ii - visualiser les molécules dans les cellules vivantes
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II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes
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Généralités
• Techniques de microscopie optiques (les moins traumatisantes)
• Marquage fluorescent des molécules à suivre
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Concentrations ioniques
• Microélectrodes (H+, Na+, K+, Cl-, Ca++) mais pas rapide
• Indicateurs sensibles aux ions– luminescents (aequorine de la
méduse)– fluorescents
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Autres indicateurs fluorescents
• Autres ions
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Injection intra-cytoplasmique de molécules marqueur
• Anticorps• Protéine cellulaire purifiée marquée• Exemple tubuline
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Fig 18-21 tubuline
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Fig 16-12 tubuline
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Injection intra-cytoplasmique de molécules pour bloquer une
fonction• Anticorps anti myosine-II dans un œuf
d'oursin bloque la division sans bloquer la mitose
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Quatre méthodes d'introduction de molécules
dans la cellule
• Microinjection• Électroporation• Vésiculation• Projection à haute vitesse…
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Fig 9-40 (AB)
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Fig 9-40 (CD)
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Molécules captives
• Synthèse d'une forme inactive de la molécule
• Introduction dans la cellule• Activation à un temps et moment
donné par un faisceau lumineux• eg : molécules captives pour Ca++,
AMPc, GTP, IP3
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Fig 9-41 Caged molecules
• La molécule X devient active après le flash d'UV
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Application
• Molécules fluorescentes piégées• Grosse modification de la molécule
qui doit rester active grosse difficulté
• Tâtonnement pour créer de nouvelles molécules
• eg : tubuline
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Fig 9-42 Caged tubuline fluorescéine
• Tubuline rhodamine (rouge)• Dapi ADN (bleu)• Tubuline flourescéine piégée (mélangée aux autres et
invisible avant le rayon d'UV)
Avant UV Après UV juste à gauche de la plaque métaphasique
Après 1,5 mn Après 2,5 mn
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Desai,A1998
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Green Fluorescence Protein
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Fig 9-43 GFP
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GFP 3D
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GFP TopolGFP
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GFP mice
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GFP
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• Isolement• Séparation (FACS)• Culture primaire et secondaire• Milieu de culture• Lignée cellulaire• Transformation• Congélation• Clone• Hybride
III - Culture cellulaire
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Facs
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Hybride cellulaire
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Production AC monoclonaux
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Culture SEM
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Immuno gold en ME
ME Immuno-gold
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• Pulse-chase• Patch-Clamp• Molécules « piégées »• Les anticorps
– immunofluorescence directe– immunofluorescence indirecte
Pistage de molécules dans la cellule
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Fig 9-46
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Fig 9-47
Autoradiographie en microscopie électronique
5 mn de pulse de 3HLeucine dans cellules B de pancréas
Après 10 mn de chasse Après 45 mn de chasse
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Fig 9-48
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• Techniques biochimiques
IV - Fractionnement des cellules et analyse des
molécules
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