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Génétique Moléculaire

Dr Caroline ROORYCK THAMBO

Service de Génétique Médicale

CHU PELLEGRIN

DCEM1 UFR 2 Février 2008

La génétique moléculaire médicale: son champ d’application

� Diagnostic moléculaire des maladies génétiques humaines

� Faire le diagnostic (trouver l’étiologie) d’une maladie transmise selon un mode héréditaire

� Au moyen des techniques d’analyse de l’ADN (essentiellement)

� Autres applications courantes : le dépistage des hétérozygotes, le diagnostic prénatal, le conseil génétique aux couples et aux familles

Complexités du champ d’application

� Très nombreux gènes et maladies génétiques

� Hétérogénéité tant sur les anomalies génétiques (génotype) que sur les présentations cliniques (phénotypes)

� Stratégies (et moyens d’analyse) d’un gène à l’autre, d’une maladie génétique à une autre

� La maladie génétique peut ne pas être que d’origine génétique, d’où l’élargissement du champ d’application de la génétique moléculaire vers le diagnostic de la prédisposition génétique à des maladies non exclusivement génétiques

� Au-delà du diagnostic proprement dit, la génétique moléculaire s’ouvre aussi vers une meilleure connaissance des capacités de réponse d’un patient à des agents thérapeutiques (pharmacogénétique)

En guise de plan

� Rappels fondamentaux sur les gènes et le génome

� Diagnostics moléculaires des maladies génétiques (au sens large) : Stratégies

� Evolutions récentes de la génétique moléculaire médicale

Rappels fondamentaux

introns

ATG TGAsites d’épissage

5’UTR 3’UTR

TATACAATenhLCR LCR

UTR : région non traduiteenh : enhancerLCR : locus control region

-40b-70b1-10kb

10-100kb promoteur

Région adjacente 5’ régulatrice exons

site début detranscriptionet capping

signal fin detranscription

sitepolyA

Structure d’un gène

Du gène à la protéine

GENE

(30000)

Transcription

ARN messager

(100000 – 200000)

(100000 – 500000)

PROTEINE

Traduction

…atg gct aaa tcg cgg ggg ata…

…aug gcu aaa ucg cgg ggg aua…

…Met-Ala-Lys-Ser-Arg-Gly-Ile…

GENE

PROTEINE

non muté muté

fonction normale

absence de fonctionou

fonction anormale

Maladie génétique

Environ 2000 gènes responsables demaladies génétiques identifiés à ce jour

Le génome humain

� Taille : 3 000 000 000 de paires de bases

� Le génome est hautement inhomogène (gènes et éléments répétés)

� Nombre de gènes : 30 000 – 35 000

� Proportion du génome transcrite : 12 %

� Proportion de séquences codantes : 1 - 2 %

� Eléments répétés : 30 %

� Le rôle des éléments non codants (>90%) est peu connu: régulation des gènes, maintien de la structure des chromosomes, ou simples vestiges de l’évolution?

Les polymorphismes de l’ADN

� Polymorphismes de longueur de fragments de restriction

� Polymorphismes de répétition:� Minisatellites (10 à 100 pb) (= Variable Numberof Tandem Repeats)

� Microsatellites (2 à 6 pb) (= Short Tandem Repeats)

� Single Nucleotide Polymorphisms = SNP

� Polymorphismes nombre de copies = CNV

Les Microsatellites

� Répétition en tandem de di- tri- ou tétra-nucléotides

� Typiquement formés de dinucléotides CA n>12

� Distribution homogène dans le génome (tous les 6 à 10 Kb)

� Issus du « dérapage » de la réplication

� Hautement polymorphes: 6 à 15 allèles/locus

> INFORMATIVITE ELEVEE 80 – 90 %

� Marqueur de choix pour les empreintes parentales

MICROSATELLITES

Génotypage : PCR avec une amorce fluorescente, séquenceur automatique

allele 1

allèle 2

allèle 3

= CA, CAC, CACT oligonucléotidepour PCR

CEN

D15S128 D15S986

D15S97

D15S1002 D15S1048

D15S165

D15S1007

D15S210

Gène PGènes UBE3A/SNRPN

0,3 0,8 1,08 0,1 1,44 1,4 2.470,1

344 Kb

TEL

D15S1019

0.2

D15S217D15S156 D15S1233

(Mb)

