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HEMATOLOGIE - CYTOLOGIE
- ESTBA -
Ecole Supérieur des Techniques
de la Biologie Appliquée
Ingrid CONTASSOT – Technicienne de Laboratoire
CHU Robert Debré - APHP
PRESENTATION
Spécificité:
PEDIATRIE
-Technicienne de Laboratoire en Hématologie Biologique
- Pratique la Cytologie depuis plus de11 ans
- Référente des automates Sysmex® du laboratoire
Centre de
référence de
Maladies Rares
Hématologie Biologique
Laboratoire JOUR
Laboratoire Pluridisciplinaire de GARDE
Chaîne XN3000
2 Analyseurs XN10
1 Etaleur-colorateur
Pas de DM
4 microscopes optiques
XT2000i
Chaîne XN3000
XN 10 : CBC, DIFF, RET XN 10 : CBC, DIFF, RET et PLTF
SP10i: Etalement de frottis en fonction de l’HCT + coloration MGG
CBC = Numération Globulaire GB, GR, PLQ
Constantes Erythrocytaires
Erythroblastes
PP: Photométrie / Impédance
DIFF = Formule Leucocytaire PNN, PNE, PNB, LY, Mo,
Myélémie (IG)
PP: Fluorescence des cellules (ADN/ARN)
RET Numération des Réticulocytes
Numération de GR (optique)
PP: Flurorescence (ARN/ADN)
PLT-F
Numération plaquettes
PP: Flurorescence par marquage spécifique
XT2000i NUM, DIFF, RET
Ne compte pas les érythroblastes GB
NUM = Numération
Globulaire GB, GR, PLQ
Constantes Erythrocytaires
PP: Photométrie / Impédance
DIFF = Formule Leucocytaire PNN, PNE, PNB, LY, Mo,
Myélémie (IG)
PP: Fluorescence des cellules (ADN/ARN)
RET Numération des Réticulocytes
Numération de GR (optique)
PP: Flurorescence (ARN/ADN)
Colorateur Boréalys de Biocentric® lames manuelles
Coloration au May Grunwald Giemsa
Ensemble des frottis
manuels
Sanguins
Médullaires
LCR
Acheminement des Prélèvements
Pneumatique
URGEB
8h-17h45
Manu-Portée
Laboratoire
Enregistrement
- Prescriptions Connectées
- Prescriptions Manuelles
Transmission au technicien(ne) en charge du
« compteur »
2± 250 NFS
GARDE
Pneumatique/Manu
Portée
17h45 – 8h
≈ 50% de revue de lame
Réalisation des examens (1)
Mode de passage: Manuel / Automatique 88 µL de sang
-Fonction du type de tube: tubes pédiatriques
Tubes de 1.6 mL et 2.4 mL Automatique
Tubes de 500 µL « Microvette » Manuel (obligatoire)
- Fonction du niveau de remplissage des tubes
Lame SP10i ou Lame manuelle?
-Une lame SP10i en cas de relecture de lame Gestion par le
middleware en fonction d’algorithme définit par le LBM (gestion des
alarmes
-Une lame manuelle pour les demandes particulières: recherches
spécifiques sur les différentes lignées cellulaires
-Une lame manuelle pour les microvettes (contrainte technique)
Réalisation des examens (2)
SIL numéro d’échantillon avec code à barre
Connexion Bidirectionnelle
L’analyseur interroge le SIL pour savoir quelles analyses sont demandées
L’analyseur envoie les résultats au middlware après analyse
Le technicien valide techniquement via le middleware le bilan en fonction des règles
définies au LBM
Le middleware envoie les résultats de l’analyseur sur le SIL
Le bilan est validé biologiquement via le SIL
A Debré chaque NFS est validée
TECHNIQUEMENT puis BIOLOGIQUEMENT
Pas de système de validation automatique
Gestion des Alarmes
Quantitative: anomalie de nombre
Qualitative: anomalie de structure, de positionnement…
Lignée
Erythrocytaire
Lignée
Leucocytaire
Lignée
Plaquettaire
Revue de lames au microscope optique
Lignée Erythrocytaire
Principe de mesure – Hématies
(Technologie Sysmex®)
Canal GR/PLQ Canal RET
Principe d’analyse:
IMPEDANCEMETRIE
Principe d’analyse:
Mesure optique par
CYTOMETRIE EN FLUX
Hematies
Alarmes Quantitatives Alarmes Qualitatives
Microcytose VGM < 70 fl
Anémie HGB < 8 g/dl
Hypochromie CCMH < 29 g/dl
Anisocytose
IDR-CV > 22%
IDR-SD > 65 fl
Distribution anormale de la courbe
impédance des GR
Double population (transfusion)
Alarmes de suspicion
Carence en fer?
