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Herbstsemester 2015 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Badertscher, martin.badertscher@org.chem.ethz.ch 1

(done) Flüssigchromatographie (LC)

à Gaschromatographie (GC)

Herbstsemester 2015 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Badertscher, martin.badertscher@org.chem.ethz.ch

Gaschromatographie (GC)

Mobile Phase: gasförmig Stationäre Phase: flüssig

Mittels Gaschromatographie (GC) lassen sich nur Analyten untersuchen, welche sich unzerstört verdampfen lassen (ca. 10–20% der bekannten org. Moleküle) v.a. kleine, unpolare, flüchtige Moleküle Die Betriebstemperatur des Gaschromatographen muss aber nicht über dem Siedepunkt der Analyten liegen. Die Flüssigchromatographie (LC) hat ein viel breiteres Anwendungsfeld, da man mit ihr auch thermolabile und grosse Moleküle trennen kann: kleine ungeladene Moleküle anorganische und organische Ionen Organometallkomplexe Polymere Grosse (Bio-)Moleküle (z.B. Proteine)

Vorteile GC gegenüber LC: •  Kapillarsäulen haben sehr hohe Bodenzahlen (bis ca. 200 000)

•  scharfe Peaks •  hohe Peakkapazität (viele basisliniengetrennte Peaks in einem Chromatogram) •  Untersuchung komplexer Proben

•  GC-Detektoren sind sehr empfindlich (keine flüssige mobile phase) •  Quantifizierung im Bereich sehr kleiner Konzentrationen möglich •  Spurenanalytik

Typisches Problem: •  Kapillarsäulen werden leicht überladen

•  Überladungseffekte, asymmetrische Peaks •  Abhilfe: Verdünnung der Proben oder Split-Injektion

Derivatisierung: Überführung von Analyten mit hohem Siedepunkt in leichtflüchtige Derivate

è „Absättigung“ polarer funktioneller Gruppen (z.B. –OH, –NH2, –COOH) mit apolaren Gruppen (z.B. –Si(CH3)3, –CH3)

Beispiele Silylierung von Alkoholen, Aminen und Thiolen

R OH +

CH3 - HCl

R OH +

Si(CH3)3

NSi(CH3)3

Trimethylchlorsilan (TMCS)

N,O-bis-(trimethylsilyl)acetamid (BSA)

R COOH +- N2

Diazomethan

N- R COOCH3

Alkylierung von Carbonsäuren

Hauptbestandteile: Kapillarsäule, Trägergas, Säulenofen und Detektor Kapillaren sind weniger als 1mm im Durchmesser, aber oft mehrere Meter lang.

GC: Injektor

Splitless-Split-Injektion •  Mikroliterspritze durchstösst ein Septum

•  Injektion der Probe (Analyten + Lösungsmittel) in geheiztes Rohr (Verdampfer, Liner)

•  Schlagartiges Verdampfen der Probe

•  Trägergas transportiert die Probenmoleküle zur Säule (A) Trägergas

(B) Septumspülung

(C) Splitfluss

GC: Injektor

Splitless-Split-Injektion

Splitverhältnis = SplitflussSäulenfluss

•  Bei der Split-Injektion gelangen weniger Probenmoleküle zur Säule

•  Verringerung von Überladungseffekten

•  Äquivalent zur Verdünnung der Probe (Verdünnung ist zusätzlicher Arbeitsschritt è Fehlerquelle)

GC: Injektor

Headspace-Technik

(1) Beprobung der Gasphase (headspace) über einer flüssigen Probenlösung

(2) Injektion der flüchtigen Analyten in die Säule

•  Analyse flüchtiger Substanzen, direktes Gasförmiges auftragen

•  Abtrennung nicht flüchtiger Matrixbestandteile

•  Beispiel: Bestimmung des Blutalkoholgehaltes

GC: Mobile Phase

•  Häufigste Trägergase: N2, He, H2

•  Mobile Phase wechselwirkt nicht mit stationärer Phase oder Analyten

•  Mobile Phase dient nur zum Transport der Analyten durch die Säule

•  Das Trägergas beeinflusst die Trenneffizienz bzw. die Bodenhöhe

•  Viskosität: H2 < He < N2 •  Diffusionskoeffizienten der Analyten in der mobilen Phase: N2 < He < H2 •  Beste Trenneffizienz um ca. u = 1 ml/min mit H2 und He. N2 ist kostengünstiger.

