixed anthocyanins were removed using 3 x 5 mL of 2% (w/v) ammonia in methanol-
water (80:20 v/v), and the cationic exchanger material was regenerated with 3 x 5 mL
of 2% (w/v) hydrochloric acid in methanol-water (80:20 v/v). The anthocyanin eluate
(deep blue color solution) was immediately acidified by adding HCl 4N until intense red
color was regenerated. After drying in rotary evaporator (35 ºC), anthocyanins were
solved in acetone (5 mL) and excess of ammonium chloride was eliminated by
filtration. A further purification by SPE on C18 cartridges (Sep Pack, Merck) was
necessary to completely removing of salts: after removing of acetone in a rotary
evaporator (35 ºC), the residue was re-dissolved in 0.1N HCl and applied to a the SPE
cartridge, previously conditioned with 5 mL of methanol and 5 mL of water; the
purified anthocyanins were recovered with 2% HCl in methanol and stored at -20 ºC
until use.
Reaction of Formation of 10-Acetyl-Pyranoanthocyanins
Reaction conditions described for the synthesis of 10-carboxy-pyranomalvidin-3-
glucoside12 were adapted for improving reaction yield. The adequate volume of purified
grape skin extract that contained 100 mg of total anthocyanins (as malvidin-3-
glucoside equivalents) was dried in rotary evaporator (35 ºC). The solid residue was
dissolved in water (50 mL) in an amber glass bottle (60 mL) and pH was adjusted to
2.5 with HCl 1N. Further addition of diacetyl (9.85 mL) was made to obtain a molar
ratio diacetyl:anthocyanin of 500:1 with regard to the total anthocyanin concentration
(2000 mg/L of mv-3-glc equivalents). After closing of the bottle, the reaction mixture
was gently blended and allowed to react in an oven at 35 ºC. The reaction was
stopped after maximum chromatographic yield was reached (usually 17-18 h) by
cooling and removing the excess of diacetyl. Thus, the reaction mixture was applied to
a chromatographic glass column (2.5 x 30 cm) filled with Amberlite XAD-7 (2 h
methanolic suspension, followed by filling of the column and rinsing with 2 x 125 mL
water). First wash with methanol-water (25:75 v/v) removed excess diacetyl (yellow
eluate) and non-reacted anthocyanins (orange eluate). Further elution with methanol-
water (40:60 v/v) yielded a fraction containing the expected reaction products (red-
purple eluate) that were submitted to countercurrent chromatography in the next step.
Resultados y Discusión. Capítulo V.
291 Dora Blanco Vega 2013
Fractionation of Main Reaction Products by Fast Centrifugal Partition
Chromatography (FCPC)
Countercurrent chromatography was carried out using a Fast Centrifugal
Partition Chromatography system model FCPC-200 (Kromatron, France) with a total
rotor volume of 198 mL and 840 partition cells. The FCPC system was connected to a
semi-preparative ternary pump model BETA-50 (ECOM, Czech Republic), a UV-Vis
detector model Flash 06S DAD 600 (ECOM, Czech Republic) and a fraction collector
model CHF122SC (Advantec, USA). Samples were manually injected from a 10 mL
loop through a 3725i Rheodyne valve (USA).
Separation was carried out using a gradient of a ternary biphasic solvent system
composed by ethyl acetate, 1-butanol and water and operating the FCPC system in
ascending mode, at a flow rate of 5 mL/min and a rotor speed of 1750 rpm, as
modified from Renault et al.20 Phases composition was as follows: stationary phase,
ethyl acetate-1-butanol-water (4:5:91 v/v); mobile phase A, ethyl acetate-1-butanol-
water (77:15:8 v/v); mobile phase B, ethyl acetate-1-butanol-water (40:46:14 v/v).
Each phase was acidified with 0.1% trifluoroacetic acid. Sample was injected dissolved
in 10 mL of a mixture of stationary phase and mobile phase A (50:50 v/v). The linear
gradient was as follows: zero min, 100% mobile phase A; 90 min, 100% mobile phase
B; 115 min, 100% mobile phase B. Fractions of 10 mL were collected every 2 min
from minute 12. Detection was performed at 280 and 520 nm.
Composition of the fractions was determined using HPLC-DAD-ESI-MS/MS and
those containing the compounds of interest were stored at -20 ºC until further
purification. Two main fractions were collected containing the main produced 10-
acetyl-pyranoanthocyanins derived from the main anthocyanins present in grape skin
extracts, namely the 3-glucosides of malvidin and peonidin.
Semi-Preparative HPLC Purification of Main Produced 10-Acetyl-
Pyranoanthocyanins
FCPC fractions enriched in 10-acetyl-pyranoanthocyanins were purified using a
semi-preparative HPLC system composed by two HPLC pumps model 510, a gradient
controller model 600, a manual injector model U6K and an UV-Vis detector model
PDA-996 all from Waters (USA) and controlled by the Millenium v. 3.2 software
(Waters, USA). Volume injection was 250 µL and separation was carried out in a
Resultados y Discusión. Capítulo V.
292 Dora Blanco Vega 2013
Kromasil C18 column (250 x 10 mm i.d., 5 µm; Análisis Vínicos, Spain), flow 2
mL/min, using a biphasic solvent gradient: phase A, water-acetonitrile-formic acid
(87:3:10 v/v); phase B, water-acetonitrile-formic acid (40:50:10 v/v). The gradient
was as follows: zero min, 75% A; 8 min, 65% A; 18 min, 65% A; 21 min, 0% A; 23
min, 0% A; 25 min, 75% A. Detection was performed at 520 nm and fractions were
manually collected. Fractions containing the purified 10-acetyl-piranoanthocyanins
were dried under vacuum, re-dissolved in 0.1 N HCl methanol and dried again under
vacuum to obtain the compounds as chloride salts, which were stored at -20 ºC until
further use.
Analytical HPLC-DAD-ESI-MS/MS
HPLC separation, identification, and quantification of 10-acetyl-
pyranoanthocyanins were performed on an Agilent 1100 Series system (Agilent,
Germany), equipped with DAD (G1315B) and LC/MSD Trap VL (G2445C VL)
electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS/MS) system, and coupled to an
Agilent Chem Station (version B.01.03) data-processing station. The mass spectra
data were processed with the Agilent LC/MS Trap software (version 5.3). The reaction
mixture samples and semi-preparative HPLC fractions were directly injected after
proper dilution if necessary (HCl 0.1N) whereas the FCPC were previously dried in
rotary evaporator (35 ºC) and re-dissolved in HCl 0.1 N. After filtration (0.20
polyester membrane, Chromafil PET 20/25, Macherey-Nagel, Düren, Germany) the
-phase column Zorbax Eclipse XDB-C18
(2.1 x 150 mm; 3.5
protected with a guard column of XDB-
Germany). The chromatographic conditions were adapted from the OIV method for
analysis of anthocyanins in red wines21 and the detection wavelength was 520 nm. The
solvents were water/acetonitrile/formic acid (87:3:10, v/v/v, solvent A; 40:50:10,
v/v/v, solvent B), and the flow rate was 0.19 mL/min. The linear gradient for solvent B
was: zero min, 6%; 15 min, 30%; 30 min, 50%; 35 min, 60%; 38 min, 60%; 46 min,
6%. For identification, ESI-MS/MS operating parameters were optimized by direct
infusion of solutions of both a standard of malvidin 3-glucoside and
chromatographically pure isolated 10-acetyl-pyranomalvidin-3-glucoside.
Resultados y Discusión. Capítulo V.
293 Dora Blanco Vega 2013
pH Assay
For the pH assay, solutions of each pigment (2 mM) were prepared in 12% (v/v)
aqueous ethanol and added to buffer solutions with different pH values in a range
between 1.0 and 13.0. The solvents used for preparation of the buffer solutions were
0.2 M KCl, 0.1 M HCl, 0.2 M HCl, 0.1 M KHC8O4H4, 0.1 M NaOH, 0.2 M NaOH, 0.1 M
KH2PO4, 0.1 M tris-(hydroxymethyl)-aminomethane, 0.025 M Borax, and 0.05 M
Na2HPO4 according to Robinson and Stokes.22 The final concentration of each pigment
was 0.08 mM. All of the pigments solutions were left to equilibrate for 2 h, and then
spectroscopic absorbance curves were recorded for all of the solutions from 360 to 830
nm with a 1 nm sampling interval, using a 10 mm path-length quartz cell in a
Shimadzu UV-1800 spectrophotometer (Japan).
SO2 Bleaching Assay
The bleaching by SO2 was studied using the pigments solutions at pH 2.0.12 To
these solutions were added different aliquots of an aqueous solution of sodium bisulfite
to achieve SO2 concentrations in the range between 0 and 200 ppm. Spectroscopic
absorbance curves were recorded for all of these solutions from 360 to 830 nm with a
1 nm sampling interval, using a 10 mm path-length quartz cell in a Shimadzu UV-1800
spectrophotometer (Japan).
Molar Extinction Coefficients and CIELAB Color Measurements
Molar extinction coefficients of the isolated 10-acetyl-piranoanthocyanins
according to the Beer-Lambert law were determined using solutions of the pigments in
the concentration range 0.01-0.16 mM at pH 1.0 and pH 3.6 buffers prepared
according to Robinson and Stokes.22 Spectroscopic absorbance curves were recorded
from 360 to 830 nm with a 1 nm sampling interval, using a 10 mm path-length quartz
cell in a Shimadzu UV-1800 spectrophotometer (Japan). Molar extinction coefficients of
each pigment were calculated at two different wavelengths, namely, 520 nm and the
wavelength corresponding to the maximum absorbance of each pigment.
Spectroscopic curves of the 0.08 mM solutions of the pigments at pH 3.6 were used to
determine the color coordinates in the CIELAB color space using CIE D65/10º
illuminant/observer conditions.23 All of the color calculations were performed using a
computer program developed by our group.
Resultados y Discusión. Capítulo V.
294 Dora Blanco Vega 2013
Structure Elucidation by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
The assignment of the proton (1H) and carbon (13C) peaks was done by 1H-NMR,
1H-1H-COSY, 1H-1H-NOESY, 1H-13C-HMQC and 1H-13C-HMBC experiments in CD3OD and
DMSO-d6 containing different proportions of CF3COOD (from 2% to 30%). The NMR
experiments were carried out using a Varian Inova NMR spectrometer operating at
499.772 MHz for 1H and at 125.678 MHz for 13C. The spectrometer was equipped with
a gradient amplifier and a four-nucleus 5 mm 1H{15N-31P}PFG high-field indirect
detection probe. All 1D and 2D experiments (COSY, NOESY, HMQC, and HMBC) were
performed at 298K using standard pulse sequences from the Varian library.
RESULTS AND DISCUSSION
Synthesis and Isolation of the 10-Acetyl-Pyranoanthocyanins
Derivatives Formed from the 3-Glucosides of Peonidin and Malvidin
Starting from the most common reaction conditions found in literature about the
synthesis of pyranoanthocyanins from their anthocyanin precursors,12 we assayed
different conditions in order to increase yield reaction and minimize anthocyanin
thermal degradation and also product degradation following extended reaction time.
We finally found that use of high anthocyanin concentration (2000 mg/L) with a great
excess of diacetyl (molar ratio 500:1 with regard to anthocyanins) during a relatively
short reaction time (18 h) led to the best results in aqueous solution at pH 2.5 and 35
ºC.
The used red grape skin extract contained two main non-acylated anthocyanins
in similar proportions, namely, the 3-glucosides of peonidin and malvidin (pn-3-glc and
mv-3-glc, respectively), together with little amounts of their respective 6”-p-
coumaroylated derivatives.
Resultados y Discusión. Capítulo V.
295 Dora Blanco Vega 2013
Figure V.4. Reaction mixture after 18 h showing the formation of 10-acetyl-
pyranoanthocyanins and the remaining anthocyanin precursors. Abbreviations: pn, peonidin; mv, malvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-cmglc, 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside; pypn, pyranopeonidin; pymv; pyranomalvidin.
When the reaction was stopped, less than 10-19% of initial individual
anthocyanins still remained, and the expected 10-acetyl-pyranoanthocyanins were
observed but their yields were far from quantitative: on the basis of calibration curves
obtained for pn-3-glc and mv-3-glc and their isolated reaction products (the purity of
isolated compounds was checked by HPLC peaks detected at both 520 and 280 nm),
the calculated reaction yields for 10-acetyl-pyranopeonidin-3-glucoside (10-acet-pypn-
3-glc) and 10-acetyl-pyranomalvidin-3-glucoside (10-acet-pymv-3-glc) were 32% and
35%, respectively; in contrast, the estimated yields for their p-coumaroylated
derivatives, 10-acet-pypn-3-cmglc and 10-acet-pymv-3-cmglc, were higher (50% and
63%, respectively), thus suggesting the presence of p-coumaroyl residue could
facilitate the reaction or even stabilize the new pigments formed.
Likely explanations for the aforementioned low reaction yields comprised the well
known thermal degradation of anthocyanins and also the involvement of formed 10-
acetyl-pyranoanthocyanins in further reactions similar to those reported for other
vitisin-like pyranoanthocyanins.3-10
min0 5 10 15 20 25 30
0
25
50
75
100
125
150
175
mAU
pn
-3-g
lc
mv-3
-glc
pn
-3-c
mglc
mv-3
-cm
glc
10-a
cet-
pyp
n-3
-glc
10-a
cet-
pym
v-3
-glc
10-a
cet-
pyp
n-3
-cm
glc
10-a
cet-
pym
v-3
-cm
glc
200
Resultados y Discusión. Capítulo V.
296 Dora Blanco Vega 2013
The fractionation of the reaction mixture by countercurrent chromatography
(Fast Centrifugal Partition Chromatography, FCPC) allowed the separation of almost
pure 10-acet-pymv-3-glc that further was highly purified by semi-preparative HPLC.
However, in the case of 10-acet-pypn-3-glc, FCPC did not allow a proper fractionation,
but semi-preparative HPLC overcame this trouble and also highly pure compound was
obtained. Unfortunately, we had no success in obtaining any fraction enough enriched
in the p-coumaroylated derivatives of 10-acetyl-pyranoanthocyanins
Structure Elucidation of 10-Acetyl-Pyranopeonidin-3-Glucoside and 10-
Acetyl-Pyranomalvidin-3-Glucoside
The on-line UV-vis spectra registered for the new 10-acetyl-pyranoanthocyanins
showed remarkable differences with regards to other previously described structure-
related pyranoanthocyanins bearing a non-phenolic substituent at position C-10 (the
so-called vitisin-type pyranoanthocyanins). For instance, 10-carboxy-
pyranoanthocyanins (also known as A-type vitisins) show well defined visible
absorbance maxima around 505-509 and 511-514 nm for compounds derived from pn-
3-glc and mv-3-glc, respectively, and the analogue 10-methyl-pyranoanthocyanins
have visible absorbance maxima at even lower wavelengths values, around 475-480
and 480-482 nm.18 For most described pyranoanthocyanins, the visible absorbance
maxima are hypsochromically shifted with regard to their anthocyanin precursors and
their color is described as red-orange. However, the synthesized 10-acetyl-
pyranoanthocyanins showed a broad absorbance band with not-well defined
absorbance maxima at similar wavelength values with regards to their anthocyanin
precursors.
Resultados y Discusión. Capítulo V.
297 Dora Blanco Vega 2013
Figure V.5. HPLC on-line DAD UV-vis spectra of 10-acetyl-
pyranoanthocyanins (C, D, G, H) and their respective anthocyanin precursors (A, B, E, F). Abbreviations: pn, peonidin; mv, malvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-cmglc, 3-
(6”-p-coumaroyl)-glucoside; pypn, pyranopeonidin; pymv; pyranomalvidin.
