“il monitoraggio delle produzioni nazionali” … · coincidenza con le fasi fenologiche...
Post on 16-Feb-2019
219 Views
Preview:
TRANSCRIPT
1
Contaminazione da tossine di Contaminazione da tossine di FusariumFusarium (DON, T(DON, T--2 e HT2 e HT--2) 2)
nel grano duro nazionalenel grano duro nazionale
Michelangelo Pascale
“IL MONITORAGGIO DELLE PRODUZIONI NAZIONALI”Bologna, 30 Settembre 2010
Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA) - Bari
• FHB è una malattia causata da diverse specie fungine appartenenti al genere Fusarium e Microdochium
• Colpisce frumento, orzo, segale, triticale, mais, sorgo ………
• Condizioni ideali per l’insorgenza della malattia: andamenti climatici piovosi e/o caldo umidi, in coincidenza con le fasi fenologiche comprese tra la spigatura e la maturazione latteo-cerosa
FUSARIOSI DELLA SPIGA (FHB) e MICOTOSSINE
• FHB sta ricevendo particolare attenzione in
Italia negli ultimi anni per le conseguenze che
la malattia può avere su:
� resa in granella� qualità della granella � contaminazione delle cariossidi con
micotossine (di Fusarium)
�� Fusarium graminearumFusarium graminearum(DON, AcDON, NIV, FUS, ZEN)(DON, AcDON, NIV, FUS, ZEN)
�� F. culmorumF. culmorum(DON, AcDON, NIV, ZEN, ZOH)(DON, AcDON, NIV, ZEN, ZOH)
�� F. avenaceumF. avenaceum(MON, BEA, enniatine)(MON, BEA, enniatine)
�� F. poaeF. poae(DAS, NIV, FUS, T(DAS, NIV, FUS, T--2)2)
�� Microdochium nivaleMicrodochium nivale
�� Fusarium graminearumFusarium graminearum(DON, AcDON, NIV, FUS, ZEN)(DON, AcDON, NIV, FUS, ZEN)
�� F. culmorumF. culmorum(DON, AcDON, NIV, ZEN, ZOH)(DON, AcDON, NIV, ZEN, ZOH)
�� F. avenaceumF. avenaceum(MON, BEA, enniatine)(MON, BEA, enniatine)
�� F. poaeF. poae(DAS, NIV, FUS, T(DAS, NIV, FUS, T--2)2)
�� Microdochium nivaleMicrodochium nivale
� F. cerealis (NIV, FUS, ZEN, ZOH)
� F. sporotrichioides (T-2, HT-2, NEO)
� F. tricinctum (MON, BEA, ENS)
� F. acuminatum (T-2, NEO, MON, ENS)
� F. subglutinans (MON, BEA, FUP)
� F. oxysporum (MON, BEA, ENS)
� F. equiseti (DAS, ZEN, ZOH)
SPECIE FUNGINE ASSOCIATE ALLA SPECIE FUNGINE ASSOCIATE ALLA FUSARIOSI DELLA SPIGAFUSARIOSI DELLA SPIGA
First Report of Fusarium langsethiae on Durum Wheat Kernels in Italy
Infantino et al., Plant Disease, 2007, 91, 1362
Tricotecene Prodotto contaminato (percentuale di campioni positivi)*
Deossinivalenolo mais (89%), frumento (61%)
Nivalenolo mais (35%), avena (21%), frumento (14%)
3 Acetil-DON mais (27%), frumento (8%)
Tossina T-2 mais (28%), frumento (21%), avena (21%)
Tossina HT-2 avena (41%), mais (24%), segale (17%), frumento (12%)
DON campioni analizzati:DON campioni analizzati:NIVAc-DON TT--2 2 HTHT--22
11022 (57% positivi)11022 (57% positivi)4166 (16% positivi) 3721 (8% positivi)3490 (20% positivi) 3490 (20% positivi) 3032 (14% positivi)3032 (14% positivi)
*
TRICOTECENI TRICOTECENI -- Prodotti a rischio contaminazioneProdotti a rischio contaminazioneScientific Cooperation (SCOOP) - Aprile 2003
“Wheat and wheat containing products (like bread and
pasta) represent for DON, NIV, T-2 toxin and HT-2 toxin the major source of intake”
2
6358 campioni analizzati61% positivi (2 – 50000 µg/kg)6358 campioni analizzati61% positivi (2 – 50000 µg/kg)
