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Ionentransportstörung und mukoziliäreDysfunktion bei chronisch obstruktiven

Lungenerkrankungen

Prof. Dr. med. Marcus A. MallSektion Päd. Pneumologie & Allergologie und CF-Zentrum

Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin und Abteilung Translationale Pneumologie

Zentrum für Translationale LungenforschungUniversität Heidelberg

Mukusobstruktion bei chronisch-obstruktiven Atemwegserkrankungen

• Mukusobstruktion• Chronische Entzündung und rezidivierende Infektionen• Remodeling und Gewebedestruktion

Mukoviszidose Asthma bronchiale Chronische Bronchitis

Mall M et al. Prog Respir Res 2006 Elias J.A. et al., JCI 2003 Hogg J. et al., NEJM 2004

Defekt der mukoziliären Clearance bei chronisch-obstruktiven Atemwegserkrankungen

% In

itial

dep

ositi

on

CF severe lung disease

CF mild lung disease

CF normal lung function

Normal

Regnis J et al., Am J Respir Crit Care Med 1994Goodman R, Am Rev Respir Dis 1978 Mall MA, JAMPDD 2008

Mukoviszidose (CF)

You

ng n

on-s

mok

ers

Eld

erly

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-sm

oker

s

You

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You

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mok

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Chr

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bro

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tisTrac

heal

muc

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ansp

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eloc

ity Chronische Bronchitis

• Asthma bronchiale

Traditionelles Modell der mukoziliären Clearance

1. Mukus

2. Zilien

3. Periziliäre Flüssigkeit

Wanner A, et al. Am J Respir Crit Care Med. 1996Knowles M.R. et al. J Clin Invest 2002

Neues Modell der mukoziliärenClearance

Button et al., Science 2012

Mucus Transport: Traditional View of the PCL as a Liquid Layer is Inaccurate

Epithelial CellR. Pickles, JVI 1998

Button et al., Science 2012

Morphologic Evidence for Structure in Both the Mucus and PCL Layers

Button et al., Science 2012

Tethered Mucins in the PCL250nm

1 µm

4 µm

500 nm

MUC1 200KdaMUC4 900KdaMUC16 3500Kda

MUC5B 400KdaBSA 66Kda

Relative Sizes

ProteinSize

MUC1 MUC4

Behavior of Mucins in Solutions:Generation of Osmotic Pressures

πmucus ≈ n . kT πmucus ≈ kTξ3

mucus

Two‐Layer Hydration Model of MCC: In Health, PCL Osmotic Pressure > Mucus Layer Osmotic 

Pressure

ππ

Summary Data for Mucus Layer and PCL Osmotic Pressures

Mucus exerts osmotic pressure on PCLPCL has internal osmotic pressure due to thestructural integrity of tethered mucins and cilia

ξmucus = 50 nm 

ξPCL

πmucus ≈ kT ≈ 100 Paξ3

mucus πPCL ≈ kT ≈ 520ξ3

PCL

ΠPCL > Πmucus

PCL is stable as long as its osmotic pressure is higher 

Mucus30 Pa

PCL520 Pa(ξ=20nm)

Button et al., Science 2012

Mucus Concentration, PCL Height, and Mucus Transport vs. Adhesion 

2 4 6 8

h PCL[μm] 7

5

3

1

Mucin concentration (mg/ml)

MCC= 0

4 μm

Πmucus>> ΠPCL

Collapse Conc.

Πmucus≤ ΠPCL

7 μm

MCC= MCC=

Πmucus> ΠPCL

Critical Conc.

Button et al., Science 2012

Primär Ionentransportdefekt

Mechanismen der Mukusobstruktion bei chronischen Atemwegserkrankungen

Primär Entzündung

Mukushypersekretion:(Asthma, chronische Bronchitis…)

Erhöhte Mukuskonzentration(Dehydratation)

Mukoziliäre Dysfunktion

Mukusobstruktion Fahy J et al. NEJM 2010

Model Disease Cystic Fibrosis: Chronic Mucostasis, Inflammation, Infection and Progressive Lung Damage

Gibson RL et al., Am J Respir Crit Care Med 2003Mall M et al., Prog Respir Res 2006

Courtesy of Jeff Wine

CF Lung Disease is Caused by Mutationsin the CFTR Chloride Channel

ClosedOpen

Time

Current

Gibson RL et al., Am J Respir Crit Care Med 2003Sheppard DN et al, Physiol Rev 1999Kreda SM et al. Methods Mol Biol. 2011

ΔF508

CFTR

CFTR ΔF508

Basic Ion Transport Defect in CF Airway Epithelia

Normal CF

CF Ionentransportstörung führt zu Dehydratation derAtemwegsoberflächen und mukoziliärer Dysfunktion

J. Wine

Matsui H. et al., Cell 1998Tarran R. et al., J. Biol. Chem. 2005

Normal CF

Normal

CF

Knowles MR et al., NEJM 1981

Mechanismen der mukoziliären Dysfunktion und Mukusobstruktion bei chronisch-obstruktiven

Lungenerkrankungen?

