histolojik teknikler
Post on 02-Jul-2015
2.416 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Histoloji, dokuları inceleyen bir bilim dalıdır. Dokuların yapısının araştırılması yanısıra ikincil
olarak tek tek hücrelerin ayrıntılı yapısını da araştırır. Histoloji ve sitoloji birbirleri ile yakın ilişkilidir.
Canlı dokuların mikroskobik incelenmesi ile ideal sonuçlara ulaşılır. Ancak sadece küçük ilkel canlılar bu
yolla incelenebilir. Dokuların çoğu bu yolla incelenemeyecek kadar kalındır. Histolojik tekniklerin çoğu
canlı dokuya en yakın bir biçimde korunmuş veya fikse edilmiş öldürülmüş dokulara uygulanır. Ölü
dokulardan hazırlanan histolojik preperatların canlı dokulardan daha farklı olduğunu unutmamak gerekir.
Bu değişiklikler artifakt olarak adlandırılır. Artifaktlar herhangibir işlem basamağında ortaya çıkabilir.
Dokuda en az hasara yol açacak yöntemler kullanılmalıdır.
Sitolojik ve histolojik çalışmalardaki amaç, organizmayı oluşturan hücre, doku ve organların
normale yakın bir şekilde morfolojik olarak mikroskop altında incelenmesidir. Bu da ancak histolojik ve
histokimyasal teknikler sayesinde olabilmektedir. Histokimya 1830’dan bu yana ayrı bir bilim dalı olarak
gelişmiştir. Ancak 1899-1928 yıllarında anilin boyaların histolojide kullanılmaya başlamasıyla büyük bir
atılım olmuştur.
Preparat hazırlamak için çok teknik vardır. Bunların çoğu değişik tip mikroskoplarda incelenen
kesitlerin hazırlanması ile ilgilidir. Tek bir yöntem tek bir boyama yöntemi dokunun ne tüm hücrelerini ne
de hücre bileşenlerini ayrıntılı gösteremez. Çok az bir doku örneğinin boyanması ile morfoloji,
histokimyasal ve immünolojik yöntemlerle fonksiyonel özellikleri, elektronmikroskopi ile de ince yapı
gösterilebilir.
Histologlar, tekniğin neden kullanıldığını, nasıl çalıştığını ve yöntemin ayrıntılarını bilmelidir.
Uygun zaman içinde, dokudan mümkün olan en fazla bilgi edinilmelidir. Teknikler dikkat ve beceri ile
uygulanmalı sonuçlar doğru yorumlanmalıdır.
Histolojide Kullanılan Yöntemler
1-Preparasyon Yöntemleri
Taze hücre ve dokular: Kan ve lenf gibi sıvısal örnek hücreleri, derialtı bağ dokusu hücreler direkt
olarak incelenebilir. Doku kalın veya katı bir organ halindeyse tuz çözeltisi içinde diderek veya
ayırarak hücrelerin birbirinden ayrılması sağlanır. Taze preparatlarda hücreler gerçek
morfolojilerini yitirmeden incelenir. Ancak kontrast azlığından dolayı vital boyama uygulanmalı ya
da faz-kontrast mikroskop kullanarak incelenmelidir.Canlı ve taze materyelin
çalışılması için lam ve lameller temiz olmalı. Canlı numuneler için
kullanılan pipetler, cam eşyalar ve aletler kimyasal maddeler için
kullanılanlar ile asla karıştırılmamalıdır. Herbir kültürden alınacak
2
küçük organizmalar için ayrı bir pipet kullanılır. Her kimyasal madde için
de ayrı pipet kullanılmalıdır. Saf kültür için çalışmaya başlanmadan önce
cam eşyayı ve ortamı sterilize etmek gereklidir. Canlı ve taze materyel için
bright-Field illumination- ışıklandırma dikkatli kontrol edilmeli, çünkü
canlı hücrenin birçok yapısı refraktif indeks veya renkte çok az fark
ile ayırt edilir. Küçük ve şeffaf organizmalar, serbest yaşayan protozoalar,
küçük sölenteratlar, rotiferler, ectoproct lar, yassı kurtlar, nematod lar
snnelidler, krustaseler ve omurgasızların ve aşağı omurgalıların larvaları,
embriyoları ve yumurtaları bir iki damla su içinde incelenebilir. Tatlı su
ve toprakta yaşayanlar tatlı suda ve deniz suyu veya tuzlu ve acı suda
yaşıyanlar uygun tuzluluktaki suda incelenirler. Ancak su metaller,
chlorine veya diğer zehirler ile kirlenmemiş olmamalıdır.Tatlı su
organizmaları için havuz veya kültür kabından alınan su yeterlidir. Deniz
suyu yalnız cam, porselen, toksik tipte olmayan bazı plastik ile temasta
olmalı, metal borular birçok organizma için toksiktir.
Vital boyama ile hücrelerin sitoplazmasına renk ve kontrast kazandırılır. Vital boyama 2 şekilde
uygulanır. Canlı hücreler boya solusyonunda ayrılarak (supra-vital boyama ) veya canlı organizmaya
boyanın injeksiyonu ile (intra-vital) boyanabilirler. Canlı hücre kısımları gösterildiğinden bu yöntemler
idealdir. Vital boyama ile sitoplazmik yapılar gösterilir. Çekirdek zarı vital boyalara dirençlidir. Çekirdek
zarının boyalara geçirgenleşmesi hücre ölümünün ifadesidir.
2-Sitolojik Yöntemler
Hücre içeren sıvılar, aspire kemik iliği gibi ince doku parçaları lam üzerine alınır ve hücrelerin
görünüşlerini koruyabilmeleri için tespit edilir. Organlar ve dokular da lama sürülerek ve smearler hücre
yapısını göstermek için boyanırlar. Boyanmış smearlerin incelenmesi eksfolyatif sitolojide standart bir
yöntemdir. Atipik hücrelerin bulunuşu malignite hakkında fikir verir. Diagnostik sitolojideki gelişmeler
Beale (1860) ‘nin karsinoma hücreleri için vücut sıvılarını incelemesi ile başlamış ve Papanicolaou (1943)
yöntemi ile ilerlemeler kaydetmiştir.
Dalak ve kemik iliği gibi organlarının kesi yüzeyine veya organın bir parçasına lam değdirilerek
uygulanan impression yöntemi ile dokunun küçük bir artitektürel düzeni hakkında fikir edinilebilir.
Yumuşak tümörlerde malignite bu teknikle hızla çalışılabilir.
Smearlerde hücreler yassıldıkları, dokulardan hazırlanan kesitlerdeki hücrelerden daha geniş
olduklarından ve dokunun artitektürünü koruduklarından hücresel ayrıntılar daha kolaylıkla izlenir.
Kesitsel tekniklere ek olarak smearler kullanılabilir.
3-Kesitsel Yöntemler
3
Doku parçalarından alınan örnekler yaklaşık olarak 1 hücre kalınlığında dilimlere ayrılırlar.
Hücresel yapıyı görmek için bu kesitler değişik tekniklerle boyanırlar. Kesitlerin yorumu, kesitler dikey
ya da yatay konumda alınmamışsa tecrübe gerektirir.
Histolojide doğru sonuç veren birçok kesitsel yöntem vardır. Seri kesitlerin alınması ile küçük bir
dokunun rekontriksüyonu yapılabilir. Tüm örneklerden numaralandırılarak kesitler alınır, boyanır ve
incelenir. Doku büyük ise belirli aralıklarla alınan kesitler örneğin tüm yapısını kapsamlı olarak
açıklayabilir. Bu yöntem basamaklı kesit alma (step-sectioning) olarak bilinir.
Taze veya tespit edilmiş dokulardan jilet ile mikrotomsuz kesit alınabilir. Sadece yüzey
boyanacağından histolojik yapı iyi gözlenemez. Bu yöntem hala dokuları tanımanın hızlı ve kolay yoludur.
Mikrotom kullanarak uygulanan kesitsel yöntemlerin çoğunda doku uygun bir kıvama getirilir,
parafin, selloidin veya sentetik resinlere gömülür ya da dondurma (freezing) yapılabilir. Frozen kesitler
taze dokulardan alındığı için tespite gerek duyulmaz. Diğerleri için tespit gereklidir.
Histolojik kesitler genellikle 4-7 m kalınlığında alınır. Yağ damlacıkları, sinir fibrilleri ve kan
damarları gibi geniş yapılar için 10-25 m daha uygundur. Sentetik rezinlere gömülen dokulardan 1
m’luk kesitler alınabilir. Doğal olarak hücresel ayrıntı daha iyi olacaktır. Elektronmikrospobik gözlemler
için ultratom ile 50-100 nm’ lik kesitler alınır. Genellikle gösterim ve eğitim için çıplak gözle incelemek
üzere 300-400 m’ luk kesitler alınabilir. Bu amaçla jelatine gömülmüş organlardan geniş bir mikrotom ile
kesitler alınarak incelenir.
Dokuların çoğu yumuşaktır. Dişler, kemik gibi bazı dokular ise çok serttir. Bu nedenle kesitten
önce dekalsifikasyona gereksinim vardır. Matriksin kalsifikasyonun normal olup olmadığı ise dekalsifiye
edilmemiş örneklerde araştırılır. Bu amaçla dens gömme ortamları ve ağır mikrotomların kullanılması
gereklidir.
Mikroskobik inceleme için dokuların renge ve kontrasta gereksinimi olduğundan kesitlerin
boyanması yapılır. Preperatların uygun bir kırma indisi olmalıdır. Boyama; renkli olan veya floresansı
artıran boyalarla, renkli son ürünler oluşturan kimyasal reaksiyonlarla veya metalik çöktürme ile doku
bileşenleri opaklaştırılarak yapılabilmektedir. Geleneksel boyama yöntemlerine ek olarak boyama-
olmayan teknikler de kullanılabilir.
Histolojide floresans immünolojik yöntemler, otoradyografi, mikroinkrinasyon ve mikroradyografik
yöntemler de kullanılmaktadır.
Floresans immüno-histolojik yöntemler: Florokromla işaretlenmiş antikorların kullanımına
dayanmaktadır. Çok spesifik bir yöntemdir. İmmün kompleksleri ve dokulardaki yapıları göstermek için
kullanılır. Floresans mikroskopta incelenen preparatlar az miktardaki florokromu gösterme yeteneğindedir.
4
Otoradyografi: İşaretlenmiş bir radyoaktif element dokuya verilimini takiben dokudaki hücrelerle
birleşebilir. Otoradyografi bir fotografik emülsiyondaki gümüş tuzlarını indirgeme yetenekleri ile
radyoaktif izotop alanlarını gösterecektir. Fotografik emülsiyon özel plaklardan çıkarılır ve kesitlere
uygulanır. Çalışanlar, radyoaktivitenin zararları konusunda uyarılmalıdır. Biyolojik kullanımdaki
radyoaktif izotopların yarı-ömrü birkaç saatten yıllara kadar değişebilir.
Mikroinkrenasyon (yakıp kül etme ): Lam üzerine alınan kesitler elektrikli fırında ısı yavaş yavaş
artırılarak ısıtılır. Organik maddelerin tümü uzaklaştığından geriye dokunun mineral iskeleti kalır.
Yansıyan ışık ve karanlık saha mikroskobu ile inkrenasyon yapılmamış kontrol kesitle karşılaştırılarak
incelenir. Histospektrografik yöntemle minerallerin kantitatif ölçümü de yapılabilir.
Mikroradyografi: X-ışınlarının absorbsiyonu ile dokunun kimyasal yapısı hakkında bilgi edinilir. X-
ışınlarını absorbe eden kemik, kıkırdak, enamel ve dentin gibi hidroksi-apatit kristallerini içeren kalsifiye
dokular ince taneli fotografik emülsiyon ile yakın temasa tutularak yumuşak bir X-ışını verilir. Elde edilen
fotograf mineralin dağılımını gösterir ve kontakt mikroradyograf olarak adlandırılır. Klasik ışık
mikroskobu ile incelenebileceği gibi projeksiyon mikrografi için geliştirilen aletlerle de incelenebilir.
Kesitin alanlarında mineral miktarları da ölçülebilir. Kemik örnekleri metil metakrilata gömüldükten sonra
öğütülür ve parlatılır. 20 kV X-ışını ile ışınlanır. Çok ince taneli özel fotografik emülsiyonundan geçirilir.
5-10 kV’ lik çok yumuşak X-ışınları kullanılırsa yumuşak doku kesitlerinin mikroradyografları dokuların
protein içeriği ve hücrelerin kuru kütlesi hakkında bilgi elde edilebilir. Mikroradyografi, bazen radyoopak
maddenin injeksiyonu sonunda kan damarlarının düzenini göstermek için kullanılır.
İNCELEME YÖNTEMLERİ
Makroskobik Yöntemler: Histolojide çıplak gözle inceleme yöntemleri de kullanılmaktadır. Müze
örnekleri, kan damarlarının ve diğer anatomik yapıların injeksiyon teknikleri ile gösterimi makroskobik
yöntem, bütün halindeki organların geniş kağıda monte edilmiş kesitleri ise makroskobik ve mikroskobik
yöntemler arasında bir yöntemdir.
Mikroskobik Yöntemler:
Steroskobik diseksiyon mikroskobu ile yansıyan veya geçen ışık kullanarak embriyoları,
dokuları ve bağırsak villusları incelebilir.
Faz-kontrast mikroskobu ile taze ve boyanmamış doku ve hücreler incelenir.
İnterferans mikroskobu ile canlı ve boyanmamış hücrelerin detayları araştırılır. Bu mikroskop
optik terazi olarak kullanılarak hücre içi yapıların ağırlıkları hesaplanabilir.
Konvensiyonel mikroskop ile şeffaf kesitler ve smearler incelenir.
Karanlık saha mikroskobu ile objelerin indirekt görünümünü sağlamak için yüksek yoğunlukta
aydınlatma gereklidir.
5
Polarizasyon mikroskobu ile polarize veya kristalli yapılara sahip dokular incelenir.
Floresans mikroskop ile florokrom boyalarla boyanan veya immünohistolojik yöntemlerle
floresanla işaretlenmiş kesitler incelenir.
Elektron mikroskoplar da yüksek büyütme ve ayrım gücü üreten elektronlar kullanılır. Scanning
elektron mikroskobunda doku yüzey özellikleri ortaya konurken, transmisyon elektron mikroskobunda
hücre ince yapısı ortaya konur.
Histolojik Gözlemleri Kaydetme
Yapılan gözlemler kaydedilmelidir. Kayıtlar şu şekilde olmalıdır.
1-İncelenen dokuların yapısını açıklamak için nitel terimler kullanılmalıdır.
2-Gözlemler fotograflanmalıdır.
3-Nicel ifadelerle dokuların alanı, hacmi ve sayıları kesin veya karşılaştırmalı terimlerle ifade edilmelidir.
HİSTOLOJİ LABORATUVARLARI
İdeal bir histoloji labaratuvarlarında neler bulunmalıdır?
1- Uygun ölçülerde lavabosu bulunan bir tezgah
2- Formalin ve diğer gazların çalışanları etkilenmemesi için çeker ocak
3- Sert tahtadan yapılı 45x35 ebatlarında bir diseksiyon tablası
4- Diseksiyonda kullanmak üzere:
- 20-30 cm uzunluğunda ince ağızlı bıçaklar
- Makaslar
- Traş makinası
- Jiletler
- Paslanmaz çelikten cetvel
- Çeşitli ebatlarda forcepsler
- Spanclar
- Terazi
- Steromikroskop
- İlk yardım çantası
5- Bunzen beki
6- Sıcak tabla
7- 37C’lik inkübatör
8- 60 C’lik fırın
6
9- Boyama alanının iyi ışıklandırılması (Parlak gün ışığı iyidir ancak sürekli olamayacaktır. Düşük vattlı
tungsten – filamanlı lambaların verdiği sarı ışık eozinin boyama yoğunluğunu yanıltabilir. Floresan
aydınlatma ile “colour matching” tüpler tavsiye edilmektedir).
10- Bir başkasının inceleyeceği kesitleri boyayan bir kişi, her iki mikroskopta da renk filtrelerinin aynı
olmasına dikkat etmelidir. Çok kullanılan yellowish eozin eğer mavi filltre ile incelenirse farklı bir
renk tonunda görülür.
11- Boya kapları
12- Cam kapaklı kavanozlar
13- Distile su ve trikrom boyamadaki %1’lik asetik asit için polietilen yıkama şişeleri
14- Pipetler
15- Seri kapatılan kesitleri boyamak için paslanmaz çelik veya plastik kaplar
PREPERASYON
Bazı organ ve dokular için özel hazırlama yöntemleri vardır.
1-ADRENAL: Adrenalde ölümden hemen sonra otolitik değişiklikler oluşur. Otopside bez yarı – sıvı
döküntü içeren ince bir kortikal kapsülde bulunur. Bazı enzimler uzun süre değişmeden kalmasına rağmen,
hücresel ayrıntı için adrenaller ölümden sonraki 1-2 saat içinde tespit edilmelidir. Kan damarları adrenal
çevresinde dallanır. Bez etrafındaki yağlar uzaklaştırılmalıdır.
2-SİNDİRİM KANALI: Fiksasyon en önemli problemdir. Mide mukozasında otolitik değişiklikler
dolaşım durur durmaz ortaya çıkar. Otoliz bağırsakta daha hızlıdır. Özefagus ve mide mukozasının
korunması için ölümden hemen sonra fazla miktarda fiksatifin özefagustan mideye geçirilmesi gereklidir.
Formal-salin bu işlem için önerilir. Vücudu açmadan ve bağırsakları perfüze etmeden tüm bağırsak
kanalını fikse etmek zordur. Fiksatifin periton boşluğuna injeksiyonu da kaba bir fiksasyon sağlar.
Örnekler gerilmeli ve fiksatifle perfüze edilmelidir. Mide açılabilir ve mantar üzerine mukoza üste gelecek
şekilde iğnelenebilir ya da mide açılır ve fiksatif içinde dikey şekilde tespit edilip tutturulur. Gazlı bez
uygulaması önerilmez. Mide ve bağırsak içeriği asla su ile yıkanmamalıdır. Hücrelerde patlama olur. Çok
gerekli ise serum fizyolojik ile içerik uzaklaştırılmalıdır.
3-KESİLMİŞ EKSTREMİTELER: Deri su geçirmez özelliktedir ve birçok fiksatif için etkili bir
bariyerdir. Kesilmiş uzuvlar hemen dissekte edilerek fiksatife aktarılmalıdır. Hemen diseksiyon
yapılamayacaksa ekstremiteler % 10’luk formal-salin içeren bir tanka alınıp, su geçirmez bir kapak ile
kapatılıp +4 C’ de buzdolabına konulmalıdır.
4-GÖZ: Fiksasyon ve kesit alma sırasında ayrılmaya meyilli olan farklı yapıdaki tabakalardan oluşan
karmaşık organlardır. Korneanın kurumasını önlemek ve retinadaki otolitik değişiklikleri azaltmak için
göz çıkarıldıktan hemen sonra % 10’luk formal-salin içine konulmalıdır. Fiksasyondan 48 saat sonra göz
jiletle horizontal olarak açılır. Göz fiksasyondan önce açılmamalı, dondurulmamalı veya fiksatif kamera
içine enjekte edilmemelidir. Cellulose nitrat göz için önerilen gömme ortamıdır. Parafin kesitler,
7
selloidinden veya alçak viskositeli nitrocelluse (LVN) kesitlerinden daha çok retinal ayrılma ve bükülme
göstermesine rağmen kullanılabilir. Celloidin-parafin çiftli gömme ortamı da göz için yararlı bir işlemdir.
5-AKCİĞER: İyi fiksasyon için ağız içinden tüp veya kanülü geçerek toraksı açmadan önce trake içine
fiksatif injeksiyonu yapılmalıdır. 100 mm Hg’den daha az basınçlı bir şırınga ile % 10’luk nötral formal-
salin bir dirençle karşılaşıncaya kadar enjekte edilir. Eğer trake ve akciğerler dikkatli olarak vücuttan
çıkarılmışsa, trake içine akciğerler canlı ölçülerine gelene kadar fiksatif enjekte edilirse tatmin edici
sonuçlar alınmaktadır.
Trake enjeksiyondan sonra çözülür ve akciğerler 48 saat fiksatifte immerse edilir. Eğer plevra
çıkarılırken haraplanmışsa ve yoğun plevral adezyon varsa bu teknikler pek tatminkarlar olmayacaktır.
Vücuttan çıkarıldıktan sonra tüm akciğerleri fikse etmek için diğer yöntem ise formalin buharı ile
şişirmedir. Özel bir aygıtla uygulanan bu işlemde pulmoner yapı mükemmel korunur. Bu yöntemde
akciğerler formalin ile doygun hale getirilmiş kapalı bir alanda 5-6 saat bekletilmektedir.
6-LENFATİK DOKU: Lenf nodları ve dalağı fikse etmek zordur. Eğer kapsül bütünse ne kadar çabuk
fikse edilirse edilsin daha derin kısımlar otoliz olur. Dalak genellikle gerisine fiksatifin penetre olmadığı
dar bir subkapsüler kenar fiksasyonu gösterir. 5 mm den ince küçük lenf nodları bütünüyle fikse olabilir.
Büyükler ufaltılmalıdır. Yumuşak tümörlerde ve dalakta dokunun önce tamamını fikse etmek daha sonra
küçültmek uygun olur.
7-HİPOFİZ: Hipofizin medyan sajital kesitleri önden ön lop, sap ve arka loptan iyi fotograf verir. Sitoloji
lop içinde uniform olmadığından ön lop çalışmaları için horizontal kesitler daha aydınlatıcıdır. Asidofil
hücrelerin çoğunu içerdiğinden lateral kanatları içine alan kesitler tavsiye edilir.