For non-acylated 10-acetyl-pyranoanthocyanins, a broad absorbance band was
observed at 505-522 nm for 10-acet-pypn-3-glc (Figure 2A) and 515-532 nm for 10-
acet-pymv-3-glc (Figure 2B) being the visible absorbance maxima located at the same
wavelength values than their respective anthocyanin precursors. Similar results were
found for p-coumaroylated 10-acetyl-pyranoanthocyanins, with respective broad
visible absorbance bands in the ranges 510-530 nm (Figure 2C) and 520-542 nm
(Figure 2D) and maxima even slightly bathochromically shifted with regard to their
respective anthocyanin precursors. In addition, these p-coumaroylated derivatives
278
522
314
284532
312283
529
315
280
536
315
272
352
527
250
302
270
335380
nm250 300 350 400 450 500 550
Norm.
280
517
250
300 335360
10-acet-pypn-
3-glc
pn-3-glc
nm250 300 350 400 450 500 550
0
200
400
600
800
10-acet-pypn-3-cmglc
pn-3-cmglc
nm250 300 350 400 450 500 550
10-acet-pymv-
3-glc
mv-3-glc
528
nm250 300 350 400 450 500 550
10-acet-pymv-
3-cmglc
mv-3-cmglc
Norm.
Norm.Norm.
0
200
400
600
800
0
200
400
600
800
0
200
400
600
800
A) B)
C) D)
Resultados y Discusión. Capítulo V.
298 Dora Blanco Vega 2013
showed the expected absorbance band at 315 nm attributable to the p-coumaroyl
residue that was the most intense band.
Figure V. S1. MS and MS/MS (MS2) spectra of non-acylated (A and B) and
p-coumaroylated (C and D) 10-acetyl-pyranoanthocyanins. Abbreviations: pyrpn, pyranopeonidin; pyrmv; pyranomalvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-cmglc, 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside.
529.2+MS, 10-acet-pyrpn-3-glc
367.2+MS2 (529.5)
559.2+MS, 10-acet-pyrmv-3-glc
397.3+MS2 (559.5)
675.3+MS, 10-acet-pyrpn-3-cmglc
367.2+MS2 (675.6)
705.3+MS, 10-acet-pyrmv-3-cmglc
397.2+MS2 (705.7)
0
1
x107
Intens.
0
2
4
x106
0
2
4x107
0.5
1.0
x107
0
0.5
x107
0
2
4
x106
0
0.5
1.0
x107
0
0.5
1.0
x107
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
A)
B)
C)
D)
-162 (glc-H2O)
-308 (cmglc-H2O)
-162 (glc-H2O)
-308 (cmglc-H2O)
Resultados y Discusión. Capítulo V.
299 Dora Blanco Vega 2013
Mass spectrometry data were in agreement with the suggested structures of 10-
acetyl-pyranoanthocyanins. The MS spectra in positive ionization mode showed the
expected m/z signals attributable to the molecular ions of the flavylium cation form in
which these compounds predominantly might exist in the acidic medium used for their
elution.
Moreover, the MS/MS spectra (positive ionization mode) showed the expected
fragmentation pattern common to pyranoanthocyanins and anthocyanins, namely, the
breaking of the glucosidic bond at C-3 with a neutral loss of glucose (fragment loss of
162 amu) for non-acylated glucosides and a neutral loss of the entire 6”-p-coumaroyl-
glucose residue (fragment loss of 308 amu), without intermediate fragmentation of the
ester bond, in the case of p-coumaroylated glucosides.18 In both cases, the resulting
MS/MS fragment ions appeared at the expected m/z values of the aglycons 10-acetyl-
pyranopeonidin (m/z of 367) and 10-acetyl-pyranomalvidin (m/z of 397).
Definitive evidence supporting the expected structures of 10-acetyl-
pyanoanthocyanins was provided by the NMR spectra obtained for the two non-
acylated main reaction products that could be isolated in enough amount, 10-acet-
pypn-3-glc. (Table 1) and 10-acet-pymv-3-glc (table2).
Resultados y Discusión. Capítulo V.
300 Dora Blanco Vega 2013
Table V.1. NMR Spectroscopic Data Registered in CD3OD-CF3COOD (70:30,
v/v) for 10-Acetyl-Pyranopeonidin-3-O- -Glucoside: 1H Data (Chemical Shifts in ppm and Coupling Constants in Hz), 13C Data (Chemical Shifts in ppm), and 1H-13C Correlation Experiments at One Bond (HMQC) and More than One Bond (HMBC).
Resultados y Discusión. Capítulo V.
301 Dora Blanco Vega 2013
Resultados y Discusión. Capítulo V.
302 Dora Blanco Vega 2013
Table V. 2. NMR Spectroscopic Data Registered in (A) DMSO-d6-CF3COOD (80:20) and (B) CD3OD-CF3COOD (70:30) for 10-Acetyl-Pyranomalvidin-3-O- -Glucoside: 1H Data (Chemical Shifts in ppm and Coupling Constants in Hz), 13C Data (Chemical Shifts in ppm), and 1H-13C Correlation Experiments at One Bond (HMQC) and More than One Bond (HMBC).
The NMR spectra were registered in acidic medium to promote the almost quantitative
predominance of the flavylium cation form. The obtained NMR data were in
Resultados y Discusión. Capítulo V.
303 Dora Blanco Vega 2013
concordance with reported data for structurally related compounds, as the 10-carboxy-
pyranoanthocyanins.12,24
The evidence of formation of the new pyrano D-ring was supported by the
absence of any signal attributable to H-4 which was present in the anthocyanin
precursors. In addition, a new signal appeared at 7.90-7.97 ppm having an integral
value corresponding to 1 proton and which was not coupled with any other proton; this
new signal was assigned to H-9 of the new D-ring. The recording of the 1H-NMR
spectrum of 10-acet-pymv-3-glc in CF3COOD-DMSO-d6 (20:80) after 15 h of storage at
25 ºC gave additional supporting evidence to the suggested structure of
pyranoanthocyanin
Figure V. S2. 1H-NMR signals corresponding to the aromatic protons in rings A (H-6 and H-8), B (H-2’ and H-6’), and D (H-9) for spectra of 10-acet-pyrmv-3-glc registered in DMSO-d6 with 20% CF3COOD: A) fresh solution; B) solution stored at
7.68.0 7.2
A)
B)
H-9
H-2’H-6’
H-8
H-6
H-9
H-2’H-6’
H-8 H-6
*
* *
Resultados y Discusión. Capítulo V.
304 Dora Blanco Vega 2013
25ºC during 15 hours (asterisks indicates signals of free aglycon released by acid hydrolysis of glucosidic bond during storage).
A decrease in the intensity of the signal attributable to H-9 of the new formed
D-ring was observed after this time. Hydrogen-deuterium (H-D) exchange in CD3OD
has been reported for anthocyanin positions H-6 and H-8, whereas for A-type vitisins
(10-carboxy-pyranoanthocyanins) the latter positions do not exchange but the position
H-9 does,25 with a half-life for the H-D exchange of 25 hours in the latter case. For 10-
acet-pymv-3-glc the signal intensity for H-9 decreased by 71% of its initial value after
15 h, thus suggesting that H-D exchange in this type of pyranoanthocyanins is faster
than those described for A-type vitisins. Moreover, the signal at 2.64-2.65 ppm was
not coupled with any other signal and integrated for 3 protons, thus being compatible
to the expected acetyl group at C-10 position of the new D-ring. The integral value of
signals attributable to methoxy groups, together with chemical shifts and signal
multiplicity (proton-proton coupling constants) assigned to protons of B-ring allowed
the confirmation of the corresponding peonidin- and malvidin substitution patterns.
Finally, the chemical shifts and, especially, the proton-proton coupling constants
values attributable to the glucosidic moiety were compatible, in both cases, with a
glucose linked in β anomeric configuration to the pyranoantocyanidin residue. The
linkage position of glucose to pyranoanthocyanidin was confirmed by the detection of
the corresponding long-distance 1H-13C correlation (HMBC experiment) between the
anomeric proton (H-1”) and the carbon at position 3 in C-ring. In summary, the two
main reaction products formed from the reaction of pn-3-glc and mv-3-glc with
diacetyl were 10- acetyl-pyranopeonidin-3-O- β -glucoside (Figure 3A) and 10-acetyl-
pyranomalvidin-3-O- β -glucoside (Figure 3B), respectively.
Resultados y Discusión. Capítulo V.
305 Dora Blanco Vega 2013
Figure V. 6. Chemical structures of synthesized and isolated 10-acetyl-pyranomalvidin-3-O- β -glucoside (A) and 10-acetyl-pyranopeonidin-3-O- β -
glucoside (B) in their flavylium cation forms.
NMR Study of the Different Equilibrium Forms of 10-Acetyl-
Pyranoanthocyanins in Solution
It is well established that both anthocyanins and pyranoanthocyanins are
involved in several equilibria in solution. In fact, the use of NMR spectroscopy for
structure elucidation of pyranoanthocyanins works easier if only one of all possible
forms are present in solution at the moment of spectroscopic analysis. As usual in the
NMR analysis of these compounds, a strong acidic medium (trifluoroacetic acid in
proportions 2-10%), mainly in non-aqueous solvents (DMSO-d6 or CD3OD) allows that
only the flavylium cation form was occurring and, subsequently, most of reported NMR
data for anthocyanins and pyranoanthocyanins are those of their flavylium cation
forms.
However, the recording of NMR spectra of the isolated 10-acetyl-
pyranoanthocyanins using up to 10% CF3COOD in both CD3OD and DMSO-d6 always
resulted in a mixture of the expected signals attributable to the flavylium cation form
together with two set of signals occurring in similar proportions (Figure 4A) which were
tentatively assigned to neutral hemiacetal forms.
A) B)
Resultados y Discusión. Capítulo V.
306 Dora Blanco Vega 2013
Figure V.7.. 1H-NMR signals corresponding to the anomeric (H-1”) and aromatic protons in
rings A (H-6 and H-8), B (H-2’ and H-6’), and D (H-9) for spectra of 10-acetyl-
pyranoanthocyanins registered in different solvents: A) 10-acet-pymv-3-glc in CD3OD with 2%
CF3COOD (asterisks indicate signals assigned to hemiacetal forms); B) 10-acet-pymv-3-glc in
DMSO-d6 with 20% CF3COOD; C) anomeric proton (H-1”) section of 10-acet-pypn-3-glc spectra in
CD3OD with variable proportions (5-30%) of CF3COOD. Abbreviations: f, flavylium cation form;
hm, hemiacetal form.
A) B)
7.58.0 7.58.0 4.64.84.64.8
H-1”H-1”
H-9
H-2’H-6’
H-8H-6
H-9
H-2’H-6’
H-8H-6
* * * **
*
* *
4.7 4.7
C)
*
H-1” f
H-1” hm-a
H-1”
hm-b5% CF3COOD
10% CF3COOD
20% CF3COOD
30% CF3COOD
ppm ppm
ppm
ppm
ppm
A) B)
7.58.0 7.58.0 4.64.84.64.8
H-1”H-1”
H-9
H-2’H-6’
H-8H-6
H-9
H-2’H-6’
H-8H-6
* * * **
*
* *
4.7 4.7
C)
*
H-1” f
H-1” hm-a
H-1”
hm-b5% CF3COOD
10% CF3COOD
20% CF3COOD
30% CF3COOD
ppm ppm
ppm
ppm
ppm
Resultados y Discusión. Capítulo V.
307 Dora Blanco Vega 2013
The mixture of different forms in equilibrium was quite evident with regard to
the signal attributable to the anomeric proton (H-1”) of the glucose residue, which
appeared as a set of three signals (three doublets with identical constant coupling):
the most intense was assigned to the flavylium cation form, whereas the other two of
similar intensity were assigned to the two possible epimeric isomers of the resulting
hemiacetal forms following hydration of flavylium cation form.26 One proof supporting
that we were dealing with a mixture of different forms in equilibrium was given by the
increase of the anomeric proton signal of flavylium cation form (H-1” f) and the
parallel decrease of both signals of epimeric hemiacetal forms (H-1” hm-a and hm-b)
when the percentage of CF3COOD was increased (Figure 4C). The set of signals
attributable to hemiacetal forms was still present as traces in the NMR spectrum
recorded in CF3COOD-CD3OD (30:70) but they totally disappeared using CF3COOD-
DMSO-d6 (20:80) (Figure 4B). Unfortunately, the use of CF3COOD-DMSO-d6 (20:80)
resulted in some extent of hydrolysis of the glucosidic bond after several hours (Figure
S2), as confirmed by chromatographic analysis, thus making unable the use of this
solvent for recording of low sensitive, time-consuming, 13C-NMR spectra.
Additional evidence supporting the existence of the aforementioned suggested
equilibrium was achieved by 2D NOESY NMR experiment performed with 10-acet-
pypn-3-glc in CF3COOD-CD3OD (5:95). Besides negative NOE cross-peaks, we
observed additional positive cross-peaks that are caused by chemical exchange
between the two hemiacetal forms and the same flavylium cation form of 10-acetyl-
pyranoanthocyanins.26 Due to the similar values of chemical shifts attributable to the
anomeric proton signals for both flavylium and hemiacetal forms (Figure 4C), it was
not possible to clearly observe the expected cross-peaks because they were almost
indistinguishable from the correlation diagonal. Fortunately, clear positive cross-peaks
could be detected for the signals assigned to the different forms of 10-acetyl protons.
Resultados y Discusión. Capítulo V.
308 Dora Blanco Vega 2013
Table V. 3. Chemical Shifts of Nuclei (1H and 13C) Showing the Greatest
Differences with Regard to Compound 10-Acetyl-Pyranomalvidin-3-O--Glucoside
was in the Flavylium Cation (f) or Epimeric Hemiacetal (hm-a and hm-b) Forms. Spectrum Registered in CD3OD-CF3COOD (98:2).
As also found for anthocyanins,26 the chemical exchange was not observed
between the two epimeric hemiacetal forms.
The sample of 10-acet-pymv-3-glc used for registration of NMR spectra in
CD3OD with increasing proportions of CF3COOD showed a new chromatographic peak,
eluting 5.92 min later, following several hours of storage after the recording of NMR
spectra
Resultados y Discusión. Capítulo V.
309 Dora Blanco Vega 2013
Figure V.8.. Chromatogram (detection at 520 nm) corresponding to the sample of 10-acet-pymv-3-glc just after recording the 1H-NMR in CD3OD with 30% of CF3COOD. It is also shown the on-line UV-vis spectra of 10-acet-pymv-3-glc (17.750 min) and newly formed compound (23.667 min), as well as the suggested
chemical structure of 10-(1´,1´-dimethoxy)-ethyl-pymv-3-glc for the latter.