1. Mukushypersekretion

2. Ziliendysfunktion

3. Dehydratation durchIonentransportdefekt

Wanner A, et al. Am J Respir Crit Care Med. 1996Knowles M.R. et al. J Clin Invest 2002

Lessons from Animal Models

Mall M. JAMPDD 2008

Asthma Mouse Models with Mucus Hypersecretion do not Develop Mucus Plugging

Kuperman DA et al., Nat. Med. 2002

• Allergic sensitization with ovalbumin (OVA)• Lung-specific overexpression of Th2 cytokines(IL-4, IL-5, IL-9, IL-13)

Phenotype:• Eosinophilic inflammation • Goblet cell metaplasia &mucus hypersecretion

• No mucus plugging• No pulmonary mortality

Mucus clearance probably normal

Mouse Models with Primary Ciliary Dysfunction do not Develop Lung Disease

Wild-type HFH-4 -/-

Nose

Trachea

Brody SL et al. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2000

Trachea

Phenotype:• Systemic absence of ciliary function • Situs inversus• Hydrocephalus internus• No pulmonary pathology

Probably cilia-independent mucus transport

• Cough clearance• Gas-liquid pumping

HFH-4 -/- Wild-type -/- Wild-type

Überprüfung der Dehydratations-Hypotheseim Mausmodell

Wild-type βENaC-Tg

ASLASL

Mall M. et al., Nat Med 2004

Wild-typeβENaC-Tg

Wild-typeβENaC-Tg

Wild-typeβENaC-Tg

Dehydratation der Atemwegsoberflächen führt in der Mauszu chronisch-obstruktiver Atemwegserkrankung

Wild-type

βENaC-Tg

Wild-typeβENaC-Tg

Sur

viva

l (%

)

Age (days)

βENaC-Tg βENaC-Tg

Wild-typeβENaC-Tg

Mall M et al., Nat. Med. 2004Mall M et al., AJRCCM 2008

Lack of CFTR Aggravates Mucus Obstructionand Mortality in βENaC-Tg Mice

Johannesson B et al. PLoS One 2012

Airway Surface Dehydration (Imbalance of Na+

Absorption and Cl- Secretion) Critical in Pathogenesisof Mucostasis and Lung Disease

Pilewski J. & Frizzell R. Nat. Med. 2004

Is Mucus Obstruction Bad?

Mucus Obstruction Causes Spontaneous BacterialInfection in βENaC-Tg Mice

Livraghi-Butrico A. et al., Mucosal Immmunology 2012

Wild-typeβENaC-Tg

Mucus Obstruction Causes Neutrophilic Inflammation under Germ-free Conditions

Livraghi-Butrico A. et al., Mucosal Immmunology 2012

Specific Pathogen Free

Germ Free

AB‐PASH&E

Wild-typeβENaC-Tg

Spielt Ionentransport eine Rolle bei anderen chronisch-obstruktiven

Atemwegserkrankungen?

Th2 Cytokines Induce a Pro-secretory Ion Transport Phenotype in Bronchial Epithelia in Vitro

Galietta L. et al. PATS 2004Danahay H. et al. AJP Lung 2005

Model of IL-13 Mediated Inflammation to Test Effectson Airway Ion Transport in Vivo

Anagnostopoulou P. et al. ERJ 2010

UTP

WT ± IL-13 or± Aspergillus Ag

VehicleIL-13 inflammation

Vehicle IL-13 inflammation

IL-13 Mediated Airway Inflammation Induces a Pro-secretory Ion Transport Phenotype in Mouse Bronchi

Anagnostopoulou P. et al. ERJ 2010

VehicleIL-13

In 2008 TMEM16A was Identified as the Calcium-Activated Chloride Channel (CaCC) in Airway Epithelia

HBE

Microarrays

RNA (+/- IL-4)

TMEM16A

Caputo et al. Science 2008Yang YD et al. Nature 2008Schroeder BC et al. Cell 2008

However, IL-13 Mediated Inflammation has no Effect on TMEM16A and CFTR Expression in Mouse Airways

VehicleIL-13 inflammation

Anagnostopoulou P. et al. ERJ 2010

SLC26A9 as Potential Candidate for Inflammation Induced Cl- Secretion?