RUTİN HİSTOLOJİK TAKİP
1- Parça alma
2- Tespit (Fixation)
3- Sudan kurtarma (Dehyration)
4- Şeffaflandırma (Clearing)
5- Parafine gömme (Embedding)
6- Kesit alma (Sectioning)
7- Boyama (Staining)
8- Kapatma (Mounting )
1 -PARÇA ALMA
Mikroskobik kesitler için kullanılacak parçaların ölümden,biopsiden ve operasyon işleminden hemen sonra
veya en kısa zamanda alınması gereklidir. Elde edilen ve büyük olan doku ve organ parçalarının çok keskin
bir bisturi veya jiletle daha küçük parçalara ayrılması gerekmektedir. Bu parçaların kalınlığı, tespit
solusyonunun (fiksatifin) nüfuz edebilrne özel1iklerine göre 2-4 mm arasında olmalıdır (1 cm3 ). Jiletin
veya bisturinin keskin olmaması doku parçalarında zedelenme, ezilme ve büzülmelere ve dolayısıyle
yapısal değişikliklere yolaçar.
8
2- TESPİT –FIKSASYON
Bir insan ve hayvan ölür ölmez hücreleri ve dokuları çeşitli katabolik enzimleri kapsadığı için yavaş
yavaş otoliz (kendi kendini çözme) sebebiyle değişikliklere uğrar. Buna postmorterm (ölüm sonrası)
dejenerasyon diyoruz. Aynı değişiklikler operasyonla alınan canlı doku parçalarında da görülür.
Fiksasyonun amacı hücrelerin ve doku elemanlarının canlı hale yakın bir konumda muhafaza etmektir. Bu
yolla ince, boyanmış kesitlerin hazırlanması mümkün olacaktır. Histolojik inceleme için vucuttan çıkarılan
materyelle bu amaç asla tam olarak yerine getirilemez. Mevcut yöntemler, esasen sınırlı teknikler, koruma
arzusu ve her doku kompenentini tamamen canlı halini göstermek arasındaki bir uzlaşmadır.
Amaç:
l-Otolizi ve bakteriyel bozulma ve çürümeyi önlemek veya durdurmak
2-Kolaylıkla diffüzyon olan maddelerin kaybını önlemek
3-Kesit hazırlama basamaklarındaki sağlığa zararlı kötü etkilere karşı dokuyu kuvvetlendirmek (Örnek
dehidrasyon, şeffaflandırma, parafine gömme gibi)
4-Dokuyu boyalarla ve diğer reaktiflerle diferensiyel boyamayı kolaylaştıran bir
duruma getirmek
FİKSASYONUN ETKİLERİ
Otoliz, hücrelerin ölümünden sonra intraselüler enzimlerin hareketinin değişmesi ile protein
yıkımına ve sonuçta hücrelerin sıvı hale gelmesine yol açar. Otolitik değişiklikler herhangibir bakteriyel
hareketten bağımsızdırlar, soğukla geciktirilir, 37 C de muhafaza etmek önemli ölçüde hızlandırır. Doku 57
C'ye ısıtılırsa hemen hemen tamamen inhibe edilir. Otoliz, beyin, böbrek gibi çok iyi özelleşmiş organları ,
elastik fibriller, kollajen gibi yapılardan daha hızlı ve ciddi olarak etkilemektedir. Mikroskobik incelemede
otoliz olmuş dokunun hücre çekirdekleri kondensasyon (piknoz), fragmentasyon (karyoreksis), lizis veya
görülmeme (karyolizis) gösterebilir. Sitoplazma şişmiş ve granüler hale gelebilir ve tüm doku sonradan
boyama reaksiyonunda kayıp veya büyük değişimle granüler ve homojenöz kütle haline dönüşür. Otoliz,
epitelin dökülmesine, hücrelerin bazal membrandan ayrılmasına yol açar. Ek olarak teşhis önemi olan
maddeler (örn.glikojen) miktarca azalır ve uygun fiksasyonun olmayışından dokuda yayılırlar.
Bakterilerin dokularda yol açtıkları değişiklikler otolizdekine çok büyük benzerlik gösterir ve ölüm
sırasında (septisemi gibi) hasta dokudaki veya yaşamda vücutta normalde bulunan ( Örneğin barsak flora
bakterileri gibi) non-patojenik organizmaların çoğalmasıyla meydana gelmektedir. Fiksatifler dokuda
mevcut olan veya ölümden sonra meydana gelen ve dokunun daha ileri değişimlerine yol açan bütün
bakterileri öldürür.
Fiksasyonun en önemli etkilerinden biri doku proteinlerinin ve yapı taşlarının koagülasyonudur.
Böylece takip sırasında kayıpları ve diffüzyonları minimuma inmektedir. Ancak ek olarak fiksatif, takip
sırasındaki haraplayıcı etkilere karşı koruyucu olmalıdır. Eğer, taze tespit edilmemiş doku çeşme suyunda
yıkanacak olursa ciddi ve tamir edilemez harabiyet ve hücre lizisi oluşur. Fakat doku önce, Zenker de tespit
9
edilirse ve daha sonra suya daldırılırsa zararsızdır. Akılda tutulmalıdırki doku elemanlarının koagulasyonu
gerekli olmasına rağmen büyük bir artifakt oluşacaktır. Çünkü canlı hücre sıvı veya yarı-sıvıdır.
Fiksasyon hücre ve doku elemanlarına değişen oranlarda kırma indislerini değiştirerek optik
differansiasyon sağlamaktadır. Bazı hücre elemanlarının kırma indisleri çevreleyen ortama çok yakındır.
Bu nedenle klasik mikroskopla canlı olarak incelendiklerinde görülemezler. Fiksasyon dokuların boyama
basamağında da önemli bir etkiye sahiptir ve genellikle boya hareketlerini kolaylaştırır. Tespit ajanları bazı
boyaların uygulanması üzerine özellikle faydalı bir etkidir. Örneğin çekirdek boyası olan carmalum,
formalinden sonra merkurik klorid fiksasyonuna göre daha az boyar. Bazen tespit ajanı özel doku
kompenenti ve doku arasında direkt bir link olarak hareket edebilir ve bu durumda fiksatifin bir mordant
olarak hareket ettiği söylenebilir. Örnek olarak da hematoksilenle miyelinin gösterimi için dokunun
potasyum dikromatla muamele edilmesi verilebilir.
Fiksatiflerin diğer önemli bir fonksiyonu ise, dokuyu sertleştirmeleri sebebiyle doku parçalarından
kolaylıkla ince kesitlerin alınmasına sebep olmalarıdır. Fiksasyon olayında fiksatifte kullanılan bazı
kimyasal maddeler sebebiyle enzimler inaktif hale getirilir veya muhafaza edilir. Fiksatiflerin pratik
uygulanması düşünülürken, araştırmanın gerçek amacı, dokunun boyutu, tipi ve tazeliği kesit alma prosesi
ve uygulanmak istenen boyama tekniğinin bilinmesi gereklidir. Hiçbir fiksatif bütün dokular ve teknikler
için ideal değildir. Proteinler, tuzlar, CH'lar veya lipidler çökertilir ve dolayısıyle dokunun yapısı
elemanları sertleşir ve katılaşır.
Fiksasyon işlemi fiziksel (ısı, kurutma ve dondurma ile ) ve kimyasal yolla yapılabilir. Isı ile
fiksasyon dezavantajları nedeni ile artık uygulanmamaktadır. Kurutma ile fiksasyon, kan ve kemik iliği
yaymalarında kullanılır. Dondurma ile fiksasyon, lipidler, enzimler ve ameliyat parçalarının hızlı
teşhisinde kullanılır. Dondurulan örneklerden dondurma mikrotomu ( Cryostat ) ile kesit alınır. Kimyasal
fiksasyon en çok kullanılan yöntemdir. Bu yöntemde alınan örnekler ya fiksatife atılır (immersiyon
yöntemi ) ya da hayvan anestezi altında iken organı besleyen arter yolu önce serum fizyolojik ardından
fiksatif verilerek yapılır (Perfüzyon Yöntemi). Perfüzyondan sonra örnekler alınarak tekrar fiksasyonun
tamamlanması için fiksatife atılırlar. Böylelikle organ vücuttan çıkarılmadan bir miktar tespit edilir.
Morfoloji daha iyi korunduğundan genellikle titiz çalışma gerektiren araştırmalarda kullanılır.
Fiksatifler daima maksada ve boyama metodlarına uygun olarak seçilmelidir. Tespit olayının
basarılı olması aşağıdaki unsurlara bağlıdır
1- Ölümden ve operasyondan sonra elde edilen doku ve organ parçaları derhal fiksatife atılmalıdır. Kalp
durmasından en geç ışık mikroskobunda 30 dk., elektron mikroskobunda 4 dk. sonra örnekler fiksatife
alınmalıdır.
2- Fiksatifte kullanılan kimyasal maddelerin tazeliğinde emin olmalı ve bu maddeleri titizlikle tartmalı ve
karıştırmalıdır. Aksi taktirde fiksatifin etki ve nüfuz kabiliyeti ortadan kalkar.
3- Doku parçaları mümkün olduğu kadar küçük olmalıdır.
10
4- Fiksatif yeterli miktarda yani doku parçasının en az 10 misli olmalıdır (Formalin için 20 misli).
5- + 4C'de fiksasyon yapılması önerilmektedir. Her ne kadar düşük ısılar fiksatifin, dokuya penetrasyonunu
azaltırsa da otolizi önlendiğinden iyi tespit için gereklidir.
6- İçi boş organlar tespit solusyonu ile doldurulmalıdır. Böylece tespit solusyonu dokuya her iki yüzden
işler. Hem de boşluğun iç yüzündeki düzgün yüzey şeklini korumuş olur.
7- Kırışma ve katlanma olasılığı olan dokular mantar plakalar üzerine gerilmelidir.
8- Kaba önce fiksatif konmalı sonra parçalar aktarılmalı. Aksi taktirde doku kaba yapışır ve yapışma
yerinden tespit solusyonu dokuya işlemez.
9- Yağdan ve havadan zengin dokular tespit solusyonunda yüzdükleri için bir kaset içine alınarak tespit
edilmelidir.
10- Tespit solusyonunun dokuya işleyişini hızlandıran işlemlerden kaçınmalıdır. Yüksek ısı bir yönden
tespit solusyonunun. dokuya işlerliğini artırır. Diğer yönden de dokuda otolizi hızlandırır.
11- Kullanılan tespit solusyonunun dokulara işleme hızları bilinmelidir. Bu hız her tespit solusyonu için
değişiktir. Örneğin aIkol 5 mm kalınlığında bir dokuyu 2-4 saatte tespit eder. Aseton 5 mm kalınlığında bir
dokuyu 2 saatte tespit ederken, sublime 5 mm kalınlığında bir dokuyu 5 saatte tespit eder .% 4'1ük formalin
4 mm kalınlığında bir dokuyu + 4 Cde 5 saatte tespit eder.
12- Kural olarak özel amaçlar dışında doku 24 saatten fazla tespit edilmemelidir.
13- Tespit solusyonu ne hipotonik,ne de hipertonik olmalıdır. Kullanılacak tespit solusyonunun
osmomolaritesi canlı dokunun osmolaritesi (300 mosl) ve ölü dokudakine (450 mosl) uygun olmalıdır. Bu
özellik gözönünde bulundurularak tespit edilmeyen doku su ile kesinlikle yıkanmamalıdır.
14- Tespit solusyonunun pH'sı canlı dokunun pH'sına yakın olmalıdır (6-8). Bu nedenle tamponlanmış
formalinle dokuların tespit edilmesi daha uygun olur.
16- Dokunun aşırı derecede sertleşmesine müsade edilmemelidir. Doku aşırı derecede katılaşacak olursa
daha sonraki işlemleri zorlaşır.
17- Kaplar yeterli büyüklükte ve düz hatlı olmalı, boğazı ise dar olmamalıdır. Böylelikle spesimenlerin
sonradan çok küçük kavanoza aktarılırken minumum hasar görmesi sağlanır.
Uzun zaman tespit solusyonunda kalan ve tespit solusyonunun buharlaşması sonucu sertleşen
dokulardan tekrar çalışmak istendiğinde bu doku antiformine konarak yumuşatılabilir.
ANTi FORMİN SOLUSYONU: 1 gr antiformin 5 ml suya konarak yahutta konsantre solusyonun
20 ml'si 80 ml suya konarak hazırlanır. Tamamen kuruyan dokuysa Dimetilsülfoksid (DMSO) içinde
yumuşatılarak tekrar çalışır hale getirilebilir.
TESPİT ESNASINDA MEYDANA GELEN HATALAR
Fiksasyon artefaktları birçok nedeni vardır. Bunlar :
11
a) Doku parçaları iyi tesbit edilmemişse, tespit olmamış doku elemanları otolize uğrarlar. Böylece ileride
yapılacak işlemlerde beklenen netice alınamaz.
b) Eğer bir fiksatif hazırlanırken formule iyi dikkat edilmez ve karışımı temin edecek maddeler uygun bir
denge sağlıyamazlarsa hücrelerde şişme, büzülme ve ayrılmalar meydana gelerek, histolojik detaylar
kaybolur.
TESPİT AJANLARI
A-SIVI TESPİT AJANLARI: Tek ya da diğer sıvılarla ve katılarla karıştırılarak kullanılan en çok
kullanılan sıvı tespit ajanları, alkol, aseton, formalin, gluter aldehit ve asetik asittir. Trikloroasetik asit daha
az kullanılır. Son yıllarda trikloroasetik asit hem fiksatif hem de dekalsifiye ajanı olarak kullanılmaktadır.
1-Absolu Alkol: 78 C de kaynayan, renksiz, tutuşabilen bir sıvıdır. Glikojeni iyi korur ancak çekirdek
detayının kaybına ve sitoplazmanın büzülmesine neden olur.
2-Soğuk Aseton: Özellikle lipazlar ve fosfatazlar gibi enzimlerin histokimyasal çalışmalarında tercih
edilir. Rutin fiksatif olarak kullanılmaz. Çekirdek detayının kaybına ve sitoplazmanın büzülmesine neden
olur. Glikojeni iyi korumaz.
3-Formaldehit: Ağırlığının yaklaşık %40 ı kadar suda çözunebilen bir gazdır ve formaldehit (%40) veya
formalin adı altında satılmaktadır. Proteinleri precipite etmez ve diğer hücre bileşenlerini ise kısmen
precipite eder. Albümini sertleştirmez ve çözünür halde tutar ve sonraki dehidratasyonda alkollerle
sertleşmeyi engeller Formalin yağları ne korur ne de haraplar. Kompleks lipidler için iyi bir fiksatiftir
fakat nötral lipidler üzerine etkisi yoktur. Formalin karbohidratlar için seçilen bir fiksatif olmamasına
rağmen glikojeni kolaylıkla çözünmesini engelleyerek korur. Frozen kesitler için ideal bir fiksatiftir.
Solusyonun nötralizasyonu arzu edilir. Tampon tuzları nötralizasyon sağlanabilir. Konsantre asit formalin
sonuçta çıkan CO2 in labarotuvarda ciddi patlamalara yol açtığından Mg veya CaCO3 ile muamale
edilmemelidir. Kalsiyuım karbonat dokularda pseudokalsifikasyon oluşturabilir. Konsantre formalin
solusyonu bazen paraformaldehit oluşumu nedeni ile bulanıklaşır, solusyonun gücü azalır. Fakat filtre
edilirse kullanılabilir. Formalin renksiz olmalıdır. Sarı solusyonlar kullanılan demir kaptan kaynaklanan
demir iyonları ile kontamine olmuştur. Demir içeren formalinle fikse edilen dokuların kesitleri pozitif
Prusya mavisi reaksiyonu verir ve kontamine olacağı düşünülen formalin örnekleri aynı yöntemle test
edilebilir. Formalini konsantre solusyon olarak kullanmak uygun değildir ve çesme suyuyla serum
fizyolojik ile veya tampon tuz solusyonları ile yaygın olarak %10 luk olarak seyreltilir. Bu solusyonlar %4
oranında formaldehit içermektedir.
Formalin, özellikle bazı kişilerde gözlere, solunum epiteli iridasyonuna yol açan istenmeyen bir duman
çıkarır. Bu nedenle formalinle tespit edilen dokuların diseksiyonu için iyi havalandırılan oda kullanılmalı,
tüm saklama kaplarının ağzı sıkıca kapatılmalı, korozyona dirençli kapaklar kullanılmalıdır. Bunlara ek
olarak eldiven veye etkili krem bariyer, formalinle tespit edilmiş materyal tutulduğunda kullanılmalıdır.
12
Bazı çalışmalar bu etkilere bağışıktır fakat bazıları bu solusyona ellerini daldırdıktan sonra istenmeyen
"formalin
dermatitis" den yakınırlar. Formalin, ideal bir fiksatif olarak önerilse de bazı çekirdek şişmeleri oluşabilir.
Asetik asit formalini ile post fikse edilirse bu etki ortadan kaldırılır ve H-E ile parlak boyanma sağlanır.
Formalin, kromatlar formik asite oksitleyeceğinden kromatlarla kullanılmamalıdır.
4-Gluter Aldehit: Formaldehitten daha yavaş penetre olur.Elektron mikroskopi ve enzim
histokimyası için çok yararlıdır. E.m için standart bir fiksatiftir ve OsO4 den önce birinci fiksatif olarak
kullanılmaktadır. Fikse edilen örnekler solusyonda aylarca kalabilir. GA ile tespit edilen kesitler
PAS+reaksiyon vermeye meyillidirler. Formaline göre daha pahalıdır.
5-Trikloro Asetik Asit: Günümüzde kullanılmamaktadır. Sistin, sistein ve metionin gibi sülfür
grubu amino asitleri iyi korur. Dekalsifiye ajanı olarak kullanılmaktadır.
6-Asetik Asit: Tek olarak kullanılmaz. Hızlı ve iyi penetre olur ancak alyuvarların lizisine yol açar.
Kollajen fibrilleri şişirir, nukleoproteinleri precipite eder ve bazı sitoplazmik granüller üzerine çözücü bir
etkiye sahiptir.
B-KATI TESPİT AJANLARI:
1-Civa Klorür (HgCl2): Çok zehirli ve metallere korosivdir. Merkurik klorid kapları kesinlikle
metal kapaklı olmamalı ve kullanılan metal aletler parafine daldırılarak kullanılmalıdır. Civa klorür,
kuvvetli bir protein precipitantıdır. Dokuya hızla penetre olur ve dokuyu sertleştirir. Dokuyu büzer fakat
eğri büğrü etmez. Hem nukleusu hem de sitoplazmayı iyi fikse eder. Çekirdeğin özellikle sitoplazmanın
asit boyalarla boyanmasını sağlar. Diğer fiksatiflerle (özelikle formalin, potasyum dikromat ve asetik asit)
karıştırılarak kullanır fakat dokunun her tarafına uniform olarak dağılan kahverengiden siyaha kadar
değişen granüler madde oluşturur. "Mercury pigment'' olarak adlandırılan bu madde alkolik iodinde,
çözünür ve daha sonraki boyamayı etkilemez. Dehidratasyon sırasında bloklardan %70-80 alkoldeki %0.-
25-05 iodin eklenmesiyle veya kesitleri boyamadan önce aşağıdaki gibi işlemden geçirerek uzaklaştırılır.
İşlem
l-Ksilol ile muamele ederek parafin uzaklaştırııir.
2-%100'lük alkolde yıka
3-%70'lik alkolle hazırlanmış %0.5'lik iodinle 3-5 dakika muamele et
4-Çeşme suyunda kısa bir süre çalkala
5-%2.5 luk sodyum thiosulfatla(hipo) beyazlaşıncaya kadar (30 saniye-iki dakika) muamele et
6-Akarsuda 5 dakika yıka
7-Boyamayı yap
2-Potasyum Dikromat: Potasyum dikromat solusyonlarının pH’sı fiksasyonu önemli ölçüde
etkiler. pH 3.4-3.8 arasında sitoplazma homojen olarak ve mitokondriler fikse olurken, nukleoproteinler
korunamazlar. Daha asidik olduğunda ise kromik asit gibi davranır; hem nukleus hem sitoplazma
13
mitokondri harabiyeti ile birlikte precipite olur. Potasyum dikromat diğer maddelerle karıştırılarak birçok
önemli fiksatif elde edilir. Potasyum dikromatla tespit edilen dokular, çözülemeyen precipitelerin
oluşumunu engellemek için alkolden geçirilmeden önce akarsuda yıkanmalıdır. Dokuya uzun süre maruz
bırakmak (günlerden haftalara kadar) özellikle parafine gömülmüşse gevrekleşerek kesit almada zorluk
çıkarır.
3-Kromik Asit: Kromik asit anhidritin(Cr03)' in koyu kırmızı kristallerini distile suda çözerek
hazırlanır. %2'lik solusyon fiksatiflerin hazırlanması için uygundur. Proteinleri precipite eder ve
karbohidratları tespitler. Kuvvetli bir oksitleyici ajan olarak genel olarak alkol veya formalinle
karıştırılmamalıdır. Kromik asitle fiksasyondan sonra dokular alkolle muamele edilmeden önce akarsuda
yıkanmalıdır. Böyle yapılmazsa dokularda çözünemez precipat oluşumuyla sonuçlanabilir.
4-Pikrik Asit: Pikrik asit parlak sarı kristalin bir maddedir. Isıtılırsa patlayıcı özelliği vardır.
Tedbirli olarak suda oda ısısında yaklaşık %1 oranında, benzende %10 oranında çözünür. Pikrik asit
nukleoproteinleri precipite eder ve biraz büzer fakat hafif sertleştirir. Sitoplazmik boyalarla zenginleştirir
ve glikojen için kullanılan fiksatiflerin faydalı bir elemanıdır. Pikrik asit fiksasyonundan sonra dokular
direkt olarak alkole alınırlar.
5-Osmiyum Tetroksit: Yaygın olarak söylendiği gibi osmik asit, 0.5 veya 1 gramlık etiketli
ampullerde bulunan soluk sarı kristal bir maddedir. Pahalıdır. Hem kristalin hem de çözeltinin dumanı
iridanttır ve tehlikelidir. Gözün dumana maruz kalmasından sıkı gözlük kullanarak kaçınılmalıdır.
Kullanıldığı şişe sıkıca kapatılmalıdır. Çözelti aşağıdaki gibi hazırlanır.
Etiketi çıkarın.Tüpteki yapışkanı suyla (sıcak su değil) yıkayıp çıkarın.Temiz bir bezle ampulu kurulayın,
ortasından kırın. Her iki yarısını uygun miktarda distile su içeren koyu renkli cam şişeye koyun.