However, in this case, the characteristics of UV-vis spectrum (shape and value of
maximum absorbance wavelength) were closer to those described for A- and B-type
vitisins and 10-methyl-pymv-3-glc,18 showing a maximum at 498 nm. In addition, this
peak disappeared after drying of the sample and re-dissolution in HCl 0.1 N in
methanol. The MS spectra of this new compound showed a similar fragmentation
pattern than 10-acet-pymv-3-glc, but all signals were increased in 46 amu: molecular
ion at m/z 605 that originated a fragment ion at m/z 443 after loss of a neutral
glucose residue (162 amu). These results suggested that the new formed compound
was likely the product of the addition of two molecules of methanol to the carbonyl of
the 10-acetyl substituent of 10-acet-pymv-3-glc, that is, the new compound should be
10-(1´,1´-dimethoxy)-ethyl-pymv-3-glc. This kind of derivative was also observed
when 10-acet-pypn-3-glc was kept in methanolic solution with 30% CF3COOH for 48
hours at room temperature. A minor new chromatographic peak appeared eluting 5.93
min later, showing a visible absorbance maximum at 491 nm, and having a molecular
ion at m/z 575 that further fragmented resulting in a product ion at m/z 413 (again
the same m/z values for molecular and fragment ions than 10-acet-pypn-3-glc, but
both increased in 46 amu). The formation of these dimethoxy derivatives suggested
the high reactivity of the carbonyl of the 10-acetyl substituent of 10-acetyl-
min0 5 10 15 20 25 30 35 40
mAU
0
100
200
300
400
500
600 17.7
50
23.6
67
nm250 300 350 400 450 500 550
Norm.
0
100
200
300
400
500
600 23.667 min
17.750 min498 530
Resultados y Discusión. Capítulo V.
310 Dora Blanco Vega 2013
pyranoanthocyanins. This question will be discussed later with regard to the results of
stability of these pigments towards SO2 bleaching.
Looking back to the suggested occurrence of hemiacetal forms of 10-acetyl-
pyranoanthocyanins detected in the 1H-NMR spectra of these compounds, it is
necessary to remark that two possible positions are available for hydration of the
flavylium cation form, namely, positions C-2 and C-10 .
Figure V. S3. Resonance forms of 10-acet-pyrmv-3-glc involving oxygen
atoms of rings C and D, and suggested formation of hemiacetals of this compound at positions C-2 and C-10.
Resultados y Discusión. Capítulo V.
311 Dora Blanco Vega 2013
Previous studies have demonstrated that the presence of new D-ring in
pyranoanthocyanins increases their stability towards nucleophilic attack of water
(resulting in the formation of hemiacetal forms) or bisulfite ion, both resulting in color
loss (bleaching), in comparison to their anthocyanin precursors.27-29 Moreover, several
studies had reported that pyranoanthocyanins were only involved in proton transfer
equilibria and the formation of hemiacetal forms had been not observed.14,15 However,
vitisin A has been suggested to form the hemiacetal forms at both C-2 and C-10
position;13 more recently, a study reported that 10-methyl-pyranomalvidin-3-glucoside
in weak acidic (pH 5) aqueous medium could give rise to a minor hemiacetal form
together with the flavylium cation and neutral quinoidal base forms, but the position of
nucleophilic addition was not specified.17
An in-depth analysis of NMR spectra of 10-acet-pymv-3-glc in CD3OD-CF3COOD
(98:2) (the less acidic medium assayed, thus favoring the formation of hemiacetal
forms) provided enough evidence to suggest that the hemiacetal forms were formed
by nucleophilic attack of water to C-10, thus originating a mixture of two epimeric
isomers in similar proportions. The key was to determine whether, as a result of
hemiacetal formation, the chemical shift of the possibly involved carbon (C-2 or C-10)
was affected. NMR studies dealing with anthocyanins have determined that hemiacetal
formation is located in C-2, because an upfield shift (lower value of chemical shift) of
61 ppm was observed for this nucleus as compared to its anthocyanin precursor.26 The
long-distance 1H-13C correlation experiments allowed to determine the chemical shifts
of the nuclei involved in the possible location of hydration position for both the
flavylium cation and the two epimeric hemiacetal forms.
Resultados y Discusión. Capítulo V.
312 Dora Blanco Vega 2013
Figure V. S4. Long-distance 1H-13C correlations (HMBC experiment)
detected for the hemiacetalic form of 10-acet-pyrmv-3-glc involving nuclei susceptible to hemiacetal formation (C-2 and C-10).
(Table 3). Chemical shift values of carbon nuclei of B-ring (C-1´; C-3´and 5´; C-
4´) and C-2 assigned to hemiacetal forms differed little with regard to those
corresponding to flavylium cation form. However, the chemical shift of C-10 assigned
to hemiacetal forms was upfield shifted by 60.7 ppm with regard to the value for its
flavylium cation form. In addition, other nuclei showed lower upfield shifts (carbonyl
carbon of acetyl group) or even did not change their chemical shift values in their
hemiacetal forms as compared to their corresponding flavylium cation form. The
aforementioned results strongly evidenced that hydration position of 10-acetyl-
pyranoanthocyanins is located at C-10.
Resultados y Discusión. Capítulo V.
313 Dora Blanco Vega 2013
Color Properties of 10-Acetyl-Pyranopeonidin-3-Glucoside and 10-
Acetyl-Pyranomalvidin-3-Glucoside
Anthocyanins are unstable compounds involved in several acidic-basic equilibria
in aqueous solution and also suffer nucleophilic attack to positions C-2 and C-4 of its
flavylium cation form.30 With regard to acidic-basic equilibria, the red-colored flavylium
cation form predominates in strong acidic medium. As pH increases, this cationic form
losses protons to form, successively, the blue-colored neutral and anionic quinoidal
bases. Pyranoanthocyanins are also involved in those aforementioned acidic-basic
equilibria.5,11-17 With regard to nucleophilic attack, position C-2 is the preferred for
water as nucleophilic agent whereas C-4 is the only available position for bisulfite
because the steric hindrance of position C-2.31 In both cases, the formed adduct
breaks the aromaticity of C-ring and the resulting compound is colorless (bleaching
effect). The ability of bisulfite bleaching is apparently lost by pyranoanthocyanins
because the position C-4 is involved in the formation of the new D-ring and is not
available for nucleophilic attack. Moreover, the nucleophilic attack of water to position
C-2 of pyranoanthocyanins is notably decreased. For those reasons,
pyranoanthocyanins are described as more stable pigments with regard to their
anthocyanin precursors and it is usual to evaluate how much more stable they are.
The visible spectra of 10-acetyl-pyranoanthocyanins were modified when
registered in aqueous solution in a pH range 1-13 (Figure 6) as it has been also
reported for analogous compounds like vitisin A.13 At strong acidic media (pH < 4.0)
the absorbance maximum were in the range.
Resultados y Discusión. Capítulo V.
314 Dora Blanco Vega 2013
Figure V. 9. Changes in the visible spectra of 10-acetyl-pyranoanthocyanins as a function of pH: A) 10-acet-pymv-3-glc; B) 10-acet-pypn-3-glc.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
360 410 460 510 560 610 660 710 760 810
Ab
sorb
ance
l (nm)
pH 1
pH 2
pH 3
pH 4
pH 5
pH 6
pH 7
pH 8
pH 9
pH 10
pH 11
pH 12
pH 13
A) 10-acet-pymv-3-glc
505
572
604
363
520
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
360 410 460 510 560 610 660 710 760 810
Abs
orba
nce
l (nm)
pH 1
pH 2
pH 3
pH 4
pH 5
pH 6
pH 7
pH 8
pH 9
pH 10
pH 11
pH 12
pH 13
B) 10-acet-pypn-3-glc
500
565
576
360
510
556
Resultados y Discusión. Capítulo V.
315 Dora Blanco Vega 2013
500-505 nm, with the highest value corresponding to pyranomalvidin derivative,
in agreement to previous findings related to the B-ring substitution pattern of vitisin-
type pyranoanthocyanins.18 At those very acidic pH values the flavylium cation form
must predominate but a broadening of the visible absorbance band, together with a
bathochromic shift and a parallel decrease in the absorbance maximum intensity, was
observed following pH increase.
At pH around 4.0 the visible spectra showed a broad absorbance band with
maximum around 510-520 nm. This behavior could be likely explained as the result of
two concurrent processes. On one hand, the formation of hemiacetal forms (colorless
form) that causes decrease in red color intensity as evidenced the NMR data. On the
other hand, the beginning of the deprotonation of the flavylium cation form to give rise
to the neutral quinoidal base (blue-colored form) which was increasing its proportion
as pH value increased up to reach a purple-blue color in weak basic media (around
8.0-9.0), with absorbance maximum at 604 nm for 10-acet-pymv-3-glc (Figure 6A)
and 576 nm for 10-acet-pypn-3-glc (Figure 6B).
At strong basic conditions (pH 10.0-12.0) the neutral quinoidal bases should be
subsequently deprotonated to form the anionic quinoidal base and this process was
accompanied by a hypsochromic shift of the visible absorbance maximum, at around
560 nm. Finally, at pH 13.0 the visible absorbance maximum changed to 360 nm and
the solution was light yellow.
The above mentioned results suggest that at usual red wine pH values (3.5-4.0)
the 10-acetyl-pyranoanthocyanins do not exist exclusively as flavylium cation forms,
being remarkable the contributions of hemiacetal and neutral quinoidal base forms. A
similar behavior has been reported for the analogous pyranoanthocyanin called vitisin
A (10-carboxy-pyranomalvidin-3-glucoside) that at wine pH (3.2-3.8) is in a complex
mixture of neutral and anionic, hydrated and non-hydrated states with the principal
species was the orange quinoidal base.13 Thus, the calculation of molar extinction
coefficients of 10-acetyl-pyranoanthocyanins suggested that these pigments show
similar color hue and intensity than their anthocyanin precursors in real wine
conditions (Table 4). 10-Acetyl-pyranoanthocyanins are red pigments with lower
coloration capacity than anthocyanins at strong acid media (pH 1.0), showing molar
extinction coefficient at 520 nm of 9700 for 10-acet-pymv-3-glc vs. 28100, the value
obtained for mv-3-glc which is also in agreement with literature data.11 However, at
Resultados y Discusión. Capítulo V.
316 Dora Blanco Vega 2013
red wine pH conditions (reference pH value of 3.6) both kinds of pigment showed quite
similar coloration capacity (molar extinction coefficients of 7800 and 10600,
respectively), but the decrease in coloration capacity suffered by mv-3-glc (from pH
1.0 to 3.6) was higher than that of 10-acet-pymv-3-glc (62% and 20%, respectively;
34% in the case of 10-acet-pypn-3-glc). This decrease is likely owing to the formation
of hemiacetal forms, but 10-acetyl-pyranoanthocyanins were more resistant to this
process than their anthocyanin precursors. Moreover, the CIELAB color parameters
calculated at pH 3.6 are a reflection of the aforementioned results.
Table V.4.. CIELAB Color Parameters Measured at pH 3.6 for 0.08 mM Pigment Solutions.
At equal molar concentrations, 10-acet-pymv-3-glc shows color characteristics
very close to those of mv-3-glc, the only difference being a slight lower contribution of
the red component (a*) of the former pigment with parallel lower chroma value (C*).
Finally, the B-ring substitution pattern affected the color characteristics of 10-acetyl-
pyranoanthocyanins, as also found for anthocyanins and other vitisin-type
pyranoanthocyanins:18 on one hand, a bathochromic shift of 8 nm is observed in B-ring
tri-substituted compounds (10-acet-pymv-3-glc) with regard to di-substituted ones
(10-acet-pypn-3-glc), which is independent of the pH value; on the other hand, the
molar extinction coefficient were notably higher for tri-substituted compound (35%
more at pH 1.0; 65% more at pH 3.6). These differences also reflected on the CIELAB
color parameters shown by 10-acet-pypn-3-glc with regard to 10-acet-pymv-3-glc
measured at the same concentration and pH 3.6 (Table 5): its color was less intense
Resultados y Discusión. Capítulo V.
317 Dora Blanco Vega 2013
(higher value of L*) with lower contributions of both red (a*) and blue (b*) color
components.
Figure V. S5. Color shown by aqueous solutions at pH 3.6 and concentration of 0.08 mM of: A) 10-acetyl-pyranomalvidin-3-glucoside; B) 10-acetyl-
pyranopeonidin-3-glucoside.
The behavior of 10-acetyl-pyranoanthocyanins toward SO2 bleaching gave
unexpected results compared with previous studies dealing with other
pyranoanthocyanins .
Firstly, the samples did not bleach after SO2 addition and a hypsochromic shift of
the color hue was observed to red-orange nuances. Moreover, the color intensity
increased in parallel to concentrations of added SO2. The wavelength of absorbance
maximum after addition of SO2 (491 nm for 10-acet-pymv-3-glc and 487 nm for 10-
acet-pypn-3-glc) and the shape of spectra resembled those of vitisin-type
pyranoanthocyanins, especially those of 10-methyl-pyranoanthocyanins.18
A) B)
Resultados y Discusión. Capítulo V.
318 Dora Blanco Vega 2013
Figure V.10.. Changes in the visible spectra of 10-acetyl-pyranoanthocyanins as a function of the concentration of added SO2 at pH 2.0: A)
10-acet-pymv-3-glc; B) 10-acet-pypn-3-glc.
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
360 460 560 660 760
Abso
rban
cia
l (nm)
0 ppm SO2
50 ppm SO2
100 ppm SO2
150 ppm SO2
200 ppm SO2
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
360 410 460 510 560 610 660 710 760 810
Abso
rban
ce
l (nm)
0 ppm SO2
50 ppm SO2
100 ppm SO2
150 ppm SO2
200 ppm SO2
504
491
499
487
A) 10-acet-pymv-3-glc
B) 10-acet-pypn-3-glc
Resultados y Discusión. Capítulo V.
319 Dora Blanco Vega 2013
Figure V. 11. Reaction product of nucleophilic attack of SO2 to 10-acet-pymv-3-glc: A) suggested structure; B) mass spectra (MS, MS2, and MS3).
NMR data have supported that nucleophilic attack of water was in C-10 position
of 10-acetyl-pyranoanthocyanins, but in the case of bisulfite ion (the ionic species
formed by SO2 in acidic aqueous media) it is expected that steric hinderance of the
acetyl group would prevent the formation of an addition compound. Moreover, if
bisulfite attacks happened in C-10, a decrease in color intensity must be observed as
in the case of formation of hemiacetal form. Therefore, bisulfite has to attack another
electrophilic position of the molecule, as the carbonyl of the 10-acetyl substituent.
397.2
559.3
577.2 641.2
663.1
641.2
+MS
559.2 +MS2(641.7)
397.2 +MS3(641.0->559.0)
0
1
2
3
4
5
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0
1
2
3
350 400 450 500 550 600 650 m/z
-162 (-glc-H2O)
-82 (-H2SO3)
397.2
x105
Intens.
x105
x104
A)
B)
Resultados y Discusión. Capítulo V.
320 Dora Blanco Vega 2013
The resulting adduct (Figure 8A) could eliminate the conjugation of acetyl group
with D-ring and the new substituent at C-10 could resemble, in terms of visible
absorption spectrum, the structural features of 10-methyl-pyranoanthocyanins. This
result is in the same way of the finding reported in the latter section dealing with the
formation of dimethoxy derivatives of 10-acetyl-pyranoanthocyanins in acidic
methanolic solutions. Both results suggest a high reactivity of the 10-acetyl group of
this kind of pyranoanthocyanins.
The HPLC chromatograms of samples of 10-acetyl-pyranoanthocyanins treated
with SO2 did not show any additional peak attributable to the suggested adduct with
bisulfite. However, direct injection of reaction mixture in the MS detector allowed the
detection of the expected molecular ion for the suggested adduct (Figure 8B; similar
molecular ion at m/z 611 was observed for the reaction mixture of 10-acetyl-pypn-3-
glc). Moreover, the MS2 spectra showed a fragment ion assignable to 10- acet-pymv-
3-glc by loss of a molecule of H2SO3, and the MS3 spectra give rise to the subsequent
aglycon 10-acet-pymv by loss of the glucose unit. A similar behavior was observed for
the MS2 and MS3 spectra corresponding to the bisulfite adduct formed from 10-acet-
3pypn-3-glc. The aforementioned result suggest that bisulfite adduct is very labile and
it is likely the reason why it was not observed under chromatographic conditions used.