Gène UBE3A

102 Kb

D15S122

D15S1021

0,1 0,6

D15S1035

2

Locus AOC2 15q11.2

Exemple d’utilisation des microsatellites:

recherche de délétion à un locus donné

Microsatellites Analyse de fragments

Père

Cas index

Soeur

Mère

D15S217

D15S128

Père

Cas index

Soeur

Mère

Non delete178-184164-188172-188178-188164-172D15S 1007

Non delete-200-222200-228200-224228-222D15S 1048

Non delete208-212208-212208-212208-212208-208D15S 1019

Delete176-190176160-176176-188160-180D15S 217

Non informatif231-231219219-231219-221219-231D15S 156

Delete106-120106106-118106-106116-118D15S 1002

DeleteNon informatif-185185-185185-185185-185D15S 986

Delete147-147153147-153147-153145-147D15S 122

Delete191-201199199-205197-199205-205D15S 128

Non informatif136-136136136-148136-136136-148D15S 1021

Non delete247-247176-180176-254180-254176-256D15S 1035

PCR semiQ BaranCommentairesTemoinBaran 040578Soeur 040579Pere 040577Mere 040576

Mise en évidence d’une délétion chez le cas index

Les SNPsSingle Nucleotide Polymorphisms

� 80% de tous les polymorphismes� 1/1000 pb� Bialléliques (moins informatifs que les microsatellites)� Plus stables que les microsatellites� Génotypage par test + ou - , automatisable

Carte des SNPs :

- identification des SNPs par séquençage (génome, EST), SSCP, DHPLC, analyse bioinformatique

- plus d’un million de SNP déjà répertoriés : très grande densité- extra- ou intra-géniques (régions codantes, promoteurs)- optimisation de la carte: régions riches en gènes, fonction

du taux de recombinaison des différentes régions du génome

Applications liées à l’étude de SNP

� Recherche d’anomalies de dosage génique� CGH array avec plusieurs milliers de SNP

o Etude de gènes candidats en pharmacogénétique

POLYMORPHISMES DE NOMBRE DE COPIESCNV: Copy Number Variation

o Délétions/Duplications

o Dus à la présence de duplications segmentaires

o Une des sources les plus importantes de polymorphis me

o Représente environ 12% du génome ( Redon et al., 2006 )

o Concerne des segments de quelques kb à plusieurs centaines, voire milliers, de kb

o Peuvent contenir plusieurs gènes

CNV: intérêt en CGH array

Validation des anomalies de dosage génique en CGH array� Nombreuses publications avec plusieurs centaines de témoins issus des banques mondiales (HapMap..)

� Bases de données sur les CNV:� Database of Genomic Variants (Toronto)

� Database of Sanger Institute

Les mutations géniques

1) Petites délétions, duplications, insertions, inversions intragéniques : taille: quelques dizaines de bases à quelques kbavec ou sans décalage du cadre de lecturedécalage : structure anormale, aboutit à codon STOP

2) Mutations ponctuelles : - non sens : STOP (TAA, TGA, TAG)- faux sens : substitution d’un AA par un autre (pathogénicité?)- création/abolition d’un site d’épissage- délétion, insertion d’1 ou plusieurs nucléotides (2 - 5) : décalage du

cadre de lecture

3) Mutations instables avec amplification :- (CGG)n : X fragile- (CTG)n : Steinert- (CAG)n - polyglutamines : maladies neurodégénératives- (GAA)n : Friedreich- (GCG)n - polyalanines- (CCCCGCCCCGCG)n

Se rencontrent dans : éléments régulateurs, exons, introns, jonctions int ron-exon

Conséquences possibles des mutations ponctuellesd’un gène et de ses régions régulatrices

Diagnostic moléculaire des maladies génétiques

DIAGNOSTIC MOLECULAIRE

o de sujets atteints : diagnostic de certitude, prise en charge spécifique, prévention, pronostic

o de « porteurs sains » de la mutation (maladies récessives)

