introducciÓn objetivo - expofybi · 1- vacuna comercial juan battagliotti, diego fontana, marina...
Post on 28-May-2020
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Producción, caracterización y evaluación de inmunogenicidad de partículas pseudovirales para hepatitis B (HB-VLPs) expresadas en líneas celulares de mamiferos recombinantes.
IMÁGENES: En caso de incluir imágenes o gráficos, estos deberán presentarse en una resolución de 200dpi con tamaño
mínimo de 200mm x 250mm (proporcional)
FORMATO: El eposter deberá ser enviado una única página/diapositiva
en formato PDF sin excepción
No se deben incluir animaciones o hipervínculos
El tamaño del eposter será PANORÁMICO 16:9 Orientación VERTICAL
Juan Battagliotti, Diego Fontana, Marina Etcheverrigaray, Claudio Prieto UNL, CONICET, FBCB (Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas), CBL (Centro Biotecnológico del Litoral),
Laboratorio de Desarrollo Biotecnológico, Ciudad Universitaria, Ruta Nacional 168 - Km 472,4 - C.C. 242 - (S3000ZAA) Santa Fe, Argentina.
LaHepatitisBesunainfecciónhepáticapotencialmentemortalcausadaporelvirusdelahepatitisB(HBV).Aúnhoyendía,constituyeun importanteproblemadesaludanivelmundial,afectandoamásde350millonesdepersonas. LavacunaparaHepatitisBquesecomercializa en Latinoamérica es producida en levaduras, expresando solo la proteína S de la envoltura del HBV en su forma noglicosilada.Sibienestavacunahademostradosereficazysegura,alrededordeun10%de lapoblaciónsana inmunocompetentenologradesarrollarunarespuesta inmune.Unaestrategiaparamejorar la respuestade lavacunacióncontraelHBVeseldesarrollodevacunasmásinmunogénicasmediantelainclusióndelas3proteínasdelaenvolturadeestevirus(S,MyL)ensusformasglicosiladas.Estas proteínas tienen la capacidad de autoensamblarse formando estructuras llamadas partículas pseudovirales (VLPs, Virus-LikeParticles), las cuales imitan la conformación del virus nativo, pero carecen del genoma viral, lo que las convierten en excelentescandidatosvacunales.
INTRODUCCIÓN
EnestetrabajosepresentaeldesarrolloycaracterizacióndeVLPsparaelvirusdelaHepatitisB(HB-VLPs),expresandolastresglicoproteínasdeenvolturadelHBVencélulasCHO-K1yHEK293,comoestrategiaparaeldesarrollodeuncandidatovacunalde
nuevageneración.Asuvez,lainmunogenicidaddeestasHB-VLPsfueevaluadaenanimalesdeexperimentación.
OBJETIVO
96 %
92%
A B
D
CONSTRUCCIÓNDELVECTORDEEXPRESIÓN,GENERACIÓNDELÍNEASRECOMBINANTESYANÁLISISDELAEXPRESIÓNDELAGLICOPROTEÍNAS
LasecuenciacodificantedelHBsAgfueclonadaenvectoresdetransferencialentivirales.EstosvectoresseutilizaronparatransducircélulasCHO-K1yHEK293,ygenerarlíneascelulares
recombinantesestables.
ElniveldeexpresiónenlaslíneascelularesrecombinantesCHO-HByHEK-
HBfueanalizadamediantemicroscopíadefluorescencia(MF)ycitometríadeflujo
(CF).
CARACTERIZACIÓNDEHB-VLPsElbrotedeHB-VLPsalsobrenadantedecultivosedeterminómedianteunensayodeELISAsándwichespecífico
paralaglicoproteínaS.
SedeterminóquelasHB-VLPsestabancompuestasdelastresglicoproteínasdesuperficiedelHBVmedianteunensayodeELISAsándwichencualseemplearonanticuerposmonoclonalesespecíficosparalacapturadecadaglicoproteína.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
LCHO-HB LCHO-K1wt
Absorban
cia49
2nm
mAbS
mAbM
mAbL
LasHB-VLPsfueronconcentradasmedianteprecipitaciónconpolietilenglicolyanalizadasmediantemicroscopíaelectrónicadetransmisión(TEM)ywesternblot
Seutilizóunsueropoliclonalanti-proteínaS.Elpeso
molecularresultóelesperadoparalaproteínaSglicosilada(27kDa)presenteenlasHB-VLPsy24kDaparaelcontrol(proteínaSnoglicosiladaproducidaenlevadura).
Seobservaronpartículasdentrodelrangoesperado(22-30nm).
ANÁLISIS DE LA INMUNOGENICIDAD DE HB-VLPs
Eltítulodeanticuerposanti-antígenoSobtenidoenlossuerosderatonesinmunizadosconHB-
VLPsresultósignificativamentemayoralobtenidoenlossuerosinmunizadosconel
antígenoSprovenientedeunavacunacomercial(*=ValorP<0,05).
Se determinó la presencia de anticuerpos específicos anti-L en sueros de ratones
inmunizados con HB-VLPs de la línea HEK-HB. Para esto, las placas de ELISA fueron
sensibilizadas con un péptido sintético correspondiente con una región presente
en la proteína L involucrada en la unión del HBV con el hepatocito.
A.LCHO-HBMF.B.LCHO-HBCF.C.LHEK-HBMF.D.LHEK-HBCF
A B
DC
92%
96%
A.HB-VLPsproducidaenLCHO-HB(campoampliado).B.HB-VLPsproducidasenLHEK-HB
A B
26,3nm
1 2 3
1-Vacunacomercial2-HB-VLPsLCHO-HB3-HB-VLPsLHEK-HB
Cut-off
** **
Títulodeanticuerpos:diluciónmayoralvalordecutoff, calculadocomo laabsorbanciadelcontrolnegativomásdosdesviacionesestándar.Segraficaelpromedioobtenidoparacadagrupoconsurespectivadesviaciónestándar.
PLANDEINMUNIZACIÓN:RATONESBALB/Cn=53dosisvíaintramuscularAdyuvante:Liposap®(producidoporLipomizeS.R.L.)
GRUPOI:HB-VLPsequivalentea0,4ugdeproteínaSprovenientedelalíneaLCHO-HB
GRUPOII:HB-VLPsequivalentea0,4ugdeproteínaSprovenientedelalíneaLHEK-HB
GRUPOIII:0,4ugdeantígenoS,provenientedeunavacunacomercialproducidaenlevadura
24kDa27kDa
Sedesarrollaronlíneascelularesrecombinantescapacesde
expresarysecretaralsobrenadantecultivosHB-VLPscompuestasporlas3proteínasdelaenvolturadelHBV.Estas
partículaspresentaronlamorfologíaytamañoesperados.
Asuvez,fueroncapacesdeinducirunarespuestainmune
humoralenanimalesdeexperimentación,ysedetectaronanticuerpos
específicosparalaregióndeunióndelHBVconelhepatocito.
Porlotanto,estasHB-VLPssuponenuncandidatovacunal
promisorio.
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