Lohi H. et al. JBC 2002Xu J. et al. PNAS 2008Bertrand CA. et al. JGP 2008

• Member of SLC26 family of aniontransporters

• Predominantly expressed in epitheliaof the lung and upper GI tract

• Functions as Cl- channel thatcontributes to constitutive and cAMP-induced Cl- secretion in HBE cells

• Slc26a9-/- mice show reduced acidsecretion in stomach but appearhealthy and display normal growth

Slc26a9-deficient Mice do not Show Lung Disease or Abnormal Airway Cl- Secretion

under Physiological Conditions

Anagnostopoulou P. et al. JCI 2012

WT Slc26a9-/- WT Slc26a9-/-

Does SLC26A9 Contribute to Inflammation-InducedCl- Secretion?

Anagnostopoulou P. et al. JCI 2012

WT versus Slc26a9-/-

SLC26A9 Determines Constitutive Cl- SecretionInduced in IL-13 Mediated Airway Inflammation

Anagnostopoulou P. et al. JCI 2012

SLC26A9-mediated Cl- Secretion Prevents Mucus Obstruction in Airway Inflammation

WT vehicle WT IL-13 Slc26a9-/- vehicle Slc26a9-/- IL-13

Anagnostopoulou P. et al. JCI 2012

IL-13 Mediated Inflammation has no Effect on SLC26A9 mRNA Expression in Mouse Airways

Anagnostopoulou P. et al. JCI 2012

A Single Nucleotide Polymorphism in SLC26A9 isAssociated with Asthma in Children

Anagnostopoulou P. et al. JCI 2012

• Genetic association study inhealthy children and childrenwith asthma (n=1,319)

• SNP rs2282430 in 3‘ UTR ofSLC26A9 is associated with asthma

• Odds ratio 1.48 (P<0.012)

The SNP in the 3‘ UTR of SLC26A9 Creates a miRNA Binding Site

Greco S J et al. PNAS 2007

Translational repression

The SNP in the 3‘UTR of SLC26A9 Causes Translational Repression in Luciferase Reporter Assays

PGK Firefly luciferase 3'UTR SV40 Renilla

luciferase Precursor miRNA+Dual luciferase reporter

Anagnostopoulou P. et al. JCI 2012

Effects of cSNPs in SLC26A9 on Cl- Channel Function in Xenopus Oocytes

Chen AP et al. Human Mutation 2012

SLC26A9-mediated Cl- Secretion Prevents Mucus Obstruction in Th2-driven Airway Inflammation

Associated with Mucus Hypersecretion

Anagnostopoulou P. et al. JCI 2012

Therapeutische Implikationen:„Hydration Therapies“

Verbesserung der Befeuchtung der Atemwegsoberflächen als therapeutische Strategie

NormalMukoviszidose

Mukoviszidose +Hydratations-Therapie

Ionenkanal-Modulatoren• CFTR-Modulatoren• Na+-Kanal Blocker

Osmolyte• Hypertones Kochsalz• Mannitol

Dosis-abhängige Verbesserung der mukoziliären Clearance durch hypertones Kochsalz bei Mukoviszidose

Robinson M. et al. Thorax 1997

Studie 1:

Intensive Inhalationstherapie:24 Patienten, 4-mal täglich 5 ml HS 7% über 2 Wochen

Intensive Inhalation mit hypertonem Kochsalz verbessert die Lungenfunktion bei CF

Donaldson et al. NEJM, 2006

* *

Langzeittherapie mit inhaliertem Kochsalz reduziertpulmonale Exazerbationen bei Mukoviszidose

Elkins et al., NEJM, 2006

ΔFEV1 absolut 3.2 %

Langzeit ‘low dose’ Inhalationstherapie:164 Patienten, 2-mal täglich 4 ml HS 7% über 48 Wochen

Hypertonic Saline Improves LCI in Pediatric Patientswith CF with Normal Lung Function

Amin R et al. Thorax 2010

Effekt von hypertoner Kochsalzlösung auf Mukusobstruktion?

Behandlung mit HS 7% (1µl/g i.t.) oder Vehikel (ddH2O ) 3 x täglich

Geburt 1 2 3 4 5 6

Intervention

Wildtyp + VehikelWildtyp + HSβENaC-Tg + VehikelβENaC-Tg + HS

Studiendesign

Alter (Wochen)

Endpunkte:1. Mukusobstruktion2. Atemwegsentzündung

Graeber S. et al, AJRCMB in press

Behandlung mit hypertoner Kochsalzlösung reduziert Mukusobstruktion bei Mäusen mit chronischer Atemwegserkrankung

Vehicle 7% HS

βENaC-Tg

Wild-type

Erwachsene Mäuse 3-mal täglich HS 7% über 2 Wochen

Graeber S. et al, AJRCMB in press

Effekt von inhalativer HS auf die Atemwegsentzündung im Mausmodell

Erwachsene Mäuse 3-mal täglich HS 7% über 2 Wochen

Graeber S. et al, Am J Respir Cell Mol Biol 2013

Hypertones Kochsalz und Inflammation: Pro-inflammatorische Effekte am normalen Atemwegsepithel