CCMH < 31 g/dl, VGM < 75 fl, IDR-
CV > 15%, HGB < 11 g/dl
Anomalie de l’hémoglobine? VGM
< 75 fl, IDR-CV > 15%
Turbidité Hgb? CCMH > 36.5 g/dl
Limites des automates (1)
Quelles sont les anomalies renseignées par les automates?
Anomalies de
TAILLE
Anomalies de
TEINTE
Anomalies de
FORME
(indirectement renseignées)
- Microcytes
- Macrocytes - Hypochromie
- Polychromatophilie
- GR fracturée
(schizocytes)
- GR Fragmentée
Hématies
Nouveau Né (à terme)
TAILLE
TEINTE
FORME
- Polyglobulie
- Macrocytaire : VGM 97-122 fl
- Réticulocytes élevé 300x109/L
Morphologie des Hématies du NNE
Pyknocyte Echinocyte Acanthocyte Hématies
cibles Sphérocytes
Corps de
Jolly
Hématies
Anémie Ferriprive
TAILLE
TEINTE
FORME
Anémie microcytaire hypochrome
Hématies cibles, elliptocytes, microcytes
Hématies
Incompatibilité ABO
TAILLE
TEINTE
FORME
- Nouveau-né anémie sévère
- Régénérative ++ : le VGM, CCMH
- Sphérocytes ++ (≈ sphérocytose héréditaire)
-Test de Coombs: POSITIF
la mère de groupe O et l’enfant de groupe A
ce qui est en faveur d’une incompatibilité ABO
Hématies
Sphérocytose Héréditaire
TAILLE
TEINTE
FORME
- Sphérocytes ++
- Réticulocytes ++ avec aspect du graphe (LFR )
- Alarme scatterg RET Anorm
- IDR-SD et CV
- CCMH normale
Spherocytose
Hématies
Drépanocytose Homozygote
TAILLE
TEINTE
FORME - Drépanocytes, hématies cibles,
corps de jolly (asplénie fonctionnelle),
-Réticulocytes ,
-Canal RET: le nuage de GR a une forme
rectangulaire évocatrice, avec la fraction la plus à
droite des globules rouges LFR
- Réticulocytes surestimés bleu de Cresyl
Drépanocytose
Hématies
Hémoglobinose C
TAILLE
TEINTE
FORME - Anémie discrète
- Microcytaire
- Hyperchrome (déshydratation due à l’HbC
- Hématies cibles ++
un aspect » vrillé »
déformée par les cristaux d’hémoglobine C
Hématies
Beta-Thalassémie
TAILLE
TEINTE
FORME
- Polyglobulie microcytaire
- Quelques hématies cibles, microcytes
rares dacryocytes et elliptocytes
Hématies
Elliptocytose Héréditaire
TAILLE
TEINTE
FORME
- Elliptocytose héréditaire (plus de 30%)
- Sans fragmentation
- Sans retentissement clinique
Aucune alarme de l’analyseur
Elliptocytose
Elliptocytose avec fragmentation
Hématies
Syndrome Hémolytique et Urémique
SHU
TAILLE
TEINTE
FORME - SHU infection à Escherichia coli
- Schizocytes, hématies fracturées
-Pas d’alarme « fragments » du XE2100
présence de 3.5% de schizocytes
Hématies Syndrome Hémolytique et Urémique SHU et intérférence
TAILLE
TEINTE
FORME
-Interférence des hématies fracturées de
petite taille sur le graph des PLQ-O, ce qui
surestime le chiffre de PLQ.
