genų inžinerija (pildoma)

Genų inžinerija

Pagrindinės kryptys

Rekombinantinės DNR technologija;

Transgeniniai augalai ir gyvūnai; Kamieninių ląstelių tyrimai;

Pagrindiniai rekombinantinės DNR technologijos etapai

1. Reikiamo geno išskyrimas2. Įterpimas į tikslinę ląstelę

panaudojant vektorių3. Padauginti ląstelių, kiek įmanoma4. Atskirti ir išgryninti gautą produktą

(baltymą)

1 etapas. Geno išskyrimas

1 etapas. Alternatyvus metodas (naudojant atvirkštinę transkriptazę)

Atvirkštinė transkriptazė; Pagal iRNR sintezuoja viengrandę

DNR; Komplementarioji grandis gaunama

panaudojant DNR polimerazę; Šis būdas turi privalumų, nes

normalioje ląstelėje iRNR yra daug daugiau, nei DNR.

II etapas. Geno įterpimas į vektorių

Vektorius – DNR molekulė, kuri panaudojama tam, kad įneštų svetimą geną į tikslinę ląstelę

III etapas. Vektoriaus įterpimas į ląstelę

See worksheet

Replica plating

IV etapas. Ląstelių dauginimasis

Visos gaunamos genetiškai vienodos, nes dauginasi nelytiniu būdu

Transgenai

Transgenezė - procesas, kurio metu svetimi genai ar egzogeninė DNR įterpiami į gyvūno genomą

Transgeninis gyvūnasDNA introduced

•Mice•Cows•Fish•Birds•Sheep•Goats

Kam reikalinga transgenezė?

•Naminių gyvūnų savybėms pagerinti;•Sukurti gyvūnų modelius žmonių ligų tyrimams;•Naudojant naminius gyvūnus juose gaminti žmonėms skirtus vaistinius preparatus (piene);•Gyvūnų genų reguliacijai ar gyvūnų vystymuisi tirti

Retroviral Vectors Microinjection Embryonic stem cells

Kaip įterpiami transgenai?

Mikroinjekcija

A. Remove eggsB. Fertilize in vitroC. DNA is microinjected into male pronucleus (prior to nuclear fusion)

100-1000 copies of gene

D. Implant eggs into surrogate

Fig 22.13 The production of transgenic animals by microinjection of DNA into

fertilized eggs.© 2003 John Wiley and Sons Publishers

Retrovirusiniai vektoriai

Infect early stage embryo with replication-defective retrovirus

Limitationsonly small DNA insertsno regulatory sequencessafety

Engineered Embryonic Stem Cells

FIGURE 19.4

• Remove pluripotent ES cells from blastocyst• Transfect ES• [Site specific Integration - advantage]• Selection• Microinject back into blastocyst• Implant

Transgeninių linijų kūrimas

1. Determine whether the progeny are TRANSGENICpiece of tail, PCR, Southern Blot

2. Mate this transgenic animal to determine whether the transgene is in GERM line

3. Breed to get homogenous transgenic line

Integration of DNAG0 generation -Mosiacs(G1 progeny)

all cells contain transgene

Cloning by Nuclear Transfer

Quiescent [G0] cells Plus EGG

First 3 cell division of Fertilized Egg•no gene expression•embryo-initiating protein factors in

cytoplasm bind to embryonic development genes

When G0 nucleus is transferred•cell specific regulatory proteins are stripped•EIPF bind to EDG

Pelės gamina žmogaus antikūnūs

Transgeniniai galvijai

Pritaikymas•Increasing casein content of milk increase cheese production•Lactose free milk (transgene lactase)•Resistance to bacterial infections•In vivo immunization

•transgene is specific Heavy and Light chain genes which•create mAn against a specific antigen

Kodėl žmogui reikalingi baltymai gaminami piene?

Easy to purify - few other proteins in milkDoesn’t harm transgenic animal- no change to physiology

rProtein is authentically modified post-translationally

Large quantities

Renewable source

Mammary Gland-specific Promoterspromoter and transcription termination sequences are present

Avys ir kiaulės

PIGSPST porcine somatotropin (growth hormone)

adverse effects- kidney, stomach, heart, sterility

human Hemoglobin to replace whole blood transfusions

SHEEPIncrease wool production

keratin promotergrowth factor

Organų persodinimas

Pr

Problema: atmetimasAntibodies from Host bind to Donor OrganElicits Inflammatory ResponseTransplanted Organ Lost

Solution:Transgene in Donor for Complement-

Inhibiting Protein

Paukščiai ir žuvys

Birdstraditional methods can not be used because of avian embryogenesis differences no ES cells found

ALV resistant chickenstransgene - defective ALV genome

makes viral RNA and protein, but blocks assembly of wt viral particlesFish

aquaculturetransgene - growth hormone