Kristallerin çözünmesi zaman alır. Fakat hızlandırmak için ısı kullanılmamalıdır. Şişenin cam kapağı
olmalı ve soğukta muhafaza edilmelidir. OSO4' ışık, ısı veya organik etkenlerle kolaylıkla gri veya siyah
lower okside indirgenir ve bir kere kullanılan solusyon, stok şişesine geri konulmamalıdır. İndirgenmeyi
önlemenin etkili bir yolu her 10 cc lik solusyona bir damla suda doyurulmuş merkurik klorid eklemektir.
OSO4, formalin gibi protein ile additive bileşikler oluşturur, miyelini de içeren çoğu lipidler OS04 in
lower okside indirgenmesiyle siyahlaşır. Penetrasyonu zayıftır. Küçük objeler, smearler ve ince kesitler
sıvıya daldırmaksızın dumanıyla fikse olabilir. Genel histolojik ve histopatolojik çalışmalarda az
kullanılmasına rağmen (fiat yüksek, kullanımdaki sınırlamalar) e.m de yaygın kullanılmaktadır.
TESPITTE KULLANILAN STOK SOLUSYONLAR
Formalin: %40' lık formaldehit
Gluter aldehit: %25' lik solusyon
14
Civa klorür: doymuş sulu solusyon
Potasyum dikromat: %5' lik sulu solusyon
Kromik asit: %2' lik sulu solusyon
Pikrik asit: Doygun sulu solusyon
OSO4: %2'1ik sulu solusyon
Asetik asit: Glasial asetik asit
Etil alkol: Absolu etil alkol
Yukardaki maddelerden başka birçok madde özel amaçlar için kullanılmaktadır. Aseton bazen
histokimyasal araştırmalarda kullanılır. Trikloroasetik asit bir dekalsifiye ajan olarak kullanılabildiği gibi
''Susa'' fiksatifinin de içeriğinde bulunur. Çinkoklorür, Zenker fiksatifindeki civa klorür yerine daha ucuz
olduğu için kullanılabilir. % 71ik sulfosalisilik asit, ayrıca %2-10'1uk glyoxal formalin yerine kokusuz
olduğu için kullanılabilir.
FİKSATİFLER VE HAZIRLANIŞLARI
Fiksatifler kullanımlarına göre iki gruba ayrılabilir.
l-Mikro-anotomik fiksatifler: Bu fiksatifler doku tabakaları arasındaki bağlantıları ve geniş hücre
kümelerinin diğeri ile bağlantılarını tam olarak korumak amaçlandığında kullanılır. Normal ve patolojik
histolojinin rutin çalışmalarının çoğu bu tip fiksatiflerle yapılmaktadır.
2-Sitolojik fiksatifler: Hücreyi oluşturan elementleri korumak istendiğinde kullanılırlar. Penetre olma
gücü, büyük doku kütleleri ile çalışma yeteneği, kesit almayı veya boyamayı engellememeli. Şöyleki
Flemming fiksatifinde ara zon çok güzel fikse olurken en dış ve iç parçalar kötü fikse olabilirler.
% 10’luk Formalin
Formalin 100 cc
Çeşme Suyu 900 cc
%10'luk Formal Salin
Formalin 100 cc
NaCl 8.5 gr
Çeşme suyu 900 cc
%10' luk Tamponlanmış Formalin (pH=7.0)
Formalin 100 cc
Çeşme suyu 900 cc
15
NaH2P04 : H20 4 gr .
Na2HP04 6.5 gr
Formalini nötralize etmek için %2' lik kalsiyum asetat birçok araştırıcı tarafından tavsiye edilmiştir. Fakat
yumuşak dokularda artifakta benzer alanlar oluşturabilir.
%10' luk formal-salin histolojik fiksatiflerin ençok kullanılanıdır. Aşırı bir sertleşme olmaksızın dokuyu
sertleştirir. Fiksasyon süresine dayanıklıdır. Genellikle formalin fiksasyonundan sonra dokuların doğal
rengini kısmen veya tamamen korumak mümkündür. Bu fiksatif, müze örneklerinin hazırlanmasında özel
bir değere sahiptir. Özellikle nötral tamponlanmış olarak kullanıldığında kırmızı kan hücrelerinin
korunması içeren iyi fiksatiftir.
Formalinde uzun süre kalma (aylarca-yıllarca) dokunun kesit alma niteliğini bozmaz. Dokunun
bazik boyalarla boyanmasında biraz kayba yol açabilir. Bazı gümüş çöktürme tekniklerindeki sonuçlar
daha iyiye gidebilir. İnce bloklar % 10'luk formal-salinle 24-48 saatte iyi şekilde fikse olurlar fakat
optimum fiksasyon süresi 7-10 gündür. Formalin fiksasyonundan sonra, değişen miktarlarda kan içeren
dokular bir artifakt pigmenti (formalin pigmenti) gösterebilirler. Bu, kahverengi, granüler, ekstraselüler bir
materyeldir. Çoğunlukla post-mortem dokularda bulunur, saklandıkca artar ve sıklıkla formaline
daldırdıktan birkaç saat sonra yoktur fakat birkaç gün sonra dokularda çok geniş ve fazla olarak depo edilir.
Kanla asit formalin pigmente yol açar ve nötral tamponlu solusyonlar kullanarak bunlardan kurtulabilir.
Pikrik asidin alkolde doymuş solusyonunda 20 dakika ya da daha fazla tutarak kesitlerden uzaklaştırılabilir.
Pigmentin görünümü ve özellikleri malarya pigmentine benzemektedir fakat malarya pigmenti
intraselülerdir.
% 10' luk formal-saline mikroanotomik bir fiksatiftir. Birçok boyama yöntemi için uygundur.
Hematoksilenle iyi sonuçlar verir. Nadiren belirli hiçbir neden olmaksızın formal-salinle tespit edilip, H+E
ile boyanmış kesitlerde garip bir artifakt görüIür. Nukleusların hematoksilen ile kısmen veya tamamen
boyanmamasına, bunun yerine eozini almasına sonuçta ise çekirdek kenarlarının kaybına yol açar. Ençok
lenfoid ve epitel dokusunda göze çarpan artifakt, dağılımında aşırı olarak bozuktur ve garip bir şekilde
fiksasyonu iyi yapılmış dokularda ortaya çıkar. Nadiren otolize olmasına rağmen, postmortem dokularda da
görülür. Bu artifakt "pembe hastalık" olarak açıklanmıştır ve ortaya çıkmaması için %1O'luk formalindeki
%2' lik asetik asit kullanımı ile korunur veya olduğunda parafini alınmış kesitlerin hematoksilenle
boyanmasından önce absolu alkoldeki %l'lik HCl ile 1 saat bırakarak uzaklaştırılır. Formalin
fiksasyonundan sonra hiçbir şeye gereksinim yoktur ve dokular gömmeden önce direkt % 70'lik alkole
alınabilir veya dondurma yöntemi ile kesit alınabilir .
ALKOL-FORMALİN SOLUSYONU:
Nötralize edilmiş formalin 10 cc
%95 Alkol 90 cc ,
16
Bu fiksatifte parçalar 2-4 saat içinde çabucak tespit olur. Eğer doku parçaları kalın olursa, bu solusyon
içinde buzdolabında 24 saat kalmalıdır. Bilhassa polisakkaridlerin gösterilmesi için kullanılan fiksatiflerden
biridir.
ALKOL FİKSATİFLERİ: Absolu alkol (%99) özellikle hücrelerde glikojenin gösterilmesinde kullanılan
bir fiksatiftir. Eğer buzdolabında veya daha düşük derecede kullanılmazsa dokuda büzülmelere sebep olur.
Doku parçaları absolü alkolde 20C'de iki gün bırakılacak olursa en elverişli şekilde, büzülrne meydana
gelmeden tespit olurlar. %80 alkol fiksatif ise 5C'de 24-48 saat arasında dokuyu büzmeden tesbit etme
özelliğine sahiptir. Bu solusyon alkaline phosphatasın gösterilmesinde kullanılır. Alkol fiksatifleri oda
ısısında kullanıldiklarında bunların %65-%70' lik solusyonları kullanılmalıdır. Aksi halde dokuda çok fazla
büzülme ve değişikliklere sebep olurlar.
LİSON VOKAER' İN GLİKOJEN TESPİT ÇÖZELTİSİ: %96' lık alkolde doymuş picric
asit çözeltisinden 85 ml; 10 ml formalin, 5 ml asetik asit. Küçük parçaları buzdolabında 5-10 saatte tespit
eder. Glikojen için iyi tespit edicidir. Tespitten sonra absolu alkolden geçirilerek gömme işlemi
yapılmalıdır. Çünkü gıikojen suda erir.
MERKÜRİK KLORİD-FORMALİN (FORMAL-SUBLİMATE)
Suda doymuş merkürik klorid 900cc
Formalin 100 cc
Mükemmel bir mikro-anotomik fiksatiftir. Formal-salindeki distorsion olmadan dokuyu büzer. Asit
boyalarla çok parlak boyadığı gibi mükemmel bir sitoplazma korunması sağlar ve metakromaziyi
artırır.Formal-saline göre sinir fibrilleri ve hücreler için gümüş çöktürme tekniklerinde daha az elverişli
olmasına rağmen mükemmel retiküler fibril impregnasyonu elde edilebilir. Bloklar 12-24 saat tespit edilir
fakat uzun süre işlem kesit almayı zorlaştıran bir sertlik yaratmaz. Formal-sublimat özellikle formal-salinle
birinci fiksasyondan sonra ikinci fiksatif olarak yararlıdır. En büyük dezavantajı pahalı olması ve metallere
korosiv olmasıdır. Dokular fiksasyondan sonra %70-90' lık alkole aktarılmalı ve mercury pigmenti
kesitlerden daha önce açıklandığı gibi uzaklaştırılmalıdır.
SUSA FİKSATİFİ ( HEİDENHAIN 1916)
Merkürid klorid 45 gr
Sodyum klorid 5 gr
Trikloroasetik asit 20 gr
Asetik asit 40 cc
Formalin 200 cc
Distile su 800 cc
17
Özellikle biopsi materyelleri için uygun bir fiksatiftir. İyi bir mikro-anotomik fiksatiftir. Nedeni
açık olmamakla birlikte Susa' dan sonra elastik fibriller Weigert'in (1898) elastik fibril boyası ile zayıf
boyanırlar. Hazırlanması için gerekli maddelerin çokluğu dezavantajdır. Ancak karışım bir önceki formal-
sublimata göre biraz daha avantajlıdır.
Bloklar 3-24 saatte fikse olurlar ve direkt olarak % 95' lik etil alkole aktarılırlar. Daha sulu
solusyonlara aktarma kollajen fibril1erin şişmesine yol açmaktadır.
ZENKER FİKSATİFİ ( ZENKER 1894)
Merkürik klorid 5 gr
Potasyum dikromat 2.5 gr
Sodyum sülfat 1 gr .
Distile su 100 cc
Asetik asit 5 cc (kullanımdan hemen önce eklenir)
Asetik asitsiz stok solusyon iyi korunur. Zenker etkili bir mikro-anotomik fiksatiftir ve özellikle
sitoplazmik ve fibril boyaları üzerine çok yararlı etkisinden dolayı kullanılmaktadır. Taze materyelde post-
mortem dokulara göre daha yararlıdır. Alyuvarları iyi korumazlar. Bloklar 3-8 saatte fikse olurlar ve fazla
dikromatı uzaklaştırmak için çeşme suyuyla yıkanırlar. Mercury pigmenti ise daha önceki yöntemle
uzaklaştırılır.
HELLY SIVISI ( VEYA ZENKER-FORMAL, HELLY 1903)
Zenkerdeki asetik asit yerine 5 cc formalin kullanmadan hemen önce eklenir. Helly sıvısı bir
oksitleyici ajan (potasyum dikromat ve bir indirgeyici ajan (formalin) içermesine rağmen rnükemmel bir
fiksatiftir. Helly özellikle kemik iliği, dalak, lenf bezleri, hipofiz ve pankreas için çok yararlıdır. Bloklar 6-
24 saat tespit edilmeli ve mercury pigmenti Zenkerdeki gibi uzaklaştırılmalıdır. Helly hem mikro-anotomik
hem de sitolojik (sitoplazmik) fiksatif olarak kullanılabilir ve formal-sublimat gibi % 10' luk formal-
salinden sonra ikinci fiksatif olarak da uygulanabilir.
BOUİN FİKSATİFİ ( BOUİN l897)
Suda doyurulmuş pikrik asit 75 cc
Formalin 25 cc
Asetik asit 5 cc
18
Bouin, alyuvarların kısmen veya tamamen lizisine yol açar ve kollajen fibrilleri şişebilir. Aşırı
sertleşmeye yol açmaz. Sitoplazmik boyalarla parlak boyanma sağlar. Glikojen çok iyi korunur (özellikle
yukardaki karışımın alkolik varyantı ile) fakat böbrek iyi korunamaz. Bazı sitoplazmik granüller
çözünebilir. Bouin, bir mikro-anotomik fiksatif veya kromozomların gösterilmesi için kul1anıldığında da
sitolojik (nükleer) fiksatiftir. Bloklar 6-24 saat fikse edilirler ve % 70 lik alkole aktarılırlar. Dokuların sarı
boyanması çok küçük örnekler için avantaj oluşturur. Fakat kesitlerden bu boya, alkolü takiben bazik anilin
boyaları kullanmadan önce % 2.5 lik sodyum thiosulfat kullanarak uzaklaştırılmalıdır, aksi takdirde
precipat oluşacaktır.
CARNOY FİKSATİFİ (CARNOY, 1887)
Absolü alkol 60 cc
Kloroform 30 cc
Asetik asit 10 cc
Carnoy, hızla penetre olan ve hareket eden bir fiksatiftir. Acil teşhis için dokuların hızlı tespit edilmesi ve
kısmi dehidrasyonu için kullanılır. Kromozom çalışmaları için kullanılır fakat alyuvarların lizisine ve fazla
büzülmeye yol açar. Glikojen korunur fakat bazı sitoplazmik granüller çözünebilir. 3 mm' den kalın
olmayan dokular 30-90 dakikada fikse edilmeli ve % 95'lik ya da % 100' lük alkole transfer edilmelidir. Bir
mikro-anotomik veya sitolojik (nükleer) fiksatifdir.
SANFELİCE FİKSATİFİ (SANFELİCE, 1918)
Çözelti A Çözelti B
Formalin 128 cc %l'1ik kromik asit 100 cc
Asetik asit 16 cc
Karışım: Kullanmadan az önce hazırlanır. 9 cc A +16 cc B
Genellikle mitotik figürler ve kromozomlar için mükemmel bir fiksatifdir. 3 mm den kalın olmayan küçük
parçalar 12-24 saatte tespit edilmeli ve sonra akarsu ile yıkanmalıdır. Sitolojik (nükleer) fiksatiftir.
FLEMİNG FİKSATİFİ (FLEMMİNG, 1884)
% l'1ik kromik asit 15 cc
%2' lik OSO4 4 cc
Asetik asit 1 cc ya da daha az
19
Kullanmadan önce hazırlanmalıdır. Penetrasyon eşit olmayabilir ve tam olmayan fiksasyonla yüzeyel
tabakaların aşırı kararmasına neden olabilir ve sonradan en içteki hücrelerin zayıf boyanmasına yol açabilir.
Page (1970), Flemming sıvısını formalin fiksasyonunu takip eden ikinci fiksatif olarak kullanarak
miyelini .başarılı şekilde göstermiştir. İki mm kalınlığındaki küçük parçalar 12-48 saat tespit edilmeli ve
sonradan akarsuda yıkanmalıdır. Asetik asit içeriği ile bir nükleer fiksatiftir. Lipidler OSO4 ile siyahlaşır.
Bu fiksatiften sonra alum hematoksilen nükleer boyaları kolaylıkla alınmaz, bunun yerine safranin
kullanılmalıdır.
FLEMİNG SIVISlNIN LEWITSKY-BAKER MODIFIKASYONU
Flemming sıvısını asetik asitsiz fakat % O.75'lik sulu NaCl solusyonunu distile su yerine çözücü olarak
ekleyerek hazırlanır. 12-24 saatlik fiksasyondan sonra dokular akarsuya aktarılır. Sitolojik (sitoplazmik)
fiksatif, bu ve diğer krom-osmium karışımlar omurgasız ve alt omurgalıların dokuları ile çok iyi sonuçlar
verirler. Helly sıvısı memeli dokuları için tavsiye edilmemektedir.
ORTH FİKSATİFİ ( ORTH 1896)
Formalin 10 cc
Müller sıvısı (Potasyum dikromat 2.5 gr +sodyum sülfat 1 gr+distile su 100cc) 100 cc
Taze olarak hazırlanmalıdır. Formalin ve Müller sıvısını karıştırma mitokondri gibi sitolojik yapılar üzerine
ve kromaffin reaksiyonundaki mordantlama özelliği nedeni ile çok yararlıdır. Bloklar çeşme suyuyla
yıkanmadan veya distile sudaki %2.5'lik potasyum dikromatla ileri kromasyondan önce 24-48 saat tespit
edilmelidir.Bazen potasyum dikromatla uzun süre muamele etme hemen hemen kaçınılmaz olarak
kırılganlıkta artış ve parafin kesitlerden kesit alma zorluğu ile (özellikle yumuşak dokularda, dalak ve beyin
gibi) sonuçlanmaktadır.
FİKSASYONDAN SONRA DOKULARA UYGULANAN İŞLEM
%10' luk formal-saline
%1O'1uk tamponlanmış formalin %70'1ik alkol ile
Bouin
Formal-sublimat %8O-90'lık alkolle
Susa %95' lik alkolle
Carnoy %95'lik ve %lOO' lük alkolle
Zenker Çeşme suyu ile yıkama (l2-24 saat)
Helly Çeşme suyu ile yıkama (l2-24 saat)
20
Sanfelice Çeşme suyu ile yıkama (l2-24 saat)
Flemming Çeşme suyu ile yıkama (l2-24 saat)
Lewitsky-Baker Çeşme suyu ile yıkama (l2-24 saat)
Orth Çeşme suyu ile yıkama (l2-24 saat)
İKİNCİ FİKSASYON
%10' luk formal-salin ile tespit edilen dokuların hala diğer ve daha etkili precipitant fiksatiflerin etkilerine
duyarlı olduğunu gösterilmiştir. Uygulama ''ikinci fiksasyon'' olarak adlandırılır. Civa klorür-formalin ve
Helly fiksatifi özellikle ikincil fiksatif olarak yararlıdır. Böylelikle dokular daha iyi korunur ve boyanırlar.
Post-kroming ve post mordantlama: Korunmayı ve özel doku bileşenlerini boyamayı kolaylaştıran ve
doku bloklarının (fiksasyondan sonra) veya kesitlerinin bir krom tuzu ile muamele edilmesiyle yapılan
yöntemlerdir. Yöntem özellikle mitokondri ve miyelini göstermek için kullanılır.
Postfiksasyon: Bazı doku proteinlerinin çoğu fiksatiflerin tam penetrasyonunu önleyen yağsı maddelerle
maskelenir veya saklanır. Bu protein sonradan yağ çözücüleri ile şeffaflandırma sırasında yağsı maddenin
ortadan kaldırılmasından sonra kaybolur. Dokular bir yağ çözücü içinde tespit edilip, sudan kurtarma,
şeffaflandırma ve sonradan tekrar şeffaflandırma ve parafine gömmeden önce absolu alkolde postfikse
edilirse iyi sonuçlar verir.
Hemen kesit alınmasına gerek olmayan formalinle tespitlenmiş dokular fiksatif değiştirilmeden uzun yıllar
fiksatifde kalabilir.Tamponlanmış nötral solusyonlar bu etkiyi geçiktirmesine rağmen, boyanma kalitesi
kademeli olarak bozulur. Diğer bir yöntemde fiksasyondan ve fiksatifin yıkanarak uzaklaştırılmasından
sonra saklama solusyonu olarak %70'lik alkole koymaktır. Formal-sublimat ve yıkamadan sonra %30’luk
gliserol, %10-20' lik dietilen g1ikol önerilmektedir.
DOKU TAKİBİNİN (İMPREGNASYON ) PRENSİPLERİ
Doku takibinin amacı, dokuyu desteklemek için yeterince sert bir katı ortama gömmek ve kesitlerin
alınması için gerekli sertliği vermektir. Bu sertliği verirken de dokunun bıçağa çok az zarar verecek
sertlikte olmasını sağlamaktır. Rutin histoloji için tatmin edici gömme materyeli parafindir. Doku parafine
gömülmeden önce şu işlemlerden geçirilmelidir.
l-Fiksasyonun tamamlanması
2-Sulu fiksatifi ve doku sıvısını uzaklaştırmak için hafif fakat tatmin edici bir dehidrasyon
3-Hem kendinden önceki dehidrasyon ajanı ile hem de daha sonra uygulanacak gömme ajanı ile tam olarak
karışabilen bir madde ile şeffaflandırma
21
İMPREGNASYON HIZINI ETKİLEYEN FAKTÖRLER
Doku sıvıya daldırıldığında, doku sıvısı ve çevresindeki sıvı arasında karşılıklı yer değişimleri olmaktadır
ve bunu birçok faktör etkilemektedir. Bunlar fiksasyondan gömmeye kadar tüm basamakları
etkilemektedir.Bunlar:
1-Ajitasyon: Shandon Elliott ve Technicon ultra modelleri vertikal ajitasyon uygularken Colombia
Histokineti dönme hareketi uygulamaktadır. Ajitasyonun hızı önemlidir, çok düşük hız etkisizken, çok
yüksek hız ise yumuşak veya gevşek dokularda harabiyete yolaçabilir. Dakikada 25-30 cm' lik bir hız her
iki ajitasyon için de uygundur.
2-Isı: Isı penetrasyon hızını artırırken, soğuk azaltır. Isı her nekadar süreci hızlandırırsa da dokuları fazla
ısıtmamaya dikkat edilmelidir. Çünkü büzülmeye, gevrekleşmeye ve kesit almada zorluklara yol açabilir.
