isolasi dna sederhana
Post on 11-Jul-2016
262 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
ISOLASI DNA SEDERHANA
LAPORAN PRAKTIKUM
disusun untuk memenuhi tugas Matakuliah Genetika
yang dibimbing oleh Prof. Dr. A. Duran Corebrima, M.Si
Disusun Oleh:
Kelompok 3/Offering A
Dwi Arianita Wulan S (140341602770)
Anis Fitriana Pratama (140341606809)
UNIVERSITAS NEGERI MALANG
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
Februari 2016
A. TUJUAN
Adapun tujuan dilakukannya praktikum ini adalah:
1. Untuk memperoleh keterampilan mengisolasi DNA secara sederhana
B. DASAR TEORI
Pada umumnya, sel mengandung dua asam nukleat yaitu DNA dan RNA.
DNA terletak dalam kromosom, yang dijumpai dalam nukleus, mitokondria, dan
kloroplas. Sedangkan RNA dijumpai di dalam nukleus, sitoplasma dan ribosom.
Di dalam sel mahluk hidup terdapat DNA, dimana zat ini disebut sebagai cetak
biru kehidupan karena mempunyai peranan yang sangat penting, yaitu sebagai
pembawa hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme
lain (Hays, 2005 dalam Jamilah 2005).
DNA (Deoxyribose Nucleid Acid) merupakan struktur makromolekuler
yang disusun oleh sub unit yang disebut mitokondria (Gardner, 1991). DNA
ditemukan pada semua makhluk hidup dari mikroorganisme sampai organisme
tingkat tinggi misal: manusia, hewan dan tanaman. DNA terdapat di dalam sel dan
inti sel. DNA dapat diekstrak dari segala macam organ yangterdapat pada bagian
tubuh mahluk hidup bersel, misalnya pada tumbuhan dapat diekstrak dari daun,
buah maupun dari batangnya (Muladno, 2002).
Untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel dalam jaringan tubuh
makhluk hidup dapat dilakukan suatu teknik isolasi DNA. Zubaidah (2004: 38)
menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan
tetapi pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat menimbulkan masalah
berbeda, antara lain karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam
konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA dan juga
mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi,
atau enzim untuk kegiatan molekuler lain yang dapat menyebabkan DNA tidak
dapat digunakan untuk aplikasi penelitian.
Prinsip teknik isolasi DNA ada berbagai tahap reaksi dengan tujuan yang
berbeda-beda pada setiap tahapnya. Tahap pertama adalah penghancuran dinding
sel, tahap ini dapat dilakukan secara mekanis dan enzimatis. Tahap kedua adalah
melisis sel, cara ini tergantung dari jenis selnya. Tahap ketiga adalah pemurnian
DNA dari sisa-sisa molekul penyusun sel, seperti protein dan lain-lain.
Isolasi DNA dapat dilakukan dengan menggunakan perlakuan deterjen.
Detergen telah lama dikenal masyarakat sebagai bahan untuk membantu dalam
proses mencuci, karena detergen memilki sifat sebagai bahan pengemulsi yang
baik. Detergen memiliki ikatan kimia dengan gugus hidrofil yang bersifat polar
dan gugus hidrofob yang bersifat non polar. Gugus hidrofob inilah yang
bertanggung jawab dalam pengikatan kotoran dari bahan cuci, karena mampu
mengikat senyawa non polar (protein dan lipid) dari lingkungan sekitar dan
membentuk “ protein-lipid-detergen kompleks”, hal inilah yang menyebabkan
detergen menjadi salah satu polutan bagi lingkungan perairan, karena kemampuan
membentuk “ protein-lipid-detergen kompleks” dapat mengakibatkan rusaknya
membran sel orgaisme (Machmud, 2006).