DONDONDONDON
Deossinivalenolo Deossinivalenolo -- Prodotti a rischio contaminazioneProdotti a rischio contaminazione
Scientific Cooperation (SCOOP) - Aprile 2003
DONDON –– numero di campioni positivi per nazionenumero di campioni positivi per nazione
Scientific Cooperation (SCOOP) - Aprile 2003
Tossina TTossina T--2 2 -- numero di campioni positivi per nazionenumero di campioni positivi per nazione
Scientific Cooperation (SCOOP) - Aprile 2003
TT--22405 campioni analizzati94% positivi (2 – 280 µg/kg)Metodo di analisi: ELISAMetodo di analisi: ELISA
* nessun campione analizzato per HT-2
*
253 campioni frumento e prodotti derivati
(2-160 µg/kg)
O
O
OHOH
O
OH
Dessinivalenolo
FUNGHIFUNGHI PRODUTTORIPRODUTTORIFusariumFusarium graminearum,graminearum, FF.. culmorumculmorum
DERRATAfrumentofrumento, mais, orzo, segale,avena, birra
EFFETTIEFFETTI TOSSICITOSSICIvomitovomitorifiutorifiuto didi cibociboridottoridotto pesopeso corporeocorporeoimmunosoppressioneimmunosoppressione
LIVELLI MASSIMI AMMISSIBILILIVELLI MASSIMI AMMISSIBILIRegRegolamenti (CE) n. 1881/2006 e olamenti (CE) n. 1881/2006 e (CE) n. 1126/2007 (CE) n. 1126/2007
Deossinivalenolo (vomitossina, DON)
3
Livelli max. Livelli max. (µg/kg)(µg/kg)
PRODOTTO DONDON
Cereali non processati diversi da frumento duro, avena e
mais1250
Frumento duro e avena (non processati ) 17501750
Cereali destinati al consumo umano diretto, farina di cereali, crusca, germe
750
Pasta (secca) 750
Pane (compresi piccoli prodotti da forno), prodotti della
pasticceria, biscotteria, merende a base di cereali e cereali da
colazione
500
Alimenti a base di cereali trasformati e altri alimenti destinati ai lattanti e ai bambini
200
Regolamento (CE) N. 1181/2006 e 1126/2007
PRODOTTI A RISCHIO
FUNGHI PRODUTTORI
EFFETTIEFFETTI TOSSICITOSSICI
O
O
H3C
H
H
CH2
OH
H
CH3
H
OCOCH3OCOCH3
(CH3)2CHCH2OCO
Tossina T-2
9
16 10
87
6
11
1
15
12
13
2
3
45
14
O
O
H3C
H
H
CH2
OH
H
CH3
H
OHOCOCH3
3 2 2(CH ) CHCH OCO
Tossina HT-2
9
16 10
87
6
11
1
15
12
13
2
3
45
14
•• avena,avena, mais,mais, frumento,frumento, orzo,orzo,segalesegale ee prodottiprodotti derivatiderivati
•• FusariumFusarium sporotrichioides,sporotrichioides, FF.. poae,poae,FF.. langsethiae,langsethiae, FF.. acuminatumacuminatum
•• attivitàattività immunosoppressivaimmunosoppressiva•• citotossicitàcitotossicità•• attività dermotossica ed emorragicaattività dermotossica ed emorragica•• inibizione della sintesi proteicainibizione della sintesi proteica•• leucopenia tossicoleucopenia tossico--alimentare (ATA)alimentare (ATA)
Rispetto al DON, la tossicità delle tossine T-2 e HT-2 è 20 volte più elevata nel topo e 100-1000 volte più elevata in linee cellulari (in vitro).
Tossine T-2 e HT-2
”Stime sull'assunzione indicano che la presenza delle tossine T-2 e HT-2 può essere preoccupante per la salute pubblica. È quindi necessario e altamente prioritario sviluppare un metodo di analisi sensibile e affidabile, raccogliere ulteriori dati sull'occorrenza e svolgere ulteriori maggiori indagini/ricerche sui fattori che incidono sulla presenza delle tossine T-2 e HT-2 nei cereali e nei prodotti a base di cereali, in particolare nell'avena e nei prodotti a base di avena”.