> permet le conseil génétique

o fœtal : diagnostic prénatal

o diagnostic préimplantatoire

o diagnostic présymtomatique (législation)

DIAGNOSTIC MOLECULAIRE

o Cas du gène exprimé dans un tissu profond, dont la fonction est difficile à mettre en évidence : analyse du produit du gène impossible

o Le gène peut être analysé sur n'importe quelle cellule (globules blancs)

o Diagnostic possible dans certains cas même si gène non identifié

Le matériel biologique

� Analyser quoi?

o ADN génomique

o ARNm (>ADNc)

� Où? (le génome est partout)

o Cellules nuclées du sang

o Cellules de desquamation buccale

o Cellules de la racine du cheveu

oEct…

� Type de prélèvement

o Sang (leucocytes) prélevé sur tube avec anticoagulant EDTA +++ (3 ml)

o Sang séché sur papier buvard

o Prélèvement biopsique

Cas du diagnostic prénatal

� Prélèvements par voie trans-abdominale

� Villosités choriales (cellules du trophoblaste, 9ème-11ème SA) (avantage= pas de culture+++)

� Amniocytes (cellules du liquide amniotique, 17ème SA)

Extraction, purification, quantification de l’ADN

� Méthodes manuelles et automatiques

� Procédé classique� Phénol : dénature les protéines� Chloroforme : élimine les traces de phénol� Protéinase K : hydrolyse les protéines

� Quantification : spectrophotométrie UV� 260 nm : absorbance des acides nucléiques� 280 nm : absorbance des protéines� Rapport DO (260 nm)/ DO (280 nm) = 1,8 � < 1,8 : mauvaise qualité d’ADN

Stratégies d’analyse des mutations géniques

DIAGNOSTIC DIRECTRECHERCHE DE DELETIONS/DUPLICATIONS

• Situation normale au niveau somatique :• séquences autosomiques : 2 copies• séquences portées par X et Y : fille 2X; garçons 1X, 1Y

• Nombreuses situations pathologiques avec aneusomie :• microdélétions : cancers, Di-george, Williams-Beuren, Rubinstein-Taybi,

Duchenne, retards mentaux (télomères 6-8%), surdités …• duplications : CMT1A, …• amplification : cancers

• Intérêt analyse de la ploïdie :• diagnostic• identification de gènes responsables de maladies : clonage positionnel

• Techniques• Southern Blot, PCR semi quantitative ou quantitative, FISH, CGH array…

Southern Blot- Principe

� Digestion de l’ADN par enzyme de restriction

� Séparation des fragments de restriction par électrophorèse sus gel d’agarose

� Transfert des fragments d’ADN du gel sur membrane de nylon

� Hybridation de la membrane par une sonde spécifique marquée au P32

� Exposition sur un écran et révélation

Southern Blot- X fragile

M Marqueur1 Garçon normal (Villosité)2 Fille normale3 Garçon muté4 Garçon muté5 Fille normale6 Garçon normal7 Garçon normal8 Fille normale9 Garçon muté10 Fille mutée (Villosité)11 Garçon muté

Southern Blot- X fragile

PCR semi-quantitative et quantitative

� Plusieurs techniques: QMF-PCR, QM-PSF, MLPA, MPLC, PCR-Q avec Sybrgreen ou avec sondes Taqman

� Principe QMF-PCR: (Niel et al. 2004)� Amplification multiplex en condition limitante (23 à 24 cycles)

� Analyse des pics sur séquenceur automatique

� Comparaison de la hauteur des pics entre témoins et patients

QMF-PCR

P e a k he i gh t E x o n sE x o ns T h 0 3 0 8 5 7 D S C R 1 F c IX E x o n2 E x on 3 E x on 7 E x o n1 0 E x on 1 5 E x on 2 0 E x on 2 4 E x on 2 5D SC R 1 5 07 4 1 8 9 1 - 0 ,9 2 2 ,7 6 2 ,1 1 2 ,1 9 1 , 6 0 1 , 9 4 1 , 9 4 1 ,0 2 0 ,9 6