C. ALAT DAN BAHAN
Alat:
1. Blender
2. Timbangan
3. Beaker glass 100 ml
4. Gelas ukur 50 ml
5. Saringan teh
6. Kain saring
7. Corong
8. Pengaduk kaca
9. Spatula
10. Pipet tetes
11. Tabung reaksi
12. Rak tabung Reaksi
Bahan:
1. Buah semangka,melon, jeruk
2. Detergen rinso, wings cream,
sunlight
3. Garam (NaCl)
4. Alkohol 70%
5. Aquades
6. Alkohol 96% (dingin)
7. Kertas saring
8. Kertas label
D. PROEDUR
Memblender satu macam buah (semangka, nanas, jeruk)yang telah dikupas sebanyak 200 gram bersama 200 ml air
aquades hingga halus
Menyaring buah yang telah diblender dengan saringan teh dan menampung hasilnya
Menyaring kembali dengan menggunakan kain saring dan menampung hasilnya ke dalam beaker glass yang berbeda
Menyaring kembali dengan menggunakan corong yang dilapisi dengan kertas saring yang telah dilipat. Mengaduk perlahan
dan hati-hati menggunakan pengaduk kaca untuk memudahkan penyaringan. Menampung hasilnya pada
beaker glass
Menambahkan satu spatula detergen ke dalam masing-masing beaker glass (untuk sabun krim, melarutkannya terlebih dahulu dengan air). Mengaduknya dengan perlahan dan berhati-hati agar tidak berbusa. Memberikan label untuk
masing-masing beaker glass
Membagi hasil saringan ke dalam 3 beaker glass yang berbeda
Setelah detergen larut, menambahkan masing-masing satu spatula garam dapur (NaCl). Mengaduknya perlahan
Menuang masing-masing 10 ml ke dalam tabung reaksi
Memperhatikan pembentukan struktur berwarna putih yang dapat berupa benang-benang serupa kapas, atau seperti
kabut di bagian batas antara alkohol dan larutan. Bentukan yang berwarna putih itulah yang merupakan DNA pada
buah
Mencatat kuantitas dan waktu terbentuk struktur tersebut untuk masing-masing buah dan masing-masing jenis detergen
Menambahkan 5 ml alkohol dingin dengan perlahan melalui dinding tabung reaksi
E. DATA
No. Jenis Buah Jenis Detergen Waktu (s) Kuantitas Keterangan
1. Semangka Rinso 60 ++ Seperti
kabut
Wings cream 40 ++++ Seperti
kabut
Sunlight 13 +++ Seperti
kabut
2. Melon Rinso 43 ++ Seperti
kabut
Wings cream 53 +++ Seperti
kabut
Sunlight 25 ++++ Seperti
kabut
3. Jeruk Rinso 8 ++++ Seperti
kapas
Wings cream 9 +++ Seperti
kapas
Sunlight 13 ++ Seperti
kapas
Keterangan:
+ : sedikit
++ : agak banyak
+++ : banyak
++++ : sangat banyak
Mengulangi langkah di atas untuk jenis buah yang lain
F. ANALISA DATA
Pada buah semangka, ketika jus diberikan larutan detergen rinso, tercatat
waktu hingga 60 sekon hingga terbentuk struktur berwarna putih dengan kuantitas
agak banyak. Kemudian, ketika jus buah semangka pada beaker glass yang lain
diberikan larutan wings cream, dibutuhkan waktu sebanyak 40 sekon hingga
terbentuk struktur berwarna putih dengan kuantitas sangat banyak. Penambahan
larutan sunlight pada beaker glass ketiga yang berisi jus semangka, dibutuhkan
waktu 14 sekon hingga terbentuk struktur berwarna putih. Semua struktur
berwarna putih yang terbentuk pada buah ini bersifat seperti kabut.
Pada buah melon, ketika ditambahkan larutan rinso, dibutuhkan waktu 43
sekon hingga terbentuk struktur berwarna putih dengan kuantitas agak banyak.
Kemudian, pada beaker glass yang berbeda ditambahkan larutan detergen wings
cream dan didapatkan hasil bahwa dibutuhkan waktu 53 sekon hingga terbentuk
struktur berwarna putih dengan kuantitas banyak. Selain itu, pada beaker glass
yang ketiga juga ditambahkan larutan sunlight dan dibutuhkan waktu 25 sekon
untuk membentuk struktur berwarna putih dengan kuantitas sangat banyak. Semua
struktur berwarna putih pada buah melon bersifat seperti kabut.