H = A+ Bu

B ∝DM

CM ∝ 1DM

GC: Stationäre Phase

•  Bei Betriebstemperatur flüssige stationäre Phasen (type A,B)

•  Gepackte Säule: Partikel im 100-µm-Bereich beschichtet mit stationärer Phase

•  Kapillarsäule: stationäre Phase als dünner Film auf der Innenwand einer Kapillare Die 10–60 m langen Kapillarsäulen haben um 1–2 Grössenordnungen höhere Bodenzahlen è schmalere Peaks è höhere Auflösung Heute werden in der analytischen GC fast ausschliesslich Kapillarsäulen eingesetzt

gepackte Säule Kapillarsäule

Zeit Zeit

Gepackte Säule: Kapillarsäule:

Chromatogram eines bei einer Brandstiftung gefundenen Brandbeschleunigers

Vergleich der GC-Trennungen mit einer gepackten Säule und einer Kapillarsäule

•  Polarität der stationären Phase häufig ähnlich der Polarität der Analyten

•  Analyten häufig flüchtige, unpolare Moleküle

•  Standardphasen: apolare Dimethylsiloxan-Phasen

•  Auf apolaren Phasen werden apolare Analyten gemäss ihren Siedepunkten getrennt.

•  Elutionsreihenfolge / Retentionszeit: niedriger Siedepunkt < hoher Siedepunkt

CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

......

Polare Phasen: Neben dem Siedepunkt ist auch die Polarität der Moleküle ein Trennkriterium.

CH3 100%

O Si Si

Poly(dimethylsiloxan)

Poly(5%-diphenyl-95%-dimethylsiloxan)

Poly(14%-cyanopropylphenyl-86%-dimethylsiloxan)

Polyethylenglykol

X-1701

apolar

Zunahme der P

olarität

Struktur Name Kürzel Polarität

http://www.youtube.com/watch?v=08YWhLTjlfo

Optimierung einer GC-Trennung

Ziel der Optimierung (wie bei LC):

Effiziente Trennung (mit RS > 1.5) in möglichst kurzer Analysenzeit

RS = α−1α

⎛ ⎝ ⎜

⎞ ⎠ ⎟

k21+ k2

⎝ ⎜

⎠ ⎟

⎝ ⎜

⎠ ⎟

Einfluss der stationären Phase

Trennung von (1) p-Xylen, (2) m-Xylen, (3) Decan und (4) Undecan auf (a) einer apolaren Polydimethylsiloxan- und (b) einer polaren Polyethylenglycol-Phase.

RS = α−1α

⎛ ⎝ ⎜

⎞ ⎠ ⎟

k21+ k2

⎝ ⎜

⎠ ⎟

⎝ ⎜

⎠ ⎟

k = tR − tM

=′ t R

α =′ t R 2′ t R1

= KC 2

Trennung nur nach Siedepunkt!

Trennung nach Siedepunkt und Polarität!

Einfluss der Säulenlänge

Trennung verschiedener Kohlenwasserstoffe mit unterschiedlich langen GC-Säulen. Analyten: (A) n-Nonan, (B) 2-Octanon, (C) n-Decan, (D) 1-Octanol, (E) 2,6-Dimethylphenol, (F) n-Undecan, (G) 2,4-Dimethylanalin, (H) Naphthalen, (I) n-Dodecan. Stationäre Phase: Poly(dimethylsiloxan).

RS = α−1α

⎛ ⎝ ⎜

⎞ ⎠ ⎟

k21+ k2

⎝ ⎜

⎠ ⎟

⎝ ⎜

⎠ ⎟

L = 2.5 m

L = 5 m

L = 12 m

L = 25 m

N = LH

RS ∝ N bzw. RS ∝ LAnalysendauer ∝ L

Einfluss des Säuleninnendurchmessers

Zwei Trennungen, die – bei sonst gleichen Bedingungen – mit zwei Säulen mit unterschiedlichem Innendurchmesser (ID = 0.1 und 0.25 mm) durchgeführt wurden. Der geringere Säuleninnendurchmesser im oberen Chromatogram bewirkt eine höhere Auflösung.

RS = α−1α

⎛ ⎝ ⎜

⎞ ⎠ ⎟

k21+ k2

⎝ ⎜

⎠ ⎟

⎝ ⎜

⎠ ⎟

k =′ t R

k ∝ 1β

β = VM

GC-Trennungen, die mit verschiedenen Filmdicken der stationären Phase durchgeführt wurden (0.25 µm, 0.5 µm und 1 µm). Ein dickerer Film bewirkt niedrigeres Phasenverhältnis und damit höhere Retentionsfaktoren und Auflösungen, was jeweils exemplarisch an zwei Peaks gezeigt ist.

RS = α−1α

⎛ ⎝ ⎜

⎞ ⎠ ⎟

k21+ k2

⎝ ⎜

⎠ ⎟

⎝ ⎜

⎠ ⎟

k =′ t R

k ∝ 1β

β = VM

Einfluss der Filmdicke

GC: Optimierung

Ziel der Optimierung ist es, eine effektive Peakauflösung (RS > 1.5) in möglichst kurzer Analysenzeit zu erreichen.