Kullanılan sıvıların birçoğu yanıcıdır ve ısıtma yangın tehlikesini artırabilir.
3-Viskozite: Kullanılan sıvıların viskozitesi, dokulara penetre olma hızını etlkiler, molekül büyüdükce
viskozite artar ve penetrasyon hızı azalır.
4-Ultrason: Ultrason kullanımı önerildiği halde birçok nedenle çok geniş kullanım kazanamamıştır.
5-Vakum: Azaltılmış vakumun kullanımı erimiş parafinle dokuların impregnasyonunda çok
kullanılmaktadır. Bazı otomatik takip aletlerinde takibin tüm basamaklarında vakum kullanılmaktadır.
Dehidrasyon ve şeffaflandırmada vakumun kullanılmasının çok az avantajı vardır. Dokudaki hava
kabarcıkları bu yolla uzaklaştırır.
Sert Dokuların Muamelesi: Tendon, tırnak, fibröz doku, keratin kütleleri normal şekilde takip edilebilir.
Fakat takipten önce özel işlemden geçirilirse daha iyi sonuçlar alınabilir. Bu dokuları yumuşatmak için %
70 lik alkolle hazırlanmış % 4 lük phenol kullanılabilir. Ayrıca molliflex gibi çeşitli gliserol, alkol ve
anilin oil karışımları da kullanılabilir. Mollflex, kesit alırken parafin bloklarda da kullanılabilir.
3-SUDAN KURTARMA ( Dehidrasyon)
Tespitten sonra suyun ve bazı lipid doku sıvılarının uzaklaştırılmaları gerekir. Dehidrasyonda
genellikle değişik alkol tipleri kullanılmaktadır. Bunların çoğu hidrofiliktir ve dokulardaki suyu çekerler.
Diğerleri ise sulu doku sıvılarının seyreltilmeleri ile dehidrasyonu etkilerler. Dehidrasyon basamağı
katılaştırıcı ortam olarak suyla karışabilen madde kullanan gömme teknikleri hariç tüm tekniklerde
kullanılır.
Dokular genellikle fazla miktarda su içerirler. Dokulardan suyun çıkarılmasıyla erimiş parafinin
doku parçalarına tamamıyle nüfus etmesi sağlanır. Alkol en iyi su çeken maddedir. Genellikle dehidrasyon
22
safhasında doku parçaları tespitten sonra en az 2-3 saat akar suda yıkanırlar. Sonra %30 veya %50 alkolden
başlayarak %10 artan alkol serilerinden geçirilirler. En çok kullanılan dehidrant etil alkoldür. % 70’lik
derişim ile başlayarak, % 95’ lik alkole kadar artan derişimlerden sonra birkaç absolü alkolden geçirerek
dokular sudan kurtarılır. Kademeli geçiş ile dokular büzülme olmadan sudan kurtarılır. Özellikle
embriyonik dokular gibi hassas yapılarda % 30’ luk derişimden başlamak uygun olur.
Dehidrasyon Sıvıları
1-Etanol: Şeffaf, renksiz, yanıcı ve hoş kokulu bir sıvıdır. Hidrofiliktir bu yüzden su ile her oranda
karışır. Histolojik çalışmalar için çok uygundur.
2-Ticari Endüstriyel Metillenmiş Ruh: Etanole biraz metanol eklenerek hazırlanmış bir dehidranttır.
3-Metil Alkol: Su, etanol ve çoğu organik çözücü ile karışır.
4-Propan-2-ol,ipopropil alkol:Su, etanol ve çoğu organik çözücü ile karışabilir.Rutin histoloji
laboratuvarında çok kullanılmaz fakat dokuları etanolde olduğu gibi sertleştirmez.
5-Aseton: Renksiz, şeffaf, yanıcı ve karakteristik keskin kokulu, su, etanol ve çoğu organik çözücü ile
karışan bir sivıdır. Yaygın kullanılan diğer dehidrantlardan daha uçucudur ve etanol ve metanolden daha
hızlı hareket etmektedir. Fakat uzun süre mualemede dokuları gevrekleştirir. Uçucu, yanıcı yapısından ve
sertleştirici etkisinden dolayı rutin dehidrant olarak otomatik takiplerde fazla kullanılmaz. Hız önemli
olduğunda ise aseton, çoğu şeffaflandırma ajanını hızla uzaklaştırdığından elle takip yöntemlerinde iyi bir
dehidranttır. Aseton, lipidler üzerine etanol ve metanolden daha çözücü bir etkiye sahiptir.
6-Katı Dehidrantlar: Anhidros bakır.sulfat yüksek konsantrasyonlu dehidretleyici alkollerde
kullanılabilir. Anhidros olduğunda tuz beyazdır fakat suyun absorbsiyonunda mavileşir; su
kontaminasyonu ile sıvı mavi renktedir.
7-Kimyasal Dehidrasyon: Son yıllarda. dokuların sudan kurtarımında 2,2-dimetoksipropanın kimyasal
olarak su ile birleşimi kullanılmaktadır. Doku hızla aşağıdaki karışım kullanılarak sudan kurtarılır.
2,2-dimetoksi propan 100 cc
Konsantre HCl 0.05 cc
Bu yöntemde dehidrant tek seferde kullanılır, değişik kaplardan geçirmeye gerek yoktur. Gece boyunca
tutmak gibi uzun süre kullanım, dokuda bir miktar büzülmeye yol açmaktadır. Dimetoksipropan çoğu
resinle ve erimiş parafinle karışmaz. Fiksasyonu takiben ve dehidrasyondan önce doku suda iyice
yıkanmalıdır. Çünkü tampon tuzları dimetoksipropanla precipite olur. Dimetoksipropan bir fiksatifle veya
dehidrantla birleştirerek de kullanılabilir.
Dehidrasyon genellikle aşağıdaki gibi uygulanır:
%50 alkolde 1 saat
23
%60 alkolde 1 saat
%70 alkolde 1 saat
%80 alkolde 1 saat
%95 alkolde 2 saat
%100 alkolde 2 saat ( iki defa değiştirilerek)
4-ŞEFFAFLANDIRMA (Clearing) : Bu terim, dehidratlayıcı ajanı uzaklaştırmak için seçilmiş sıvının
uygulanmasından sonra dokuların görünümünü ifade etmektedir. Bu sıvıların çoğu proteinlerinkine benzer
bir refraktif indisine sahiptir. Bu nedenle de dokuyu yarı şeffaf hale getirir. De-alkolleyici ajan olarak
ksilen kullanırken bu yarı şeffaflık, küçük bir doku parçası aydınlık görüldüğünde bir rehber olarak
kullanılır. Şeffaflandırıcı ajanın kullanımı dehidratlayıcı ajanın-örneğin alkol- gömme ortamı ile
karışmadığı zaman-örneğin parafinle- gereklidir. Bir şeffaflandırıcı ajandan esasda beklenen şey hem
dehidrant .ile hem de gömme ajanı ile karışabilir olma özelliğidir. Bu amacı tam olarak yerine getirecek
birçok sıvı vardır. Uygun şeffaflandırıcı ajanın seçiminde şunlara dikkat edilmelidir:
l-Alkolü uzaklaştırma hızı,
2-Erimiş gömme ortamı ile uzaklaştırılmasının kolaylığı,
3-Dokulara karşı nezaketi
4-Yanıcılık,
5-Toksisite
6-Fiyat
Şeffaflandırıcı ajanların çoğu yanıcı sıvılardır onun için dikkati gereklidir. Bir şeffaflanrıcı ajanın
kaynama noktası erimiş parafinin uzaklaştırılmasındaki hızının belirleyiciliğini verir. Sıcak parafine
aktarmada kaynama noktası düşük sıvılar, yükseklere göre uçuculuklarındaki fark nedeni ile daha hızlı
uzaklaştırılmaktadır. Bu özellik vakum altında artırılır. Bu kesin bir faktör değildir. Örneğin çok düşük
kaynama noktasına sahip olan kloroform, ksilene göre daha yavaş uzaklaştırır. Viskozite, şeffaflandırıcı
ajanın penetrasyon hızını eşit olarak etkileyebilir. Parafine gömme takibinde kullanılan şeffaflandırıcı ajan,
kesit almanın kolaylaştırılması üstüne ve kesitlerin sonuçtaki niteliği üzerine etkilidir. Çoğu şeffaflandırıcı
ajan, dehidratasyon ajanının tam olarak uzaklaştırılması için gereklı minimum zamanda kullanılırsa tatmin
edici sonuçlar verir. Otomatik olarak takip yapılıyorsa zaman çok geniş ve çok dens bloklar için yeterli
olmalıdır fakat zamanda küçük doku parçaları , bu uzun uygulamadan da etkilenmemelidir.
Şeffaflandıcı Ajanlar
1-Ksilen
2-Toluen
3-Kloroform
4-Benzen
5-Karbon tetraklorür
24
6-Propilen oksit
7-Petrol
8-Karbon disülfit
9-Amilasetat
10-Metil benzoate ve metil salisilat
11-Sedir yağı
12-Karanfil yağı
13-İnhibisol (1,1,1,trikloroetan (metil kloroform)
Dehidrasyondan alınan doku parçaları xylol, toluol, benzen ve sedir yağı içine aktarılırlar. Burada
parçalar şeffaflanıncaya kadar bırakılırlar. Amaç, dokulardaki alkolün şeffaflandırıcı madde ile yer
değiştirmesidir. Böylece alkol ve sudan yoksun hale gelmiş ve şeffaflanmış doku parçaları artık parafinin
nüfüz etmesine elverişli hale gelmişlerdir.
5-PARAFİNE GÖMME ( Embedding) :Gömme materyeli olarak parafin, selloidin, selloidin-parafin
kullanılabilir. Amacı, dokuları yarı sert ve kolayca kesebilen bir materyal içerisine yerleştirmek ve
şeffaflandırıcı ajanı dokudan uzaklaştırmaktır. Böylece kolay taşınan ve parçanın istenilen yönde
kesilmesini sağlayan bloklar elde edilir. Histolojik çalışmalarda ençok kullanılan parafine gömme
tekniğidir. Çünkü uygun takip hızına sahiptir, seri kesit alınımı için iyi bir kıvamı vardir. Kesit kalınlığında
geniş ranjı vardır. Dens kortikal kemiği parafinde kesmek, kalın kesitler istendiğinde büyük beyin parçaları
için sellüloz nitrat gömmesi veya dondurma kesit daha uygundur.
Erime derecesi 45-50 C olan parafin yumuşaktır, 55-60 C' lik ise daha sert olur. Parafinin seçimi
çalışma ortamının ortalama ısısına, gömülecek materyelin yapısına ve istenilen kesit kalınlığına bağlı
olmalıdır. 3-5 mikronluk kesitleri, sıcak bir iklimde 45 derecelik ergime noktası olan parafinle kesmek çok
zordur. Parafine gömme safhası sıvı parafinin dokuya nüfuzu ve şeffaflandırıcı madde ile yer değiştirmesi
ile başlayıp dokunun kesilmesi için uygun blok yapılması ile sona erer. Şeffaflandırıcı maddeden çıkarılan
doku parçaları 55-60 C deki parafin etüvünde üç ayrı kaptaki erimiş parafinden geçirilerek blok yapılırlar.
Genellikle doku parçaları parafinde 1 ,5 saat , 2.parafinde 1 .5 saat , 3.parafinde 2-3 saat kalabilir. Fakat
her dokuya sıvı parafinin nüfuz etme kabiliyeti değişik olduğundan parafinde kalma süresi doku çeşitlerine
göre tecrübe ile ayarlanmaktadır Büyükçe bir cam parçası üzerine ''L'' şekline sahip olan blok demirleri ,
tahta, hatta kağıtlardan yapılmış kare veya dikdörtgen şeklindeki kalıplara yerleştirilir. "Leuckhart's
plakları'' ile hazırlanan kalıba önce bir miktar erimiş parafin, ardından dokuyu istenilen yönde yerleştirip
tekrar parafin dökülerek etiketlenip soğumaya bırakılır. Sıvı parafin buz kalıplar içinde doku parçaları ile
birlikte dondurulurak (soğuk su ile veya buzdolabında) kalıplardan kolaylıkla ayrılabilen sert parafin
blokları elde edilir.
GÖMME HATALARI
1. Parafin dokuya nüfuz edememişse , blok iyi kesilemez , kesitler yırtılır veya parçalanır.
2. Parafinin dokuya nüfuzu safhasında sıvı parafinler çok sıcak ise dokuda büzülmelere sebep olurlar.
25
3. Demir kalıp içine parafin dikkatsizce dökülürse, donmuş blokta parafin kristalleri veya hava
kabarcıkları meydana gelir. Kesit alırken parafin ufalanır ve doku parçalanır.
6-KESİT ALMA (Sectioning)
Mikrotom denilen aletle doku parçasını içeren parafin bloklarından 5-10 m kalınlıklarında kesitler alınır.
Bunun için, mikrotomda kullanılan bıçağın çok keskin olması ve uygun açıda kullanılması şarttır. Kesitler,
jelatin solusyonu ihtiva eden 4O-50 C lik su banyosuna atılırlar. Jelatin, kesitlerin lamlara yapışmasına
yardım eder. Böylece su banyosuna atılan kesitler ısının tesiri ile açılırlar. Sonra birer birer lamlara alınarak
kurumaya terkedilirler.
Kesit Alırken Meydana Gelen Hatalar:
1. Mikrotom bıçağı keskin olmazsa bıçakta mevcut olan çentikler yer yer şeritler halinde yırtılma ve
ezilmelere sebep olur.
2. Eğer su banyosu çok sıcak olursa parafin erir, doku kesiti gerilir.
3. Su banyosu yeter derecede sıcak değilse , kesitler açılamadığından buruşukluklar meydana gelir.
7-BOYAMA (Staining)
Boyanmamış preperatlarda çoğu doku elemanları renksizdirler. Değişik kırma indeksine sahip
olmaları nedeniyle ışık mikroskobu ile hücresel detayı görmek güçtür. Farklı morfolojik kısımların, farklı
boyalarla boyanması gereklidir. Bu durumda çekirdek sitoplazmadan, kas bağ dokusundan farklı
boyanarak, morfolojik inceleme kolaylaşır. Boyalar histokimyasal işlemlerle, dokuların kimyasal
reaksiyonlarını ortaya koyar.
Histolojik Boyamanın Kimyasal Temeli:
Genel olarak kesitler iki boya ile boyanırlar. Bazik ve asit boyalarla boyanan kesitleri mikroskop altında
incelediğinde bazik ve asit boyaların bazı doku elemanlarını boyadıkları görülür. Bazik boya ile boyanan
doku elemanları "bazofilik'' asit boya ile boyananlar ise "asidofilik" olarak adlandırılırlar. Bazı doku
elemanları bazik, bazıları ise asit boyaları tutmaktadır. Genel olarak kullanılan bazik boyalar doku
elemanları ile mavi-mor, asit boyalar ise pembe-kırmızı renk verirler.
Boyalar sulu bir solusyon içinde anyon ve katyonlara ayrılırlar. Boyaların renk verme kabiliyeti,
anyon ve katyonlardaki boya taşıyan organik gruplara bağlıdır. Eğer boya taşıyan grup katyonda ise boya
bazik (katyonik) , anyonda ise asit ( anyonik) bir boyadır.
Boyaların doku elemanlarına bağlanma mekanizması genel olarak şöyledir: Doku kesitlerindeki
protein, lipoprotein ve glikoproteinler amphoteric' tirler. Yani pH'ya ve çevrelerindeki çeşitli diğer şartlara
bağlı olarak iyonize olabilirler. Bir protein,sahip olduğu elektrik yüküne ve boyanmanın meydana geldiği
pH' da geldiği ( - ) ve (+ ) yüklerin cebirsel toplamına bağlı olarak asit veya baz olarak hareket eder. Bu
her iki tür proteinin (-) ve (+) yük sayılarının eşit olduğu bir pH vardır. Bu pH' ya o proteinin
"izoelektrik noktası'' denir. Bu pH'da o protein çok az boyanır. Fakat izoelektrik noktanın üstünde
26
proteinin anyonik gruplarının iyonizasyonu kolaylaşır ve protein, metilen mavisi veya bazik fuksin gibi
bazik boyalara bağlanır. Bu izoelektrik noktasının altında, aynı protein, pozitif yüke sabiptir ve bu durumda
eosin, orange G veya light green gibi asidik ( anyonik) boyalarla birleşirler. Dokulardaki proteinlerin
amino asitleri nisbi miktar bakımından oldukça farklıdırlar ve farklı izoelektrik noktalarına sahiptirler.
Dolayısıyla histolojik boyama için kullanılan mutat pH' da, bazı elemanlar daha çok bazik boyaları alarak
bazofilik, bazıları ise aynı pH' da asit boyalarla asidofilik olarak boyanır. Eritrositler, eosinofilik
lökositlerin granülleri ve midedeki parietal hücrelerin sitoplazmaları pH 6' da asit boyalarla boyanırlar.
Buna karşılık çekirdek kromatini sinir hücrelerinin sitoplazmaları ve kıkırdak dokusunun ara maddesi ise
bütün bazik boyalarla boyanmaktadır. Dokuları boyamak için ilk girişim, Leuwenhoek(l7l9) tarafından
safran kullanılarak yapılmıştır. Bu girişim başarılı olmadığı gibi diğer araştırıcılar tarafından da takip
edilmemiştir.
l9. yüzyıl ortalarında dokuların mikroskobik yapıları ayrıntılı olarak açıklanmaya başlanmıştır
(Kölliker, l852). Bu dönemde boya endüstrisi gelişmiştir. Histolojide ticari boyaların uygulanması,
önceden görülemeyen hücresel yapı detaylarını saptamayı, görülmesini ve çalışılmasını sağlamıştır. Boya
teknikleri son yüzyılın ikinci yarısında gelişmiştir ve birçok yöntem o zamandan beri çok az değişikliğe
uğramıştır. İki botanikçi ilk kez Carmin boyama yöntemini tanıtmışlardır ancak bu yöntemle sadece
dokuların hafifçe renklenmesini sağlayabilmişlerdir. Seçici çekirdek boyamasının ilk kullanımının, sinir
hücrelerini boyamaya çalışan Gerlach (l858) tarafından yapıldığı kabul edilmektedir. Başlangıçtaki
başarısızlıktan sonra potasyum bikromatta sertleştirilen bir cerebellum kesiti yanlışlıkla fazlasıyla seyreltik
amonyaklı carmin solusyonunda bırakılmış ve 24 saat sonra bulunduğunda çok güzel boyanmış olduğu,
sinir fibrilleri ve sinir hücrelerinin ayrılabildiği görülmüştür. Gerlach aynı zamanda zayıf asetik asitle
differansiyasyonla gerileyen (çekinik) boyanmayı da keşfetmiştir. Hematoksilen ilk kez yetersiz sulu
ekstrak olarak kullanılmıştır. Fakat iki yıl sonra Böhmer (l865), hematoksileni bir mordant olarak alumla
(şapla) karıştırmıştır ve daha spesifik boyanma elde etmiştir.
Endüstriyel kullanım için anilin boyalar geliştirildikten sonra bu boyalar, hematoksilenle birlikte
hala histolojide çok yaygın kullanılmaktadır. Eski boya yöntemlerinin büyük bölümü hala kullanılmaktadır.
Carmin , histolojide daha az kullanılmakla beraber, zoologlar tarafından günümüzde bütün haldeki
cestodlar, medusalar vs gibi hayvanların boyanmasında kullanllmaktadır.
Günümüzdeki boyama yöntemleri genellikle klasik yöntemlerin modifikasyonlarıdır. Son yöntemler
genellikle spesifik kimyasal yapıların ve enzimlerin tayini için renkli reaksiyonlar veren histokimyasal
yöntemlerdir.
HİSTOLOJİK BOYAMA YÖNTEMLERİNİN HEDEFİ
.Doku bileşenlerinin ayırt edilmesi için kullanılan başarılı histolojik teknikler, dokularda genel
olarak iki değişikliğe yol açar. Bunlar:
a-Ya kontrastta değişiklik
b-Ya da renkte bir değişikliktir.
27
Doku kontrasttındaki değişiklikler faz-kontrast veya polarize ışık kullanımı gibi mikroskobik yöntemlerle
de oluşturulabilir doku parçaları gri veya siyah olur. Aynı sonuç çöktürme yöntemleri ile de başarılabillr.
Şöyleki, opak gümüş veya diğer metalik bileşikler çoğunlukla fibrillerin, hücrelerin yüzeyinde depolanırlar.
Histolojik boyama yöntemleri sıklıkla boya-boyanması ile dokularda renk oluşturmaya
dayanmaktadır. Bu; boyanmış doku içinden geçen ışığın dalga boyunu değiştirir. Boya solusyonlarında
kullanılan boyalarla dokuların renklendirilmesi, boya yolu ile ışığın absorbsiyonudur. Başarılı boya
yöntemleri hem SPESİFİK tir hem de HASSAS tır. Spesifiklik veya seçicilik, tek tek doku
kompenentleri arasındaki farkı ayırt etmeyi ve bu yapılardan birini veya birkaçını renklendirerek,
boyanmamış diğer yapılardan ayırt etmeyi sağlar. Eğer kişi sadece özel bir yapıyı göstermek isterse; boya
sadece bu yapıyı seçmeli, diğerlerine yerleşmemelidir.
HASSASİYET ise boyanın düşük konsantrasyonda bir doku elemanını gösterebilme kapasitesidir. Tüm
boyama yöntemlerinde bileşenlerin bu değerin altında gösterilebilmesinin mümkün olmadığı bir eşik
değerine sahiptir. Eğer bir boyama tekniğinin eşik değeri yüksekse, bu hassasiyetin düşük olduğunu ve
doku kompenentlerinin bir bölümünün var olmalarına karşın bu teknikle gösterilemiyeceğini ortaya
koymaktadır. Tatmin edici bir boyam yöntemi yüksek hassasiyeti, yüksek seçicilikle biraraya getiren bir
yöntemdir.
HİSTOLOGLARCA UYGULANAN BOYAMA İŞLEMLERİ
Histologlarca kullanılan temel boyama teknikleri aşagıdaki tabloda verilmiştir.