-Pas d’alarme Scatter Plq Anorm
Décompte des plaquettes en cellule de
Malassez 35000/mm3
Hématies
Déficit en G6PD
(crise hémolytique)
TAILLE
TEINTE
FORME
- Anémie hémolytique régénérative
- Hemighost
Déficit en G-6 PD Hemighosts
Lignée Leucocytaire
Principe de Mesure et Différenciation
Leucocytes (1)
(Technologie Sysmex®)
Canaux DIFF (XE/XT) et WDF (XN)
Principe d’analyse:
CYTOMETRIE EN FLUX
- Nombre de GB
- Formule leucocytaire
Principe de Mesure et Différenciation
Leucocytes (2)
(Technologie Sysmex®)
Canaux GB/BASO (XE/XT) et WNR (XN)
GB/BASO
- Nombre de GB total
- Polynucléaires Basophiles (% et #)
WNR
- Nombre de TNC-N
- Erythroblastes
Principe d’analyse:
CYTOMETRIE EN FLUX
Leucocytes
Alarmes Quantitatives (1)
Seuils
paramétrables au
sein de l’analyseur
Seuils à définir en
fonction du
recrutement du
laboratoire
Leucocytes
Alarmes Quantitatives (2)
Scatter GB Anormal
Qualitative Présence IG Présence NRBC
- Population non
différenciée
- Aucune discrimination
de GB
- Population au dessus
des PN
- Fluorescence élevée
Présence
d’érythroblastes
Revue de lame
Leucocytes
Alarmes de suspicion (qualitative)
Ly atypique ? Blasts/Abn Lympho ? Deviation gauche ?
Présence d’éléments à
fluorescence élevée
Présence d’éléments au
dessus des lymphocytes
et/ou monocytes
Apparition de cellules au
dessus des neutrophiles
Revue de lame
RDB: Revue de lame obligatoire
- Algorithmes définis par le biologiste responsable du secteur
- Paramétrage du middleware du laboratoire qui va classer la revue de lame
au microscope en différentes catégories, il tient compte du service clinique,
des antériorités et de l’âge:
VF: Vérification de la formule leucocytaire qui consiste à recompter
la formule au microscope
VA: Vérification de la présence d’anomalie au niveau des différentes
lignées cellulaires
Une formule est systématiquement rendu au-delà de 1 G/L de GB,
dans le cas contraire aucune formule n’est rendue
- Environ 50% des lames sont revues: 35% de VF et 15% de VA
Pourquoi autant?
Atypical Lympho?
En pédiatrie, elle correspond aux lymphocytes réactionnels
hyperbasophiles (lympho-plasmocytes principalement)
Blasts Abn/Lympho?
à des lymphocytes réactionnels (cellules mononuclées hyperbasophiles
principalement) couplé avec Atypical lympho dans les syndromes mononucléosique
mais aussi à des blastes lymphoïdes ou myéloïdes ( service d’hématologie clinique)
Alarme déclenchée en pédiatrie fréquemment en excès notamment
pour les moins de 1 ans (liée à l’hyperlymphocytose physiologique)
RDB: Critères de revue de lame
Laboratoire de Jour (1)
Formule de l’automate NON RENDU
Services Cliniques ciblés Hématologie clinique, hôpital de jour hématologie, consultation
hématologie (OHEM)
Pour ces services, seul le biologiste valideur peut décider de
rendre la formule de l’automate.
Type de prélèvement particulier Prélèvements de sang de cordon et de sang fœtal
Anomalie de nombre - Polynucléaires basophiles > 2%
- Polynucléaires neutrophiles < 1G/L si non connu ou
antériorité de plus de 30 jours alarme Neutro sur le
middleware
- Polynucléaires éosinophiles > 2G/L
- Immatures Granuleux > 3% si âge > à 17 ans (obstétrique)
- Immatures Granuleux > 2% si âge < à 17 ans alarme IG
Présence d’alarme - Alarme « Blasts/Abn Lympho ?» associée ou non à l’alarme
« Atypical Lympho » pour les patients < à 3 mois ou service
HAD
- Alarme « Blasts/Abn Lympho ?» associée ou non à l’alarme
« Atypical Lympho » avec un chiffre de plaquettes < 150 G/L
- Alarme « Blasts/Abn Lympho ?» associée ou non à l’alarme
« Atypical Lympho » avec un chiffre de PN < 1 G/L pour un
patient > à 3 mois
- Alarme « Atypical Lympho » pour les patients < 1 an
- > à 3 mois
Alarme « Atypical Lympho » pour les patients < 1 an
RDB: Critères de revue de lame
Laboratoire de Jour (2)
Formules sanguines de l’automate rendue MAIS
Vérification des éventuelles anomalies sur les GB, GR et PLQ au microscope optique
Dans tous ces cas le message « Lame VA » apparaîtra sur le middleware
Services Cliniques ciblés - Urgences pédiatriques (OURG), lits portes (HURG),
réanimation, pédiatrie générale, HAD
- Neurologie : sauf si réalisation de 2 formules sanguines en
antériorité
Recherches particulières - Recherche de schizocytes, de corps de jolly
- Recherche de parasites sanguins
- Recherche de lymphocytes vacuolés, de blastes
Anomalie de nombre - Polynucléaires neutrophiles < 1,5 G/L
- Leucocytes < 4 G/L ou > 20 G/L
- Hémoglobine < 10 g/dl
- IDR CV > 18% si âge < à 17 ans
- IDR CV > 22% si âge > à 17 ans
- IDR SD > 55 fl si âge < à 17 ans
- VGM < 70 fl
- CCMH > 36.5
- Chiffre de plaquette non rendu
- Plaquettes < 150 G/L
- Réticulocytes > 150 G/L Alarme « Voir GR »
Présence d’alarmes - Alarme « Blasts/Abn Lympho ?» associée ou non à l’alarme
« Atypical Lympho » si âge entre 3 mois et 1 an
- Alarme « Blasts/Abn Lympho ?» associée ou non à l’alarme
« Atypical Lympho » si âge > 1 an avec plaquette > à 150 G/L
- Alarme « Blasts/Abn Lympho ?» associée ou non à l’alarme
« Atypical Lympho » si âge > 1 an et PN > 1 G/L
sans antériorité.