�
Paragrafo 31
REGOLAMENTO (CE) N. 1881/2006che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti
nei prodotti alimentari
UEUE: livelli massimi ammissibili in discussione
Annata
Frumento tenero Frumento duro
Campioni positivi
(%)
Valore medio (µg/kg)
Valore massimo (µg/kg)
Campioni positivi
(%)
Valore medio (µg/kg)
Valore massimo (µg/kg)
1997-98 30 140 1000 92 200 1540
1998-99 61 220 960 83 250 1200
1999-2000 38 610 30003000 61 1100 64206420
2000-01 50 150 480 28 90 250
2001-02 100 590 18601860 79 420 39003900
2002-03 16 180 350 5 80 110
2003-04 4 110 110 5 170 850
Totale campioni analizzati 945; 1997-98: 155; 1998-99: 268; 1999-2000: 88; 2000-01: 109;2001-02: 154; 2002-03: 89; 2003-04: 82.
Campagna et al., 2005Campagna et al., 2005
LIVELLI DI LIVELLI DI DONDON IN FRUMENTO IN FRUMENTO PRODOTTO IN ITALIA PRODOTTO IN ITALIA (1998-2004)
(analisi HPLC-IMA/DAD, LOD = 20 ppb)
4
LIVELLI DI LIVELLI DI DONDON IN FRUMENTO DURO IN FRUMENTO DURO PRODOTTO IN ITALIA PRODOTTO IN ITALIA
aziende eaziende e centri di stoccaggio centri di stoccaggio (2006-2008)
Risultati del Progetto MICOCERRisultati del Progetto MICOCER
ANNI
CENTRO SUD-ISOLE
n. camp.
n.pos.
Media pos.
(µg/kg)
max.(µg/kg)
n. camp.
n. pos.
Media pos.
(µg/kg)
max.(µg/kg)
2006 15060
(40%)84 449 299
74(25%)
54 906
2007 15286
(57%)286 43514351 254
89(35%)
48 422
2008 134114
(85%)477 1356113561 98
28(29%)
45 329
totale 436260
(60%)- - 651
191(30%)
- -
metodo di analisi ELISA, LOD = 18,5 ppb
Aureli et al., 2009Aureli et al., 2009Totale campioni analizzati: 1087
LIVELLI DI LIVELLI DI DONDON IN FRUMENTO DURO IN FRUMENTO DURO PRODOTTO IN ITALIA PRODOTTO IN ITALIA rete nazionale rete nazionale (2006-2008)
Risultati del Progetto MICOCERRisultati del Progetto MICOCER
ANNI
NORD CENTRO SUD-ISOLE
n. cam.
n.pos.
Media pos.
(ppb)
max.(ppb)
n. cam.
n.pos.
Media pos.
(ppb)
max.(ppb)
n. cam.
n. pos.
Media pos.
(ppb)
max.(ppb)
2006 8455
(65%)291 1280 258
129(50%)
225 791 29746
(15%)62 219
2007 135131
(97%)174 502
264 189(72%)
155 1285 305173
(57%)88 459
2008 6666
(100%)(100%)22112211 67646764 102
81(80%)
480 46134613 13244
(33%)57 233
totale 285252
(88%)- - 624
399(64%)
- - 734263
(36%)- -
metodo di analisi ELISA, LOD = 18,5 ppb
Aureli et al., 2009Aureli et al., 2009
Totale campioni analizzati: 1643
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
ELISA DON (ng/g)
HP
LC D
ON
(ng
/g)
range 18,5 range 18,5 –– 13600 ng/g13600 ng/g
n = 256
y = 1,0162x – 68,017r = 0,98885
FFRUMENTO RUMENTO DDUROUROCCORRELAZIONE ORRELAZIONE EELISA/LISA/HHPLCPLC
Risultati del Progetto MICOCERRisultati del Progetto MICOCER20082008 20092009
Numero di campioni analizzatiNumero di campioni analizzati 136136 9393
Numero di campioni positiviNumero di campioni positivi 99 99 (73%)(73%) 67 67 (72%)(72%)
< 20 µg/kg < 20 µg/kg (LOD)(LOD) 37 37 (27%)(27%) 26 26 (28%)(28%)
20 20 -- 1750 µg/kg1750 µg/kg 71 71 (52%)(52%) 60 60 (65%)(65%)
> 1750 µg/kg> 1750 µg/kg 28 28 (21%)(21%) 7 7 (7%)(7%)
Media dei positivi Media dei positivi (ppb)(ppb) 11701170 672672
Min Min (ppb)(ppb) 2020 2020
Max Max (ppb)(ppb) 82408240 34603460
2008 = Nord (51), Centro (32), Sud (53)2009 = Nord (35), Centro (31), Sud (27)
Pascale et al., 2010Pascale et al., 2010
Monitoraggio Monitoraggio DONDON grano grano duro nazionale duro nazionale (2008 e 2009)(metodo di analisi HPLC-IMA/UV, LOD = 20 ppb)
5
20082008 20092009
n. n. camp.camp.