Tablo :Histolojide Kullanılan Boyama Süreçlerinin Esas Tipleri
BOYAMA YÖNTEMİ BELİRLEDİĞİ YAPILAR NEREDE NE İLE
1- Vital Boyama
a-partiküllerin Makrofaj sistemi. canlı dokular trypan mavis
fagositozu
b-canlı yapıların Mitokondri canlı hücreler Janus green
spesifik boyanması
2- Seçilen Çözünebilirlik yağ damlacıkları dondurma kesitler Sudan boyaları gibi lizokromlar
3- Renkli kimyasal madde-
lerin yapımı
a-Stabil bileşikler Ferrik demir tüm kesitler Perls' yöntemi
b-Stabil olmayan bi- Enzimler özel hazırlanmış kesitler Histokimyasal Yön.
4 -Metal Çöktürme
a-Intrasellüler yapılar Melanin tüm kesitler Fontana gümüş
b-Fibriller Reticulin tüm kesitler Gümüş yöntemi
28
5- Boyalarla Boyama
a-Genel kimyasal ve Doku yapıları tüm kesitler H+E
fiziksel hareketler
b-Metakromazi kıkırdak, amyloid " " Thionin, crystal violet
c-Bir boyanın lokal DNA parafin kesit Feulgen reak.
Şekillenmesi
Enzim histokimyasından, gumüş çöktürme yöntemine kadar tüm yöntemlerin fizikokimyasal temelleri
aynıdır. Bütün boyama yöntemlerinde sorulacak en önemli sorular şunlardır:
a-Doku kompenentleri neden boyanır?
b-Neden boyanmış kompenentler boyalı olarak kalırlar?
c-Neden tüm kompenentler boyanmazlar?
NEDEN BOYALAR DOKULARCA ALINMAKTADIR?
Belki de alınmamaktadır. Negatif boyamada yapıların şekilleri boyanın penetre olrnasından değil boya ile
çevrelendiğinden gösterilmektedir. Bazen boyalar yenir. Daha kusursuz olarak, boya reaktifleri
organizmanın fizyolojik aktivitelerine bağlı olan değişik yollarla canlı hücre içine alınabilir. Bu ise vital
boyama ve supra-vital boyama olarak adlandırılır.Daha da genellersek, boya alınımı, boya-doku veya
reaktif-doku affiniteleri nedeniyledir. Bazı doku kompenentlerinin bazı boyalar için yüksek bir affiniteye
sahip olduğu söylendiğinde, spesifik kullanım şartlarında-kompenent yoğun olarak boyanacaktır. Öte
yandan dokuya boyayı bağladığı düşünülen Coulomb, hidrojen bağı ve diğer bağlar gibi çekici kuvvetleri
de açıklamak için de kullanılmaktadır. Bu yüzden affinite, bir boya maddesini boya banyosundan bir kesite
transfer olma eğiliminin bir ölçümü olarak düşünülebilir ve affinitenin önemi (büyüklüğü), bu prosese
eklenen veya engellenen her faktöre bağlıdır.
1-VİTAL BOYAMA
Canlı hücreler, boyama sıvılarındaki ayrışma ile (supra-vital boyama) veya canlı organizma içine boyanın
enjeksiyonu ile (intra-vital boyama) boyanabilirler. Bu yöntemler, tespit edilmiş dokudan alınan kesitlere
uygulanmaz. Fakat boyanmış kesitlerin karşılaştırılmasında değerli bir kontrol olarak kullanılabilirler.
Canlı hücrelerin boyanması için ilk uygulama, önce metilen blue'yu (l887), daha sonra nötral red'i (l894)
kullanan Paul Ehrlich' ten gelmiştir. Vital boyamada önce sitoplazmik yapılar ortaya konur. Canlı
hücrelerin çekirdek zarı boyalara geçirgen değildir ve canlı çekirdeği boyamak mümkün değildir. Trypan
mavisi ile makrofaj sistem hücrelerinin vital boya ile gösterimi, sitoplazmik fagositoza bir örnek oluşturur.
Bu boya kolloidaldir. Çini mürekkebi gibi ince süspansiyonlar, Makrofaj Sistemi hücreleri ve diğer
hücrelerce fagositik kapasiteleri ile alınmaktadır. Hücresel bileşenlerin gerçek vital boyanması,
mitokondrilerin Janus green ile gösterilmesidir.
29
2-SEÇİLEN ÇÖZÜNURLUKLE BOYAMA
Su, hücrenin her tarafında geniş olarak dağıldığı için sulu boyalar uygun değildir ve boyama çok gevşek
olacaktır. Dokularda çözünen maddeler ''Lysochrom'' lar olarak bilinmektedir. Hemen hemen tüm
lysokromlar lipidde çözünür ve doku kesitlerinde lipidlerin gösterimi için histolojide kullanılırlar. Yağ
damlacıkları, eğer boya yağda alkolden daha çözünürse, alkolik solusyonlardaki (sıklıkla % 70' lik)
boyalarla seçici olarak renklenirler. Solusyonla başarılı histolojik boyama esas olarak yağ boyaları ile
sınırlandırılmıştır ve lysokromlar, parlak renkli, lipidlerde yüksek çözünür olmalı ve seçilen tercihli
çözünürlükler hariç diğer hücresel yapıların hiçbirine affinitesi olmamalıdır.
3-DOKULARDAKİ RENKLİ MADDELERİN KİMYASAL URUNLERİ İLE BOYAMA
Bazı boyama yöntemlerinde, doku kompenentleri ile reaksiyona girip renkli maddeler üretecek soluk veya
renksiz solusyonlar kullanılır. Bu reaksiyonların sonunda oluşan renkli ürünler ya gerçek boyalar veya
boya olmayan renkli kimyasal ürünlerdir.
Birinci gruba örnek olarak PAS reaksiyonunda kullanılan Schiff reaktifi ve Feulgen reaksiyonu
verilebilir. Saman renkli veya renksiz solusyon, dokulardaki aldehitlerin varlığı ile mor renge dönüşür.
Histokimyasal reaksiyonların ikinci grubu renkli olan fakat bir boya olmayan final ürününe sahiptir.
Reaksiyona örnek olarak demirin gösteriminde kullanılan Perls' reaksiyonu verilebilir. Potasyum
ferrosiyanid, potasyum ferric ferrosiyanid (prusya mavisi) oluşturmak için demir iyonları ile birleşir (+3
değerlikli Fe). Bu basit bir kimyasal reaksiyondur. Ürün olan Prusya mavisi bir boya değildir ve boya
olarak kullanılmaz. Fakat görülebilen, koyu boyanmış çözünmeyen bir birikimdir. Dokuların böylesi
renklendirilmesinin bir diğer değişik tipi enzim histokimyasında görülmektedir. Enzimler, renkli son
ürünler oluşturmak üzere kimyasal substratlarla birleşmezler ya enzim aktivitesi olan alanlarda substratları
renkli maddelere dönüştürerek ya da iki basamaklı bir reaksiyonda renkli bir bileşikle yer değiştirebilecek
renksiz bir ürün oluşturarak substratları üzerine etki yaparlar. Renkli bir final reaksiyon bileşiği üretimi ile
ilgili tüm bu yöntemlerin sonuçları benzerdir. Reaksiyonun yoğunluğu, dokulardaki aktif reaktifin miktarı
ile orantılıdır. Histolojik kesitlerdeki bu kimyasal reaksiyonların başarısı, aktif hücresel yapıların hücre
içindeki orijinal yerlerinde ve orijinal konsantrasyonlarında korunmasına bağlıdır; glikojen veya enzimler
gibi stabil olmayan maddelerin kaybından kaçınmak için özel önlemler alınmalıdır. Ayrıca son ürünler
opak veya koyu boyanmış olmalıdır.
4-METALİK ÇÖKTÜRME
Bazı metalik bileşikler dokular tarafından opak, genellikle siyah birikinti oluşturarak metalik duruma
indirgenebilirler. Kolayca indirgendiğinden ve depo edilmiş gümüş stabil olduğundan Ag(NH3)20H
çözeltileri histoloji için çok uygundur. Melanin gibi tyrosin türevleri ve intestinal bezlerin Kultschitzky
hücre granüllerinde bulunan fenolik bileşikler, görülebilen birikinti oluşturmak üzere Ag(NH3)2)OH’ı
indirgeme kapasitesine sahiptir. Bu tip hücreler arjentaffin hücreler bilinirler. (Ag(NH3)2)OH’ ı direkt
olarak indirgeyemeyen fakat bunu dışarıdan ilave edilen bir indirgeyicinin eklenmesi ile gerçekleştiren
hücreler argirofil hücreler olarak bilinir.
30
Metalik çöktürme aynı zamanda fibrillerin gösterilmesinde kullanılan standart bir yöntemdir. Sinir
fibrilleri ve retiküler fibriller gibi diğer fibril1er Ag(NH3)2OH ile birleşirler ve bu transparan
indirgenmemiş gumüş, bir fotografik developer tarafından veya tekniğin ikinci basamağındaki diğer bazı
indirgeyici ajanlar tarafından opak metalik gümüş olarak fibril1er üzerinde birikebilir. Metalik çöktürme
ile boyama, dokulardaki indirgeyici ajanlar yeterli güçte ise tek basamaklı bir teknik olabilir. Fakat
fibrillerin impregrasyonla gösteriminde, argirofil hücrelere benzer olarak genellikle iki basamaklı
indirgenmeye gereksinim olacaktır. Hassaslaştırıcı ajanların ve gümüş yöntemlerinin varyasyonlarını
kullanarak, birçok hücresel yapı, pigmentler, spiroketler ve funguslar metalik impregnasyonla
gösterilebilir.
5-DOĞAL VE YAPAY BOYALARLA BOYAMA
Boyama tekniklerinin büyük bölümü bu gruba girmektedir. Ticari boyalara ait bilgilerin histolojiye
aktarımı, dokularla boya kombinasyonları ile ilgili birçok faktörü anlamamıza yardım etmiştir.
Histolojide Kullanılan Boyalar
Histolojide iki tip boya kullanılmaktadır. Bunlar:
a-Doğal boyalar b-Yapay (sentetik) boyalar dır.
Doğal Boyalar: Örnek/ Carmin ve Hematoksilendir. Carmin boyası, Orta Amerika sulak ormanlarında
yaşayan Dactylopius cacti türü dişi böceğin (kırmız böceği) kurutulmuş gövdelerinden elde edilir.
Carminik asit, kırmız böceğinin suda kaynatılması ile ve kimyasal saflaştırmayı takiben ekstre edilmesi ile
elde edilmektedir. Kaba form olan Carmin, kırmızın potasyum alimunyum sulfatla çöktürülmesi ile
hazırlanır.
Hematoksilen ise Meksika'dan orijin almış ve Jamaika'da ıslah edilmiş Haematoxylen
campechianum türü küçük bir ağacın tahtalarından ekstrakte edilmektedir. Hematoksilen histolojide en
çok kul1anılan boyalardandır. Hematoksilenin doğal formunun boyama yeteneği çok azdır veya yoktur.
Bu nedenle ya hava ile temas ederek doğal yoldan ya da sodyum iodat veya mercuric oksit gibi oksitleyici
ajan kullanarak kimyasal yoldan hemateine okside olması gerekmektedir.
Yapay Boyalar: Kömür-gaz endüstrisinde kömürden elde edilen organik bileşiklerdir. Son yıllarda petrol
yağları önemli bir alternatif kaynak haline gelmiştir. Benzen, toluen ve naftalin gibi hidrokarbonlar; fenol
ve cresol' ler gibi fenoller primer ürünlerdir. Yapay boyaların büyük bir bölümü üç olası alternatif yapısal
formülü bir türevli moleküldür (Şekil )
Şekil :Boya bileşiklerinin benzen halka yapısı
31
a-Benzen b-Quinone c-Anilin
Resonans, ışığın absorbsiyonu ve renk oluşumu ile ilgilidir. Benzen renksiz bir bileşik olmasına
rağmen, ultraviyole bandında bir absorbsiyon bandına sahiptir ve eğer gözlerimiz ultraviyole ışığa duyarlı
olsaydı benzen renkli görünecekti. Benzenden renkli bir bileşik yapmak için, bazı kimyasal değişiklikler
yapmaya gereksinim vardır ve renk oluşturan kimyasal konfügirasyonlar "kromofor ‘ lar olarak
bilinmektedir. Üç esas tip chromofor vardır (Şekil ). Bunlar:
l-Quinonoid halka (genellikle paraquinonoid, bazen orto-quinonoid)
2-Azo-eşlenme
3-Nitro-gruplanma, NO2
Şekil : Kromoforlar a-Paraqulnonoid halka b-ortoquinonoid halka c-Azo-eşlenme
d-Nitro-gruplanma(nitrobenzen)
QİNONE, sarı renkte, önemli bir kromofor içeren bileşiktir. Daha kompleks organik bileşiklerde bir
quinonoid halkanın bulunuşu, parlak daha koyu renkler oluşturur. Kromoforları içeren bileşikler '
Kromojen' ler olarak bilinirler. Dokuları ve kumaşları renklendirirler. Oluşan renkler sabit değildir ve
basit solusyonlarda yıkama ile kolaylıkla uzaklaşabilirler. Kromojenler solusyonlarda moleküller
oluşturarak çözünürler. Halbuki tatmin edici boyalar iyonlar şeklinde çözünürler. Bir kromojeni gerçek bir
boyaya çevirmek için iyonize edici bir grubun ortama verilmesine gereksinim vardır.Bu iyonlaştırıcı
gruplar ''auxokrom'' lar olarak bilinirler ve rengin yoğunluğunu artırırlar. Auxokromlar ya asidik veya
baziktirler ve tüm molekülün boyanma hareketini belirleyen boya parçalarıdır.En önemli bazik auxokrom,
amino-qrubu (-NH2) dur. Boya endüstrisinin temelini oluşturan anilin halkayı içeren boyalar (Şekil-c),
histolojide birçok boyama tekniğinde hala kullanılmaktadır.
Asidik auxochromlar ise şunlardır:
sülfür grubu (-SO3)
karboksil grubu (-COOH)
hidroksil grubu (-OH)
32
Bir boya bileşiği içeren asidik veya bazik auxokromların büyük bir bölümü, bazik (katyonik) veya
asidik (anyonik) boya karakterlerinin gücünü belirler. Bir bazik ve bir asidik gruba sahip boyalar baziktir
ve bazik grup predominanttır fakat asidik grubun varlığı ile boyama özelliği zayıflamıştır. Boyalar
modifier ' ler olarak adlandırılan ve boyanın rengini değiştirme etkisine sahip ek kimyasal gruplar içerirler.
Bunlar metil (-CH3) veya etil (-C2H5 grupları olabilir ve boyanın rengini daha belirginleştirirler.
Rosanilin, pararosanilin' den rengi biraz daha mavi yapan bir metil grubuna sahip olması ile ayrılır. Eğer
bazik amino-auxochromların hidrojenleri metil veya aril grupları ile yer değiştirirse, boya daha mavi olur.
Kristal viyole birden fazla modifiere sahip boyalara örnek olarak verilebilir. Şöyleki, bir koromofor ile
renklenmiş ve bir auxokrom ile iyonize edilmiş organik bileşikten oluşmuş bir boyanın final rengi, bir
modifier ile değiştirilir veya kuvvetlendirilir. Örnekler aşağıda verilmiştir.
QUİNONOİD ROYALAR:
Asit ve bazik fuksin
Krista1 viyole
Anilin blue
Eozin
Thionin
Metilen blue
Nötral red
Doğal boyalardan hematein ve karminik asit
AZO BOYALAR : Küçük bir boya grubudur .
Orange G
Congo Red
Trypan blue
NİTRQ BOYALAR :En küçük boya grubudur.
Pikrik asit (trinitrofenol)
Aurantia
Şekil:Boyaların Yapıları
a-Quinoid boya (hematein) b-Azo boya (Orange G) c-Nitro-boya (Pikrik Asit)
33
ASİDİK- BAZİK VE NÖTRAL BOYALAR
Asidik ve bazik boyalar, solusyon hazırlandığında iyonize olurlar.Tipik bir bazik boya, katyonik
veya pozitif yüklü boya iyonları ve negatif yüklü, renksiz klorid iyonları oluştururlar. Halbuki asidik bir
boya anyonik veya negatif yüklü renkli boya iyonları ve pozitif yüklü renksiz sodyum iyonları
oluştururlar. Boyalara uygulanan bu ''asidik'' ve ''bazik'' terimleri pH ile ilgili değildir ve bazik boya için
katyonik boya; asidik boya içinse anyonik boya terimlerini kullanmak daha iyi olacaktır. Uygulamada,
katyonik bazik boyalar reaksiyonda klorid köklerinden dolayı kısmen asit olarak bulunurlar. Asit boyalar
ise sodyum tuzlarıdır ve kısmen alkali olabilirler.
Bazik fuksin , renkli rosanilin temele ve renksiz asidik Cl köküne sahip bir bazik boyadır (Şekil a).
Boya molekülünün asidik kısmı renkli olan, temeli ise renksiz ve genellikle sodyum olan boya ise
asidofilik ' tir. Asit fuksin; rosananilin bir asidik sulfonat türevinin sodyum tuzudur.
Şekil : Bazik ve asidik boyalar
a-Bazik fuksin
b-Asit fuksin
Nötral bir boya; bir asidik ve bir bazik boyanın etkileşimi ile olur. Hem katyon hem de anyon
chromophorik gruplar içerirler ve boya molekülünün her iki kısmında renkli bir boya vardır. Büyük
moleküllerin kombinasyonundan dolayı, nötral boya solusyonları sıklıkla kolloidaldir. Nötral boyalar
alkolde çözünürler, suda ise nadiren çözünürler. Halbuki asidik ve bazik boyalar genel1ikle her ikisinde
de çözünürler. Nötral boyalara en iyi bilinen örnek Romanowsky boyalarıdır ve polychrom metilen blue
ve eozinin etkileşimi ile şekillenirler; bu boyalar kan boyaması için çok kullanılırlar. Metilen mavisinin
metilen azure oksidasyonu boyaya özel seçicilik özelliğini vermektedir. Bu oksidasyon hematoksilen gibi
diğer boyaların olgunlaşmasına analogtur.
Amfoterik bir boyama; belli bir pH'nın altında (izo-elektrik nokta) katyonik; bu pH'nın üstünde anyonik
olan bir boyadan yapılır. Carminik asit izo-elektrik noktası pH-4.5' de olan bir amfoterik boyadır.
Bazik boyalar; nukleuslar gibi asidik doku kompenentlerini renklendirirler. Asidik boyalar ise
sitoplazma gibi bazik yapılarla birleşirler. Nötral boyalar ise hücredeki asidofilik ve bazofilik elementlere
ilgi duyarlar ve bazı doku kompenentleri aynı zamanda üçlü boyama etkisi veren bileşik nötral boya ile
reaksiyona girerler.
34
RENKSİZ LEUCOBAZLAR
Bazı boyalar kolaylıkla indirgenebilirler ve eğer bu süreçte kromofor haraplanırsa, boya rengini kaybeder.
Böylesi leuco-boyalar (örnek: leuco-metilen blue), vital bir boya yönteminde oksidasyonla tekrar
renklenirler. Buna karşılık eğer oksijen gerilimi düşerse metilen mavisi ile vital olarak boyanan hücre
yapıları renksiz hale (leucobaza döner) gelir ve oksijene maruz bırakarak tekrar renklenebilir. Oksitleme
ajanı için bir test olarak kullanılmadığından Schiff reaktifi ( bir leuco-fuksin) gerçek bir leucobaz değildir.
Halbuki kromoforun tekrar yapımı ile renkli hale geldiğinden leucobazlara benzemektedir.
METAKROMATİK BOYANMA
Bazı doku kompenentleri boyalarla birleştiklerinde boyanın orijinal renginden ve dokunun diğer
bölümünde oluşan renkten farklı bir renk oluştururlar. Bu olay metakromazi olarak adlandırılır. Bu şekilde
hareket eden boyalar ise metakromatik olarak adlandırılmaktadır. Metakromatik boyanın rengini
değiştirebilen madde ise 'Kromotrop'' olarak bilinir. Ortokromatik terimi ise metakromazi göstermeyen
doku veya metakromatik olmayan bir boya için kullanılabilir. Metakromatik boyaların birden fazla
absorbsiyon spektrumu vardır ve bunlar ortokromatik ve metakromatik doku-boya bileşikleri arasında göze
çarpan kontrastı vermek için yeteri kadar farklı olmalıdır. En önemli metakromatik doku kompenentleri
kıkırdak, bağ dokusu, epitelyal musin, mast ve bazofil hücre granülleri ve amyloid' tir. Metakromatik
olan boyalar esas olarak toluidin blue, thionin gibi thiazinlerdir (Şekil ). Metil viyole de yaygın olarak
kullanılmaktadır.
Şekil :Thiazine boya yapısı (thionin)
Bu boyalarda kullanılan renk kontrastı mavi-kırmızıdır. Ortokromatik doku ile Toluidin blue nun
absorbsiyon spektrumu yaklaşık 630 nm de maksimumdur ve ortaya çıkan renk mavidir; metakromatik
madde ile ise maksimum absorbsiyon 480-540 nm dir ve renk kırmızıdır. Gamma metakromazi olarak
bilinen kırmızı boyanmaya ek olarak, Toluidin blue dokuları menekşe veya mor renge boyar ve beta
metakromazi olarak bilinir.
Alfa................. mavi; negatif
Beta................. menekşe veya mor; kısmen pozitif
Gamma ...........kırmızı ; kuvvetli pozitif
35
Metakromazinin ortaya çıkması için, dokunun yüzeyinde serbest elektronegatif gruplar (genellikle
sülfat veya karboksil ) bulunmalıdır. Bu gruplar bol sülfatlı asidik polisakkaritlerde mevcuttur. Asidik
grupların sayısında bir düşüş veya protein bağlanması ile bunların kaybı metakromazide düşüşe yol açar.
