istra živanja genoma čoveka

Istraživanja genoma čoveka

I. Novaković

Nasledna osnova čoveka

• Podeljena je u 23 para hromozoma– + DNK u mitohondrijama

99.9995%0.0005%

Organizacija humanog genoma

g en i u jedn o j ili p ar ko p ijan p r.: za h orm on rasta,

in su lin , d istrofin

clano vi u tan dem sko m n izun p r.: za rRNK, tRNK

sn RNK, h iston e

clano vi rasu ti u g eno m un p r.: g en i za g lob in ske lan ce,

im u n og lob u lin e, kolag en

fam ilije g ena

kod irajuca DNK(~10% )

p seu d og en ifrag m en ti g en ain tron i, sekven ce kojese n e p revod e itd .

n eko d iraju ca DNK(~90% )

geni i s rodne sekvenc e(~30% )

jed in stven e sekven ceili m ali b roj kop ija

(~80% )

tan d em ska il i n etan d em ska p on avljan jarasu ti p on ovci

sred n je d o visoko rep etitivn esekven ce

(~20% )

DNK van gena(~70% )

GENOM J EDR A3000 Mb

oko 30.000 g en a

13 g en a za i RNK22 g en a za tRNK2 g en a za rRNK

M IT OHONDR IJ A L N I GENOM16,6 Mb37 g en a

HU M A N I GENOM

Jedinstvene ili srednjerepetitivne sekvence

Humani genom:

3x109 parova svaki 1000. nukleotid

nukleotida je polimorfan

Razlike u nukleotidnom sastavu tj. gradji DNK koje se sreću u populaciji zdravih ljudi f alela > 1%, hetrozigoti > 2% Genetički markeri, DNK profil, predispozicija za

bolest...

3x109 bp

Genetički-DNK polimorfizam

Tipovi DNK polimorfizma

Polimorfizam pojedinačnih nukleotida (SNP)

Različiti broj uzastopnih

ponovaka (VNTR, CNV)

Deleciono/insercione varijante

(CA)10 = ALEL 2(CA)15 = ALEL 3

(CA)5 = ALEL 1

(CA)20 = ALEL 4(CA)25 = ALEL 5

AAGGT C ili T GTTC

Izvori DNK za analizu

Biološki materijal u kome su

ćelije sa jedrom: krv horionske resice, amnionska tečnost, krv iz pupčanika bris bukalne sluzokože trag telesne tečnosti koren dlake ...

PCR – lančana reakcija polimerizacijemolekula DNK

PCR (

umnožavanje odredjenog segmenta DNK pomoćuenzima Taq polimeraze

Real-time PCR

Sekvenciranje DNK

“Genski čip”- test hibridizacije na mikroploči

“Genski čip”- test hibridizacije na mikroploči

Genetička osnova bolesti

• Hromozomske aberacije

• Monogenske bolesti– AD, AR– X vezano– preko mtDNK

• Poligenske bolesti

monogenskeforme

poligenske/multifaktorske forme

Rodoslovna stabla

muškarac

žena

nepoznat pol

brak

aficirana osoba

mrtva osoba

prenosilac X-vezanerecesivne osobine

brak u srodstvu

dvojajčani blizanci

jednojajčani blizanci

bez potomstva

heterozigot zamutaciju koja seprenosi autozomima

proband

Mutacije gena

– Delecije = gubitak dela ili celog gena– Duplikacije/insercije = “višak” dela gena– Supstitucije (point mutacije) = zamena jednog

para baza drugim parom– Povećanje broja ponovaka u genu

Rezultat: Protein za koji je gen zadužen je

IZMENJEN ili ODSUTAN

Segregaciona analiza

• Na koji način se svojstvo-bolest prenosi u porodici?