< 20 < 20 ng/gng/g
2020--1750 1750 ng/gng/g
> 1750 > 1750 ng/gng/g
Media Media pos. pos.
(ng/g)(ng/g)
n. n. camp.camp.
< 20 < 20 ng/gng/g
2020--1750 1750 ng/gng/g
> 1750 > 1750 ng/gng/g
Media Media pos. pos.
(ng/g)(ng/g)
NORDNORD 515111
(2%)(2%)
2424(47%)(47%)
2626(51%)(51%)
20422042 353500
(0%)(0%)
2828(80%)(80%)
77(20%)(20%)
11381138
CENTROCENTRO 323266
(19%)(19%)
2525(78%)(78%)
11(3%)(3%)
376376 31311010
(32%)(32%)
2121(68%)(68%)
00(0%)(0%)
146146
SUD e SUD e ISOLEISOLE
53534444
(83%)(83%)
88(15%)(15%)
11(2%)(2%)
329329 27271616
(59%)(59%)
1111(41%)(41%)
00(0%)(0%)
191191
metodo di analisi HPLC-IMA/UV, LOD = 20 ng/g
Monitoraggio Monitoraggio DONDON grano grano duro nazionale duro nazionale (2008 e 2009)
20102010
n. n. camp.camp.
< 80 < 80 ng/gng/g
80 80 -- 1750 1750 ng/gng/g
> 1750 > 1750 ng/gng/g
Media Media pos. pos.
(ng/g)(ng/g)
NORDNORD 292911
(3%)(3%)
2222(76%)(76%)
66(21%)(21%)
13391339
CENTROCENTRO 4422
(50%)(50%)
22(50%)(50%)
00(0%)(0%)
610610
SUD e SUD e ISOLEISOLE
73736969
(94%)(94%)
44(6%)(6%)
00(0%)(0%)
105105
Monitoraggio Monitoraggio DONDON grano grano duro nazionale duro nazionale (2010)
Laboratorio accreditato SINAL-ACCREDIA (n. 0975)
metodo di analisi ELISA, LOD = 80 ppb
I livelli di DON e la frequenza di contaminazione dipendono dall’annata agraria
Livelli e frequenza di contaminazione di DON più elevati nei campioni del Nord Italia rispetto a quelli del Sud Italia
DON-
+
MONITORAGGIO grano duro nazionale MONITORAGGIO grano duro nazionale -- DONDON
TT--2 + HT2 + HT--22 20082008 20092009
Numero di campioni analizzatiNumero di campioni analizzati 136136 9393
Numero di campioni positiviNumero di campioni positivi 81 81 (60%)(60%) 54 54 (58%)(58%)
< 3 ppb < 3 ppb (LOD)(LOD) 55 55 (40%)(40%) 39 39 (42%)(42%)
33--100 ppb100 ppb 77 77 (57%)(57%) 53 53 (57%)(57%)
> 100 ppb> 100 ppb 4 4 (3%)(3%) 1 1 (1%)(1%)
Media dei positivi Media dei positivi (ppb)(ppb) 27,327,3 24,824,8
Min Min (ppb)(ppb) 33 55
Max Max (ppb)(ppb) 122122 108108
2008 = Nord (51), Centro (32), Sud (53)2009 = Nord (35), Centro (31), Sud (27) Pascale et al., 2010Pascale et al., 2010
Monitoraggio Monitoraggio TT--2/HT2/HT--22 grano grano duro nazionale duro nazionale (2008 e 2009)
(metodo di analisi HPLC-IMA/FD, LOD = 5 ppb (T-2) e 3 ppb (HT-2)
6
TT--2 + HT2 + HT--22
20082008 20092009
n. n. camp.camp.