In conclusion, this study describes the synthesis, isolation, structure elucidation
and color properties of a new type of vitisin-like pyranoanthocyanins derived from
analogous grape anthocyanins and diacetyl, the so-called 10-acetyl-
pyranoanthocyanins, which were previously detected in red wines. These pigments
exhibit unusual properties like forming colored adducts with bisulfite. Significant
proportions of these pigments seem to exist on their hemiacetal and quinoidal base
equilibrium forms at weakly acidic pH. At wine pH, the color exhibited by these new
pigments is described as red-purple, in contrast to the most common red-orange color
reported for other vitisin-like pyranoanthocyanins. It would be of interest further
investigation about the factors influencing the formation of 10-acetyl-
pyranoanthocyanins in red wine: extent of diacetyl production by microorganisms
involved in alcoholic and malolactic fermentations; competing reactions of anthocyanin
precursors; and their evolution after formation as suggested by both the low reaction
yields observed in their synthesis and the reported reactivity for other similar vitisin-
like pyranoanthocyanins.
Resultados y Discusión. Capítulo V.
321 Dora Blanco Vega 2013
REFERENCES
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compounds. In Wine Chemistry and Biochemistry; Moreno-Arribas, M. V., Polo, M. C.,
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Funding
Authors Sergio Gómez-Alonso and M. Victoria Gómez thank the Fondo Social
Europeo and Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha for co-founding of their
contracts through the INCRECYT program.
DISCUSIÓN
GENERAL
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
327 Dora Blanco Vega 2013
DISCUSIÓN GENERAL
No cabe duda de que el color de los vinos tintos y rosados es una característica
que influye de manera primordial en la calidad de estos vinos. El color suele ser la
primera característica sensorial que los consumidores perciben de un vino y puede
condicionar en gran medida la valoración global que se le otorgue. En el caso de
consumidores no expertos, el color puede meramente conducir a tomar decisiones en
el ámbito de las preferencias personales de cada individuo. En cambio, para un
consumidor experimentado el color del vino constituye una herramienta
complementaria que le ayuda a evaluar la calidad de un vino, pudiéndole ofrecer
información de interés sobre las variedades de uvas empleadas, el tipo de elaboración
utilizado o la edad del vino, ayudándole así a interpretar de forma más certera el resto
de sensaciones percibidas y, en suma, a modular la valoración global de los vinos de
una forma más justificada.
Los vinos rosados y tintos deben su color rojo, en sus diversas variantes de
intensidad y tonalidad, a la presencia de unos pigmentos de naturaleza fenólica. Los
pigmentos rojos de los vinos proceden en primera instancia de la materia prima, la
uva, y son denominados antocianos. Durante la elaboración de los vinos, los
antocianos de la uva son transferidos por maceración al mosto-vino en fermentación.
Los antocianos de la uva son sustancias poco estables, bastante reactivas, y desde los
primeros momentos de la vinificación comienza su transformación en pigmentos
derivados antociánicos. El estudio de las nuevas estructuras formadas y del
comportamiento de estos pigmentos en relación a su estabilidad y evolución es objeto
de estudio desde hace bastantes décadas.
Una de las primeras hipótesis formuladas en relación a la evolución y
estabilización del color del vino tinto durante el envejecimiento de éstos fue la
formación de pigmentos antociánicos poliméricos por reacción de los antocianos de las
uvas con los taninos también procedentes de éstas. Esta hipótesis ha sido comprobada
experimentalmente en sistemas modelo y en los propios vinos y explica algunos de las
propiedades del color del vino tinto, como la precipitación de materia colorante y la
resistencia a la decoloración por sulfuroso y a cambios de color por variaciones de pH.
No obstante, en los últimos 20 años se ha sumado a esta hipótesis otra que la
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
328 Dora Blanco Vega 2013
complementa, que considera la formación de pigmentos antociánicos de bajo peso
molecular, con formación de unas nuevas estructuras denominadas piranoantocianos
ya que se forma un nuevo anillo piránico fusionado a la estructura del antociano. A
pesar de la aparente unicidad estructural, en realidad existe una gran diversidad de
piranoantocianos debido a que existen muchas variantes estructurales respecto a la
porción molecular unida al nuevo anillo de pirano formado, incluso hay
piranoantocianos que pueden llegar a adquirir naturaleza casi polimérica, como puede
ser el caso de los 10-flavanol-piranoantocianos.
Son muchos los estudios que se han realizado para identificar las estructuras en
las que pueden encontrarse los piranoantocianos. En los primeros años dedicados al
estudio de este tipo de compuesto se ponía en duda la relevancia de este tipo de
pigmentos en el color del vino tinto, incluso en el caso de vinos tintos envejecidos que
ya habían perdido mucho color por precipitación de pigmentos poliméricos (derivados
de la reacción entre antocianos y taninos). El principal argumento esgrimido era la
baja concentración en que se encontraban los pocos casos entonces conocidos de
estos nuevos pigmentos, normalmente en el rango de unos pocos mg/L, siendo los
mayores valores las pocas decenas de mg/L de vitisina A que se podían encontrar en
vinos tintos de Oporto, cuyo especial procedimiento de elaboración (adición de alcohol
vínico a un mosto tinto a mitad de la fermentación alcohólica) favorecía la formación
de estos derivados. El tiempo ha demostrado que la gama de piranoantocianos es muy
amplia y que, recurriendo al famoso dicho de “muchos pocos hacen un mucho”,
aunque cada uno de ellos se encuentra realmente en cantidades pequeñas, del orden
de algunos mg/L, en conjunto pueden contribuir con cantidades relevantes al color del
vino tinto. No obstante, no se han realizado estudios sistemáticos sobre la composición
en piranoantocianos de vinos tintos, y menos aún estudiado es el contenido de estos
pigmentos en vinos rosados. Esta Tesis ha pretendido, entre sus objetivos, rellenar
este hueco de datos realizando un estudio lo más detallado posible de los
piranoantocianos existentes en un número amplio de muestras de vinos.
Los vinos rosados suelen elaborarse con una corta maceración de las partes de
la uva en un medio que apenas contiene alcohol, por lo que en poco tiempo
(normalmente no excede de las 24 horas) se consigue extraer una pequeña fracción
de los antocianos del hollejo (bastante solubles en medio acuoso de acidez media,
como es el mosto con incipiente fermentación) pero apenas se extraen taninos de los
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
329 Dora Blanco Vega 2013
hollejos y, aún menos, de las pepitas. Por esta razón los vinos rosados tienen un color
rojo menos intenso que los tintos y las sensaciones de astringencia (relacionada con la
presencia de taninos) son prácticamente inexistentes. No obstante, es muy conocida la
evolución del color del vino rosado, con un viraje hacia tonos anaranjados en un
tiempo de envejecimiento relativamente corto. Podría pensarse que en los vinos
rosados la formación de pigmentos poliméricos es poco probable, mientras que sí se
podrían formar pigmentos del tipo piranoantociano, sobre todo derivados de la
reacción de los antocianos con ácidos hidroxicinámicos, un argumento que gana peso
cuando se considera que los piranoantocianos muestran coloraciones más anaranjadas
que los antocianos de partida (coloraciones rojas o con tonalidades ligeramente
púrpuras).
En el Capítulo I se describe el estudio de las características cromáticas y de la
composición en antocianos y piranoantocianos de una muestra de 130 vinos rosados
de 1 y 2 años de edad, elaborados con diversas variedades de uva. Los resultados han
mostrado que en la mayoría de los vinos rosados analizados predominan la
componente roja del color (a*), determinando en gran medida los valores tanto de
cromaticidad (C*) como de ángulo de tono (h*). Los vinos rosados presentaban
coloraciones que, en la mayoría de los casos, podían describirse como rojas con ligeras
tonalidades púrpuras y apenas tonalidades amarillentas (es decir, con una escasa
contribución de la componente amarilla del color, b*).
Las características cromáticas de los vinos rosados pudieron relacionarse con el
hecho de que la mayor parte de los pigmentos presentes en los vinos rosados eran los
antocianos originales de las uvas, cualquiera que fuera la variedad de uva empleada,
estimándose que la proporción de estos antocianos constituía, en término medio, un
76 % del conjunto de antocianos presentes (contenido medio de unos 37 mg/L,
expresado como malvidina 3-glucósido), siendo el contenido en antocianos
decolorables por sulfuroso (asimilables como pigmentos poliméricos o, al menos, como
pigmentos distintos de los antocianos nativos de la uva) muy bajo, con un promedio
del 16 %. De hecho, el antociano nativo de la uva predominante en los vinos rosados
fue malvidina 3-glucósido, que es el antociano habitualmente mayoritario en uvas Vitis
vinifera, hasta el punto que no pudieron diferenciarse de forma satisfactoria los vinos
rosados elaborados con distintas variedades de uva en base a sus perfiles de
antocianos, algo que sí suele ser posible en vinos tintos con hasta 3-5 años de edad. Al
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
330 Dora Blanco Vega 2013
parecer, la predominancia de malvidina 3-glucósido en las uvas sugiere que puede ser
un factor determinante que hace prevalecer su transferencia al vino frente a los otros
antocianos debido al corto tiempo de maceración empleado en la elaboración de vinos
rosados (se podría hablar de una especie de “control cinético” de la transferencia de
antocianos durante la vinificación).
Entre los antocianos no decolorables por el sulfuroso se encuentran los
piranoantocianos. En los vinos rosados analizados se encontró que la vitisina A
(formada por reacción de los antocianos con el ácido pirúvico producido por la
levaduras durante la fermentación) fue el compuesto de este tipo predominante. En
cambio, la formación de hidroxifenil-piranoantocianos, por reacción de ácidos
hidroxicinámicos con antocianos, fue escasa. Si bien las levaduras podrían activar la
formación de piranoantocianos por transformación de algunos derivados
hidroxicinámicos de la uva en 4-vinilfenoles (la llamada vía enzimática de formación),
ésta vía sólo es posible en el caso de los derivados de los ácidos p-cumárico y ferúlico,
pero no con los derivados mayoritarios que son los del ácido cafeico. Hay una segunda
vía de formación de este tipo de piranoantocianos, que supone la liberación de ácidos
hidroxicinámicos por hidrólisis de sus precursores de la uva, y su posterior reacción
directa con los antocianos (la denominada vía química de formación), que es posible
para todos los derivados hidroxicinámicos; no obstante, los ácidos hidroxicinámicos
liberados parece que mostraron mayor tendencia a formar ésteres etílicos, quizá por la
baja concentración en los vinos rosados del otro reactivo necesario, los antocianos.
Por último, las relaciones anteriormente encontradas entre las características
cromáticas de los vinos rosados y su composición en pigmentos antociánicos fueron
corroboradas al comparar vinos de 1 y 2 años de edad. Los vinos rosados más
envejecidos mostraron coloraciones rojas menos intensas y con tonalidades más
anaranjadas, así como un menor contenido en antocianos totales, con una mayor
contribución de los antocianos no decolorables, relacionados estos últimos con
mayores concentraciones de hidroxifenil-piranoantocianos.
El paso siguiente fue estudiar la composición en pigmentos antociánicos de bajo
peso molecular (incluidos los antocianos nativos de la uva) de vinos tintos. En el
Capítulo II se recogen los resultados obtenidos para una amplia muestra de 286
vinos tintos comerciales. Uno de los principales problemas al abordar el estudio de una
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
331 Dora Blanco Vega 2013
gama tan amplia y nutrida de pigmentos del vino tinto es la capacidad de separación e
identificación de todos y cada uno de estos compuestos. Se ha propuesto con
anterioridad la separación de fracciones de pigmentos del vino mediante técnicas
cromatográficas semi-preparativas, que posteriormente permiten realizar un análisis
muy detallado de prácticamente casi todos los pigmentos antociánicos conocidos, e
incluso esta metodología ha permitido la detección de nuevas estructuras presentes de
forma muy minoritaria. Sin embargo, este procedimiento resulta poco práctico cuando
se pretende aplicarlo de forma rutinaria al análisis de un número importante de
muestras de vino. Por esta razón, la metodología analítica empleada en nuestro
estudio consistió en el análisis cromatográfico directo del vino, sin fraccionamiento
previo, y asistido por la detección combinada mediante espectroscopía UV-vis
(detector DAD) y espectrometría de masas multidimensional (ESI-MS/MS). Se
pudieron identificar un total de 90 pigmentos antociánicos correspondientes a tres
grandes tipos de pigmentos (antocianos, aductos tanino-antociano y
piranoantocianos), de los que pudieron cuantificarse hasta 68 de ellos, aunque no para
todas las muestras. El primer resultado destacable es que el contenido en pigmentos
antociánicos de bajo peso molecular fue muy variable y los valores promedios para el
conjunto de todos los vinos oscilaron, para cada tipo de pigmento, dentro de rangos
muy amplios de valores (con valores de desviación standard que fueron de magnitud
similar o mayor que los valores medios): antocianos nativos de la uva, rango de 0.3-
505.0 y valor medio de 93.3 ± 80.2 mg/L, como equivalentes de malvidina 3-glucósido
(mv-3-glc); aductos directos flavanol-antociano, 0.00-3.19 y 1.24 ± 0.59 mg/L, como
mv-3-glc; aductos flavanol-antociano con puente etilideno, 0.00-8.70 y 1.14 ± 1.20
mg/L, como mv-3-glc; vitisinas tipo A, 0.71-49.16 y 7.84 ± 6.25 mg/L, como vitisina
A; vitisinas tipo B, 0.00-16.44 y 1.31 ± 1.87 mg/L, como vitisina B; 10-DHP-
piranoantocianos, 0.00-21.24 y 1.54 ± 2.58 mg/L, como 10-(3’,4’-dihidroxifenil-
piranomalvidina-3-glucósido (10-DHP-pymv-3-glc); 10-HP-pranoantocianos, 0.00-6.82
y 0.71 ± 0.89 mg/L, como 10-(4´-hidroxifenil)-piranomalvidina-3-glucósido (10-HP-
pymv-3-glc); 10-MHP-piranoantocianos, 0.00-1.27 y 0.11 ± 0.24 mg/L, como 10-DHP-
pymv-3-glc; y 10-flavanol-piranoantocianos, 0.00-12.36 y 0.74 ± 1.45 mg/L, como
10-HP-pymv-3-glc.