Fc IX 2 55 6 1 0 3 4 1 , 0 9 - 3 ,0 0 2 ,2 9 2 ,3 8 1 , 7 4 2 , 1 1 2 , 1 0 1 ,1 1 1 ,0 5E x on 2 4 90 7 6 6 2 0 , 3 6 0 ,3 3 - 0 ,7 6 0 ,7 9 0 , 5 8 0 , 7 0 0 , 7 0 0 ,3 7 0 ,3 5E x on 3 7 00 1 1 2 3 8 0 , 4 7 0 ,4 4 1 ,3 1 - 1 ,0 4 0 , 7 6 0 , 9 2 0 , 9 2 0 ,4 8 0 ,4 6E x on 7 6 01 5 1 0 2 2 0 , 4 6 0 ,4 2 1 ,2 6 0 ,9 6 - 0 , 7 3 0 , 8 9 0 , 8 8 0 ,4 6 0 ,4 4

E x o n1 0 4 76 3 1 1 0 8 0 , 6 2 0 ,5 8 1 ,7 2 1 ,3 2 1 ,3 7 - 1 , 2 1 1 , 2 1 0 ,6 4 0 ,6 0E x o n1 5 4 08 3 7 8 3 0 , 5 1 0 ,4 7 1 ,4 2 1 ,0 8 1 ,1 3 0 , 8 2 - 1 , 0 0 0 ,5 2 0 ,5 0E x o n2 0 5 55 3 1 0 6 9 0 , 5 2 0 ,4 8 1 ,4 3 1 ,0 9 1 ,1 3 0 , 8 3 1 , 0 0 - 0 ,5 3 0 ,5 0E x o n2 4 5 00 5 1 8 2 9 0 , 9 8 0 ,9 0 2 ,7 1 2 ,0 7 2 ,1 5 1 , 5 7 1 , 9 1 1 , 9 0 - 0 ,9 5E x o n2 5 6 37 3 2 4 6 2 1 , 0 4 0 ,9 5 2 ,8 6 2 ,1 8 2 ,2 7 1 , 6 6 2 , 0 1 2 , 0 1 1 ,0 6 -

P e a k he i gh t E x o n sE x o ns T h 0 3 0 8 5 7 D S C R 1 F c IX E x o n2 E x on 3 E x on 7 E x o n1 0 E x on 1 5 E x on 2 0 E x on 2 4 E x on 2 5D SC R 1 5 07 4 1 8 9 1 - 0 ,9 2 2 ,7 6 2 ,1 1 2 ,1 9 1 , 6 0 1 , 9 4 1 , 9 4 1 ,0 2 0 ,9 6

Fc IX 2 55 6 1 0 3 4 1 , 0 9 - 3 ,0 0 2 ,2 9 2 ,3 8 1 , 7 4 2 , 1 1 2 , 1 0 1 ,1 1 1 ,0 5E x on 2 4 90 7 6 6 2 0 , 3 6 0 ,3 3 - 0 ,7 6 0 ,7 9 0 , 5 8 0 , 7 0 0 , 7 0 0 ,3 7 0 ,3 5E x on 3 7 00 1 1 2 3 8 0 , 4 7 0 ,4 4 1 ,3 1 - 1 ,0 4 0 , 7 6 0 , 9 2 0 , 9 2 0 ,4 8 0 ,4 6E x on 7 6 01 5 1 0 2 2 0 , 4 6 0 ,4 2 1 ,2 6 0 ,9 6 - 0 , 7 3 0 , 8 9 0 , 8 8 0 ,4 6 0 ,4 4