< 3 < 3 ng/gng/g
33--100 100 ng/gng/g
> 100 > 100 ng/gng/g
Media Media pos. pos.
(ng/g)(ng/g)
n. n. camp.camp.
< 3 < 3 ng/gng/g
33--100 100 ng/gng/g
> 100 > 100 ng/gng/g
Media Media pos. pos.
(ng/g)(ng/g)
NORDNORD 51513333
(65%)(65%)
1818(35%)(35%)
00(0%)(0%)
13,313,3 35352222
(63%)(63%)
1313(47%)(47%)
00(0%)(0%)
10,310,3
CENTROCENTRO 323299
(28%)(28%)
2121(66%)(66%)
22(6%)(6%)
33,533,5 313199
(29%)(29%)
2121(68%)(68%)
11(3%)(3%)
39,539,5
SUD e SUD e ISOLEISOLE
53531313
(24%)(24%)
3838(72%)(72%)
22(4%)(4%)
30,230,2 272788
(30%)(30%)
1919(70%)(70%)
00(0%)(0%)
17,817,8
LOD = 5 ng/g (T-2), 3 ng/g (HT-2)
Monitoraggio Monitoraggio TT--2/HT2/HT--22 grano grano duro nazionale duro nazionale (2008-2009)
Determinazione LCDeterminazione LC--MS/MSMS/MS
Purificazione su colonne Purificazione su colonne ad immunoaffinitàad immunoaffinità
(T(T--2 Test2 Test™™ HPLC, VICAM)HPLC, VICAM)
Purificazione su colonne Purificazione su colonne ad immunoaffinitàad immunoaffinità
(T(T--2 Test2 Test™™ HPLC, VICAM)HPLC, VICAM)
Estrazione(con metanolo:acqua + NaCl)
Filtrazione (Whatman Nº 4)Diluizione con acqua (1:5)Filtrazione (Whatman GF/A)
Multiple Reaction Monitoring (MRM) mode(cinque ioni monitorati per ogni tossina)
Uso di Standard Interno13C24 T2 toxin e 13C24 HT2 toxin (Biopure, Austria)
Conferma dei risultati mediante LC-MS/MS(20% dei campioni analizzati)
LOD (LC/MS-MS): T-2 = 0,5 ng/g; HT-2 = 0,7 ng/g
Contemporanea presenza di tossina T-2 e HT-2. Livelli di tossina HT-2 in genere più elevati dei livelli di tossina T-2.
Livelli di contaminazione trascurabili (piu’ del 90% dei campioni analizzati erano contaminati a livelli <50 ng/g).
Livelli di tossine T-2 e HT-2 più elevati nei campioni del centro-sud Italia rispetto a quelli del Nord Italia (da confermare).
T2/HT2
+
-
MONITORAGGIO grano duro nazionale MONITORAGGIO grano duro nazionale –– T2/HT2T2/HT2
??
Correlazione tra il contenuto di DON e T-2 + HT-2 in frumento duro (2008)
1 7
13 19 25 31 37 43 49 55 61 67 73 79 85 91 97
103
109
115
121
127
133
S1 S
2
2000
4000
6000
7000
DON (µg/kg)
125
250
375
500
T2+HT2(µg/kg)
625
750
8000875
1000
5000
3000
1000
campioniDON
T2+HT2
7
DONDON2008 + 20092008 + 2009
semolasemola integraleintegrale
Numero di campioni analizzatiNumero di campioni analizzati 145145 2929
Numero di campioni positiviNumero di campioni positivi 113 113 (80%)(80%) 19 19 (66%)(66%)
< 20 ppb (LOD)< 20 ppb (LOD) 32 32 (20%)(20%) 10 10 (34%)(34%)
2020--750 ppb750 ppb 113 113 (80%)(80%) 19 19 (66%)(66%)
> 750 ppb> 750 ppb 0 0 (0%)(0%) 0 0 (0%)(0%)
Media dei positivi (ppb)Media dei positivi (ppb) 112112 157157
Min (ppb)Min (ppb) 2020 4040
Max (ppb)Max (ppb) 530530 410410
TT--2/HT2/HT--22:: tutti i campioni <LOD tutti i campioni <LOD ((<3 ppb T<3 ppb T--2;<5 ppb HT2;<5 ppb HT--2)2)
ATTIVITÀ MONITORAGGIOATTIVITÀ MONITORAGGIOpastapasta nazionalenazionale
(analisi HPLC-IMA/DAD, LOD = 20 ppb)
Pascale et al., 2010
* Valore medio ± SD (n=9), frumento duro contaminato nell’intervallo 0.3 - 13.1 µg/g; ** calcolato sul peso secco.