Metakromazinin ilginç bir özelliği ise, alkolün, boyanın polimerize (metakromatik) şeklini, monomerik
(ortokromatik) forma dönüştürmesidir. Eğer kesit, boyamadan sonra alkolle dehidre edilirse metakromazi
genelikle kaybolur. Hughesdon tekniğinde metakromazi kaybolmaz. Su, metakromatik boyaların büyük
bölümü için gereklidir.
FLORESANS BOYAMA
Fluorochromlar, asidik veya bazik boyalar olarak hareket eden kromoforlu ve auxokromlu
quinonoid boyalardır. Bu boyalar dokularla birleştiklerinde ultraviyole ışığı, görünen ışığa çevirme
kapasitesine sahiptirler. Ultraviyole ışığın kullanımı ile fluorokromla birleşmiş dokuları tanıyabilirken;
dokuları gün ışığında oluşan renkle tanıyamayız. Flurokromlar, floresans olmayan boyalardan daha
spesifik değildirler ancak çok hassastırlar. Floresans, bazı maddelerin belirli bir dalga boyunda
aydınlatıldığında farklı ve daha uzun ışınları yayma özelliğidir. Floresans teknikler çok kullanılır.
Flurokrom boya yöntemleri ise doku bileşenlerinin, bakterilerin, fungusların , ağır metallerin gösteriminde,
eksfolyatif sitolojide malign hücrelerin tanınmasında rutin olarak kullanılmaktadır. Floresans mikroskopi,
dokulardaki ve serumlardaki antijen ve antikorların gösteriminde kullanılan immüno floresan tekniklerin
temelini oluşturmaktadır.
İki tip floresan vardır:
1-Primer Floresans (doğal-otofloresans): Vitamin A, riboflavin, porfirin, kloroplast gibi biyolojik
materyelin kendi özelliğidir. Dokular, genel mavi floresansa sahip olabilirler ve bu elastik fibrillerde
kuvvetlidir. Civa, demir ve iodine gibi bazı maddeler doğal floresansı ortadan kaldırır.
2-Sekonder Floresans (yapay-indüklenmiş): Doğal floresans olmayan maddelerin acridin orange,
auramine, thioflavine-T vb bir flurokrom boya ile etkileşimden sonra ortaya çıkar. Yapay floresanla
malign hücreler, acridine orange ile birleştiğinde çok hızlı gösterilebilir. Floresan mikroskopi tekniklerinde
indüklenerek oluşturulan yapay floresansın birçok avantajı vardır. Çok az bir floresans materyel görülebilir
floresans üretir. Çok düşük konsantrasyondaki doku bileşenlerinin çok az floresan boya ile gösterilebilir.
Floresan boyalar toksik etki yaratmaksızın canlı hücrelere de verilebilir. Yöntem çok hassastır ve iyi
kontrast verir. Yapay floresans da ağır metallerle haraplanır. Bazı tekniklerle başarılı sonuçlar için
tamponlanmış flurokrom boya solusyonları gereklidir.
TESPİT EDİLMİŞ DOKULARI BOYAMADAKİ GENEL FAKTÖRLER
1-Fiksasyonun Boyama Üzerine Etkileri: Fiksasyon, dokularla boyaların etkileşimine yardım
eder. Formaldehit ve civa klorür, bazik boyaları tercih ederken, trikloroasetik asit, pikrik asit ve krom
36
bileşikleri asidik boyaların hareketini kolaylaştırır. Etil alkol veya asetik asitle fiksasyondan sonra hem
asidik hem de bazik boyalar dokular tarafından kolaylıkla alınır.
Çekirdek boyası olan carmalum, civa klorür fiksasyonundan sonra daha çok, formalinden sonra ise
daha az boyar. Bazen tespit edici ajan, özel bir doku bileşeni ve boya arasında direkt olarak hareket eder.
Bu durumda iken fiksatifin bir mordant olarak hareket ettiği söylenir. Örnek olarak, hematoksilenle
miyelinin gösterilmesinde başlangıç basamağı olarak dokunun potasyum dikromatla muamelesi verilebilir.
2-Progressif ve Regressif Boyama: Progresif boyama tekniği, dokulardaki farklı elementlerin sıra
ile renklendiği ve boyama solusyonunda uygun sürenin sonunda dokuların tatmin edici differensiyel
renklenmesinin başardığı bir tekniktir.
Regressif teknikte ise dokular önce fazla boyanırlar, hücresel ayrıntılar yok olur. Sonra dokunun
istenmeyen kısımlarından fazla boyanın uzaklaştırılması ile boyanın alındığı veya differensiye edildiği bir
tekniktir. Regressif boyama eski progressif yöntemlerden daha çok uygulanmaktadır. Çünkü diğer hücre
yapılarının bir miktar boyanması olmaksızın bir hücrenin bir kısmının yeterli yoğun progressif boyanması
olmaksızın hücre bölümlerini yeterli yoğun progressif boyanmasını elde etmek zordur. Regressif boyama
ise ayrıntıları örten diffüz sonuç verir. Differansiyasyonla daha açık renkte boyanmış alanlardan boyaların
uzaklaştırılması olasıdır. Differansiyasyondan sonra hala diğer yapılarda seçici ve açık biçimde ayrıntılı
sonuçlar için yeterli miktarda boya kalmaktadır.
3- Direkt ve İndirekt Boyama: Anilin boyaların bir çoğu ( metilen mavisi, eozin gibi) boyanın
basit sulu veya alkolik solusyonlarına konursa dokuları mükemmel olarak boyar ve direkt boyama olarak
bilinir (Şekil a). Hematoksilen gibi birçok boya ise dokularda tatmin edici bileşimin oluşması için
mordant olarak bilinen ara bir maddeye gereksinim duyarlar. Bu olay indirekt boyama olarak bilinir.
Boya ve mordant ünitesi renkli bir göl şekillendirmek için ve mordantlanmış boya, bir doku-
mordant-boya kompleksini oluşturmak üzere doku ile birleşirerek sonraki zıt boyamanın ve dehidrasyonun
kolaylıkla yapılmasına izin verir. Histolojik boyama yöntemlerinde boya ve mordant ya birlikte (örn/
Erlich hematoksileninde hematoksilen potasyum alum ile) veya mordant doku boya solusyonuna
aktarılmadan önce ( örn; Heidenhein hematoksileninden önce iron alum banyosu) kullanılabilir. Demir,
alimünyum ve krom bileşikleri boyalarla bazik boyalar oluşturmak üzere birleşen mordantlardır. Metalik
mordant; kimyasal bağlarla kendini hem boyaya hem de dokuya bağlar.
Accentuator-Vurgulayıcılar: Mordantlardan farklıdırlar ve kullanıldıkları boyanın boyama gücünü
artırırlar. Boyalarla göller oluşturmazlar ve boyanın doku ile kimyasal birleşmesi için esasi değildirler.
Loeffler' in metilen mavisindeki potasyum hidroksit ve karbol thionin ve karbol fuksindeki fenol; boyanın
yoğunluğunu ve seçiciliğini artırarak accentuator olarak hareket ederler. Accentuatorlar sırası ile anyonik
(asidik) ve katyonik (bazik) boyalara eklendiklerinde sıklıkla asit ve alkalidirler. Bir anyonik boyaya
asidin eklenmesiyle; dokuların bazik gruplarının iyonlaşmasının artmasıyla boyama yoğunlaşır. Eğer bir
katyonik boyaya alkali eklenirse, asidik gruplarının iyonizasyonu artar. Fenol, karbol thionin ve karbol
fuksinde accentuator olarak kullanılır fakat hareket tarzı tam olarak anlaşılamamıştır.
37
Şekil : Direkt ve indirekt boyama
a- Direkt boyama
b- Mordant ile indirekt boyama
c- Accetuator ile indirekt boyama
Sinir sistemi için metalik impregnasyon yöntemlerini de kullanılan Acceleratörlerin
(hızlandırıcılar) (örn/ Cajal yöntemlerindeki chloral hidrat ve veronal) de aynı zamanda accentuatorlar gibi
aynı yolla hareket ettikleri görülmektedir. Trapping(tuzağa düşüren ajanlar), boyaları dokularla ve
bakterilerle birarada tutar; tannik asit ve iodin örnek olarak verilebilir. Metilen mavisi/ eozinle seçici olarak
boyanan bir kan smeari, tannik asitle muamelesinden sonra krornatindeki metilen mavisini tutar. Gentian
viyole ve iodin ile boyanan bakterilerin ve alkolik deklorizasyona dayanması da aynı zamanda bakteri-boya
kompleksine iodinin trapping hareketi yüzündendir. İodinin boyanın bakteriler ile reaksiyona girme
kapasitesini değiştirmediğine, fakat boyayı tutmaya meyilli olduğuna ve differansiyasyon sırasında
dokudan kaçışına engel olduğuna inanılmaktadır.
4-Differansiyasyon: Regressif bir teknikteki aşırı boyanmış dokunun differansiasyonu veya boyanın geri
alınımı (de-staining), basit solusyonlarda yıkama ile veya asitler ve oksitleyici ajanların kullanımı ile
sağlanabilir. Mordantlar ve bazı boyalar aynı zamanda differansiasyon ajanları gibi hareket edebilirler.
Suda veya alkolde yıkama, differensiasyonun temelidir ve boyanın içinde çözünebileceği herhangi bir
solvent de kullanılabilir; differensiasyon sıvısı basit çözünebilirlikle hareket eder. Dokularla sıkı kimyasal
birleşme ile birleşen boyalar, bu yolla kolaylıkla differansiye olamazlar fakat onların doku-boya linkajları
asitlerin hareketi ile parçalanabilir. Differansiasyon ajanı ya doku ve mordant arasındaki birleşimi ya da
mordant ve boya arasındaki bağları koparır. Asitlerle hematoksilen boya göllerinin differansiasyonu;
mordantla birleştiğinde kaybolan boyadaki hidroksil grubun yeniden oluşumu ile mordant-boya hattını
kırar; asit aynı zamanda dokulardaki asidik grupların iyonizasyonunu baskılar. Doku-mordant bağı da
kırılır. Oksitleme ajanları farklı olarak hareket ederek boyayı renksiz bir bileşiğe oksitlerler.
Differensiasyon için kullanılan mordantlar; çözünmeyen boya mordant doku kompleksini, bir boya olarak
dokuda boyanın sadece bir bölümünü bırakarak, boyanın kismi redistribution yolu ile differensiasyon
sıvısında dağılan çözünebilir boya-mordant gölüne dağıtır. Boyalar, kullanılan boyalardan doku
kompenentleri için daha kuvvetli bir affiniteleri olduğunda differentiatör olarak işlev görürler. Orange G
38
gibi daha kuvvetli bir boya, diğer daha az hırslı boyayı yerinden çıkarır ve basit de-staining gibi aynı etkiyi
yaratır.
Boyama Solusyonlarının Olgunlaşması: Bazı boyama solusyonları sadece haftalarca veya aylarca
havaya, ışığa ve (sıklıkla) ısıya maruz kaldıktan sonra etkilidir. Hematoksilen iyi bilinen bir örnektir. Taze
hazırlandığında nukleus boyası için kullanışsızdır fakat stoklandıktan birkaç hafta sonra aktifleşir.
Hematoksileni hemateine okside olur. Oksitleme ajanlarının (sodyum iodat, merküri oksit, potasyum
permanganat gibi) eklenmesi ile hızlandırılabilir. Hematoksilenin bir kısmının boyama solusyonunda suni
olarak fazla hematoksilenin ise doğal olarak olgunlaştırılmasının mümkün kılınması önerilmektedir. Bu,
boyanın bir kerede kullanılmasına izin verir fakat devam eden oksidasyon boyanın aktivitesinin birkaç ay
sürmesini sağlar; yoksa tamamen olgunlaşmış solusyon daha ileri oksidasyonla inaktif bileşiklere
dönüşerek hızla etkisiz hale gelir. Boyaların hazırlandığı günün tarihini etiketle belirlemek akıllıca
olacaktır.
BOYALARIN SINIFLANDIRMASI VE STANDARDİZASYONU
Histolojide kullanılan boyaların büyük bölümü 3 temel chromoforik gruptan (quino-noid halka, azo-
grup veya nitro grup) tan birine dahildir. Quinonoid boyalar çok geniş ve önemli bir gruptur ve quinonoid
yapının özel tiplerine bakılarak alt gruplara ayrılırlar.
Histolojide boyalar ya boyaların uygulama tarzlarına bakılarak direkt veya mordant boya; ya da
genel kimyasal özelliğine bakılarak asit veya bazik boya olarak sınıflarıdırılırlar. Bazı boyalar light green
(açık yeşil) gibi rengi açıklayan isimlere, bazıları ise kimyasal açıklamayı da içeren isme sahiptirler (örn/
Anilin mavisi). Birçok boyanın sonunda ise sayılar ve harfler bulunur. Bir boyanın adından sonraki R
harfi, ilgili bir boyadan daha kırmızı olduğunu gösterir. 2 R ise daha da kırmızı olduğunu gösterir. B ise
genellikle mavimsi bir rengi G (gelb) ve Y her ikisi sarımsı bir rengi belirler. Boyalar için uniform bir
adlandırrna, bir boya için birçok sinonimin bulunmasından dolayı özellikle önemlidir. Örneğin lipid boyası
olan Sudan IV aynı zamanda Scarlet red, Scharlach R, Oil red IV, fat ponceau R veya LB veya cerotine
ponceau 3B olarak da adlandırılmaktadır. Orange G' nin de birçok sinonimi vardır. Phloxine G ve Phloxine
B gibi benzer isimli diğer boyalar birbirlerine benzer değildir. Colour Index kullanımı ile bu karışıklık
önlenebilir.
BOYA İNDEKSİ
Bazı boyaların Colour Index' teki numaraları ve varsa sinonimleri aşağıdaki
listede verilmiştir.
-
CI Number Dye Synonym
42685 Acid fuchsin acid magenta. acid violet 19
42005 Acridine orange basic orange 14
45000 Acridin red
74240 Alcian blııe 8GX Ingrain blue 1
39
- Alcian green 2GX Ingrain green 2
58005 Alizarin red S mordant red 3
42755 Aniline blue WS water blue. soluble blue.
acid blue 22
41000 Auramine basic yellow 2
52005 Azur A
520010 Azur B
- Azur
- Azur I
- Azur II
425l0 Basic fuchsin magenta. basic violet 14
26905 Biebrich scarlet acid red 66
21000 Bismark brown Y basic brown 1
16250 Brillian crystal scarlet 6R acid red 44. crystal
ponceau 6R. naphthalene
scarlet 6R. ponccau 6R
75470 Carminc natural red 4
75470 Carminic acid
51050 Celestine blue B mordant blue 14
28160 Chlorantine rast red Sirius red 4B
16570 Chromolrope 2R acid red 29
22120 Congo red direct red 28
-- Cresyl fast violet cresyl echt violet
42555 Crystal violet
42530 Dahlia Hofmanns violet
- Direct blue 109 Durazol brilliant blueB
741 80 Durasol fast blue 8G
45400 Eosin B eosin. bluish. acid red 91
45380 Eosin Y eosin yellowish, acid red 1l7
45430 Erythrosin B acid red 51
Dianozin salts
37245 Fast black B
37235 Fast blue B
37210 Fast garnet GBC
40
37150 Fast red ITR
37085 Fast red ITR
42053 Fast green FCF Food green 3
45350 Fluorescein acid yellow 73
51030 Gallocyanin mordant blue 10
Histoloji laboratuvarlarının çoğu boyaların tespiti ve analizleri ıçin olanaklara sahip değildir. Çünkü
bunun için spektrofotometrik, kromotografik ve elektroforetik yöntemler gereklidir.
Boyalar ve dokuların her ikisi de iyonize olurken birbirleri ile reaksiyona girecektir ve doğaldır ki
bu direkt boyama yöntemlerinde olacaktır; elektropozitif boyalar elektronegatif boyalarla ve karşılıklı
olarak birleşir. Mordantlanmış boyalar indirekt boyama yöntemlerindeki bazik boyalar gibi hareket ederler.
Asitlerle ve alkalilerle bazik ve asit boyamanın differansiasyonu; pH daki değişikliklerle meydana çıkan
iyonik değişiklikler nedeni iledir. Hem boya hem de doku etkilenecektir. Bir boyanın yoğunluğu ve hızı
veya tutunması doku kompenentleri için iyonize radikallerinin arzusuna bağlıdır. Karboksil gruplar sadece
zayıf asidiktir. Fosforil gruplar ve sülfüril gruplar daha kuvvetlidir. Sülfonlanmış boyalar (asit fuksin,
Orange G) proteinlerin bazik gruplarına kuvvetli ilgiye sahiptirler ve kuvvetli differansiasyon isteyen güçlü
bağlar oluşturmak üzere onlarla bağlanacaklardır. Mordantlanmış boyalar, direkt bazik boyalar gibi aynı
yol1a dokuyla birleşecektir fakat metalik mordant sabit bir doku-metal-boya linkajı şekillendirir. Kimyasal
etkileşimle başarılı boyama; birbiri için bir affiniteye sahip farklı ve zıt yüklü radikalli boya solusyonlarına
iyonize kimyasal gruplu tespit edilmiş dokuların bir gösterimi olarak kısaca açıklanabilir.
BOYA İLE BOYANMANIN HAREKET TARZI
Kimyasal ve fiziksel reaksiyonlar dokuların boyanmasını sağlarlar. Her iki olay da
çoğunlukla aynı zamanda ortaya çıkar.
A-Boyamadaki Kimyasal Reaksiyonlar: Bir boya renkli bileşikler oluşturmak üzere proteinlerle
ve diğer doku elemanları ile birleşme yeteneğinde olan renkli katyonlar ve anyonlar oluşturmak üzere
solusyonlarda iyonize olmalıdır. Tipik bir bazik boya histolojide kullanılan pH oranlarında pozitif yüklüdür
(Katyonik) , asidik boya ise negatif yüklüdür (Anyonik). Amfoterik bir boya ise PH ranjında yüksüz
noktaya (izoelektrik nokta) sahiptir ve bu pH' nın altında bazik, üstünde ise asidiktir
Tablo : Bazik, Asidik, ve Amfoterik Boyaların İyonizasyonu
41
pH 3 4 5 6 7 8 9 10
KRİSTAL VİYOLE + + + + + + + + Bazik boya ( Katyonik)
ORANGE G - - - - - - - - - - Asidik boya (Anyonik)
HEAMATEİN + + + + - - - - Amfoterik boya
Aynı şekilde elektrik yüklü gruplar proteinlerde ve dokuların diğer kompenentlerinde bulunur.Alalede
pH ranjında doku kısımları boyalara benzer olarak asidik, bazik veya amfoteriktir (Tablo ). DNA, RNA ve
fosfolipid, fosforil gruplarından dolayı asidik; mast hücreleri, kıkırdak ve bezlerin bazı mukoz salgıları ise
asidik sülfüril ve karboksil grupları içerirler. Kollajen, eritrositler ve eozinofillerin granülleri bazik amino
gruplarının baskın olmasından dolayı bazik tirler. Halbuki hücre sitoplazmasının amfoterik proteinleri ve
kasta asidik karboksil ve hidroksil grupları ve bazik amino grupları arasında bir denge mevcuttur. pH' daki
küçük değişiklikler dokulardaki amfoterik maddeleri asidik veya bazik yapar; daha büyük değişiklikler ise
bazik veya asidik doku kompenentlerinin elektrik yüklerini değiştirir.
Tablo : Doku Kompenentlerinin İyonizasyonu
BAZİK(+) ASİDİK(-) AMFOTERİK
kollojen DNA, kromatin Sitoplazma, kas
eritrosit RNA
eozonofillerin Miyelin, kıkırdak,
granülleri Mukoz salgılar,
Mast hücre granülleri
A-Boyamadaki Fiziksel Reaksiyonlar: Boyalar dokularla, katı maddelerin bir özelliği olan absorbsiyon
ile birleşebilir ve özellikle ince kesi durumlarında onları çekerek serbest yüzeylerinde diğer maddeleri
tutarlar. Böyle boyalar suda veya alkolde differansiye olurlar. Önemli olan fiziksel faktörler dokuların
densitesi ve permiabilitesi dir. Her birim hacim başına fazla miktarda protein zincirine sahip dens doku
maddeleri fazla miktarda boya alır ve bu dens dokular daha az dens dokular differansiasyonla deklorize
edildikten sonra renkli kalacaklardır. Benzer olarak çok geçirgen dokular hızla boyanacaktır ve hızla
differansiye olacaktır. Daha az geçirgen olan maddeler boyayı almak için daha uzun süreye gereksinim
duyacaktır. Ayrıca differansiasyona da daha dirençli olacaktır. Sıkı dokunmuş dokular, incelikle boyanın
penetrasyonuna, daha sonra boyanın differansiasyonuna dirençli moleküler protein zincirlerin sıkı bir
şebekesine sahiptir. Bundan başka, doku maddeleri yaşa bağlı permiabilitelerini değiştirebilirler; Farklı
yaşlardaki fibrin için boyama yöntemleri açıklamışlardır. Fibrinin ince yapısı fibrin yaşlanırken daha açık
42
hale gelir. Böylece büyük moleküllü boyaları daha fazla tutar. Bu prensip aynı zamanda amyloid
boyanmasına da uygulanmıştır. Boya boyanması bazen çözünebilirlik nedeniyledir. Bunlara en iyi örnek
Sudan yağ boyalarıdır. Boyama genellikle boya ve doku yapıları arasındaki fiziksel ve kimyasal
afinitelerinin bir karışımı sağlanır.
BOYAMA YÖNTEMLERİNİN BİLİMSEL KONTROLU
Histolojik boyamanın kesin kimyasal reaksiyonlarla başarılabildiği gösterilmiştir, fakat daha az
kesinlik kazanmış kimyasal ve fiziksel proceslerle başarılmaktadır. Bu; boyama yöntemlerinin çok sayıdaki
farklı faktörlere göre oldukça değişeceği anlamına gelmektedir. Bu aynı zamanda geliştirilen boyama
tekniklerinin çokluğunun nedenini ortaya koymaktadır. Fakat her histoloğun bu yöntemlerde başarısızlığa
uğradığı olmuştur. Bunun nedenleri şunlar olabilir:
l-Dokuların reaktif olmaması,
2-Uygun olmayan fiksasyon,
3-Boyaların kompozisyonundaki ve çözünürlüğündeki farklılıklar,
4-Yetersiz olgunlaşma veya bozulma {boya solusyonunun),
5-Boyanın ve çeşme suyunun PH' sındaki veya ısısındaki değişmeler,
6-Birçok diğer faktör olabilir.