E x o n1 0 4 76 3 1 1 0 8 0 , 6 2 0 ,5 8 1 ,7 2 1 ,3 2 1 ,3 7 - 1 , 2 1 1 , 2 1 0 ,6 4 0 ,6 0E x o n1 5 4 08 3 7 8 3 0 , 5 1 0 ,4 7 1 ,4 2 1 ,0 8 1 ,1 3 0 , 8 2 - 1 , 0 0 0 ,5 2 0 ,5 0E x o n2 0 5 55 3 1 0 6 9 0 , 5 2 0 ,4 8 1 ,4 3 1 ,0 9 1 ,1 3 0 , 8 3 1 , 0 0 - 0 ,5 3 0 ,5 0E x o n2 4 5 00 5 1 8 2 9 0 , 9 8 0 ,9 0 2 ,7 1 2 ,0 7 2 ,1 5 1 , 5 7 1 , 9 1 1 , 9 0 - 0 ,9 5E x o n2 5 6 37 3 2 4 6 2 1 , 0 4 0 ,9 5 2 ,8 6 2 ,1 8 2 ,2 7 1 , 6 6 2 , 0 1 2 , 0 1 1 ,0 6 -

Principe de la technique de CGH-Array

Elle permet la comparaison du nombre de copie d'une région génomique dans un ADN génomique à tester par rapport à un ADN de référence.

Co-hybridation de deux sondes (ADN test + ADN de référence ) marquées avec des fluorochromes différents (Cyanines 3 et 5) sur une biopuce portant un clone de la région

d’intérêt (BACs, cosmides, produits de PCR, cDNAs)

Clone « normaux » dans l’ADN à tester

marquagemarquageMélange et co-hybridation

Clone délétés dans l’ADN à tester

Clone amplifiés dans l’ADN à tester

ScanMesure des intensités de fluorescence

ADN test ADN de référence

Puces ADN ( macroarray et microarray )

• Sondes– oligonucléotides de synthèse ou produits PCR– spécifiques de certains gènes– permettent de détecter des cibles complémentaires m arquées et

présentes dans le mélange à analyser

• Sondes immobilisées sur un support solide (matrice)– Membrane de nylon (densité de dépôt faible) [macroarray]– Lame de verre (densité de dépôt forte) [microarray]

• Sondes marquées– Radioactivité [ macroarray]– Fluorescence (cyanines 3 et 5) [microarray]

• Détection des signaux d’hybridation– Phosphoimager [ macroarray]– Scanner de fluorescence [microarray]

• Logiciels d’analyse d’image, de traitement des résu ltats, de quantification

Lame CGH 244K :Un clone tous les 5 à 10 Kb

Stratégies d’analyse des mutations géniques

Recherche d’une mutation connue

a1

a2

Amplification PCR d’un fragment portant la mutation

Détection de la mutation

DIAGNOSTIC DIRECT DE LA MUTATIONMUCOVISCIDOSE : MUTATION ∆∆∆∆F508

Gène CFTR : cystic fibrosis conductance transmembrane regulator

Ile Pheallèle normal : ....... C ATC TT T GG .......

allèle DF508 : ..... C AT- - -T GG .......Ile

PCR

F508

électrophorèse :allèle normal : 97 pballèle ∆F508 : 94 pb

N/N N/∆∆∆∆F ∆∆∆∆F/∆∆∆∆F

97 pb94 pb

DIAGNOSTIC DIRECT DE LA MUTATIONMUCOVISCIDOSE : MUTATION G551D

Gène CFTR : cystic fibrosis conductance transmembrane regulator

allèle normal : ....... GGT CAA CGA .......allèle G551D : ....... GAT CAA CGA ...….

(site HincII : GTCAAC)

HincII

PCR

digestion HincII

allèle normal allèle G551D

850 pb

530 pb 320 pb

530 pb

320 pb

N/N N/ΜΜΜΜ ΜΜΜΜ/ΜΜΜΜ

530 pb320 pb

850 pb

Recherche en une seule étape de 8 mutations du gène CFTR par hybridation inverse

Stratégies d’analyse des mutations géniques

Cas des gènes avec de nombreux exons

C’est le cas général

Exemple : mucoviscidose 27 exons ; plus de 1000 mut ations

1er temps : recherche des mutations les plus fréque ntes [de30 à 40) incluant F508del (environ 65%)]existence de kits commerciaux

2ème temps : recherche des autres mutations par balaya ge des 27 exons

Principe : recherche par différentes techniques électrophorétiques

ou chromatographiques d’une anomalie sur un exon et séquençage de cet exon

BALAYAGE D’EXONS

mutation

? ? ? ? ? ?