Pada buah jeruk, ketiga beaker glass yang berisi jus jeruk dan ditambahkan
3 larutan detergen yang berbeda terbentuk struktur berrwarna putih yang bersifat
seperti kapas. Ketika ditambahkan larutan rinso, dibutuhkan waktu 8 sekon untuk
membentuk struktur berwarna putih dengan kuantitas sangat banyak. Ketika
ditambahkan larutan wings cream, pada detik ke 9 sekon baru terbentuk struktur
berwarna putih dengan kuantitas banyak. Kemudian, ketika ditambahkan larutan
sunlight, membutuhkan waktu 13 sekon hingga bisa terbentuk struktur berwarna
putih dengan kuantitas agak banyak.
G. PEMBAHASAN
Dari detergen yang telah digunakan ada yang berpengaruh sangat baik
dalam pembentukan isolasi DNA dan ada pula yang tidak berpengaruh secara
baik terhadap isolasi DNA. Pada pengamatan kali ini macam detergen yang
digunakan sebanyak 3 macam detergen yaitu sunlight, rinso dan cream.
Isolasi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari sel untuk
mendapatkan DNA murni. Hasil akhir dari proses ini adalah strand-strand
DNA yang dapat terpisah dari dalam sel dalam bentuk cincin seperti kabut
putih yang terbentuk antara campuran ekstrak buah, detergen dan garam
dengan alkohol. Sumber DNA yang digunakan pada praktikum kali ini adalah
buah-buahan (jeruk, semangka, melon).
Pada proses memblender buah yang di gunakan sebagai sumber DNA
bertujuan untuk merusak dinding sel, membran sel, dan membran inti secara
mekanik. Kemudian pecampuran dengan garam memiliki fungsi yang sama
dengan SDS pada isolasi DNA genom sel darah putih, yaitu untuk memberikan
kondisi ionik, sehingga reaksi berjalan lebih stabil (Harley 2005: 410).
Selain itu, garam (NaCl)berfungsi untuk menghilangkan protein dan
karbohidrat karena garam dapat menyebabkan keduanya terpresipitasi, dan
bersama-sama dengan detergen, keduanya berfungsi seperti halnya lysing buffer.
Garam juga digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung
oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat
DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak mnolak
satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub
negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul (Dollard, 1994 dalam Jamilah,
2005:21).
Dari pernyataan tersebut, dapat disimpulkan bahwa selain digunakan
untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing
buffer, garam juga membantu proses pemekatan DNA. Sedangkan detergent
berfungsi untuk melisiskan barrier (penghalang) sel secara kimia sebagai
pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel antara
lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa polimerik yang menyebabkan
kekakuan sel dan etil endiamintetra asetat (EDTA) yang berfungsi untuk
menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk mempertahankan keseluruhan
struktur selubung sel, serta menghambat enzim-enzim seluler yang dapat merusak
DNA (ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang bisa “memakan”
DNA). Detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel dengan mengemulsi
lipid dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel
karena detergen mengandung disodium EDTA dan lauryl sulfat yang memiliki
fungsi yang sama dengan dodesil sulfat (Jamilah, 2005:11). Machmud (2006)
menyatakan bahwa penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan
karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang
dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran
membentuk senyawa ”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat
terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik,
demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia.
Pengadukan larutan bertujuan untuk memperbesar pergerakan partikel sel
dan detergen agar reaksi berlangsung cepat, karena detergent merupakan bahan
yang dapat merusak membran sel. Tetapi jika pengadukan tidak secara perlahan
akan menimbulkan buih yang dapat menyebabkan terganggunya proses isolasi
DNA dan akan sulit diamati karena terhalangnya penyatuan DNA di daerah atas
antara etanol absolut dengan campuran ekstrak buah, detergent dan garam akibat
adanya rongga udara yang ditimbulkan oleh adanya buih.