Boyamadaki bilimsel kesinliğin eksikliği, histoloğun en iyi sonuçları elde etmek için kendi
yöntemlerini kontrol etmesi gerektiği anlamına gelmektedir. Eğer çeşme suyunun pH' sı veya yapısı
değişirse veya iklimsel durumlar farklıysa, bir ülkede iyi çalışan bir yöntem diğer bir ülkede hatta aynı
ülkenin bir başka bölümünde tatminkar olmayabilir. Bir boyama yönteminde verilen direktifler dikkatli
olarak takip edilmelidir ancak değiştirilemez diye de düşünülmemelidir. Laboratuvar, özel doku
elementleri, patolojik değişiklikler, bakteriler, metaller gibi maddeleri içerdiği bilinen dokuların kapatılmış
boyanmamış parafin kesitlerin bir stoğunu bulundurmalıdır. Bunlar kontrol kesitler olarak kullanılmalıdır.
İncelenecek kesitle aynı anda ve aynı yolla boyanmalıdır. Bu kontroller, glikojen veya asit-fast basiller gibi
özel yapıların boyanmasındaki aksiliklerden uzak kalır ve sonradan dokunun glikojen veya asit fast basiller
içerip içerrnediği mi yoksa tekniğin mi yetersiz olduğunu söylernek mümkün olamaz. Kontrol kesitine bir
göz atmakla buna karar verilecektir. Her laboratuvar çalışanı bir tekniğin kontrol edilmiş varyasyonlarını
yapma becerisinde olrnalıdır. Bir boyama yönteminin rastlantılara dayanan çok sayıdaki farklı şekilleri,
şans eseri mükemmel sonuçlar verebilir fakat sonradan genellikle tekniği tekrar etmek mümkün değildir.
Aynı doku bloğundan çok sayıda kesit alınmalı ve yöntemin her basamağındaki değişikliklerin bir serisi,
teker teker ve her kesitte sadece bir değişiklik yapılarak yapılmalıdır. Tekniğin geri kalan bölümünü sabit
tutarak, bu kesitlerle yöntemin hangi kısmında bu kesitlerin kusurlu olduğu ve nasıl düzeltilebileceği
görülecektir. Ara sıra normal dokularda ve laboratuvardaki kontrol kesitlerde sezilebilir miktarda
bulunrnayan nadir bir patolojik değişikliği veya yabancı bir maddeyi boyamak gerekir. Bu durumlarda bir
43
suni doku bloğu incelenecek maddeyi içeren jelatinden yapılabilir veya materyel bir laboratuvar hayvanına
enjekte edilebilir ve dokular kontrol kesitler olarak kullanılabilir.
HEMATOXYLİN-EOZİN BOYASI
Histolojik preparasyonlar için ençok kullanılan boyalar hemotaxylin ve eosin boyalarıdır. Buna
kısaca H.E. boyası denir. Hemotoxylin bazik bir boya olarak kabul edilirse de kendisi bizzat boya
değildir. Boya olarak tesir etmesi için zincirlerinden birinde bulunan guioid' in hematein' e okside olması
lazımdır. Hemotaxylin hematein'e okside olması sulu bir solusyon içinde bir aydan fazla bir zamana ihtiyaç
gösterir. Oksidasyon, sodium iodate veya mercuri choloride ilave etmekle hızlandırılabilir. Fakat hematein'
in ileri bir oksidasyonunda solusyon boyanma yeteneğini kaybeder.
Hematein zayıf , anyon yüklü, kırmızımtrak sarı bir boyadır. İzoelektrik noktası takriben 6.5' tur.
Zayıf bir boyadır. Fakat bir mordant ile kullanılırsa koyu ve devamlı bir boya olur. Mikroteknikten
hemateinle mordant olarak kullanılan maddeler genellikle aluminum ve demir tuzları, aluminum ve demir
şaplar. ( alum) dır. En çok kullanlan şaplar
Potasyum alum : K2S04Al2 (SO4)3 24 H2O
Ammonium alum : (NH4)2 SO4'A12 (SO4)324 H2O
Demir alum : (NH4)2SO4 Fe2(SO4)324 H20 dur.
Aliminum ile demirin verdiği renk morluğu birbirinden farklıdır. Aluminyum mavi-mor bir renk verir.
Suda erir,dokuya temas ettikten sonra ne su ne de etil alkol onu tekrar çıkartabilir. Aluminyumla hematein,
bazik boya gibi etki eder (yani katyonik bir boya vazifesi görür). Demirli hematein ise siyah veya lacivert
renk verir , fakat etkisi birincisi kadar basit değildir. Rutin teknikte, kesitler önce mordantlanır sonra boya
ile ( hematein) muamele edilir, fazla mordant solusyonda differansiye edilir. Bu şartlar altında hematein
bazik boya olarak tesir eder.
Eosin: Eosin, fluorescein' in tetra broma türevidir. Zayıf asidik anyonik bir boyadır.
Hemataxylin-Eosin boyası ile hücre ve doku elemanları aşağıda gösterildiği gibi boyanır.
Çekirdek Mavi,siyah ve koyu mavi
Sitoplazma Pembe
Eritrositler Kırmızı
Kas Kırmızı
Fibröz Doku Açık pembe
Kıkırdak Açıktan koyu maviye kadar renk tonlarında
Mükoz Mavimtrak ( metakromatik)
Kalsifiye Doku Koyu mavi
Protein çökelekleri Pembe
ödem sıvısı)
44
Bakteri toplulukları Koyu mavi
Çekirdeklerin mavi-siyah renkte boyanmasının nedeni polianyonik DNA konsantrasyonunun fazla
olması ve bazik hematein-mortantla kuvvetli bir şekilde etkilenmesidir. Durum kıkırdakta da aynıdır.
Yalnız burada anyonik glikozaminoglikan daha yüksek konsantrasyondadır. Sitoplazma, her ne kadar
pembe olarak tarif edilirse de mikroskopta maviye çalar pembe tonda görülmektedir. Sitoplazmadaki RNA
hematein-mortantla birleşerek bu rengi alır. Eğer RNA çoksa mavilik daha belirgindir. Aynı durum
anyonik polisakkaritlerden zengin mucin salgılayan hücreler için de sözkonusudur. Böylece diğer
subselüler ve doku elemanlarının kimyasal yapısını gözönüne alarak bunların değişik renk alış nedenlerini
açıklıyabiliriz.
1-HEMATOKSİLEN BOYA ÇÖZELTİSİ
Harris' s Alum haematoxylen 5.0 gr
Absolu alkol 5 0 cc
Aliminyum amonyum sulfat 100 gr
Distile su 1000. 0 cc
Merkurik asi t ( oksi t ) 2.5 gr
Hematoksileni alkol içinde hafif ısı yardımıyla erit. Alumu ısı yardımıyla distile su içinde erit. Herbiri
tamamen eridikten sonra iki solusyonu bir geniş erlenmayer içinde karıştır. Karışım süratle kaynar hale
getir, ateşi söndür. Kabarcık1ar çıkarken merkurik oksiti yavaşca (azar azar) ilave et. Çözelti koyu mor
renk alınca cam kabı soğuk su altına (dıştan) tutarak çözeltiyi soğut. Soğuyunca boyama için hazırdır.
Fakat 2-3 gün kalsa daha olgunlaşır. Olgunlaşma, cam kabın ağzı gevşekce kapatılıp güneş ışığı alan bir
yere bırakılarak sağlanır. Olgunlaşmış çözelti, koyu renkli şişelere alınıp, ağzı sıkıca kapatılarak karanlık
yerlerde saklanır.
2-ERLİCH ASİT HEMATOKSİLENİ
Hemotoksilen 6.4 gr
Ammonium alimunyum sulfat 40 gr
Etil alkol 322 ml
Gliserol 322 ml
Distile su 322 m1
25C'de 6-8 hafta beklenilir. Hemen olgunlaştırmak için 0.64 gr sodyum iodat eklenir.
3-ERLICH HEMATOKSİLENİ
Hemotoksilen 4 gr
45
% 95 Alkol 200 cc
Distile su 200 cc
Gliserin 200 cc
Amonyum veya potasyum aluminyum 6 gr
Glacial asetik asit 20 cc
2 hafta veya daha fazla süre hava ve ışığa açık tuturak olgunlaştır. Hemen kullanmak istenirse 0.6 gr
sodyum iodat eklenir.
4- %1 ‘lik ALKOLİK EOZİN
Eozin Y 10 g
Distile su 50 ml
Eozini distile suda erit, % 95’lik etil alkolden 940 ml ilave et. Bu eozin stok olarak kalır ve eşit miktarda
% 95 etil alkol ilavesi ile kullan.
5-% 0.5 lik Sudaki EOZİN
Eozin Y 5 g
Distile su 1000 cc
Eozini suda erit. Koyu ton arzu edilirse her 100 cc’lik solusyon için 0.5 cc glacial asetik asit ilave edilir.
6-HARRİS ALUM HEMATOKSİLENİ
Hematoksilen 5 g
Absolu alkol 50 cc
Alkolde ısıtalarak eritilitr.
Amnium veya potasyum alum 100 g
Distile su 1000 cc
Suda ısıtarak alumu erit. Soğutulan 2 karışım birbirleri ile karıştırılıp tekrar süratle kaynayana kadar ısıtılır
ve alev üzerinden alınır. Sonra yavaş yavaş mercury oksit ilave edilir ve tekrar ısıtılır. Menekşe rengini alır
almaz soğuk su bulunan kap içersine oturtulur. Boya kullanılacağı zaman % 4 asetik asit glasiyal eklenir.
7-EOZİN
Eozin yellowish 1 g
Distile su 100 cc
Thymol 1 küçük kristal
8-ERLİCH HEMATOKSİLENİ
Hematoksilen 80 g
Alkol (% 95) 2400 cc
Potasyum alum (Alimunyum potasyum sulfat ) 240 g
Distile su 1200 cc
Glycerol 1200 cc
46
Glasiyal asetik asit 120 cc
1-Ksilol 30 dk.
2-Ksilol 30 dk.
3-Absolü Alkol Çalkalama
4-% 95’lik etil alkol Çalkalama
5-% 80’ lik alkol Çalkalama
6-% 70’ lik alkol Çalkalama
7-% 50’lik alkol Çalkalama
8-% 30’ luk alkol Çalkalama
9-Distile su Çalkalama
10-Hematoksilen 5-8 dk
11-Akarsu
12-Asit-Alkol Daldırıp-çıkarma
13-Akarsu
14-Amonyak 30 saniye
15-Akarsu
16-Eozin 3-5 dk
17-% 30’ luk alkol Çalkalama
18-% 50’lik alkol Çalkalama
19-% 70’lik alkol Çalkalama
20-% 80’ lik alkol Çalkalama
21-% 95’lik etil alkol Çalkalama
22-% 100’lük etil alkol Çalkalama
23-% 100’lük etil alkol Çalkalama
24-Ksilol
25-Ksilol (1 gece bekletilirse iyi olur)
Hematoksileni alkolde çözün. Alumu sıcak su içinde çözüp gliserolü ekleyin, soğumaya bırakın. Azar azar
aluma hematoksileni ekleyerek karıştırın. Bu solusyon temiz bir kapta olgunlaşmaya bırakılır. Ağzı
hafifçe kapatılır. Olgunlaşma 6-8 hafta sürer ve solusyon boyama özelliğini yıllarca korur. Hematoksilende
45 dk. boyanır.
9- WEİGERT HEMATOKSİLENİ
Solusyon A: Hematoksilen 1 g
Alkol 100 cc
4 hafta olgunlaştırılır.
Solusyon B:
% 30 luk ferrik klorür-sulu 4 cc
47
Konsantre HCl 1 cc
Solusyon A ve B den eşit miktarda karıştırılıp 30 dakika içinde kullanılır ( 15-20 dak)
10-HEİDENHEİN HEMATOKSİLENİ
Demir Alum Çözeltisinin Hazırlanışı
Ammonium ferric sülfat 5 gDistile su 100 cc
Hematoksilen Çözeltisinin HazırlanışıHematoksilen 0.5 gAbsolü alkol 10 ccDistile Su 90 cc 4 hafta olgunlaşmaya bırakın
Uygulama
1-Kesitler suya indirilir2-Demir alumda 30 dakika –24 saat arasında bırakılır3-Akar suda çalkalama4-Heidenhein hematoksilende 30 dakika –24 saat arasında boyanır.5-Suda çalkalayın6-Demir alumda 1-30 dk. mikroskopla kontrol edilerek differansiye edilir.7-En az 10 dk. akar suda yıka8-Karşıt boyalar Van Gieson ve modifiye şekilleridir.
11-CARAZZİ HEMATOKSİLENİHematoksilen 0.5 gGlyserol 100 ccAluminyum potasyum sulfat 25 gDistile su 400 ccPotasyum iodat 0.1 g
Hematoksileni gliserol ile karıştırın. Isı kullanmadan distile suda potasyum alumu çözün. Çözünme uzun
zaman alabilir. Hematoksilene alumu karıştırarak yavaş yavaş ekleyin. 10 cc suda potasyum iodatı iyice
karıştırarak çözün. 4-6 ay boyunca solusyon boyanma özelliğini korur.
HEMATOKSİLEN - EOZİN BOYA TEKNİĞİ
1- Ksilol 30 Dakika
2- Ksilol 30 Dakika
3- Absolü Alkol Çalkalama % 100 Alkol
4- %95'lik Alkol Çalkalama
5- %80'lik Alkol Çalkalama
6- %70 'lik Alkol Çalkalama
7-%50' lik Alkol Çalkalama
8-%30' luk Alkol Çalkalama
9- Dis ile su Çalkalama
10-Hematoksilen Çalkalama
48
11- Akarsu Çalkalama
12- Asit- Alkol Daldırıp çıkarma
13- Akarsu Çalkalama
14- Amonyak 30 saniye çalkalama
15- Akarsu Çalkalama
16- Eozin 3-5 dakika
Suda çalkalama
17- %30 'luk Alkol Çalkalama
18- %50'lik Alkol Çalkalama
19- %70'lik Alkol Çalkalama
20- %80'lik Alkol Çalkalama
21-%95'lik Alkol Çalkalama
22-Absolü Alkol (%100 Alkol) Çalkalama
23- Ksilol 30 dakika
24- Ksilol (Bir gece bekletilirse daha iyi şeffaflanır.)
Asit-Alkolün Hazırlanışı
% 80’lik etil alkol 500 cc
Hidroklorik asit 5 cc
Amonyağın Hazırlanışı
Distile su 500 cc
Amonyak 5cc
8-KAPATMA (Mounting)
Boyanan kesitler 1 damla Kanada balzamı veya entellan damlatarak lamel kapatarak kurumaya
bırakılır. Bu maddeler hem mikroskopta kolay incelenmeyi sağlar hem de boyanmış kesitlerin yıllarca
korunmasını sağlar
RUTİN EL TAKİBİ ( 3-5mm kalınlığındaki bloklar için)
1- Tespit
2- Eğer gerekli ise suda yıkamak
3-%70'lik alkolde gün boyunca (3-8 saat)
4- % 90' lık alkolde bir gece (16 saat)
5- Absolu alkol I de iki saat
6- Absolu alkol II de üç saat
7- Absolu alkol III de üç saat
8- Toluene veya kloroform da gece boyunca ( 16 saat )
9- Her birinde birer saat olmak üzere üç kez erimiş parafinden geçirmek}:
49
10-Parafine gömmek
HIZLI EL TAKİBİ ( 3 mm den kalın olmayan bloklar için )
1- Carnoy- fiksatıtifinde 30- 60 dakika tespit
2- Absolu alkol I de 30dk
3- Absolu alkol I de 30 dk
4- Absolu alkol III de 30 dk
5- Ksilen veya. toluenle 15- 30 dk ( şeffaflanıncaya kadar )
6- Vakum fırınında herbirinden yirmişer dk. olmak üzere üç kez erimiş parafinden
geçirme
7- Gömme
RUTİN OTOMATİK TAKİP ( 3-5 mm kalnlığındaki bloklar için )
1- %70' lik akolde üç saat
2-% 90' lik alkolde üç saat
3- Absolu alkolde ( I'de ) 1 saat
4- Absolu II'de 1 saat
5- Absolu alkol III ' de 2 saat
6- Absolu alkol IV de 2 saat
7- Toluen I' de 1.5 saat
8- Toluen II' de 2.5 saat
9- Erimiş parafin I' de 3 saat
10- Erimiş parafinde II ' de 3 saat
11-Gömme
Toplam: 22 saat
48 SAATLİK OTOMATİK TAKİP (3-5 mm kalınlığındaki bloklar için )
1-% 10’ luk formal salin 4 saat
2-% 10’ luk formal salin 4 saat
3-% 70 lik alkol 4 saat
4-% 90’lık alkol 4 saat
5- Absolu alkolde I'de 4 saat
6- Absolu II'de 4 saat
7- Absolu alkol III ' de 4 saat
8- Absolu alkol IV de 4 saat
9-Kloroform I 4 saat
10-Kloroform II 4 saat
50
11-Erimiş parafin I 4 saat
12-Erimiş parafin II 4 saat
EL İLE HIZLI TAKİP
1-Bouin fiksatifi ile tespit 6-7 saat
2-Çeşme suyunda yıkama
3-% 70’lik alkol 60 derecelik etüvde 1 gece
4-% 96’ lık alkol 60 derecelik etüvde 1 saat
5-% 96’ lık alkol 60 derecelik etüvde 1 saat
6- Absolu alkolde ( I'de ) 60 derecelik etüvde 1 saat
7- Absolu II'de 60 derecelik etüvde 1 saat
8- Ksilol 60 derecelik etüvde 1 saat
9-Ksilol 60 derecelik etüvde 1 saat
10-Parafin 60 derecelik etüvde 1 saat
11-Parafin 60 derecelik etüvde 1 saat
12-Gömme
EL İLE HIZLI TAKİP
1-Tamponlanmış nötral formalin ile tespit
2- %50‘lik alkol 60 derecelik etüvde 30 dakika
3-% 70’lik alkol 60 derecelik etüvde 30 dakika
4-% 80’lik alkol 60 derecelik etüvde 30 dakika
5-% 96’ lık alkol 60 derecelik etüvde 1 saat
6-% 96’ lık alkol 60 derecelik etüvde 1 saat
7- Absolu alkol I 60 derecelik etüvde 1 saat
8- Absolu II 60 derecelik etüvde 1 saat
9- Ksilol 60 derecelik etüvde 1 saat
10-Ksilol 60 derecelik etüvde 1 saat
11-Parafin 60 derecelik etüvde 1 saat
12-Parafin 60 derecelik etüvde 1 saat
13-Gömme
PARAFİN TEKNİK ( SCHEFIELD UNİVERSİTESİ ) (3-4 m’lik )
1- Fiksasyon
2- % 70’lik etil alkol 2 saat
3- %80’ lik alkol 1 saat
4- % 90’lık alkol 1 saat
51
5- % 100’ lük alkol 1.5 saat
6- %100’ lük alkol 1.5 saat
7- Kloroform 1 gece
8- Kloroform 1.5-2 saat
9- Erimiş parafin 1.5 saat
10- Erimiş parafin 1.5 saat ( vakumla )
11- Gömme
JB-4 TEKNİĞİ
Sert bloklardan veya geniş yüzeyli bloklardan daha ince kesitler alınmasında kullanılır.
JB-4 Gömme Kiti içinde sol A, sol B ve katalizör bulunmaktadır. Polysciences INC-İngiltere’den satın
alınabilir.
1-Formaldehit veya gluteraldehitle fiksasyon
2-İnfiltrasyon Çözeltisi
50 cc JB-4 solusyonu
0.45 gr katalizör
Çeker ocakta, eldivenle çalışılır. Katalizörün erimesi için hafifçe 30 dakika karıştırın .
Gömme Çözeltisi
25 cc katalizlenmiş JB-4 solusyonuna 1 cc JB-4 solusyon B eklenir. Hafifçe çalkalanır ve 10-15
dakika içinde kullanılmalıdır.
Yöntem
1-% 70’lik etil alkol 90 dakika ( az olmayacak )
2-% 80’ lik etil alkol 60*-90 dakika
3-% 90’ lık etil alkol 60-90 dakika
4-% 95’ lik etil alkol 90 dakika ( az olmayacak )
5-% 100’ lük etil alkol 60 dakika
6--% 100’ lük etil alkol 60 dakika
7- Katalizlenmiş sol-A 1 gece
8-Gömme çözeltisine gömülür.
9-Sertleşene kadar (1-2 saat ) beklenir. Kesit alınır.
52
Not: Tüm kit aynı gün açılıp kullanılmalıdır. Dokuyu gömerken eğer büyükse çeker ocakta trimlenir. JB-4
‘ü gömme bloklarına dök, dokuları yerleştir. Üzerine takozları yerleştir. Buzdolabında 1-2 saat polimerize
olmasını bekle.
JB-4 KESİTLER İÇİN ASİT FUKSİN-TOLUİDİN BLUE BOYAMA YÖNTEMİ
1- % 1’ lik sulu asit fuksin 2 dakika
2-Distile suda yıkama 1 dakika
3-% 0.05’lik toluidin blue ( pH=4.4 olan asetat tamponu ile hazırlanmış ) 2 dakika
4-Distile suda yıkama 30 saniye
5-Havada kurutma
6-Entellan ile kapatma
JB-4 TEKNİĞİ İÇİN GEREKLİ ARAÇLAR
KNIFE-MAKER: LKB (BROMMA ) 2078 HISTO KNIFE-MAKER )
1-E.m için kullanılan aynı cam bıçaklar kullanılır.
2-Açı 25 derece olmalıdır (38 derece değil ).
3-Camı 0 ile 5 arasındaki ikinci düğmeye getir ve birinci 0’ a getir ve kes ( Bu son basamaktan önce
bıçağın ters tarafını knife-makere yerleştir ( çevir ).