Amplification PCR de chacun des exons

Amorces dans les introns à environ 50 pb des exons(jonctions intron – exon)

Eventuellement analyse du promoteur et de régions int roniques

2) Analyse des homo et hétéroduplex: DGGE, DHPLC, HRM

1) Analyse des simples brins:SSCP

ou

Balayage d’exons par analyse de polymorphisme de co nformation du simple brin (SSCP, single strand conformation polymo rphism)

Principe : dans des conditions non dénaturantes (i. e. très différentes de la DGGE), l’ADN mono brin adopte une structure secondaire dictée par sa séquence

Le changement d’un seul nucléotide va entraîner un changement de structure secondaire, donc une modification de la migration électrophorét ique

Principe des hétéroduplexes

G T G C A T A C A C T G

Homoduplexesauvage

Homoduplexemuté

Homoduplexemuté

HétéroduplexesHomoduplexe

sauvage

Après amplification par PCR, l’ADN est à nouveau dénaturé et on augmente progressivement la température

> En cas d’hétérozygotie du patient il y a formation de quatre populations

Balayage d’exons par électrophorèse en gradient de gel dénaturant (DGGE, denaturing gradient gel electrophoresis)

Principe : Dans des conditions dénaturantes, selon qu’il con tient ou pas une simple mutation ponctuelle, un même segment d’ADN n’aura pas la mêm e résistance à la dénaturation

En cas de mutation, il y aura ralentissement à la mi gration pour un double brin ADN muté/mutépar comparaison un ADN muté/normal

DHPLC

NV

Time (Minutes)6543210

Abs

orba

nce

(mV

)

3

2

1

MUT1 57.5T10 57.5T11 57.5T12 57.5

Time (Minutes)21

Abs

orba

nce

(mV

)

16

14

12

10

8

6

4

2

0

Principe: Dans des conditions de dénaturation parti elle, le temps de rétention sur colonne de chromatographie liquide est différent pour les h omoduplexes et hétéroduplexes

Technique HRM (high resolution melting, fusion haute r ésolution)

Technique qui permet, après une PCR, de discriminer , sur une montée en température très progressive, les différents variants amplifiés, et ce avec un simple fluorochrome intercalant.

En effet, l’utilisation de cette nouvelle chimie sa ture complètement les structures doubles brins et permet de distinguer des variations, même d’une seule base, selon le profil de dénaturation.

Flu

ores

cenc

e

Var

iatio

n de

fluo

resc

ence

Température Température

Homozygote allèle sauvage (GG)

Homozygote allèle sauvage (GG)

Homozygote allèle muté (AA)

Homozygote allèle muté (AA)

Hétérozygote (GA)

Hétérozygote (GA)

Exemple: Mutation G20210A du gène de la prothrombine (facteu r II)

O1’

2’3’

4’

Base

OH

HO – P – O – P – O – P – O – CH2

OH OH OH

OO O5’

désoxyribonucléotide (dNTP)

O1’

2’3’

4’

BaseHO – P – O – P – O – P – O – CH2

OH OH OH

OO O5’

didésoxyribonucléotide (ddNTP)

SÉQUENÇAGE par la méthode de Sanger dite méthode enzymatique

en présence de didésoxyribonucléotides (ddNTP)

Gène de taille modeste (quelques exons)

Séquençage direct

Hétérogénéité des gènes et mutations connues

Une centaine5118 Kb11q14.3Gène TYR (albinisme oculo-cutané)

Polymorphisme (allèle de prédisposition)

Unique

Très nombreusesDe types très variés

NombreusesDe types très variés

Nb de Mutations

2943 Kb2pGène de l’apolipoprotéine B100 (hypercholestérolémie familiale)

19q13.2

7q31.2

Xp21.2

Localisation

43,6 KbGène de l’apolipoprotéine E (dyslipémie III)

27250 KbGène CFTR (mucoviscidose)

792,5 MbGène de la dystrophine (myopathie de Duchenne et Becker)

Nbd’exons

Taille (kb)

Gène (maladie)