Setelah itu, campuran dari ekstrak buah, detergent dan garam tersebut
dimasukkan dalam tabung reaksi, ditetesi dengan etanol absolut dingin hingga
terlihat adanya cincin seperti kabut putih yang terbentuk di antara campuran
dengan etanol absolut. Penambahan etanol dingin juga bertujuan untuk
mempermudah proses presipitasi DNA. Sehingga DNA yang telah terkumpul
akan mampu terpisah dari larutan dan membentuk lapisan-lapisan yang dapat
diidentifikasi unsur penyusunnya. Etanol bersifat polar sehingga dapat melarutkan
DNA yang juga bersifat polar. Dari hasil isolasi DNA yang dilakukan, diketahui
bahwa jenis detergen berpengaruh terhadap hasil isolasi DNA dan jenis detergen
tertentu memberikan pengaruh paling baik terhadap jenis buah tertentu pula
dengan kadar air berbeda.
Dari hasil yang didapatkan buah jeruk memiliki waktu yang cepat dalam
pengisolasian DNA dibandingkan buah yang lainnya yaitu, 8 detik, 9 detik , dan
13 detik,dan terbentuk menyerupai kapas. Hal ini dikarenakan buah jeruk
memiliki kadar air tinggi namun ada seratnya. Sedangkan pada buah melon dan
semangka meskipun kadar airnya lebih tinggi dibanding jeruk namun DNA yang
terlihat tidak terlalu jelas meskipun waktu DNA terangkatnya pun lebih cepat
dibanding buah jeruk. Dikarenakan pada buah melon dan semangka kandungan
airnya lebih encer dibanding jeruk.
Buah-buah yang memiliki kandungan air yang tinggi sehingga membuat
ekstrak uji menjadi encer, seperti semangka dan melon yang memiliki DNA
murni hanya serabut-serabut tipis saja dengan waktu yang cukup lama
dibandingkan buah-buah lainnya. Secara keseluruhan serabut putih yang tampak
tidak terlihat terlalu jelas bila dibandingkan dengan buah lain.
Buah-buahan dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang
berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air rendah. Semakin tinggi
kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit,
sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.
H. SIMPULAN
Isolasi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari sel untuk
mendapatkan DNA murni. Hasil akhir dari proses ini adalah strand-strand DNA
yang dapat terpisah dari dalam sel dalam bentuk cincin seperti kabut putih yang
terbentuk antara campuran ekstrak buah, detergen dan garam dengan alkohol.
Sumber DNA yang digunakan pada praktikum kali ini adalah buah-buahan (jeruk,
semangka, melon).
Proses memblender buah yang di gunakan sebagai sumber DNA bertujuan
untuk merusak dinding sel, membran sel, dan membran inti secara mekanik.
Kemudian dibikin homogen dengan garam memiliki fungsi yang sama dengan
SDS pada isolasi DNA genom sel darah putih, yaitu untuk memberikan kondisi
ionik, sehingga reaksi berjalan lebih stabil (Harley 2005: 410).
Buah jeruk memiliki waktu yang cepat dalam pengisolasian DNA
dibandingkan buah yang lainnya. dikarenakan buah jeruk memiliki kadar air
tinggi namun ada seratnya. Sedangkan pada buah melon dan semangka meskipun
kadar airnya lebih tinggi dibanding jeruk namun DNA yang terlihat tidak terlalu
jelas meskipun waktu DNA terangkatnya pun lebih cepat dibanding buah jeruk.
Dikarenakan pada buah melon dan semangka kandungan airnya lebih encer
dibanding jeruk
DISKUSI
1. Jelaskan fungsi reagen-reagen pada praktikum isolasi DNA:
a. Detergen
b. Garam
c. Alkohol
2. Apa fungsi pemblenderan buah pada proses isolasi DNA?
2. Mengapa pada proses pengadukan tidak boleh berbusa?
3. Mengapa alkohol yang ditambahkan diharus dalam keadaan dingin?
4. Mengapa pada macam detergen yang berbeda diperbolehkan kuantitas
DNA dan waktu pembentukan yang berbeda?
5. Mengapa pada macam buah yang berbeda diperoleh kuantitas DNA
dan waktu pembentukan yang berbeda?