4-Bıçak hazırdır. Masaya koyduğunda bıçağın keskin kenarı üstte olmalıdır.
JB-4 MİKROTOMU: ( LKB BROMMA ) 2218 HISTORANGE MICROTOME )
1-Kesit kalınlığı 2-2.5 m olmalıdır.
2-Blokları mikrotoma şu şekilde yerleştir.
3-Bıçağı yerleştir. Kesi zonunu ayarla.
4-Blok ve bıçak paralel olmalıdır.
5-Kesit hızı (mm/sec ) sağ taraftan ayarlanmalıdır.
JB-4 PLASTİK KESİTLERDE GLİKOJEN İÇİN PAS BOYAMA TEKNİĞİ
1- % 1’ lik periyodik asit ile 5 dakika
2- İyice yıka ( 1 dakikadan fazla olmasın ).
53
3- Schiff reaktifi ile oda ısısında 15 dakika tut.
4- Akarsu altında 15 dakika yıka.
5- Hematoksilen ile ( Gills Hematoksileni) 2 dakika boya
6- Suda çalkala.
7- Doymuş lityum karbonat ile 1 dakika dokuları mavileştir ( Gerekli değil ).
8- Suda çalkala.
9- Alkol serilerinde dehidre et, kurumaya bırak.
10- Kesitleri ksilol ile muamele et
11- Kapat
Sonuç: Glikojen partikülleri pembe boyanır.
KONTROL KESİTLER İÇİN ( GLİKOJEN SİNDİRİMİ )
1-Her 1 cc distile su için 1 mg -amylase kullan.
2-Kesitleri 37 derecede beta amilaz içine en az 3 dakika (saatler ) bırak.
3-PAS ile boya. Amilaz glikojeni sindirdiği için glikojen olan alanlar ortadan kalkacaktır.
BAZI ÖZEL PREPATATLARIN YAPIMI
1-KAN PREPARATI: Omurgalı kanı iki türlü incelenir.
a-Canlı olarak
b-Tespit edilmiş ve boyanmış olarak
a.Canlı olarak preparat hazırlanması: Doğrudan doğruya parmaktan lama alınan kan incelenir veya %
0.9’luk fizyolojik su içine kan damlatılıp , incelenir. Eritrositler birbirinden ayrıldığı için iyi görülür.
Ayrıca 300 mg Ruj.nötr 100 cm3 saf suda eritilir. Bir damla lam üzerine konur sonra diğer bir lamın kısa
kenarı ile bu sıvı lam üzerine yayılır ve kurutulur. Sonra bir damla kan konur ve lamel kapatılır. Bir süre
sonra kan hücrelerinin bu boyayı alarak çeşitli renklerde oldukları görülür. Eritrositler bu boyayı almazlar.
Sıcak kanlı hayvanların lökösitlerin ameboid hareketlerini görmek için lam hafifçe ısıtılır. Soğuk
kanlılarda oda sıcaklığında bu hareketi görebiliriz.
b- Tesbit edilmiş ve boyanmış olarak: Alkolde temizlenen parmak ucundan sterilize iğne ile çıkarılan kan
temiz bir lam üzerine konur. Başka bir lamın kısa kenarı ile iyice yayılır. Biraz kuruması beklenir, sonra
metil alkol içinde 3 dakika bekletilir. Daha sonra lam üzerine saf su damlatılır. Biraz bekletilir, suyu
akıtıldıktan sonra bir kap içindeki Giemza boyasına konur (10 cc distile su+1 cc Giemsa ). 30 dakika
bekledikten sonra çeşme suyunda yıkanır, kurutulur, incelenir.
2-MİTOZ BÖLÜNME PREPARATI
1- Kuru soğan ya da arpacık soğanı kökleri su içine gelecek şekilde suyun içine konur.
2- Üç hacim absolü alkol+1 hacim glasiyal asetik asit içine uzayan köklerin uç kısımları kesilerek
biriktirilir.
54
3- Bu karışımdan çıkan kökler 3 N HCl içinde 2-3 dakika bırakılır ( 24 cc HCl alınır. 100 cc ye
distile su ile tamamlanır.
4- 100 cc % 50’ lik asetik asit içine 1 gr orcein konur. Asitten çıkarılan kökler boya içinde 1.5 saat
bekletilir.
5- Lam üzerine 1 kök konur. Üzerine 1 damla % 45’ lik asetik asit damlatılır.
6- Üzerine lamel kapatılır. Gazlı bez yardımıyla üstten bastırılarak yayılır ve mikroskopta
incelenir.
3-MAYOZ BÖLÜNME PREPARATI
1-Çekirge testisleri çıkarılır.
2-3 hacim alkol+1 hacim glasiyal asetik asit içersinde 24 saat buzdolabında fikse edilir.
3-Saklamak için % 70 ‘lik alkol kullanılır.
4-Boya 1 gr orcein
100 ml % 50 ‘lik Asetik asit içinde çözülür 30 ‘ dakika
5-% 45 ‘lik asetik asit damlatılıp ezilir.
6-Mikroskopta incelenir.
4-DÜZ KAS PREPARATI ( KURBAĞA MESANESİNDEN )
Araç ve Gereçler
Kurbağa
Şişe mantarı
Lam, lamel, makas, pens, küvet
Bouin, etil alkol, eter veya kloroform
Bouin Çözeltisi
9 gr pikrik asit 75 cc distile suda çözülür ( %74’ lük )
% 40’ lık formol...........25 cc
Glasiyal asetik asit.......5 cc
Bouin taze hazırlanır. Asetik asit buharlaştığından çözeltinin yapısı bozulabilir. İyi saklanırsa uzun
süre kullanılabilir. Mesaneyi iyi fikse ettiği gibi sertleştirerek kolay boyanır hale getirir. Hemalum % 1’
lik suda hazırlanmış olarak kullanılır. Eozinin ise % 70’ lik etil alkolde hazırlanmış % 1 ‘ lik çözeltisi
kullanılır.
Kurbağa bayıltılır. Mesanesi kesilerek alınır. Parafinde kaynatılmış veye doyurulmuş, ortası delik
mantarın delik kısmı üstüne iğne ile gerilir. Bouin çözeltisine aktarılır. Mesane alt yüzeyde olmalı ve
Bouin ile temas etmelidir. 1-2 saat sonra mesane sarı renk alır ve sertleşir. % 70’ lik alkole aktarılır.
Objenin rengi giderilinceye kadar alkol değiştirilir. Sonra hemen hematoksilen ile istenilen mor renk
alınıncaya kadar boyanır. Eozin ile 15 dakika boyanır. % 70-90-100’lük etil alkollerde 10’ ar dakika
dehidre edilir. Ksilolde 5 dakika tutulur. Pensle çıkarılan materyel filtre kağıdı üzerine alınır. Mesane
küçük parçalara ayrılarak lam üzerine alınır. Entellan damlatılarak lamel kapatılır. Kurutulur ve incelenir.
55
5-ÇİZGİLİ KAS PREPARATI (Çekirgeden): Çekirgenin abdomeni açılır. 2 kas demeti görülür.
Steromikroskop altında kas çıkarılır. % 0.6’ lık fizyolojik sıvıya konur (NaCl ile hazırlanmış ). Buradan 1
hacim asetik asit+3 hacim % 96’ lık etil alkol içeren tespit çözeltisine aktarılır. Burada demet halindeki
kaslar iğne veya pensle küçük parçalara ayrılır. 1 kas lifi lama alınır. Üzerine 1-2 damla asetocarmin
damlatılır, 1-2 dakika beklenir. Üzerine lamel kapatılır ve hafifçe bastırılır. Sonra lamelin bir tarafından
asetocarmin çekilip diğer taraftan % 96’ lık alkol eklenir. Bu işlem 2 defa tekrarlanır. Lameli yavaşça
kaldırıp 1 damla kanada balzamı veya entellan damlatılır ve lamel kapatılır. Bu işlemlerin lamel
kapatılarak yapılmasının nedeni kas üzerinde baskı yapmaktır. Baskı olmadığı zaman kas büzülür.
6-KEMİK PREPARATI
Araç ve Gereçler
% 5- % 7.5’ lik Nitrik asit ( 100 cc % 65’lik nitrik asit+1200 cc distile su)
% 5’ lik sodyum sülfat
Etil alkol
Kreozot (karanfil yağı )
Uzun kemik (3-5 cm boyunda )
Preparasyon 2 teknikle yapılabilir.
1-Yumuşatma: Gerekli maddeler bulunduğu takdirde daha kolay ve uygun bir tekniktir.
2-İnceltme: Daha çok el becerisine dayanır.
a-Kemiğin yumuşatılarak preparat hazırlanması: Uzun kemik parçasının üzerindeki yağ, kas
kısımları bistüri ile temizlenir. Kemiğin anorganik yapısını eritmek için % 5 veya 7.5 lik seyreltilmiş
nitrik asit içine konur., 24-48 saat bırakılır. Sık sık çalkalanır. 5 saatte bir çözelti tazelenir. Kemikler
jiletle kesilecek kadar yumuşayınca çıkarılır.. 24-48 saat kadar % 5’lik sodyum sülfat içinde bırakılır.
Sonra asitin giderrilmesi için çeşme suyunda 1-2 gün yıkanır.
Keskin jiletle yumuşamış ve yıkanmış kemikten çok ince kesitler alınarak % 50 ve % 70’ lik alkol
bulunan petri kaplarında 10-60 dakika bekletilir. Kreozot içine alınarak 15-20 dakika şeffaflandırılır.
Temiz bir lam üzerine alınan kemik kesiti üzerine entallan damlatılarak lamelle kapatılır.
Kesitler düzgün ve yeterli incelikte alınmışsa Havers kanalları ve konsantrik lameller izlenir.
Boyuna alınan kesitlerle de Volkman ve Havers kanalları ve lameller izlenir. Mikroskopta inceleme
yaparken diyafram kısılırsa daha iyi görüntü alınır.
b-Kemiğin inceltilmesi ile preparat yapımı: Uzun kemiklerden kemik testeresi ile enine parçalar
kesilir. Bunlar döner zımpara taşlarında ( elektrikli veya kolla dönen ) mümkün olduğu kadar inceltilir.
Daha sonra kesilen bir tahta üzerine koyarak ince dişli demir eğici ile çalışarak inceltmeye devam edilir.
Bu arada kesitler incelendikce daire şeklindeki kesitten kopmalar olur. Kopan parçalar ponza taşında tekrar
inceltmeye devam edilir. Ponza taşı üzerinde düzgün bir yüzey elde edilir. Bu yüzey üzerine su damlatılır.
Ve kesitler parmak ucu ile taş üzerine sürtülerek daha da inceltilir.
56
Parmak ucunda tutulan kesitlerden parmağın izleri görünüyor ise kemik parçaları yeteri kadar incelmiş
demektir.
İnceliği uygun görülen kesitler 5-10 ‘kadar HNO3 de bekletilir. Sonra damıtık suda birkaç değiştirme
ile iyice yıkanır. Filtre kağıdından suları süzülür. Dikdörtgen veya kare şeklinde kesilerek lama yerleştirip
lamel kapatılır.
Kesiler saydam olduğu için kanada balzamının ksilol ile seyreltilerek kullanılması tercih edilir.
7-KIKIRDAK PREPERATI
Kurbağanın ön ve arka ekstremitelerinin eklem yerlerindeki kıkırdak kullanılır. Hayvan eter veya
kloroformla bayılttıktan sonra ekstremitlerinden biri eklem yerinden kesilir. Kasları kemikten ayrılır.
Temizlenmiş olan kemik fizyolojik suya konur (%0.8 NaCl).
Keskin bir jiletle uzun kemiklerin uçlarındaki mavimsi renkli kıkırdaktan ince kesitler alınıp, fizyolojik
suda lamel altında incelenir. Kıkırdak ara maddesi bu bölgede homojendir.
a- Kapsülde genellikle bir kıkırdak hücresi bulunur. Ara maddeleri açık gri kapsül beyaz renkli ,
plazma ve nukleus mavimtrak görünür. Bunu boyamak için Karmin- Asetik Bunu boyamak için
Karmin -Asetik asit kullanılır. Bu boya fiksatiftir. Onun için kesit lam üzerine konan 1-2 damla
asetokarmin içinde 1-2 dakika bekletilir, lamel kapatılır. Bu arada materyal tespit edildiği için
hücreler büzülür. Nukleus kırmızı, plazma pembe boyanır. Kapsül ve ara madde az boyanır veya
hic boyanmaz.
Preparatın devamlı olması için : Boyanan kesit % 96 lık alkolde 5 dakika tutulur. Sonra kreozt veya
karanfil yağı içine konur. En fazla yarım saatte bu kesiler şeffaflaşır. Temiz bir lama bir damla Kanada
balzamı veya entellan damlatılır. Kesit bunun üzerine yerleştirilir ve lamel kapatılır.
b- Kıkırdak pikrik asit içermeyen herhangibir fiksatif içinde tespit edilir. Sonra iyice yıkanır. Aşağıda
formülü verilen Von Wijre boyasında 24 saat boyanır.
%70’ lik etil alkol.......................100 cc HCL.............................................0.1 cc Toluidin mavisi ........................ 0.1 gr
Boyadan sonra % 70 alkol içinde (0.001 HCL li) hiç boyası çıkmayıncaya kadar kalacak, % 70-80 -90-
100 alkol serilerinde dehidrasyon yapılarak şeffaflaştırıcı (kreozot) içine aktarılır. Lam üzerine alınınca
1 damla Kanada balzamı veya entellan eklenerek lamel kapatılır.
8- KURBAĞA DERİSİ
1- Kurbağanın sırt derisi kesilerek delikli bir mantar üzerine gerilir. Bouin de 3-4 saat tesbit edilir.
İğneleri çıkartılarak ufak parçalara bölünür. Sarı rengi giderilinceye kadar % 70 alkolde yıkanır.
2- % 80’lik etil alkolde 1 saat
57
3- % 90’lik etil alkolde 1 saat
4- % 100’ lık etil alkolde 1 saat
5- Ksilol + %30’luk alkolde 15-30'
6- Ksilolde 30 dakika
7- Ksilol+parafinde 30 dakika
8- Etüvdeki parafinde 24 saat
9- Bloklanır. Daha sonra mikrotomda 12 m’lik kesitler alınır. Kesitler bir gün bekletilir.
10- Ksilolde 5-10 dakika
11- Alkol serilerinde (% 100-96-80-80 ) beşer dakika
12- Hematoksilen
13- Akarsuda 15 dakika boyama
14- Eosin (Eosin su ile yapıldıysa akarsudan sonra . %80’ e kadar alkol serilerinden geçirilir sonra eosinle
boyanır ).
15- % 96 - %100’ lik alkol 1-2 dakika
16- Ksilol 2-3 dakika
17- Kanada balzamı ve lamel kapatılması
9-DEV KROMOZOMLARIN PREPARATI: Bu teknikte absolü metil alkol sadece tespit ve lamel
kapatma sırasında çözücü olarak kullanılır. Ringer çözeltisi içine alınan ganglion veya tükrük bezi temiz
bir lam üzerine alınır. Üzerine 1 damla % 45’ lik asetik asit eklenerek 3-4 dakika tespit edilir. Fazla
tutulursa parçalanır. Lamel kapatılır. Fiksatifin fazlası emdirilir.
Kullanılan lam daha önceden albümin veya başka bir yapıştırıcı sürülmüş ve kurutulmuş olmalıdır.
Lam ve lamel içinde alkol bulunan bir kaba aktarılır. 12 saat ya da daha fazla bekletilir. Lamel
kendiliğinden düşmemişse ince bir iğne yardımı ile lamel alınır. Üzerine tükrük bezi yapışmış lam alkolde
doyurulmuş amonyum ferri sülfat bulunan kaba taşınır. 12 saat bekledikten sonra biraz hematoksilen
kristali boyaya aktarılır. Alkol banyosundan sonra 5-10 dakika alkolde doyurulmuş lityum karbonat
çözeltisinde bekletilir. Kırmızı bir boyama yapılacaksa 1-3 saniye alkolik eozinde ( 100 cc % 90’ lık
alkol+ 0.5 gr eosin ) bekletilir. Entellan damlatılarak lamel kapatılır.
LABORATUVARDA KULLANILAN BAZI ÇÖZELTİLER
A-Cam Kapları Yıkamak İçin
Cam eşyadaki kaba kir bildiğimiz gibi sabun veya herhangibir temizleme
tozu ve sıcak su ile temizlenir.Saf su ile çalkalanır ve kurutulur
Reçine ve parafin ile kirlenmiş camlar önce toluen veya ksilol ile
yıkandıktan sonra sıcak su ve sabun ile yıkanmalıdır. Bu nedenle
boyalarda kullanılan artık ksilol veya toluol saklanmalıdır. Erimeyen
58
organik kalıntılar, boya çöküntüleri veya metalik tuzlar cam kaplar
aşağıdaki çözeltilerle temizlenebilir.
1-Potasyum dichromate-sulfuric acid temizleme sıvısında yıkayarak
temizlenir. Bunun için birkaç dakikadan birkaç güne kadar bu sıvıda
bırakılır. Daha sonra asit kalıntısını kaldırmak için su ile iyice yıkanır.
Potassium dichromate 200 gm.
Su 1 litre
Konsantre Sulfuric asit 750 cc
Çözeltiyi sıcağa dayanıklı bir cam kavanozda yap. Önce potassium
dichromate’ı suda erit, çabuk erimesini istiyorsan ısıt. Soğuduğu
zaman, bir taraftan cam bir çubuk ile karıştır ve sülfirik eşiti yavaşça
ilave et. Isı yükselecektir. Koyu yeşil oluncaya kadar birçok defa
kullanılabilir.
2-Potasyum bikromat...................60 gr
Sülfürik asit..............................1000 cc
3-Potasyum permanganat...............10 gr
Sodyum hidroksit.......................10 gr
Distile su....................................100 cc
4-Kral Suyu
Hidroklorik asit..........................3 birim
Nitrik asit...................................1 birim
B-Lam ve Lamellerin Temizlenmesi: Yeni lam ve lameller % 90 veya 95’lik
alkolde bırakılır, sonra buradan teker teker alınan lam veya lameller temiz
eski bir mendil veya pamuklu bir bez ile iyice kurulanır Temizliğini kontrol
için pipet ile üstüne su damlatılır. Su dağılırsa lam ve lameller
temizlenmiştir, su damla halinde kalırsa halen kirli demektir. Böyle camları
temizlemek için 15 dakika kadar yarı yarıya eter ve saf alkol karışımına
bırakılır. Kullanılmış lam ve lameller- Eğer üzerlerine balsam ve sakız
yapışmamışsa sıcak su ve yıkama tozları ile iyice yıkanır ve suda
çalkandıktan sonda % 90 veya 95’lik alkolde bırakılır. Silinip
kurutulduktan sonra kullanılmağa hazırdır. Lam ve lameller bu yöntemle
temizlenmezse bir veya iki gün temizleme solusyonunda bırakılır sonra suda
59
yıkanır ve ammonium hidroksit ile alkalize edilmiş suda birkaç saat
bırakılır. Suda yıkanır, alkolde bekletildikten sonra kurulanır. Balsam veya
sakızlı lam veya lamelleri ise bahsettiğimiz yıkamadan önce ksilol veya toluol
içinde bırakmalıdır.
Lamları Jelatinleme Yöntemi
Gelatine powder........................................5 gr
Kalium chrom (III) sülfat rein....................0.5 gr
Distile su................................................... Distile su
LABORATUVARDA KULLANILAN BAZI BOYA ÇÖZELTİLERİ
A-Nötral Red (nötral kırmızısı): Bir şişe saf suya rengi kırmızı oluncaya kadar bu boyadan karıştırınız.
Çözeltinin saydam olması şarttır.
B-Sirke asitli metilen yeşili: 100 cc saf suya 2 gr sirke asidi ve bir miktar da metilen yeşilinden
karıştırınız. Çözeltinin rengi mavimsi yeşil olmalıdır.
C-Karmin - sirke asidi: 45 hacim saf ve yoğun sirke asidini 55 hacim saf su ile karıştırınız. Buna biraz
(örneğin %45 yoğunluğundaki 100 cc sirke asidine 5gr ) saf carmin ekleyin ve dar boyunlu bir cam kap
içinde bir baget ile hafifçe kaynatınız. Çözelti soğuduktan sonra bunu bu filtre kağıdıyla süzünüz ve
damlalıklı şişelerde saklayınız. Filtre kağıdında kalan kısmını tekrar kullanılabilir. Karmin-sirke asidini
ağzı iyice kapanan şişelerde uzun zaman bozulmadan saklanabilir.
LABORATUVARDA KULLANILAN BAZI FİZYOLOJİK SIVILAR
A- Basit tuz eriyiği: Kurbağa için Memeliler için NaCl...............................6,5 gr. NaCl...............................8-9 gr. Saf su .............................1000 cm3 Saf su .............................1000 cm3
B- Ringer eriyiği
Kurba ğa için Memeliler için
Saf su ..........................1000 cm3 Saf su ..........................1000 cm3
NaCl ..................................6gr NaCl.............................. 9gr CaCl2 .............................. 0,2gr CaCl2 .............................0,2grKCl................................... 0,2 gr KCl ................................ 0,2grNaHCO3...........................0,1 gr NaHCO3 ...........................0,1gr
60
NORMALİTE-MOLARİTE
Normalite: Çözeltinin litresindeki eşdeğer gram sayısıdır.
Molarite : Çözünmüş maddenin, çözeltinin litresindeki mol veya formül
gram sayısına denir ve M ile gösterilir.
Konsantrasyon:Çözelti veya çözgenin belirli bir miktarındaki çözünmüş
madde miktarına denir. BU miktarlar amaca uygun değişik
birimlerle ifade edilebilir.
Yüzdesel konsantrasyon: Çözelti veya çözgenin 100 cc veya 100 gramındaki çözünmüş madde miktarıdır. Bir
çözeltinin yüzdesi verildiğinde, genel olarak o çözeltinin 100 gramındaki madde miktarı anlaşılır.
Çözücü : Saf halde bulunan çözücü ( Su, alkol, aseton ).
61
top related