DO
N (%
)D
ON
(%
)
100
20**
159
37
77 64
33**
0
50
100
150
200
Frumentonon pulito
Frumento pulito Crusca Farinetta Semola Spaghetti Spaghetti
dopo cottura
scartiscarti didi puliturapulitura 414%414%
* Valore medio ± SD (n=9), frumento duro contaminato nell’intervallo 0.3 - 13.1 µg/g; ** calcolato sul peso secco.
DO
N (%
)D
ON
(%
)
100
20**
159
37
77 64
33**
0
50
100
150
200
Frumentonon pulito
Frumento pulito Crusca Farinetta Semola Spaghetti Spaghetti
dopo cottura
scartiscarti didi puliturapulitura 414%414%
Distribuzione (%) del DON nei prodotti e sottoprodotti di molitura
del frumento duro e negli spaghetti prima e dopo cottura (n=9)*
(Visconti et al., 2004)
100
1
295
48
134
2212
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
grano nonpulito
granopulito
crusca farinaccio farinette semola pasta
T-2
+ H
T-2
(%
)
Scarti di pulitura = 597% Scarti di pulitura = 597%
* I valori rappresentano la media (±SD) di 11 livelli di contaminazione nell’intervallo 97-5954 ng/g (esperimenti in quadruplicato).
Distribuzione (%) della somma delle tossine T-2 e HT-2 nelle frazioni di molitura e nella pasta
T-2 + HT-2
(Pascale et al., 2010)
“Modellizzazione di un Sistema Integrato per la gestione della
SiSicurezza curezza AA limentare della limentare della filiera del filiera del FFrumento durorumento duro”
(SINSIAF)
Piano Operativo Nazionale 2000-2006 Progetto MIUR n. 12792
Progetti di Ricerca Nazionale per la sicurezza alimentare della filiera del FRUMENTO DURO
8
Progetti di Ricerca Nazionale per la sicurezza alimentare della filiera dei cereali
“Valutazione e controllo della contaminazione da micotossine
nelle produzioni cerealicole nazionali” (MICOCER)
Programma Interregionale “Sviluppo rurale”, sottoprogramma “Innovazione
e Ricerca” (MIPAAF)
CRA-QCE, Unità di Ricerca per la Valorizzazione Qualitativa dei Cereali, ROMA
Progetti di Ricerca Nazionale per la sicurezza alimentare della filiera del FRUMENTO DURO
Monitoraggio dei livelli di tossina T-2 e HT-2 (e di DON) nel grano duro nazionale e nella pasta.
�
Studio dell’effetto dei processi di molitura e pastificazione sulla contaminazione da tossina T-2 e HT-2 nei prodotti e sottoprodotti derivati del grano duro.
�
Selezione di linee grano duro dotate di resistenza alla “fusariosi della spiga”.
�
“FROM SEED TO PASTA”Filiera di ricerca integrata per la produzione
di grano duro di alta qualità
Coordinatore:Coordinatore: Produttori Sementi di BolognaProduttori Sementi di Bologna
Progetto AGER sullaqualità e sicurezza della
filiera del FRUMENTO DURO
“WP5 “WP5 -- Sicurezza delle materie prime e dei Sicurezza delle materie prime e dei trasformati”trasformati”
ISPA-CNR, Bari
UNI - Parma
Metodi Rapidi per la Determinazione di Micotossine in Grano Duro e Prodotti Derivati
Micotossine Nascoste in Grano Duro e Prodotti Derivati
Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per la vostra la vostra la vostra la vostra la vostra la vostra la vostra la vostra attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!
Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per Grazie per la vostra la vostra la vostra la vostra la vostra la vostra la vostra la vostra attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!attenzione!
“IL MONITORAGGIO DELLE PRODUZIONI NAZIONALI”Bologna, 30 Settembre 2010
top related