Entre los posibles factores que pueden contribuir a la amplia diversidad de
resultados obtenidos podrían citarse la variedad de uva empleada, el estado de
maduración (fenólica) de la uva en el momento de la vendimia, la tecnología de
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
332 Dora Blanco Vega 2013
elaboración utilizada (a su vez con múltiples opciones, entre las que se podrían
destacar la duración y el método de maceración empleados), las condiciones de
crianza y/o envejecimiento y/o almacenamiento, así como la edad del vino. Al
comparar vinos jóvenes (1-2 años de edad) se siguieron obteniendo amplios rangos de
contenido en los distintos tipos de pigmentos antociánicos, con ligeras diferencias
según la variedad de uva utilizada pero que no llegaron a ser estadísticamente
significativas, con la única salvedad de los vinos elaborados con la variedad Garnacha
que mostraron las mayores cantidades de hidroxifenil-piranoantocianos, en
consonancia con las altas concentraciones en derivados hidroxicinámicos (precursores
de este tipo de pigmentos antociánicos) que son características de esta variedad de
uva y sus vinos. Otro de los factores que pudieron evaluarse fue la edad de los vinos,
encontrándose que el envejecimiento tendió a uniformizar las pequeñas diferencias en
cuanto a la proporción de los diversos tipos de pigmentos antociánicos que se podían
encontrar entre los diferentes vinos varietales; las únicas pequeñas diferencias que se
encontraron entre vinos varietales tuvieron que ver con las concentraciones de
vitisinas de tipo B, encontrándose los mayores valores en los vinos envejecidos de
Syrah, así como con los 10-HP-piranoantocianos, con mayores concentraciones en los
vinos envejecidos de Merlot. Finalmente, se dispuso de un número suficiente de
muestras de vinos de la variedad Tempranillo (o su sinónima Cencibel) para estudiar la
evolución de las proporciones de las distintas familias de pigmentos antociánicos en
función de la edad. El envejecimiento afectó muy drásticamente a las concentraciones
de antocianos nativos de la uva, que llegaron a desaparecer en vinos con varios años
de edad, pero también lo hicieron el resto de pigmentos antociánicos, aunque de
diferente forma según el tipo de estructura: los aductos flavanol-antociano con puente
etilideno fueron los más afectados y sus proporciones tendieron a contribuir en
proporción cada vez menor conforme aumentaba la edad del vino, mientras que los
pigmentos del tipo hidroxifenil-piranoantociano fueron ganando importancia al
aumentar la edad.
Las conclusiones obtenidas en el Capítulo II, en relación a la edad del vino,
pueden estar fuertemente condicionadas por el hecho de que los vinos estudiados
pertenecían a diferentes vendimias y bodegas, con las consiguientes diferencias
intrínsecas que esto conlleva en cuanto a la composición fenólica inicial de los vinos
que, a su vez, deben afectar a las condiciones de formación de pigmentos antociánicos
de bajo peso molecular: por ejemplo, la competencia con la formación de pigmentos
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
333 Dora Blanco Vega 2013
poliméricos y la propia competencia entre los distintos precursores de los diferentes
tipos de pigmentos considerados. Para intentar arrojar un poco de luz sobre este
asunto, en el Capítulo III se presentan los resultados obtenidos en el estudio
detallado del contenido en vinos Tempranillo del pigmento nativo de la uva más
abundante, malvidina 3-glucósido (mv-3-glc), y de tres de sus derivados del tipo
piranoantociano: vitisina A (10-carboxi-pymv-3-glc) y dos hidroxifenil-
piranoantocianos (10-DHP-pymv-3-glc, o pinotina A; 10-HP-pymv-3-glc). Puesto que
es poco probable tener la oportunidad de analizar los mismos vinos a lo largo de su
envejecimiento durante un periodo de tiempo considerable, la aproximación más
factible consistió en analizar vinos de una misma bodega (elaborados con uvas de los
mismos viñedos y con técnicas enológicas similares) correspondientes a diferentes
vendimias consecutivas (serie vertical de vinos). Así, pudo analizarse una serie vertical
de vinos de hasta 29 años de edad, y también se analizaron vinos comerciales de
diferentes bodegas con edades comprendidas entre 1 y 10 años. De nuevo, se
encontró una gran variabilidad en las concentraciones de los tres piranoantocianos
considerados: vitisina A, 0-10.76 mg/L; pinotina A, 0-4.26 mg/L; 10-HP-pymv-3-glc,
0.03-1.37. El contenido en el antociano nativo mv-3-glc en los vinos jóvenes (1 año)
de la serie vertical fue inicialmente de unos 55-57 mg/L y disminuyó con la edad,
sobre todo a partir del segundo año, hasta alcanzar valores habitualmente muy por
debajo de 15 mg/L en vinos de 2-5 años, y casi desaparecer en vinos más viejos (6
años o más). No obstante en algunos vinos con 4 y 5 años se observaron cantidades
de mv-3-glc relativamente altas (próximos a 15 mg/L) que se atribuyeron al efecto
vendimia, es decir, a que en esos años pudieron darse unas condiciones que
permitieron obtener vinos con mayor contenido en antocianos. En los vinos de esta
serie vertical, la vitisina A (formada durante la fermentación alcohólica) ya se encontró
en las cantidades más altas en los vinos más jóvenes (1 a 3 años) y su concentración
mostró tendencia a disminuir con la edad, si bien se encontraron repuntes en su
concentración (máximos temporales) en vinos con 4 y 8 años que rompieron esta
tendencia, en consonancia con resultados previos reportados por otros autores. El
hidroxifenil-piranoantociano derivado del ácido caféico (pinotina A) no pudo detectarse
en muchos de los vinos de 1 año y en algunos de los vinos de 2 años, mientras que el
derivado similar formado a partir del ácido p-cumárico (10-HP-pymv-3-glc) ya se
encontraba presente en todos los vinos de 1 año, reforzando estos resultados la
hipótesis de que este tipo de pigmentos antociánicos pueden formarse tanto por vía
enzimática (durante la fermentación alcohólica) como química (en todo momento,
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
334 Dora Blanco Vega 2013
especialmente durante el envejecimiento). Ambos hidroxifenil-piranoantocianos
aumentaron sus concentraciones en los primeros años de la serie vertical de vinos,
para después disminuir fuertemente en vinos de 3-4 años, volver a aumentar sus
concentraciones a lo largo de varios años, con algunas interrupciones puntuales, y
finalmente disminuir a valores residuales en vinos muy envejecidos (más de 15 años).
La formación de hidroxifenil-piranoantocianos por vía química, durante el
envejecimiento, debe depender, en principio, de los siguientes factores: por un lado,
de la concentración de ácidos hidroxicinámicos libres (que reaccionan directamente
con los antocianos), como resultado de la hidrólisis de sus precursores procedentes de
la uva (ácidos hidroxicinamoil-tartáricos); de la concentración de antocianos que aún
queden en el vino; y de la competencia con otros reactivos que pueden reaccionar
preferentemente con los antocianos, ya sea por estar en mayor concentración (caso de
los taninos) o por ser más reactivos (caso del ácido pirúvico). En este contexto, al
analizar el conjunto de muestras de vinos comerciales, se encontró una correlación
aceptable entre las concentraciones de pinotina A y de ácido caféico (R2 = 0.623; en el
caso de la serie vertical, R2 = 0.680), lo que constituye una prueba a favor de la vía
química de formación como la principal en el caso de la pinotina A. La correlación
similar entre las concentraciones de 10-HP-pymv-3-glc y ácido p-cumárico no fue tan
buena (R2 = 0.464), sugiriendo que, en este caso, el mecanismo de formación por vía
enzimática contribuyó de manera importante en las primeras fases de elaboración
(fermentación alcohólica). La correlación encontrada para la pinotina A no mejoró
cuando se consideró la concentración combinada de los dos reactivos (ácido cafeico y
mv-3-glc), sugiriendo que los antocianos participan en otras reacciones que compiten
directamente y, al parecer, de forma más eficaz, con la de formación de hidroxifenil-
piranoantocianos. En este sentido, llamó la atención que en algunas de las muestras
de vinos envejecidos (con 4 o más años de edad) se encontraran concentraciones que
eran simultánea e inusualmente elevadas tanto de hidroxifenil-piranoantocianos como
de mv-3-glc. Esto implicaría que en estos vinos se dieron circunstancias, a lo largo del
proceso de envejecimiento, en que coincidieron concentraciones elevadas de
antocianos y ácidos hidroxicinámicos libres, junto con una escasez relevante de
posibles reactivos competidores (v.g., taninos). Como se demostró con la serie vertical
de vinos, en vinos envejecidos la cantidad de antocianos nativos de la uva debe ser
muy baja y la presencia de competidores de los ácidos hidroxicinámicos es pequeña
porque ya reaccionaron con los antocianos. La única posibilidad que prácticamente
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
335 Dora Blanco Vega 2013
queda para explicar los resultados anteriormente comentados es que se hubiera
añadido algo de vino joven (rico en antocianos) a un vino envejecido (pobre en taninos
reactivos y rico en ácidos hidroxicinámicos libres). Esta posibilidad es bastante real,
porque está permitido “refrescar” vinos envejecidos con hasta un 15 % de vino joven,
con idea de mejorar algunas de sus propiedades organolépticas (color y aromas muy
evolucionados). Para probar esta hipótesis, se realizaron experimentos de “refresco”
en vinos modelo que se sometieron a un envejecimiento acelerado. Los resultados
obtenidos demostraron cómo, tras un periodo de latencia en el que, muy
probablemente, los antocianos añadidos con el vino joven reaccionaron con los taninos
del vino envejecido y los incorporados con el vino joven, se constató el esperable
aumento de las concentraciones de pinotina A y de 10-HP-pymv-3-glc, aunque
también estuvo acompañado de un ligero aumento de la concentración de vitisina A.
Entre los resultados anteriormente comentados interesa destacar el periodo de
latencia observado en la formación de hidroxifenil-piranoantocianos en presencia de
taninos, aunque haya disponibles concentraciones elevadas de ácidos hidroxicinámicos
libres. Estos resultados sugieren que la formación de pigmentos antociánicos de bajo
peso molecular está en competencia (termodinámica o/y cinética) con la formación de
pigmentos poliméricos (tanino-antociano). También cabe destacar que los
piranoantocianos de tipo vitisina A se forman rápidamente en las primeras fases de la
elaboración de vinos tintos, en las que también hay cantidades relevantes de taninos,
al menos procedentes del hollejo y más tarde también de las pepitas, por lo que estas
reacciones parecen estar más favorecidas que las de formación de pigmentos
poliméricos. Por tanto, parece interesante conocer más acerca de la cinética de
formación de los distintos tipos de pigmentos antociánicos de bajo peso molecular. A
este interés se le puede sumar la dificultad práctica a la hora de identificar, en los
cromatogramas de muestras reales de vino tinto, los distintos miembros de cada
familia de pigmentos antociánicos, en principio con una complejidad estructural similar
a la de los antocianos a partir de los cuáles se forman (tipo de antocianidina y de
acilación del resto de glucosa). Por todo este conjunto de razones, en el Capítulo IV
se aborda el estudio que se realizó para caracterizar cromatográfica (tiempos de
retención y orden de elución) y espectroscópicamente (espectros UV-vis y MS/MS) las
series completas de piranoantocianos formados a partir de los antocianos de las uvas
(5 antocianidinas; derivados no acilados, acetilados, cumaroilados, y algunos
cafeoilados) y dos grupos de precursores del nuevo anillo de pirano: metabolitos de las
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
336 Dora Blanco Vega 2013
fermentaciones alcohólica (ácido pirúvico, acetaldehído y ácido acetoacético) y
maloláctica (diacetilo) que dan lugar a piranoantocianos de tipo vitisina; y ácidos
hidroxicinámicos (ácidos p-cumárico, caféico, ferúlico y sinápico) que originan
hidroxifenil-piranoantocianos. El estudio se realizó simulando las condiciones de
formación en un vino modelo (extracto de hollejo de uva tinta en vino sintético)
sometido a envejecimiento acelerado.
El ácido pirúvico y el acetaldehído reaccionaron rápidamente con los antocianos,
conduciendo a altos rendimientos de 10-carboxi-piranoantocianos (vitisinas tipo A) en
el primer caso, mientras que el acetaldehído mostró mayor tendencia a favorecer la
formación de pigmentos poliméricos, siendo muy bajos los rendimientos en vitisinas de
tipo B. En contraste, el ácido acetoacético y el diacetilo reaccionaron lentamente y los
rendimientos de los pigmentos correspondientes, 10-metil- y 10-acetil-
piranoantocianos, fueron pobres tras un periodo de envejecimiento acelerado de varias
semanas. Los 10-metil-piranoantocianos también fueron detectados como productos
marginales en la reacción de formación de 10-carboxi-piranoantocianos (a partir de
ácido pirúvico). La reacción de los antocianos con los ácidos hidroxicinámicos fue
progresando paulatinamente, aparentemente sin que se formaran pigmentos
poliméricos. No obstante, la velocidad de la reacción y el rendimiento obtenido de
hidroxifenil-piranoantocianos dependió de la estructura del ácido hidroxicinámico,
observándose que ambos aumentaron al hacerlo el número de sustituyentes hidróxilo
o/y metoxilo (p-cumárico < cafeico < ferúlico < sinápico).
El comportamiento cromatográfico de los derivados piranoantocianos mostró
algunas peculiaridades que se pueden relacionar con su polaridad. En el caso de los del
tipo vitisina, cada derivado eluyó (en condiciones de HPLC en fase reversa, C18) más
tarde (es menos polar) que su antociano precursor en los casos de los derivados no
acilados; en cambio, los derivados acilados eluyeron antes (son más polares) que sus
respectivos antocianos precursores, con el mismo orden de elución mostrado por estos
últimos (no acilados < acetilados < cafeoilados < cumaroilados). Este comportamiento
condujo a que cada serie de piranoantocianos tipo vitisina eluyera dentro del intervalo
de tiempo comprendido entre sus respectivos antocianos precursores de los tipos no
acilado (el más polar de cada serie de antocianos) y cumaroilado (el menos polar de
cada serie de antocianos), contribuyendo a una gran complicación de los
cromatogramas, ya que los picos de las vitisinas aparecieron entre los de los
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
337 Dora Blanco Vega 2013
antocianos de los que se forman. En cambio, los hidroxifenil-piranoantocianos siempre
resultaron ser menos polares que sus antocianos precursores y todos eluyeron más
tarde que éstos, independientemente de si eran acilados o no acilados; aún más, cada
serie eluyó después de la de sus antocianos respectivos, y la única diferencia
encontrada fue que los derivados cafeoilados y los acetilados intercambiaron su orden
de elución (no acilados < cafeoilados < acetilados < cumaroilados) respecto al de los
antocianos.
En cuanto a las propiedades espectroscópicas de los piranoantocianos (pyant)
estudiados, el sustituyente en posición C-10 del nuevo anillo piránico afectó de manera
muy acusada al máximo de absorción en la zona visible en el caso de los derivados
tipo vitisina, apareciendo a valores de longitud de onda dentro de un rango muy
amplio (475-536 nm, es decir, desde color amarillo-naranja hasta rojo-púrpura), en el
siguiente orden: 10-metil-pyant < vitisinas tipo B < vitisinas tipo A < 10-acetil-pyant.
En cambio, todos los hidroxifenil-piranoantocianos mostraron coloraciones
anaranjadas, y sus máximos visibles se concentraron en una banda más estrecha de
valores de longitud de onda (500-520 nm). En todos los piranoantocianos se observó,
al igual que ocurre con sus antocianos precursores, una influencia del grado de
sustitución del anillo B, con valores más altos de longitud de onda del máximo visible
para los compuestos tri-sustituidos respecto de los di-sustituidos, de unos 3-12 nm en
el caso de los de tipo vitisina y de 6-7 nm en los hidroxfenil-piranoantocianos.