RS = α −1α

⎛ ⎝ ⎜

⎞ ⎠ ⎟

k21+ k2

⎝ ⎜

⎠ ⎟

⎝ ⎜

⎠ ⎟

α = f k,KC( )k = f β,KC( )N = f L,H( )

•  Polarität der stationären Phase è k, a

•  Säulenlänge L è N (und Analysenzeit)

•  Säuleninnendurchmesser è β è k

•  Filmdicke è β è k

•  Säulentemperatur T è KC è k

Gradientenelution (Temperaturprogramm):

Erhöhung der Temperatur entspricht Erhöhung der Elutionskraft

Je höher a, k und N, desto besser die Auflösung RS Aber: Je höher k und L, desto länger die Analysendauer

Einfluss der Säulentemperatur

Trennung zweier Substanzen bei verschiedenen Säulentemperaturen. Eine geringere Temperatur bewirkt höhere Verteilungskonstanten KC und damit höhere Retentionsfaktoren k und eine höhere Auflösung RS. Höhere Retentionsfaktoren bewirken aber auch längere Retentions- und Analysenzeiten. Das Ziel der Optimierung, nämlich eine effektive Trennung (RS > 1.5) in kurzer Zeit, wäre hier bei einer Temperatur um 55°C erreicht.

RS = α−1α

⎛ ⎝ ⎜

⎞ ⎠ ⎟

k21+ k2

⎝ ⎜

⎠ ⎟

⎝ ⎜

⎠ ⎟

KC = cScM

= f T( )

k =′ t R

= KCVS

Einfluss der Säulentemperatur

Gradientenelution Höhere Temperatur è höhere Elutionskraft

Wie in der LC: meist Erhöhung der Elutionskraft während der Gradiententrennung

Temperatur-Gradienten-Programm

220°C

isotherme Bedingungen

GC-Trennung bei konstanter Temperatur (oben) und mit einem Temperaturgradienten (unten). Die Probleme der langen Analysenzeit und der Peakverbreiterungen im oberen Beispiel werden durch die ansteigende Säulentemperatur im unteren Beispiel verringert.

10°C/min

15 min

Gaschromatographie (GC) Detektoren

Flammenionisationsdetektor (FID)

(1) C-haltige Analyten reagieren zu CH4

(2) Umsetzung über

Radikale zu CHO+

•  Häufig eingesetzter GC-Detektor •  Erfasst alle kohlenstoffhaltigen Analyten (fast universal) •  Je mehr C-Atome im Molekül, desto emfpindlicher wird es detektiert! (aber an Heteroatome gebundene C-Atome werden seltener, Carbonyl-C gar nicht zu CH4 umgesetzt)

Messung der Leitfähigkeit der Knallgasflamme zwischen den zwei Elektroden

Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD, thermal conductivity detector = TCD)

Referenzzelle Messzelle

Trägergas mit Analyten

Trägergas

(1)  Beheizter Draht misst Wärmeleitfähigkeit (WL) von Trägergas + Analyten (im Vergleich zu einer Referenzzelle)

(2)  Abnahme der WL è Zunahme des elektr. Widerstandes

(3)  Signal = Änderung der Wärmeleitfähigkeit gegenüber reinem Trägergas …Universeller Detektor

•  Empfindlichkeit mit den Trägergasen H2 und He hoch, mit N2 deutlich geringer •  Schwierig zu kombinieren mit Kapillarsäulen (nur “wide bore” Säulen mit 0.5-1 µm ID) •  Meist nur für Analyten eingesetzt die vom FID nicht erfasst werden (z.B. SiH4)

Elektroneneinfangdetektor (electron capture detector = ECD)

(1)  Strahler gibt Elektronen ab

(2)  e– reagieren mit Trägergas- molekülen, Entstehung eines Grundstroms

(3)  Diese setzen thermische e– frei

(4)  Thermische e– reagieren mit Analyten mit hoher Elektronen-affinität

Signal = Abnahme des Stroms

(1)  Selektiver Detektor •  Nur Analyten, die leicht Elektronen aufnehmen können, werden detektiert (1)  Halogenierte (z.B. –Cl, –Br) und nitrierte (–NO2) Analyten,

daneben auch andere N- und O-haltige Verbindungen •  Empfindlichkeit und Nachweisgrenzen extrem verbindungsabhängig

Atomemissionsdetektor (AED)

(1)  Analyten werden in mikrowellen-induziertem Plasma atomisiert (und ionisiert) è Atome im angeregten Zustand