Jawaban
1. fungsi reagen-reagen pada praktikum isolasi DNA berikut:
a. detergen
jawab: Detergen berfungsi memecah membran sel (baik membran
sitoplasma maupun membran nukleus). Molekul detergen dan lemak
terdiri dari dua bagian, yaitu bagian kepala yang suka dengan air
(hidrofil) dan bagian ekor yang beni dengan air (hidrofob). Bagian yang
hidrofob akan berikatan dnegan molekul lemak dan protein yang
menyusun membran sel sedangkan bagian hidrofil akan berhubungan
dengan air
b. garam
Jawab: garam dapur (NaCl) dapat melisiskan sel yaitu dengan membuat
kondisi hipertonis sehingga sel mengalami plasmolisis. NaCl juga
berguna untuk melisiskan membran sel, bekerja pada molekul
oligosakarida dan glikoprotein pada membran
c. alkohol
Jawab: Alkohol dingin berfungsi untuk memisahkan DNA dengan
molekul yang lain seperti protein. Alkohol mempunyai molekul yang
lebih pdat dan ringan daripada air sehingga akan berada pada permukaan
campuran. Protein dan lemak akan berada pada bagian bawah sedangkan
DNA akan memisah dan berada pada daerah alkohol. Selain itu, alkohol
dingin akan mempercepat pembentukan fase gel DNA karena dalam
keadaan panas akan memperlambat pembentukan gel
1. pemblenderan berfungsi untuk mengeluarkan DNA dari dalam sel. Cara
untuk merusak membran sel itu salah satunya dengan pemblenderan.
3. Karena busa yang ditimbulkan oleh detergen akan mengganggu
pengamatan, karena DNA yang berhasil diisolasi nampak tipis, dan
dapat dipastikan lapisan DNA tersebut akan tertutupi jika terdapat
banyak busa. Disamping itu juga adanya busa akan dapat merusak
pembentukan DNA. Selain itu karena sel dapat mengalami lisis yang
disebabkan karena rusaknya dinding dan membran sel.
4. Penambahan alkohol dingin akan mempermudah koagulasi DNA
sehingga DNA yang bersifat transparan dapat terlihat dengan jelas
berupa benang-benang halus pada lapisan tengah campuran buah dan
detergen, selain itu juga karena pada alkhohol yang dingin dapat
membentu mempercepat proses mempertifikasi DNA dan jika alkohol
yang dingin yang diberikan maka konsentrasi DNA yang akan terikat
oleh alkohol tersebut akan semakin pekat.
5. Karena dari hasil isolasi DNA yang dilakukan, dapat diketahui bahwa
jenis detergen berpengaruh terhadap hasil isolasi DNA dan jenis detergen
tertentu memberikan pengaruh paling baik terhadap jenis buah tertentu
pula dengan kadar air berbeda.
6. Sebab jenis buah berpengaruh terhadap hasil isolasi DNA. DNA pada
masing-masing buah mempunyai kadar atau jumlah yang berbeda dan
warnanya pun berbeda. Buah-buahan dengan kadar air tinggi akan
menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah
berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di
dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi
juga akan sedikit.
LAMPIRAN
Isolasi DNA pada Semangka Isolasi DNA pada Jeruk
Isolasi DNA pada Melon
DAFTAR PUSTAKA
Clark, M. John. 1963. Experimental Biochemistry. San Fransisco: WH Freeman
and Company.
Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: Jurusan Biologi FMIPA UM.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan
Ekstrak Nanas (Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai
Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi
tidak diterbitkan. Malang: Program Sarjana Biologi.
Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of Genetics. Englewood :
Prentice-Hall Inc.
Machmud, wildan. 2006. Penentuan LC 50 48 Jam Detergen dan Pengaruhnya
Terhadap Mortalitas Larva Ikan Mas (Cyprus Corpio) Ras Punten
dengan tipe Ploidi Yang Berbeda. Skripsi tidak diterbitkan. Malang:
Program Sarjana Biologi
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka
Wirausaha Muda
top related