Estas diferencias espectroscópicas en el UV-vis ayudaron a identificar y asignar
los distintos derivados piranoantocianos de cada serie, en base a las variantes
estructurales que se dan a tres niveles: tipo de sustituyente en posición C-10, grado
de sustitución del anillo B (di- o tri-sustituido), y acilación o no del resto de glucosa
unida en posición C-3. No obstante, a veces resultó difícil obtener buenos espectros
UV-vis, incluso para algunos derivados mayoritarios, ya que éstos se registran en línea
y pueden coeluir otras sustancias que impiden que los espectros sean íntegros de la
sustancia que se pretende analizar. Es por ello que se recurrió a la identificación en
base a los espectros MS (se obtienen las relaciones m/z de los iones moleculares) y
MS2 (se analizan las relaciones m/z de los iones producto obtenidos tras la
fragmentación de los iones moleculares precursores). Al igual que ocurre con los
antocianos, los piranoantocianos generaron con facilidad iones moleculares cargados
positivamente (podrían designarse cationes piranoflavilio, por analogía con los cationes
flavilio que forman los antocianos), y la única fragmentación observada en los
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
338 Dora Blanco Vega 2013
experimentos MS2 fue la pérdida del resto glucosídico completo (tanto si estaba acilado
como si no) unido en posición C-3. Este comportamiento permitió identificar con
facilidad cada serie de derivados que compartían el mismo sustituyente en posición C-
10 y el mismo tipo de sustitución en el anillo B, es decir, la misma aglicona. De esta
forma, pudieron distinguirse parejas de piranoantocianos isómeros que, teniendo el
mismo valor m/z para sus iones moleculares, generaron distintos iones producto tras
su fragmentación (por ejemplo, los derivados cumaroilados y los cafeoilados de las
parejas piranodelfinidina/piranocianidina de cada serie de piranoantocianos según el
sustituyente en C-10). A pesar de todo, la metodología de análisis MS2 fue incapaz de
distinguir algunas parejas de isómeros que, además de tener la misma relación m/z
para sus iones moleculares, también generaban iones producto con el mismo valor m/z
debido a que los diferencias estructurales que afectaban a distintas posiciones de las
agliconas se vieron compensadas. En estos últimos casos, el estudio separado de cada
serie de piranoantocianos permitió asignar cada compuesto de forma independiente,
pero en un análisis aplicado a una muestra real en la que coexistan varios tipos de
piranoantocianos, la identificación podría verse limitada por estas coincidencias
espectrales (MS y MS2); los tiempos de retención y los espectros UV-vis podrían
ayudar a resolver algunas dudas pero, en los casos en que no fuera posible esto,
habría que recurrir a técnicas de espectrometría de masas multidimensional (MSn,
siendo n ≥3) para analizar en mayor profundidad las estructuras de la parte aglicona
de los piranoantocianos.
Por último, se estudiaron por primera vez los piranoantocianos formados por
reacción de los antocianos con diacetilo, un producto del metabolismo secundario de
las levaduras (fermentación alcohólica) y de las bacterias lácticas (fermentación
maloláctica) que hasta ahora no se había considerado (se había hecho con los ácidos
pirúvico y acetoacético y con el acetaldehído). Estos nuevos 10-acetil-piranoantocianos
mostraron unas características espectrales en la zona visible bastante diferentes a las
habituales para otros piranoantocianos de tipo vitisina. Lo más llamativo fue la
presencia de una banda ancha de absorción de la zona visible, con unos máximos de
absorción a longitudes de onda de 528-536 nm, es decir, estas vitisinas eran de color
rojo-púrpura, como sus antocianos precursores, y no de color rojo-anaranjado como
son las otras vitisinas. Además de obtenerse en un vino modelo, pudo demostrarse la
presencia de los nuevos pigmentos 10-acetil-piranoantociano en muestras reales de
vino tinto.
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
339 Dora Blanco Vega 2013
Las peculiares propiedades mostradas por los 10-acetil-piranoantocianos fueron
estudiadas en mayor profundidad, tal como se recoge en el Capítulo V, el capítulo
final de esta Tesis. A partir de un extracto de antocianos de uvas de la variedad
Garnacha Tintorera se sintetizaron y aislaron, para su posterior estudio, algunos de los
pigmentos mayoritarios obtenidos por reacción con diacetilo. Se eligió la variedad
Garnacha Tintorera por poseer un perfil de antocianos dominado por los derivados no
acilados y por pertenecer sus antocianos mayoritarios a las dos posibles series que
pueden considerarse en relación al grado de sustitución del anillo B: antocianos di-
sustituidos, representados por la peonidina, y tri-sustituidos, representados por la
malvidina. La combinación de técnicas de separación cromatográfica de tipo
preparativo (cromatografía de partición centrífuga rápida; en sus siglas inglesas, FCPC,
Fast Centrigugal Partition Chromatography) y semi-preparativo (HPLC con columnas
C18 semi-preparativas), permitió el aislamiento, con gran pureza, de los compuestos
10-acetil-piranopeonidina-3-β-O-glucósido y 10-acetil-piranomalvidina-3-β-O-
glucósido, en cantidades suficientes para su caracterización estructural y el estudio de
sus propiedades espectroscópicas, aunque en el medio de reacción también pudieron
detectarse los correspondientes derivados cumaroilados de los dos anteriores
piranoantocianos.
La caracterización estructural se basó en los datos obtenidos por espectroscopía
UV-vis, espectrometría de masas (MS, MS2 y MS3) y espectroscopía de Resonancia
Magnética Nuclear (experimentos mono- y bi-dimensionales de 1H-RMN y 13C-RMN).
Los datos de RMN revelaron propiedades remarcables de los 10-acetil-
piranoantocianos, sobre todo si se comparan con las de los otros piranoantocianos del
tipo vitisina conocidos (vitisinas tipos A y B, y 10-metil-piranoantocianos). Tanto los
antocianos como los piranoantocianos pueden existir en disolución acuosa en diversas
formas en equilibrio que dependen del pH del medio, habiéndose descrito la
coexistencia de formas catiónicas (cationes flavilio o piranoflavilio, de color rojo),
hidratadas neutras (hemiacetales, incoloros), desprotonadas o aniónicas (bases
quinoidales, de color azul), y formas hemiacetálicas por apertura del anillo piránico
principal (calconas, de color amarillo). Por esta razón, los espectros de RMN de este
tipo de compuestos se suelen registrar en medio metanólico ácido para que sólo se
encuentra una única forma presente, la forma catiónica roja, que facilita la elucidación
estructural. No obstante, en el caso de los 10-acetil-piranoantocianos, aún en estas
condiciones pudo observarse la presencia de las correspondientes formas
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
340 Dora Blanco Vega 2013
hemiacetálicas incoloras (los dos posibles enantiómeros que se forman por ataque
nucleofílico del agua) y se pudo demostrar que el ataque ocurría sólo en la posición C-
10 del anillo piránico secundario, el nuevo formado, en lugar de en la otra posible
posición, la C-2, que es la que únicamente se ha reportado para el caso de la
hidratación de los antocianos. La formación del hemiacetal fue posible debido a las
pequeñas cantidades de agua presentes en los disolventes empleados, sobre todo en
el metanol deuterado; únicamente en el caso en que los espectros se registraron en
dimetilsulfóxido perdeuterado fuertemente acidificado (DMSO-d6 con 20 % de
CF3COOD)pudo observarse la sola presencia de la forma catiónica de piranoflavilio.
El estudio de la modificación de los espectros UV-vis de los 10-acetil-
piranoantocianos en medio acuoso, al variar el valor del pH, mostró que estos
pigmentos tienen una fuerte tendencia a formar el hemiacetal y la base quinoidal a
valores de pH del orden de los habituales para vinos tintos (entre 3 y 4). Este
comportamiento explicaría por qué su banda de máxima absorción visible es tan ancha
(coexistencia de formas piranoflavilio, rojas, y quinoidales, azules) y se sitúa en torno
a los 510-520 nm, pudiéndose describir el color mostrado como más bien rojo neto, en
lugar del rojo-anaranjado más habitual para los otros piranoantocianos de tipo vitisina.
Todavía más sorprendente resultó el comportamiento de los 10-acetil-piranoantocianos
frente a la adición de bisulfito. Aunque, en general, los piranoantocianos se describen
como pigmentos resistentes a la decoloración por bisulfito en medio acuoso ácido (la
adición de bisulfito es similar a la adición de agua, generando una estructura incolora
parecida al hemiacetal), éstos experimentan una ligera disminución de la intensidad
del máximo de absorbancia en el visible ante dosis altas de bisulfito, pero sus
espectros no cambian de aspecto. En cambio, la adición de bisulfito en cantidades
crecientes a disoluciones acuosas ácidas de los nuevos 10-acetil-piranoantocianos
condujo a una intensificación también creciente de la absorción en el visible, junto con
un desplazamiento hipsocrómico (menor longitud de onda, es decir, con un viraje del
color de rojo hacia anaranjado) que cambió la forma del espectro UV-vis, con un
aspecto similar al mostrado por otro tipo de vitisinas. Un estudio detallado de los
espectros de masas de los aductos formados entre el ion bisulfito y los 10-acetil-
piranoantocianos, que incluyo el registro de espectros MS3, permitió establecer que el
ion bisulfito no se unió a la posición C-10 como en el caso del agua, muy
probablemente por impedimento estérico, sino que lo hizo sobre el carbono carbonílico
del sustituyente acetilo unido a la posición C-10, lo que explicaría el comportamiento
observado en los espectros UV-vis al añadir bisulfito. El aducto con bisulfito resultó ser
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
341 Dora Blanco Vega 2013
muy lábil y no pudo detectarse cromatográficamente en las disoluciones de 10-acetil-
piranoantocianos tratadas con bisulfito. No obstante, al infundir estas disoluciones
directamente en el espectrómetro de masas, pudieron detectarse los correspondientes
iones moleculares (espectro MS), así como las pérdidas sucesivas del grupo bisulfito
en la primera fragmentación (espectro MS2) y del resto de glucosa en la segunda
fragmentación (espectro MS3). La reactividad del grupo 10-acetilo también se puso de
manifiesto en disoluciones metanólicas de estos pigmentos. Tras varias horas, esta vez
sí pudieron observarse picos cromatográficos adicionales cuyos espectros UV-vis y
MS/MS fueron compatibles con la adición de 2 grupos metoxilo al carbono carbonílico
del sustituyente 10-acetilo. Todas estas propiedades de los 10-acetil-piranoantocianos
los convierten en unos pigmentos del vino singulares y de gran interés en relación con
el color del vino tinto.
En resumen, con esta Tesis Doctoral se ha podido contribuir de forma
significativa al aumento del conocimiento científico relacionado con los pigmentos
antociánicos de bajo peso molecular de los vinos tintos. En primer lugar, se ha
determinado que los antocianos nativos de la uva, en particular el mayoritario y más
estable de ellos, malvidina 3-glucósido, es el principal pigmento que se encuentra en
los vinos rosados, independientemente de la variedad de uva con que se hayan
elaborado. Los pigmentos poliméricos apenas contribuyen al color del vino rosado y,
entre los pigmentos derivados de antocianos de bajo peso molecular, la vitisina A es la
más importante, mientras que los hidroxifenil-piranoantocianos sólo comienzan a
cobrar relevancia en vinos rosados algo envejecidos. En segundo lugar, un estudio
detallado de la composición en pigmentos de bajo peso molecular (incluyendo la
antocianos nativos de la uva), realizado con una extensa y amplia gama de vinos
tintos, ha puesto de manifiesto que los contenidos y proporciones en que se
encuentran los distintos tipos de pigmentos antociánicos son muy variables y resulta
difícil establecer relaciones con el origen varietal y la edad del vino. Algunas
características que se han encontrado son, por un lado, la tendencia de los vinos de la
variedad Garnacha a poseer altas concentraciones de hidroxifenil-piranoantocianos y,
por otro, que el envejecimiento tiende a uniformizar los vinos debido a una
disminución generalizada de las concentraciones de todos los tipos de pigmentos
antociánicos de bajo peso molecular, aunque de forma particular afecta más a los
aductos flavanol-antociano con puente etilideno (casi desaparecen) y a los hidroxifenil-
piranoantocianos (parecen desaparecer a un ritmo menor y aumentan su proporción
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
342 Dora Blanco Vega 2013
entre los pigmentos que van quedando). En tercer lugar, se ha podido establecer que
ciertas prácticas enológicas, como refrescar vinos tintos envejecidos con algo de vino
joven, pueden alterar la composición de pigmentos antociánicos de bajo peso
molecular y, de forma sustancial, reactivan en los vinos envejecidos la formación, a
través de la denominada vía química, de hidroxifenil-piranoantocianos que aumentan
significativamente sus concentraciones. En cuarto lugar, se estudió la cinética de
formación de uno de los tipos de pigmentos antociánicos de bajo peso molecular, los
piranoantocianos, tanto del tipo vitisina (formados a partir de metabolitos secundarios
de las fermentaciones alcohólica y maloláctica) como de los hidroxifenil-
piranoantocianos. Se comprobó cómo, entre las vitisinas, las de tipo A (formadas a
partir de ácido pirúvico) son las únicas que se forman rápidamente y con rendimientos
elevados, mientras que los hidroxifenil-piranoantocianos sólo comienzan a formarse
después de un periodo de latencia en el que se van consumiendo otros reactivos
competidores, como los taninos, tras lo cual se forman progresivamente y pueden
llegar a alcanzar rendimientos elevados. Todos estos piranoantocianos fueron,
además, caracterizados cromatográfica y espectroscópicamente (UV-vis, MS y MS2)
para facilitar su identificación y cuantificación en análisis de muestras reales de vinos.
En quinto y último lugar, se estudiaron las propiedades del nuevo tipo de pigmentos
aportados en esta Tesis, los 10-acetil-piranoantocianos derivados de la reacción del
diacetilo (metabolito secundario de levaduras y bacterias lácticas, nunca antes
considerado) con los antocianos. Estos nuevos piranoantocianos se han podido
detectar en muestras reales de vinos y presentan unas características espectrales y de
color muy singulares. Por un lado, muestran una gran tendencia a formar hemiacetales
incoloros y bases quinoidales azules, junto con las formas piranoflavilio rojas, en
condiciones habituales del vino tinto (medio acuoso y pH entre 3 y4), por lo que el
color que muestran no es el esperable rojo-anaranjado del resto de piranoantocianos
conocidos, sino rojo-púrpura similar al de los antocianos de los que se forman. Por otro
lado, los 10-acetil-piranoantocianos no sólo no se decoloran al añadir bisulfito (como lo
hacen los antocianos de forma total, pero el resto de piranoantocianos sólo de forma
parcial y tras añadir grandes dosis de bisulfito), sino que aumentan su intensidad de
color ocurriendo paralelamente un viraje hacia tonalidades anaranjadas, todo ello
debido a la reactividad del sustituyente acetilo que los caracterizan.
La relevancia de los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral puede
justificarse por el hecho de que los resultados recogidos en los Capítulos III, IV y V
Resultados y Discusión. Capítulo VI.
343 Dora Blanco Vega 2013
han sido publicados en revistas científicas de reconocido prestigio, que se encuentran
situadas en los primeros puestos de la clasificación JCR dentro del área de
conocimiento “Food Science and Technology”. Así mismo, los resultados del Capítulo II
se han recogido en un manuscrito que está en proceso de revisión para su posible
publicación en una de las revistas anteriormente citadas. La lista de publicaciones
generadas por esta Tesis es la siguiente:
- Rentzsch, M.; Schwarz, M.; Winterhalter, P.; Blanco-Vega, D.;
Hermosín-Gutiérrez, I. Survey on the Content of Vitisin A and Hydroxyphenyl-
Pyranoanthocyanins in Tempranillo Wines. Food Chemistry, 2010, 119, 1426-
1434.
- Blanco-Vega, D.; López-Bellido, F.J.; Alía-Robledo, J.M.; Hermosín-
Gutiérrez, I. HPLC-DAD-ESI-MS/MS Characterization of Pyranoanthocyanins
Pigments Formed in Model Wine. Journal of Agricultural and Food
Chemistry,2011, 59, 9523-9531.
- S. Gómez-Alonso; D. Blanco-Vega; M. V. Gómez; I. Hermosín-
Gutiérrez. Synthesis, Isolation, Structure Elucidation, and Color Properties of
10-Acetyl-Pyranoanthocyanins. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
2012, 60, 12210-12223.
