immunologische methoden - ruhr-universität bochum · kompetitions-elisa. western blot (immunoblot)...
Post on 07-Aug-2019
218 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Charakterisierung von Antikörpern
Affinität: Bindungsstärke eines Antikörpers an eine
einzige Antigenbindungsstelle
Avidität: Gesamte Bindungsstärke mit mehr als einer
Bindungsstelle
Idiotyp: Antikörper mit der gleichen Spezifität
Isotyp: IgG, IgM, IgE, IgA und IgD definiert durch die
konstante Region des Antikörpers
Spezifität: Erkennt der Antikörper nur ein spezifisches Epitop?
Haptene
- Niedermolekulare Substanzen, die
ohne Trägerprotein keine
Immunantwort auslösen.
- Z. B. Nickel oder Penicillin können
durch haptenartige Wirkung
Immunreaktionen auslösen
Tag 1 14 24 35 45 56 70
Immunisierung mit 0,5mg Peptid konjugiert an KLH subcutan
mit Freudschem Adjuvanz
Blutentnahme
Herstellung polyklonaler Antikörper
Herstellung monoklonaler Antikörper
HGPRT=Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase
HAT-Medium=Hypoxanthin, Aminpterin, Thymidin
HAT-Medium
Aminopterin: blockiert den de novo Syntheseweg für Purine und Thymidin
Hypoxantin: Abbauprodukt aus dem Purinstoffwechsel, kann über den
salvage-pathway zur Purinsynthese eingesetzt werden mittels
HPGRT
Thymidin: muss zugeführt werden, da die Synthese durch Aminopterin
blockiert ist
1) Beschichtung
mit dem
Antigen
2) Bindung eines
spezifischen
Antikörpers
3) Bindung eines
enzymgekoppelten
Zweitantikörpers
4) Substrat Farbiges
Produkt
5) Messung der
Absorbtion
Indirekter ELISA
Blockierung
freier Bindungs-
stellen
Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat)
+
NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid)
Alkalische
Phosphatase
Antigen
(Spezifisches Allergen)
+ Serum-IgE + Detektionsantikörper
(IgG-Anti-IgE)+ Substrat
Beispiel 1: Detektion von Allergen spezifischem IgE
Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat)
+
NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid)
Alkalische
Phosphatase
Fänger-Antikörper
(IgG-Anti-IgE)
+ Serum-IgE + Detektionsantikörper
(IgG-Anti-IgE)+ Substrat
Beispiel 2: Messung von IgE mittels Sandwich ELISA
λλλλ=488 nm
Laser
λλλλ=530 nm
Emission
Fluorochrome
Antibody Photodetector
Fluoreszenz
FluorochromesExcitation
(nm)
Emission
(nm)
Immunfluoreszenz
Nachweis von Antigenen auf Zellen oder Gewebe mittels
Antikörpern, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind
Macrophagen (grün) in der roten
Pulp der Milz
top related