Stratégies d’analyse des mutations géniques

DIAGNOSTIC SEMI-DIRECT

- Gène connu - Mutation inconnue (nombreuses mutations)

Analyse de liaison génétique avec marqueurs polymorphes intra- ou juxta-géniques

Marqueurs utilisés : microsatellites

marqueurs à distance # 0 cM du gène

1cM 1cMjuxta 1 intra juxta 2

GENE

DIAGNOSTIC PRENATAL SEMI-DIRECTMaladie récessive liée à l’X

Risque d’erreur associé au diagnostic : 0.01 x 0.01 = 0.01 %Très faible car marqueurs très proches de la mutation

Mk1Mk2

13

13

13

13

21

25

25

13

21

21

21

25

21

1cM 1cMjuxta intra juxta

GENE

Mk1 Mk2

DIAGNOSTIC INDIRECT

- Gène inconnu(pas de marqueur intra ou juxta)

Analyse de liaison génétique avec marqueurs polymorphes extra-géniques

Marqueurs utilisés : microsatellites

GENEextra 1 extra 2

7 cM 10 cM

=> Nécessité d'utiliser deux marqueurs flanquants

DIAGNOSTIC PRENATAL INDIRECTMaladie récessive liée à l’X

Risque d’erreur associé au diagnostic

avec les deux marqueurs : 0.07 x 0.1 = 0.7 % : acce ptableavec le marqueur extra 1 seul : 7 % : inacceptableavec le marqueur extra 2 seul : 10% : inac ceptable

GENEextra 1 extra 2

7 cM 10 cM

Mk1 Mk2

Mk1Mk2

13

13

13

13

21

25

25

13

21

21

21

25

21

� Découverte de nombreux nouveaux gènes:

� Modification des connaissances sur les modes d’hérédité

� Modification des stratégies d’analyse moléculaire (exemple pratique du diagnostic de l’AOC)

� Classification moléculaire des maladies : albinisme oculo-cutané, rétinite pigmentaire, surdités, MAPKinases-pathies

� Décryptage de voies métaboliques, de signalisation, développementales=> hypothèses fonctionnelles pour identifier de nouveaux gènes

Evolutions conceptuelles

� Pharmacogénétique et pharmacogénomique

� Mise au point de nouveaux médicaments

� Génétique des maladies multifactorielles

� Evolution techniques : PCR temps réel, puces ADN

� Corrélation génotype – phénotype, aspects de pronostic

Evolutions conceptuelles

Hétérogénéité génétique de l’albinisme oculo-cutané.Implications pour le diagnostic moléculaire

Albinisme oculo-cutané(AOC)Introduction

� Maladie génétique, de transmission autosomique récessive, caractérisée par une dépigmentation de la peau, des phanères, et des yeux.

� Quatre types d ’AOC non syndromique (1,2,3,4).

� Incidence mondiale générale : 1/20 000.� L’AOC 2 est le plus fréquent, mais variations d ’un continent à l ’autre.

Symptomatologie

� Leucodermie homogène généralisée� Phanères dépigmentés de couleur variable� Atteinte oculaire: iris dépigmenté, photophobie, nystagmus, strabisme, acuitévisuelle réduite, absence de vision binoculaire par anomalie du trajet des nerfs optiques

� Hypersensibilité aux UV > risque accru de cancer cutané.

Physiopathologie de l’AOC

� Défaut de biosynthèse des polymères de mélanine au sein des mélanocytes.

� Anomalie de maturation des mélanosomes� Dysfonction d ’une ou plusieurs protéines

mélanosomales : TYR, P, TYRP1, TYRP2, MATP� Blocage dans le cycle de synthèse de la

mélanine

Cycle de synthèse de la mélanine

Diagnostic de l’AOC

� Clinique � Ophtalmologique: étude des segments antérieur et

postérieur, électrophysiologie oculaire.� Dermatologique:

� Recherche de l’activité DOPA oxydase de la tyrosinase sur bulbe de cheveu�AOC 1: activité négative �AOC 2, 3, et 4: activité positive

� Biopsie cutanée: étude en microscopie électronique de la morphologie de mélanosomes