Si antériorité de moins de 8 jours, l’étoilage est possible.
Leucocytes
Cas 1: (1)
HEMOGRAMME
-Hyperleucocytose
ALARMES
- Alarme Scatter GB Anorm mauvaise
Séparation des populations (DIFF)
- Alarme Blasts
- Alarme Anor. Lymph/L-Bl
- Formule non rendue
- Sur lame: nombreuses Cellules
Mononucléees
Hyperbasophile (CMH)
- DM96 lymphocytes et blastes
Leucocytes
Cas 1: (2)
MonoNucléose
Infectieuse
Leucocytes
Cas 1: (1)
HEMOGRAMME
- Hémogramme normal
- Hormis une thrombopénie modérée
ALARME
Pas d’alarme
- A noter: Le nuage des lymphocytes très allongé
est anormal
Leucocytes Cas 2: (2)
- Sur lame: présence de blastes lymphoïdes
- Ces blastes ont été comptés en lymphocytes
par l’analyseur
- Le DM96 sous estime les blastes puisqu’il en
classe une partie en lymphocytes
Leucémie Aigue
Lymphoïde
Leucocytes Cas 3: (1)
HEMOGRAMME
- Hyperleucocytose
- Anémie sévère
- Thrombopénie
- Formule non rendue
ALARME
- Alarme Scatter GB Anorm
- Blasts
GRAPH
-Canal RET: population qui interfère
Avec les réticulocytes (surestimation)
Bleu cresyl
Leucocytes Cas 3: (2)
Sur lame: présence de nombreux blastes myéloïdes
Leucémie Aigue
Lymphoïde
Leucocytes Cas 4: (1)
HEMOGRAMME
- Anémie sévère
- Thrombopénie
ALARME
- Alarme Lympho Aty
-Anor. Lymph/L-Bl
- Blasts
GRAPH
-Présence d’une population hautement
Fluorescente située au dessus des
monocytes
Leucocytes Cas 4: (2)
Sur lame présence de 35% blastes myéloïdes
de morphologie mégacaryoblastique
Leucémie Aigue Myéloïde
de type LAM7
Leucocytes Cas 5: (1)
HEMOGRAMME
- Nouveau Né
- Hyperleucocytose avec dépassement
de linéarité de l’analyseur dilution
- Aucune formule rendue
ALARME
- Alarme Scatter Gb Anorm
-Alarme Blasts
Leucocytes Cas 5: (2)
Sur lame: présence de plaquettes dysmorphiques de
grande taille et dégranulées
Présence d’un pourcentage élevé de blastes
de morphologie myéloïde et de quelques
micromégacaryocytes
Réaction Leucémoïde
Transitoire du Nne
Mongolien
RLT
Lignée Mégacaryocytaire
Principe de mesure – Plaquettes
(Technologie Sysmex® XE/XT)
Canal GR/PLQ Canal RET
Principe d’analyse:
IMPEDANCEMETRIE
Principe d’analyse:
Mesure optique par
CYTOMETRIE EN FLUX
Canal Fluorescence - PLTF
Principe de mesure – Plaquettes
(Technologie Sysmex® XN)
- La réaction est spécifique des plaquettes (marquage spécifique)
- Détermination de l’IPF: caractérisation de la thrombopénie (centrale ou
Périphérique)
Paquettes
Alarmes Quantitatives Alarmes Qualitatives
- Thrombocytopénie
- Thrombocytose
- Dist. PLQ Anorm (impédance)
- Scatter PLQ Anorm (optique)
- Aggreg PLQ? (suspicion d’agrégats
Plaquettaire)
En cas de thrombopénie?