- Blanco-Vega, D.; Gómez-Alonso, S.; Hermosín-Gutiérrez, I.
Identification, Content and Distribution of Anthocyanins and Low Molecular
Anthocyanin-Derived Pigments in Commercial Red Wines. Food Chemistry,
manuscritoen revision (FOODCHEM-D-13-04008).
ÍNDICE DE
TABLAS Y
FIGURAS
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS.
346 Dora Blanco Vega 2013
TABLAS Tabla I.1. Resultados del Análisis de Componentes Principales aplicado al conjunto de los vinos
rosados monovarietales.
Tabla I.2. Resultados del Análisis de Componentes Principales aplicado al conjunto de los vinos rosados de las variedades sinónimas Cencibel y Tempranillo.
Tabla I.3. Parámetros de los vinos rosados de Cencibel o de Tempranillo que han
resultado significativamente diferenciables (α = 0.05) según el test de la “t” de
Student.
Tabla I.4. Parámetros de los vinos rosados de Cencibel y Tempranillo, clasificados por
vendimia (2006 o 2007) que han resultado significativamente diferenciables (α = 0.05) según el test de la “t” de Student.
Table II. 1.Chromatographic (peak number as in Figure 2; retention times) and mass spectral
(MS, molecular ion; MS/MS, fragment ions) data corresponding to the low molecular red pigments identified in commercial red wine samples.
Table II. 2. Concentrations (mg/L) of red wine pigments of low molecular weight (monomeric
anthocyanins and anthocyanin-derived pigments) found in the whole set of studied samples of commercial wines (n = 286). Results are given as value ranges, mean values (MV), and standard deviations (SD) corresponding to the summation of all pigments of the same type. Wine samples are grouped according to grape variety: CBSV, cabernet sauvignon; CEN, cencibel; GAR, garnacha; MER, merlot; PV, petit verdot; SYR, syrah; TEMP, tempranillo; TEMP/CBSV, blends of tempranillo and cabernet sauvignon. Different letters after MV in the same row mean significant differences according to ANOVA (Student-Newman-Keuls test; α = 0.05).
Tabla II. 3. Concentrations (mg/L) of red wine pigments of low molecular weight (monomeric
anthocyanins and anthocyanin-derived pigments) found in the set of studied samples ofyoung commercial wines (1-2 years old; n = 199). Results are given as value ranges, mean values (MV), and standard deviations (SD) corresponding to the summation of all pigments of the same type. Wine samples are grouped according to grape variety: CBSV, cabernet sauvignon; CEN, cencibel; GAR, garnacha; MER, merlot; PV, petit verdot; SYR, syrah; TEMP, tempranillo. Different letters after MV in the same row mean significant differences according to ANOVA (Student-Newman-Keuls test; α = 0.05).
Table II. 4. Concentrations (mg/L) of red wine pigments of low molecular weight (monomeric
anthocyanins and anthocyanin-derived pigments) found in the set of studied samples ofaged commercial wines (2 or more years old; n = 84). Results are given as value ranges, mean values (MV), and standard deviations (SD)corresponding to the summation of all pigments of the same type. Wine samples are grouped according to grape variety: CBSV, cabernet sauvignon; CEN, cencibel; MER, merlot; SYR, syrah; TEMP, tempranillo. Different letters after MV in the same row mean significant differences according to ANOVA (Student-Newman-Keuls test;α= 0.05).
Table III.1. Mean values and standard deviations (MV±SD) for the content (mg/L) of pyranoanthocyanins and related compounds (their precursors, malvidin 3-glucoside, free and bound hydroxycinnamic acids) in commercial Tempranillo wines grouped by age.
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS.
347 Dora Blanco Vega 2013
Table III. 2. Composition (mg/L) in pigments and hydroxycinnamic acids of the aged and young wines used in the experiments of refreshment.
Table IV. 1. HPLC retention times (min) of vitisin-like pyranoanthocyanin series formed in model wine from different reactants (10-H, from acetaldehyde; 10-carboxy, from pyruvic acid; 10-acetyl, from diacetyl; 10-methyl, from acetoacetic acid).
Table IV. 2. HPLC retention times (nm) of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanin series
formed in model wine from different reactants (10-p-hydroxyphenyl, from p-coumaric acid; 10-catechyl, from caffeic acid; 10-guaiacyl, from ferulic acid; 10-syringyl, from sinapic acid).
Table IV. 3. On-line DAD UV-vis maxima (sh, shoulder) of vitisin-like pyranoanthocyanin
series formed in model wine from different reactants (10-H, from acetaldehyde; 10-carboxy, from pyruvic acid; 10-acetyl, from diacetyl; 10-methyl, from acetoacetic acid).
Table IV. 4. On-line DAD UV-vis maxima (sh, shoulder) of hydroxyphenyl-
pyranoanthocyanin series formed in model wine from different reactants (10-p-hydroxyphenyl, from p-coumaric acid; 10-catechyl, from caffeic acid; 10-guaiacyl, from ferulic acid; 10-syringyl, from sinapic acid).
Table IV.5. ESI-MS/MS (molecular ion; product ion) of vitisin-like pyranoanthocyanin
series formed in model wine from different reactants (10-H, from acetaldehyde; 10-carboxy, from pyruvic acid; 10-acetyl, from diacetyl; 10-methyl, from acetoacetic acid).
Table IV. 6. ESI-MS/MS (molecular ion; product ion) of hydroxyphenyl-
pyranoanthocyanin series formed in model wine (10-p-hydroxyphenyl, from p-coumaric acid; 10-catechyl, from caffeic acid; 10-guaiacyl, from ferulic acid; 10-syringyl, from sinapic acid).
Table V.1. NMR Spectroscopic Data Registered in CD3OD-CF3COOD (70:30, v/v) for 10-
Acetyl-Pyranopeonidin-3-O- -Glucoside: 1H Data (Chemical Shifts in ppm and Coupling Constants in Hz), 13C Data (Chemical Shifts in ppm), and 1H-13C Correlation Experiments at One Bond (HMQC) and More than One Bond (HMBC).
Table V. 2. NMR Spectroscopic Data Registered in (A) DMSO-d6-CF3COOD (80:20) and (B)
CD3OD-CF3COOD (70:30) for 10-Acetyl-Pyranomalvidin-3-O-β-Glucoside: 1H Data
(Chemical Shifts in ppm and Coupling Constants in Hz), 13C Data (Chemical Shifts in ppm), and 1H-13C Correlation Experiments at One Bond (HMQC) and More than One Bond (HMBC).
Table V. 3. Chemical Shifts of Nuclei (1H and 13C) Showing the Greatest Differences with
Regard to Compound 10-Acetyl-Pyranomalvidin-3-O--Glucoside was in the
Flavylium Cation (f) or Epimeric Hemiacetal (hm-a and hm-b) Forms. Spectrum Registered in CD3OD-CF3COOD (98:2).
Table V.4.. CIELAB Color Parameters Measured at pH 3.6 for 0.08 mM Pigment Solutions.
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS.
348 Dora Blanco Vega 2013
FIGURAS Figura I.1. Correlación entre los parámetros cromáticos “colorido” (C*) y “componente roja del
color” (a*) correspondientes a los vinos rosados analizados.
Figura I.2. Correlación entre los parámetros cromáticos “ángulo de tono” (h*) y “componente amarilla-azul del color” (b*) correspondientes a los vinos rosados analizados.
Figura I.3. Correlación entre los contenidos de distintas fracciones de antocianos
a) Antocianos Monómeros vs. Antocianos Totales; b) Antocianos Monómeros vs. Antocianos Decolorables por Sulfuroso. Se han marcado las muestras que no correlacionan bien.
Figura I.4. Correlación entre los contenidos de: a) Ácido cafeico vs. cafeoato de etilo; b) Ácido p-cumárico vs. cumarato de etilo.
Figura I.5. Correlación entre los contenidos de: a) Ácido cafeico vs. mv-3-glc-4-VC;b) Ácido p-cumárico vs. mv-3-glc-4-VP.
Figura I.6. Correlación entre: a) %ANDS y componente amarilla del color; b) Suma de ANDS y
ADS (8% en forma roja a pH 3.6) y componente roja del color. Figura I.7. Representación de las muestras de vinos rosados, marcadas por variedad de
uva empleada, en el plano formado por los Componentes Principales 1 y 2. Se han representado los centroides de cada grupo de vino (letra mayúscula) y se ha encerrado en una elipsoide el grupo más homogéneo de muestras de un mismo vino monovarietal (en algunos casos, las muestras más alejadas se han separado de la agrupación más homogénea). Variedades de uva: B, Bobal; C, Cencibel; CS, Cabernet Sauvignon; G, Garnacha; M, Merlot; S, Syrah; T, Tempranillo.
Figura I.8. Representación de las muestras de vinos rosados, marcadas por variedad de
uva empleada, en el plano formado por los Componentes Principales 1
Figura I.9. Perfiles de antocianos monómeros (HPLC, detección a 520 n) característicos de los
vinos rosados analizados. Dp, delfinidina; Cy, cianidina; Pt, petunidina; Pn, peonidina; Mv, malvidina; glc, glucósido; acglc, acetilglucósido; cmglc, cumaroilglucósido.
Figura I.10. Representación de las muestras de vinos rosados de las variedades
sinónimas Cencibel y Tempranillo, en el plano formado por los Componentes Principales 1 y 2: a) Muestras marcadas por nombre de variedad (rojo, Cencibel; azul, Tempranillo)
b) Muestras marcadas por vendimia (verde 2006; amarillo, 2007.Figure III.1. Chemical structure of wine pyranoanthocyanins derived from malvidin 3-glucoside: 1, vitisin-type pyranoanthocyanins (R1 = COOH, vitisin A; R1 = H, vitisin B); 2, hydroxyphenyl-type pyranoanthocyanins (R2 = R3 = H, malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol or mv-3-glc-4-VP; R2 = H and R3 = OH, malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol or pinotin A; R2 = H and R3 = OCH3, malvidin 3-glucoside-4-vinylguaiacol or mv-3-glc-4-VG).
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS.
349 Dora Blanco Vega 2013
Figure II. 1. Structures of anthocyanins and anthocyanin-derived low molecular red wine pigments found in analysed wine samples: A) grape native anthocyanins; B) vitisin-type anthocyanins (R3 = COOH, A-type vitisins or 10-carboxy-pyranoanthocyanins; R3 = H, B-type vitisins or simply pyranoanthocyanins); C) hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins (R3 = H, 10-(4’’’-hydroxyphenyl)-pyranoanthocyanins or 10-HP-pyranoanthocyanins; R3 = OH, 10-(3’’’,4’’’-dihydroxyphenyl-pyranoanthocyanins or 10-DHP-pyranoanthocyanins; R3 = OCH3, 10-(3’’’-methoxy-4’’’-hydroxy)phenyl-pyranoanthocyanins or 10-MHP-
pyranoanthocyanins); D) (4 →8)-flavanol-anthocyanin adducts (direct adducts); E) 8,8-
ethylidene-flavanol-anthocyanin adducts (acetaldehyde-mediated or ethylidene-bridged adducts); F) flavanol-pyranoanthocyanins (R = H, from monomeric flavanols; R = 8-flavanyl, from B-type procyanidin dimers). For all structures: R1 and R2 = H, OH, OCH3; acyl = acetyl, p-coumaroyl, caffeoyl
Figure II 2. Chromatographic profiles of anthocyanins and anthocyanin-derived pigments (DAD, detection at 520 nm) of different red wines: A) young Syrah wine; B) three-years old Cabernet Sauvignon wine; C) three-years old Garnacha wine; D) three-years old Merlot wine. Peak numbering (Table 2): 1-17, anthocyanins; 18-25, A-type vitisins; 26-28, B-type vitisins; 29-35, hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins; 36-37, direct flavanol-anthocyanin adducts; 38-44, ethylidene-bridged flavanol-anthocyanin adducts; 45-68, flavanol-pyranoanthocyanins.
Figure II . 3. Expanded chromatograms of the elution zone corresponding to 10-flavanol-pyranoanthocyanins of aged Merlot wine: A) DAD-chromatogram (detection at 520 nm); Extracted Ion Chromatograms (EIC) at the m/z values corresponding to: B) 10-(epi)catechin-pymv-3-glc; C) 10-(epi)catechin-pymv-3-acglc; D) 10-(epi)catechin-pymv-3-cmglc; E) 10-(B-type-procyanidin-dimer)-pymv-3-glc; F) 10-(B-type-procyanidin-dimer)-pymv-3-acglc. Abbreviations: (epi)catechin, both (–)-epicatechin or (+)-catechin; pymv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6’’-acety-glucoside; cmglc, 6’’-p-coumaroyl-glucoside.
Figure II. 4. MS/MS fragmentation patterns of: A) 10-epicatechin-pymv-3-glc; B) 10-catechin-pymv-3-acglc; C) 10-catechin-pymv-3-cmglc; D) 10-flavanol-dimer-pymv-3-glc; E) 10-flavanol-dimer-pymv-3-acglc. Abbreviations: pymv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6’’-acety-lglucoside; cmglc, 6’’-p-coumaroyl-glucoside.
Figure II: 5. On-line DAD spectra of : A) 10-epicatechin-pymv-3-glc; B) 10-catechin-pymv-3-acglc; C) 10-catechin-pymv-3-cmglc. Visible maximum absorbance is indicated for each compound. Abbreviations: pymv, pyranomalvidin; glc, glucoside; acglc, 6’’-acety-lglucoside; cmglc, 6’’-p-coumaroyl-glucoside
FigureII. 6. Low molecular weight pigment content of 1 and 2 years old red wines grouped by grape cultivar: A) concentrations (μmol/L) of monomeric anthocyanins and anthocyanin-
derived pigments; B) molar percentage of different types of anthocyanin-derived pigments. Abbreviations: CBSV, Cabernet Sauvignon; CEN, Cencibel; GAR, Garnacha; MER, Merlot; PV, Petit Verdot; SYR, Syrah; TEMP, Tempranillo; pyant, pyranoanthocyanins.
Figure II. 7. Low molecular weight pigment content of 3 or more years old red wines grouped by grape cultivar: A) concentrations (μmol/L) of monomeric anthocyanins and
anthocyanin-derived pigments; B) molar percentage of different types of anthocyanin-
derived pigments. Abbreviations: CBSV, Cabernet Sauvignon; CEN, Cencibel; MER, Merlot; SYR, Syrah; TEMP, Tempranillo; TEMP/CBSV, blends of Tempranillo and Cabernet Sauvignon; pyant, pyranoanthocyanin
Figure II. 8. Low molecular weight pigment content of Tempranillo wines according to their age: A) concentrations (μmol/L) of total pigments and molar percentage of
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS.
350 Dora Blanco Vega 2013
anthocyanin-derived pigments; B) molar percentage of different types of anthocyanin-derived pigments. Abbreviations: pyant, pyranoanthocyanin
Figure III.2. Changes in anthocyanins and pyranoanthocyanins of Tempranillo wines
during aging: a), 2 years old wine; b), 4 years old wine; c), 7 years old wine. Peak assignation: mv, malvidin; glc, glucoside; ac, acetyl; cm, p-coumaroyl; VP, vinylphenol; VG, vinylguaiacol.
FigureIII.3. Tempranillo wine vertical series. Variation with wine age of the
concentrations (mg/L) of: a) malvidin 3-glucoside (mv-3-glc); b) vitisin A; c) pinotin A (malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol); d) malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).