• Da li način prenošenja odgovara nekom od Mendelskih načina nasleđivanja:

•AR, AD•XR, XD•Y

Mapiranje gena = određivanje mesta tj. pozicije u genomu

METODE MAPIRANJA GENA

funkcionalno poziciono

protein

RNK

DNK

1,2 2,3

1,3 1,4 3,4

1,4

2,4

Lod skor > 3

Linkage analiza

Linkage analiza –analiza vezanosti

• Zajedničko nasleđivanje dve (ili više) osobina– Osobina + osobina

• Osobina + bolest• Bolest + bolest

Odgovorni geni se nalaze na istom

hromozomu

Analiza vezanosti = Analiza polimorfnih DNK markera u genomu

Lod skor

• Lod > 3 verovatnoća vezanosti lokusa

= 103 : 1 = 1.000 : 1 (

• Lod < -2 verovatnoća vezanosti lokusa

= 10-2 : 1 = 0,01 : 1

Fahrov sindromIdiopatska kalcifikacija bazalnih

ganglija

Am. J. Hum. Genet. 65:764–772, 1999

Identification of a Locus on Chromosome 14q for Idiopathic Basal Ganglia Calcification (Fahr Disease)Daniel H. Geschwind,1,2 Maxim Loginov,1,2 John M. Stern21Neurogenetics Program and 2Department of Neurology, UCLA School of Medicine, Los Angeles

III-15a 73 60 Parkinsonizam, distonijaIII-18 76 70 ParkinsonizamIII-26 70 58 disfagija, ParkinsonizamIV-7 50 23 psihoza, ParkinsonizamIV-25 52 37 fokalna distonija, tremor, napadi panikeIV-27 58 * grčevi, jerkingIV-32 43 36 ataksija, tremorIV-45 46 37 fokalna distonija, disfagijaIV-49 41 40 ParkinsonizamIV-51 40 18 tremor pri pisanju, fokalna distonija, horeaV-4 38 * fokalna distonija, grčeviV-74b 29 12 fokalna distonija, tremorV-75b 28 13 Tremor, disfagijaV-83 10 6 disfagija, fokalna distonijaV-84 9 5 Tremor, distonija

*početak ne (10–20 years, by history).a Pozitivan CT, poznata klinička slika, ali nije ispitivan(deceased).b Verovatno aficiran (negativan CT, <30 god.)

starost početak glavni simptomi

Mapiranje gena = određivanje mesta tj. pozicije u genomu

Mapiranje gena = određivanje mesta tj. pozicije u genomu

14q13-21

Genomics 84 (2004) 577–586

Cloning, genomic structure, and expression profiles of TULIP1(GARNL1), a brain-expressed candidate gene for 14q13-linkedneurological phenotypes, and its murine homologue

Thomas Schwarzbraun,a John B. Vincent,b Axel Schumacher,b Daniel H. Geschwind,c Joao Oliveira,c Christian Windpassinger,a Lisa Ofner,a Michael K. Ledinegg,a Peter M. Kroisel,a Klaus Wagner,a and Erwin Peteka,*

a Institute of Medical Biology and Human Genetics, Medical University of Graz, Harrachgasse 21/8, A-8010 Graz, AustriabNeurogenetics Section, Centre for Addiction and Mental Health, Clarke Division, 250 College Street, Toronto, ON M5T 1R8, Canadac Department of Neurology and Neurogenetics Program, David Geffen School of Medicine, University of California at Los Angeles,Los Angeles, CA 90095, USA

Gen kandidat….

Ali...