Devant une thrombopénie:
-Patient est il connu ou pas? Antériorité
-Présence ou non d’un caillot dans le tube
-Vérification de l’anticoagulant
-Si l’ensemble de ces investigations n’explique pas la thrombopénie:
Colorer un frottis sanguin au MGG
Rechercher la présence éventuelle d’amas de plaquette et/ou fibrine
Présence éventuelle d’anomalie sur la lignée plaquettaire
Devant un taux normal de plaquette avec suspicion d’agregat:
Dans tout les cas, les alarmes de suspicion d’agrégat plaquettaire devront être
Vérifiées afin aussi de passer à côté d’une thrombocytose
Plaquettes
Syndrome MYH9 (1)
HEMOGRAMME
-Thrombopénie sévère
-VMP non rendu
ALARME
- Dist. PLQ anorm
XT2000i
Plaquettes
Syndrome MYH9 (2)
HEMOGRAMME
-Thrombopénie sévère
-VMP non rendu
-PLT &F sont rendues
ALARME
- Dist. PLQ anorm
XN
Plaquettes
Syndrome MYH9 (3)
Patient atteint d’une anomalie de May- Hegglin caractérisée par une macrothrombopénie avec une ou plusieurs inclusions basophiles dans les polynucléaires correspondant à la myosine anormale précipitée.
Plaquettes
Syndrome des plaquettes grises
Plaquettes agranulaires, Absence des granules alpha et Grises sur frottis colorés au MGG. Thrombopénie est modérée. Attention à l’éventuelle activation du prélèvement dégranulation artéfactuelle des plaquettes (Fibrine et amas)
Fausses Thrombopénies
• Fausse thrombopénie :: Présence de fibrine et amas plaquettaires Élement évocateur : la remontée du bruit de fond vers la droite
• Fausse thrombopénie :: Présence de petits amas plaquettaires qui n’ont pas déclenché d’alarme agrégats plaquettaires et qui ont été comptés en plaquettes de grande taille dans le canal optique et ne donne pas un aspect habituel de distribution plaquettaire . Amas visible dans le frottis
Conclusion
Limites des analyseurs…
En pédiatrie, les analyseurs ont des difficultés à identifier et/ou à séparer les
différentes populations sanguines en particulier les leucocytes
Déclenchent des alarmes souvent par excès
A l’inverse, ils peuvent nous faire passer à côté de pathologies en n’émettant
Aucune alarme.
Cependant l’analyse de l’hémogramme, la maîtrise des scattergrammes,
notre expérience mais aussi la réalisation d’étude sur site par rapport à
notre recrutement, nous permettre de définir des algorithmes afin que la revue
de lame soit la plus pertinente possible.
De plus la remontée de ces limites auprès du fournisseur lui-même est nécessaire
pour l’amélioration futur de la prise en charge des patients.
Quel avenir pour les microscopes
optiques?
Le développement des microscopes automatisés « menace » t-il les microscopes
optique?
En ce qui concerne la pédiatrie: NON… pas encore
Nécessite une standardisation dans la réalisation du frottis: pas
toujours possible en pédiatrie
De notre étude il y a quelques années avec le DM96:
- Confortable pour détecter rapidement les anomalies des globules rouges et
des plaquettes
- Confusion entre les lymphocytes et les blastes lymphoïdes
- Reclassement manuel des cellules trop important chez le nouveau né
- Pas de vision possible du bout de frottis
-Apprécié pour les recherches spécifiques d’anomalies comme les recherches
de maladies de surcharge
Sources
Documentations Sysmex®
- XN Présentation et principes
- Support de stages de perfectionnement analyseurs: XE/XT et XN
Documentations internes – Laboratoire d’hématologie biologique de RDB
- Documents de formation interne
- Procédures internes
- Présentation du Dr Odile Fenneteau – Biologiste responsable du secteur
de cytologie du laboratoire
Fonctionnement du DI
https://www.youtube.com/watch?v=dP-FEJszyl8
MERCI DE VOTRE ATTENTION…
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