Diagnostic génétique de l’AOC

HETEROGENEITE GENETIQUE: 4 gènes connus :� gène TYR (tyrosinase) en 11q14.3 (AOC 1) 5 exons >100 mutations

� gène OCA2 (pink-eyed dilution) en 15q12q13 (AOC 2) 25 exons >60 mutations

� gène TYRP1 (tyrosinase-related-protein 1) en 9p23 (AOC 3)8 exons -5 mutations

� gène MATP (membrane associated transporter protein) en 5p13 (AOC 4) 7 exons -24 mutations

(Albinism Database: http://albinismdb.med.umn.edu/)

Stratégies d’analyse moléculaire

� Analyse de liaison génétique à l’aide de marqueurs microsatellites dans les familles informatives, aux loci AOC 1, AOC 2, AOC 3, AOC4.

� Étude moléculaire des 4 gènes (TYR, OCA2, TYRP1 et MATP) chez les cas isolés : � gène TYR par séquençage direct � gènes OCA2,TYRP1 et MATP par DHPLC puis séquençage des variants.

Présence de 2mutations

Évocation Diagnostic différentiel

Absencede 2 mutations

Recherchedélétion et mutation

TYR

Diagnostic d’AOC 1

Recherche délétion et mutation

OCA2

Absencede 2 mutations

Diagnostic d’AOC 2

Présence de 2mutations ou délétion

Recherche délétion et mutation

TYRP1

Présence de 2mutations

Absencede 2 mutations

Diagnostic d’AOC 3

Absencede 2 mutations

Recherche délétion et mutation

MATP

Présence de 2mutations

Patient caucasien

Patient noir d’origine africaine

Diagnostic d’AOC 4

Mesure activitéTyrosinase sur bulbe de

cheveu

Recherche délétion récurrente 2,7 Kb

exon 7 OCA2

Négative

Positive homozygote

Diagnostic d’AOC 2

Positive hétérozygote ou négative

Positive

Arbre décisionnel AOC

Exemple de Tony D

T373K/-

TYR

T373K/--/-

R290G/-

OCA2

R290G/--/-

Pas de digénisme. Mécanisme?

Exemple de Tony D

Classification moléculaire des maladies et décryptage de voies métaboliquesexemple des MAPkinases-pathies

PY

PY

PY

PY

PY

PY

La voie Ras

Récepteur

NRAS KRAS HRASRasGAP

SHP-2Grb2SOS

BRAF

MEK1

ERK1

MEK2

Neurofibromatose

Syndrome de Noonan(40%) Syndrome

LEOPARD

Syndrome CFC

CRAFARAF

ERK2

KinasesMNK1,2MSK1,2RSK

F de transcriptionPPARγELK1ETSSTAT1,3

Expression de gènesProgression du cycle cellulaireMort cellulaire

Syndrome de Costello

Syndrome de Noonan(<5%)

Niihori & al, 2006Rodriguez-Viciani & al, 2006

Syndrome de Noonan

� Incidence: 1/1000 à 1/2500 naissance� Gènes

� PTPN11: 50% (code pour Shp2)� KRAS: <5% (Schubbert et al., Nat genet Mars 2006)� SOS1: 20% des patients PTPN11 ou KRAS négatifs (Roberts et al., Nat genet Janvier 2007)

> Hétérogénéité génétique� Syndrome allélique: syndrome de LEOPARD (PTPN11)

� KRAS muté dans le CFC syndrome…

Syndrome de Noonan

Syndrome de LEOPARD

Syndrome de Costello

� Syndrome rare ++� Mutations dans les gènes HRAS (90%) et récemment KRAS2

� Phénotype plus sévère

Conclusion

� La génétique moléculaire médicale= domaine de connaissance en constante évolution� Mucoviscidose : deuxième gène SCNN1Bidentifié dans les formes modérées…

� Implications pour l’analyse moléculaire� Implications pour le conseil génétique:

� Identification de nouveaux gènes = nouveaux diagnostics

� Détermination d’autre modes d’hérédités � Corrélations génotype/phénotype, pronostic