Figure III.4. Correlation of free hydroxycinnamic acid concentration (mg/L) to the
corresponding concentration (mg/L) of hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins in Tempranillo wines: a) caffeic acid vs. malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol (mv-3-glc-4-VC, or pinotin A); b) p-coumaric acid vs. malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).
Figure III.5. Refreshment of aged Tempranillo wine (vintage 2002) with 15% of young Tempranillo wine (vintage 2007). Variation during accelerated aging at 30ºC of the concentrations (mg/L) of: a) malvidin 3-glucoside (mv-3-glc); b) vitisin A; c) pinotin A (malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol); d) malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).
Figure III.6. Refreshment of aged Tempranillo wine (vintage 2002) with 15% of young
Petit Verdot wine (vintage 2007). Variation during accelerated aging at 30ºC of the concentrations (mg/L) of: a) malvidin 3-glucoside (mv-3-glc); b) vitisin A; c) pinotin A (malvidin 3-glucoside-4-vinylcatechol); d) malvidin 3-glucoside-4-vinylphenol (mv-3-glc-4-VP).
Figure IV.1. General structures of vitisin-like pyranoanthocyanins (A) and hydroxyphenyl-
pyranoanthocyanins (B). Structure features: labeling of aromatic rings; substituent at C-10 (R4 in D-ring for vitisin-like pyranoanthocyanins; R4 and R5 in E-ring for hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins); B-ring substituent (R1 and R2); and type of acylation of the glucosidic moiety.
Figure IV.2. HPLC-DAD chromatograms (detection at 520 nm) for the reaction of pyruvic
acid in a model red wine made from Syrah grape skin extract, after 1 day (A), 1 week (B), and 9 weeks (C) of reaction time at 30 ºC. Peak assignations: mv-3-glc, mv-3-acglc, mv-3-cfglc, and mv-3-cmglc are the series of non-acyl, 6”-acetyl, 6”-caffeoyl, and 6”-p-coumaroyl derivatives of malvidin 3-glucoside; peaks 1-4 are the corresponding 10-carboxy-pyranoanthocyanins derived from the reaction between
pyruvic acid and the aforementioned malvidin-type anthocyanins
FigureIV. 3. DAD on-line UV-vis spectra of: malvidin 3-glucoside (mv-3-glc) vs. its 10-carboxy- and 10-catechyl-pyranoanthocyanin derivatives (A); different vitisin-like pyranoanthocyanins derived from malvidin 3-glucoside (B); different hydroxyphenyl-pyranoanthocyanins derived from malvidin 3-glucoside (C). Abbreviation: pyrmv-3-glc, pyranomalvidin 3-glucoside.
FigureIV. 4. HPLC-DAD-ESI-MS/MS analysis of a 2-years old Tempranillo commercial red wine: DAD-chromatogram at 520 nm (A); extracted ion chromatogram (EIC) at m/z 355 (pyrmv) showing the peaks assigned to the 3-glc (20.2 min), the 3-acglc (22.3 min), and the 3-cmglc (27.3 min) derivatives (B); EIC at m/z 397 (10-acetyl-pyrmv) showing the peak assigned to its 3-glc (22.1 min) derivative (C); EIC at m/z 559 corresponding to the
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS.
351 Dora Blanco Vega 2013
molecular ions of the isomers 10-acetyl-pyrmv-3-glc and pyrmv-3-acglc (D); MS/MS spectra of peaks corresponding to 10-acetyl-pyrmv-3-glc (E) and pyrmv-3-acglc (G), and their overlapping zone (F). Abbreviations: pyrmv, pyranoamalvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-acglc, 3-(6”-acetyl)-glucoside; 3-cmglc, 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside.
Figura V.1. Diagrama de cromaticidad CIE.
Figura V. 2. Coordenadas rectangulares del sistema CIELAB.
Figura V. 3. Funcionamiento del cromatógrafo FCPC.
Figure V.4. Reaction mixture after 18 h showing the formation of 10-acetyl-pyranoanthocyanins and the remaining anthocyanin precursors. Abbreviations: pn, peonidin; mv, malvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-cmglc, 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside; pypn, pyranopeonidin; pymv; pyranomalvidin.
Figure V.5. HPLC on-line DAD UV-vis spectra of 10-acetyl-pyranoanthocyanins (C, D, G,
H) and their respective anthocyanin precursors (A, B, E, F). Abbreviations: pn, peonidin; mv, malvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-cmglc, 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside;
pypn, pyranopeonidin; pymv; pyranomalvidin. Figure V. S1. MS and MS/MS (MS2) spectra of non-acylated (A and B) and p-
coumaroylated (C and D) 10-acetyl-pyranoanthocyanins. Abbreviations: pyrpn, pyranopeonidin; pyrmv; pyranomalvidin; 3-glc, 3-glucoside; 3-cmglc, 3-(6”-p-coumaroyl)-glucoside.
Figure V. S2. 1H-NMR signals corresponding to the aromatic protons in rings A (H-6 and
H-8), B (H-2’ and H-6’), and D (H-9) for spectra of 10-acet-pyrmv-3-glc registered in DMSO-d6 with 20% CF3COOD: A) fresh solution; B) solution stored at 25ºC
during 15 hours (asterisks indicates signals of free aglycon released by acid hydrolysis of glucosidic bond during storage).
Figure V. 6. Chemical structures of synthesized and isolated 10-acetyl-pyranomalvidin-3-
O- β -glucoside (A) and 10-acetyl-pyranopeonidin-3-O- β -glucoside (B) in their
flavylium cation forms. Figure V.7.. 1H-NMR signals corresponding to the anomeric (H-1”) and aromatic protons
in rings A (H-6 and H-8), B (H-2’ and H-6’), and D (H-9) for spectra of 10-acetyl-pyranoanthocyanins registered in different solvents: A) 10-acet-pymv-3-glc in CD3OD with 2% CF3COOD (asterisks indicate signals assigned to hemiacetal forms); B) 10-acet-pymv-3-glc in DMSO-d6 with 20% CF3COOD; C) anomeric proton (H-1”) section of 10-acet-pypn-3-glc spectra in CD3OD with variable proportions (5-30%) of CF3COOD. Abbreviations: f, flavylium cation form; hm, hemiacetal form.
Figure V.8.. Chromatogram (detection at 520 nm) corresponding to the sample of 10-
acet-pymv-3-glc just after recording the 1H-NMR in CD3OD with 30% of CF3COOD. It is also shown the on-line UV-vis spectra of 10-acet-pymv-3-glc (17.750 min) and newly formed compound (23.667 min), as well as the suggested chemical structure
of 10-(1´,1´-dimethoxy)-ethyl-pymv-3-glc for the latter. Figure V. S3. Resonance forms of 10-acet-pyrmv-3-glc involving oxygen atoms of rings C
and D, and suggested formation of hemiacetals of this compound at positions C-2 and C-10.
INDICE DE TABLAS Y FIGURAS.
352 Dora Blanco Vega 2013
Figure V. S4. Long-distance 1H-13C correlations (HMBC experiment) detected for the hemiacetalic form of 10-acet-pyrmv-3-glc involving nuclei susceptible to hemiacetal formation (C-2 and C-10).
Figure V. 9. Changes in the visible spectra of 10-acetyl-pyranoanthocyanins as a function
of pH: A) 10-acet-pymv-3-glc; B) 10-acet-pypn-3-glc. Figure V. S5. Color shown by aqueous solutions at pH 3.6 and concentration of 0.08 mM of: A)
10-acetyl-pyranomalvidin-3-glucoside; B) 10-acetyl-pyranopeonidin-3-glucoside
Figure V.10.. Changes in the visible spectra of 10-acetyl-pyranoanthocyanins as a function of the concentration of added SO2 at pH 2.0: A) 10-acet-pymv-3-glc; B)
10-acet-pypn-3-glc.
Figure V. 11. Reaction product of nucleophilic attack of SO2 to 10-acet-pymv-3-glc: A) suggested structure; B) mass spectra (MS, MS2, and MS3)
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES.
355 Dora Blanco Vega 2013
CONCLUSIONES
- La presente Tesis Doctoral supone una contribución al conocimiento de los
pigmentos antociánicos de bajo peso molecular del vino rosado y tinto
derivados de la transformación de los antocianos nativos de la uva, tanto por
el número de muestras analizadas como por el tipo de vinos analizados: 130
muestras de vinos rosados con 1-2 años; 286 muestras de vinos tintos de
diversas variedades con un rango de edad desde jóvenes hasta envejecidos
con 7 o más años; 106 vinos Tempranillo de 1 a 10 años de edad; y 48 vinos
de una serie vertical de vinos Tempranillo de 1 a 29 años de edad.
- De entre los pigmentos antociánicos de bajo peso molecular presentes en el
vino, se ha prestado una especial atención a los denominados
piranoantocianos, tanto los formados a partir de metabolitos secundarios de
las fermentaciones implicadas (denominados como “tipo vitisina”), como los
formados a partir de ácidos hidroxicinámicos provenientes de la materia prima
(denominados “hidroxifenil-piranoantocianos”). Se ha estudiado su formación
y evolución en los vinos y se ha contribuido con la identificación de nuevas
estructuras no descritas con anterioridad.
- Los vinos rosados, independientemente de su edad y variedad de elaboración,
contienen como pigmento mayoritario la malvidina 3-glucósido nativa de la
uva. Entre los pigmentos de tipo piranaontociano, la vitisina A (formada
durante la fermentación alcohólica a partir de ácido pirúvico) es mayoritaria, y
los hidroxifenil-piranoantocianos (derivados de ácidos hidroxicinámicos) sólo
empiezan a cobrar una importancia relativa en vinos de 2 años.
- Las características cromáticas mostradas por los vinos rosados, con una
predominancia de la componente roja del color y apenas contribuciones de la
componente amarilla, son consecuentes con la composición en pigmentos
antociánicos encontrada en estos vinos.
- El contenido en pigmentos antociánicos de bajo peso molecular fue muy
variable entre la amplia gama de vinos tintos comerciales analizados,
CONCLUSIONES.
356 Dora Blanco Vega 2013
encontrándose que los valores promedios para el conjunto de todos los vinos
oscilaron, para cada tipo de pigmento, dentro de rangos muy amplios de
valores, puesto que hay diferentes factores (variedad de uva empleada, edad
del vino) que oueden afectar al desarrollo de este tipo de pigmentos a partir
de los antocianos nativos de la uva.
- Al comparar sólo vinos jóvenes (1-2 años de edad) se siguieron obteniendo
amplios rangos de contenido en los distintos tipos de pigmentos antociánicos,
con ligeras diferencias (no significativas) según la variedad de uva utilizada,
con la única salvedad de los vinos elaborados con la variedad Garnacha que
mostraron las mayores cantidades de hidroxifenil-piranoantocianos, en
consonancia con las altas concentraciones en derivados hidroxicinámicos
(precursores de este tipo de pigmentos antociánicos) que son características
de esta variedad de uva y sus vinos.
- En cuanto al factor edad del vino tinto, el envejecimiento tendió a uniformizar
las pequeñas diferencias en cuanto a la proporción de los diversos tipos de
pigmentos antociánicos que se podían encontrar entre los diferentes vinos
varietales; las únicas diferencias significativas que se encontraron entre vinos
varietales tuvieron que ver con las concentraciones de vitisinas de tipo B,
encontrándose los mayores valores en los vinos envejecidos de Syrah, así
como con los 10-HP-piranoantocianos, con mayores concentraciones en los
vinos envejecidos de Merlot.
- En el caso de los vinos de la variedad Tempranillo (o su sinónima Cencibel), el
envejecimiento afectó muy drásticamente a las concentraciones de antocianos
nativos de la uva, que llegaron a desaparecer en vinos con varios años de
edad, pero también lo hicieron el resto de pigmentos antociánicos, aunque de
diferente forma según el tipo de estructura: los aductos flavanol-antociano con
puente etilideno fueron los más afectados y sus proporciones tendieron a
contribuir en proporción cada vez menor conforme aumentaba la edad del
vino, mientras que los pigmentos del tipo hidroxifenil-piranoantociano fueron
ganando importancia al aumentar la edad
CONCLUSIONES.
357 Dora Blanco Vega 2013
- Un estudio más detallado de los efectos del envejecimiento realizado con una
serie vertical de vinos Tempranillo reveló que en algunas muestras comerciales
de vinos envejecidos de esta variedad pueden encontrase cantidades
anormalmente altas de antocianos (superior a unos 15 mg/L como
equivalentes de malvidina 3-glucósido) y de hidroxifenil-piranoantocianos
(superior a 2-3 mg/L) de forma simultánea. Pudo demostrarse que estos casos
deben corresponder a vinos envejecidos que fueron refrescados con algo de
vino tinto joven, una práctica admitida si el vino joven no se añade en más de
un 15%.
- El efecto principal del refresco de vinos envejecidos fue la reactivación de la
vía química de síntesis de hidroxifenil-piranoantocianos, ya que el vino joven
aporta antocianos que pueden reaccionar con los ácidos hidroxicinámicos libres
presentes en los vinso envejecidos, sin la aparente competencia de los
taninos, que deben estar en menor proporción en los vinos envejecidos debido
a que ya reaccionaron a lo largo del envejecimiento de éstos.
- La formación de piranoantocianos del tipo vitisina e hidroxifenil-
piranoantocianos en vino modelo sometidos a envejecimiento acelerado,
permitió conocer las características cromatográficas y espectroscópicas
(espectros UV-vis y MS/MS) que permiten su identificación en las mezclas
complejas en las que aparecen en muestras reales de vinos, así como también
arrojó luz sobre la cinética de formación de estos compuestos.
- Entre las vitisinas, las de tipo A (a partir de ácido pirúvico) se forman muy
rápidamente y con altos rendimientos, compitiendo de forma muy efectiva con
los taninos. Las de tipo B (a partir de acetaldehido) se obtuvieron en
rendimientos muy bajos, ya que elacetaldehído parece que contribuyó en
mayor medida en la formación de pigmentos poliméricos tanino-antociano con
puente etilideno. Las vitisinas formadas a partir de ácido acetoacético y
diacetilo se formaron lentamente y con bajos rendimientos.
- Estas vitisinas mostraron características espectrales en el UV-vis que se
tradujeron en que su color rojo es de un tono más anaranjado que el de los
antocianos de partida, con la salvedad de las derivadas de diacetilo que
tuvieron una coloración rojo-púrpura.
CONCLUSIONES.
358 Dora Blanco Vega 2013
- Las vitisinas derivadas del diacetilo fueron estudiadas en mayor detalle, que
incluyó su síntesis, aislamiento y elucicidación estructural inequívoca. Estos
nuevos pigmentos de tipo piranoantociano mostraron propiedades poco
habituales en este tipo de pigmentos: gran tendencia a formar hemiacetales
incoloros a valores de pH muy ácido cuando debería predominar la forma de
catión flavilio roja; contribución destacable de la forma base quinoidal (azul) a
valores de pH habituales del vino tinto; no decoloración con sulfuroso y viraje
hacia tonalidades anaranjadas cada vez más intensas al incrementar la
concentración de sulfuroso añadido.
- En el caso de los hidroxifenil-piranoantocianos, pudo observarse una fase de
latencia en su formación, hasta que sus más directos competidores (los
taninos) se consumen y les permiten reaccionar con los antocianos. Los
espectros UV-vis no se afectaron mucho por el grado y tipo de sustitución del
ácido hidroxicinámico de partida, pero sí condicionó el rendimiento obtenido,
incrementándose en el orden p-cumárico < cafeico < ferúlico < sinápico, es
decir, al aumentar el número de hidroxilos o/y de metoxilos.
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