(2)  Übergang in den Grundzustand è Emission elementspezifischer Strahlung

(3)  Aufteilung mittels eines Prismas oder Gitters in die einzelnen Wellenlängen

(4)  Simultane Detektion aller Wellenlängen mittels eines Diodenarraydetektors

Signal = Intensität von Atomemissionslinien

•  Selektiver Detektor (elementselektiv, praktisch alle Elemente werden detektiert)

•  Für jedes Element kann ein Chromatogram aufgezeichnet werden (parallel) •  Kohlenstoff-Spur: universeller Detektor

Massen(selektiver) Detektor

Ionisationsmethode: Elektronenstossionisation (EI)

•  EI-MS-Spektren zur Strukturaufklärung •  Gesamtionenstrom (total ion current = TIC): universelle Detektion •  Single (oder selected) ion mode (oder monitoring) (SIM): massenselektive Detektion

Analysator: Quadrupole Ionenquelle: Detektor

Massenanalysator: oft Quadrupol oder Ionenfalle è relativ kompakte Tischgeräte

http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/qit-massspec.html

Quadrupol AnalytIonen mit passenden m/z werden durch das oszillierende elektrische Feld duch den Analysator transportiert

IonTrap (quadrupole ion trap) Gleichspannung und oszillierende Radiofrequenz Ringförmiger Aufbau, Analytionen mit passender Masse werden in der trap gefangen

Massenanalysatoren

TOF (time of flight) In Abhängigkeit von m/z brauchen die Analytmoleküle unterschiedlich lang für dieselbe Strecke

http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/tof-massspec.html

Massenanalysatoren

GC-Detektoren

Detektor Selektivität Nachweisgrenze Linearität Flammenionisations- C-haltige Moleküle 1 pg C/s > 106 detektor (FID) ⇒ fast universell

Wärmeleitfähigkeits- universell 400 pg/ml 104 detektor (WLD bzw. TCD)

Elektroneneinfang- selektiv (z.B. stark verbindungsabhängig 106 detektor (ECD) –Cl, –Br, –NO2) Flammenphotometrischer selektiv 20 pg S/s 103 (S) Detektor (FPD) (S, P, Sn) 1 pg P/s 104 (P / Sn)

Atomemissionsdetektor (AED) universell / stark elementabhängig 102–105

elementselektiv Massenselektiver universell / verbindungsabhängig Detektor (MSD) massenselektiv 10 pg–10 ng 105

Gaschromatographie (GC) Beispiele

Elektroneneinfangdetektor (ECD)

Bestimmung der Metaboliten von polychlorierten Biphenylen (PCB) in Blutserum-Proben von Bewohnern der Färöer-Inseln

Das dortige traditionelle Nahrungsmittel “Walspeck” (Fettgewebe von Walen, Robben, Fischen) ist häufig kontaminiert mit PCBs und anderen fettlöslichen Umweltgiften

(1) Überführung der Hydroxy-PCBs in leicht flüchtige Methylether

(2) Analyse mittels GC-ECD

Atomemissionsdetektor (AED)

Chlorpyrifos (Insektizid)

•  Kohlenstoff: universelle Detektorspur •  Zusätzlich heteroelement-spezifische Detektorspuren

GC-Detektorkombination Flammenionisationsdetektor FID und Flammenphotometrischer Detektor FPD im S-Modus

Gaschromatogram eines Schieferöls. Nach der Säule wurde der Trägergasstrom 1:1 auf einen FID und einen im S-Modus betriebenen FPD verteilt.

Massenselektiver Detektor

2,3,7,8-Tetrachlordibenzodioxin (2,3,7,8-TCDD)

MS: 2,3,7,8-TCDD

mit M+· bei 320

MS TCDD 13C12-TCDD

13C-markierter interner Standard

Bestimmung von Dioxinen mittels GC-MS GC-Trennung (auch Isomere werden getrennt) mit massenselektiver Detektion

SIM è für jede Masse ein Chromatogram Interne Standards: z.B. 13C-markierte Dioxine (werden aufgrund des Massenunterschieds unabhängig von den entsprechenden Analyten getrennt)

Selected ion monitoring (SIM) Gas-Chromatrogramm bei m/z = 320

Massenselektiver Detektor (MSD)

2,4,6-Tetrachloranisol (2,4,6-TCA) Verantwortlich für Kork-Geschmack im Wein Charakterist. Massen: Interner Standard 195 [M-15]+ 2H5-2,4,6-TCA:

210 M+· 215 M+· 212 [M+2]+·

Links: Chromatograme (GC-MS, SIM), Weinprobe mit 0.7 ppt (0.7 ng/l) 2,4,6-TCA. schwarz: m/z = 195 grün: m/z = 215

Rechts: Kalibrierung mit internem Standard

Analyt

Interner Standard: deuteriertes TCA (2H5-2,4,6-TCA)

GC (MS-Detektion im SIM-Modus)

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