Tarran R. et al. Mol Cell 2001Reeves EP Sci World J 2012

Osmotischer Effekt

Transiente Zellschrumpfung (osmotischer Stress)

Freisetzung von Zytokinen (IL-8) und Mediatoren

Rekrutierung von Neutrophilen und Bronchokonstriktion

Hypertones Kochsalz und Inflammation: Anti-inflammatorische Effekte bei chronischer

Atemwegsentzündung

Normal

CF

Reeves EP et al. Am J Respir Crit Care Med 2011

CF Sputum

Lungenerkrankung bei CF beginnt in den ersten Lebensmonaten

Sly PD et al, Am J Respir Crit Care Med 2009

Normal Bronchialdilatation (19%)

Bronchialwand-verdickung (45%)

57 Säuglinge mit CF

Air trapping (67%)

Präventive hypertone Kochsalzlösung verhindert Mukusobstruktion im Mausmodell

Behandlung mit HS 7% (1µl/g i.t.) oder Vehikel (ddH2O ) 3 x täglich

Geburt 1 2 3 4 5 6

Wildtyp + VehikelWildtyp + HSβENaC-Tg + VehikelβENaC-Tg + HS

Studiendesign

Prävention

Alter (Wochen)

Proof-of-concept

Graeber S. et al, Am J Respir Cell Mol Biol 2013

Präventive Inhalation mit hypertonem Kochsalz bei CF (Phase IIa Studie)

Run-in

CF NGSKohorte Randomisierung (1:1)

Geburt Diagnose Inhalations-beginn

Inhalations-ende

Inhalation über 52 Wochen

Isotones NaCl 0,9% (IS), 2x/Tag

Hypertones NaCl 6% (HS), 2x/Tag

Beobachtungsstudie (Biobank)Run-in

CF NBS

Mirjam Stahl

Primärer Endpunkt:• Sicherheit der Inhalation mit hypertonem Kochsalz (AE/SAE)

Sekundäre Endpunkte:

Einschlusskriterien und EndpunkteEinschlusskriterien:• Neugeborene und Säuglinge

– bestätigte Diagnose CF– Alter bei Studieneinschluss 0-4 Monate

Mirjam Stahl-4

-2

0

2

4

6

LCI z

-sco

re

Control CF

Präventive Inhalation mit Hypertonem NaCl: Studiendesign

Start 3 Monate 9 Monate Ende

Klinische Untersuchung, QoLMRT Thorax, Multiple Breath Washout

Mikrobiologie

Klinische Untersuchung, QoLMultiple Breath Washout

Mikrobiologie

6 Monate

Mirjam Stahl

Präventive HS Studie: Multi-Center Studie im Deutschen Zentrum für

Lungenforschung

KoordinierendesStudienzentrum

http://www.clinicaltrials.gov

NCT01619657

Regensburg

Bochum

Mirjam Stahl

Klinische Studien zu inhalativer hypertoner Kochsalzlösungbei obstruktiven Atemwegserkrankungen

CFBronchiolitis

Asthma bronchiale

Sekundäre,chronisch-obstruktive

Atemwegserkrankungenmit Störung der muko-

ziliären Clearance:Non-CF Bronchiektasen

Immundefekte, PCDNeuromuskulär

transient, viral

wheeze

recurrentwheeze

„protractedbacterial

bronchitis“

Indikationen und Potential von inhalativer hypertoner Kochsalzlösung bei obstruktiven Atemwegserkrankungen

Subp

häno

type

nm

it M

ukus

obst

rukt

ion

Zusammenfassung

• Mukoziliäre Dysfunktion ist eine charakteristische Störung bei obstruktiven Atemwegserkrankungen (CF, Asthma, COPD) und führt zu Mukusobstruktion, bakterieller Infektion und Entzündung

• Neues MCC Modell und Befunde aus Tiermodellen: Mukus-Hyperkonzentration (durch Ionentransportstörung oder Mukushypersekretion) kritischer Mechanismus der mukoziliären Dysfunktion und Mukusobstruktion

• Verbesserung der Mukus-Befeuchtung (Osmolyte, Ionenkanalmodulatoren) effektive „Rescue-Therapie“ bei Mukoviszidose - Potential als mukokinetische Therapie bei Spektrum von akuten und chronischen obstruktiven Atemwegserkrankungen

LaborRaman AgrawalPenelope Anagnostopoulou Julia DürrBenedikt FritzschingStefanie GehrigSimon GräberGregor ReiterZhe ZhouStephanie HirtzJolanthe Schatterny Heike StichnothDominik LeitzCharlotte van Bodegom

Klinische ForschungOlaf SommerburgMirjam StahlSusanne HämmerlingEva FritzschingCristina Prat KnollCornelia Joachim