American Journal of Medical Genetics Part B (Neuropsychiatric Genetics) 147B:1319–1322 (2008)Brief Research Communication

Exclusion of Linkage to Chromosome 14q in aLarge South Tyrolean Family With IdiopathicBasal Ganglia Calcification (IBGC)

Claudia Be´u Volpato,1* Alessandro De Grandi,1 Ebba Buffone,2 Irene Pichler,1 Uwe Gebert,3 Gunther Schifferle,4Rudolf Scho¨nhuber,2 and Peter P. Pramstaller1,2,51Institute of Genetic Medicine, European Academy, Bolzano, Italy2Department of Neurology, Central Hospital, Bolzano, Italy3Department of Radiology, Marienklinik, Bolzano, Italy4Department of Radiology, Central Hospital, Bolzano, Italy5Department of Neurology, University of Lubeck, Lubeck, Germany

J Mol Neurosci (2009) 39:346–353

2q37 as a Susceptibility Locus for Idiopathic Basal GangliaCalcification (IBGC) in a Large South Tyrolean Family

Claudia Béu Volpato, Alessandro De Grandi, Ebba Buffone, Maurizio Facheris,Uwe Gebert, Günther Schifferle, Rudolf Schönhuber, Andrew Hicks &Peter P. Pramstaller

Mapiranje gena za ICBG

FS 9 FS 7 FS 5 FS 3 FS 4

FS 1 FS 8

FS 2 FS 6

2 42 21 21 31 12 1

FS4

D14s596 2 4D14s1014 1 2

D14s75 1 2D14s306 3 3D14s288 3 1D14s259 2 1

FS15 24 25 11 12 11 2

FS8

2 51 41 53 13 22 1

FS32 33 31 32 23 11 1

FS5

3 53 43 52 11 21 1

FS62 21 31 13 23 32 1

FS2

2 12 31 43 32 22 1

FS74 22 41 11 23 31 1

FS9

Analiza vezanosti u porodici iz Srbije

= 0.00

D14s596 -3.36

D14s1014 -2.998

D14s75 -3.132

D14s306 -6.573

D14s288 -3.345

D14s259 -5.876

haplotip -5.706

Kostić Vladimir, M. Lukić-Ječmenica, I. Novaković, V. Dobričić, L. Brajković, M. Krajinović, C. Klein, A. Pavlović: Exclusion of linkage to chromosomes

14q, 2q37 and 8p21.1-q11.23 in a Serbian family with idiopathic basal ganglia calcification. J Neurol. 2011;258(9):1637-42.

Wang C, Li Y, Shi L, Ren J, Patti M, Wang T, de Oliveira JR, Sobrido MJ, Quintáns B,

Baquero M, Cui X, Zhang XY, Wang L, Xu H, Wang J, Yao J, Dai X, Liu J, Zhang L, Ma H, Gao Y, Ma X, Feng S,

Liu M, Wang QK, Forster IC, Zhang X, Liu JY

"Mutations in SLC20A2 link familial idiopathic basal ganglia calcification with phosphate homeostasis". Nat Genet 44 (February 2012).

Sodium-dependent phosphate transporter 2 PIT-2, inorganic phosphate transporter

8p12-p11

Mutations in SLC20A2 are a Major Cause of Familial Idiopathic Basal Ganglia Calcification

Neurogenetics, November 2012

F5 Family c.583_584delGT

F1 Family c.508delT

ICBG porodica iz Srbije

• Nema mutacije u SLC20A2 genu!

• GENETIČKA HETEROGENOST!

NATURE METHODS, VOL.5 NO.1, JANUARY 2008

Next-generation sequencing transforms today’s biologyStephan C Schuster

Poligenske bolesti

Genetička osnova

(više parova gena)

Faktori sredine

fenotip

Studije asocijacije

Udruženost genskih polimorfizama sa nekom od poligenskih bolesti.

Sklonost tj. podložnost!

Pristupi u izučavanju multifaktorske osnove bolesti

• Studije asocijacije

Geni kandidati

Čitav genom

bolesni zdravi

Učestalost polimorfizma:

:

Izbor gena-kandidata

– Na osnovu poznavanja etio-patogenetskih činilaca

– Geni identifikovani u analizama vezanosti

– Geni identifikovani kod animalnih modela

Alzheimer-ova demencija

– ApoE polimorfizam4 alel PREDISPOZICIJA!

– ranije obolevanje (4/4, 4/3) !– 50-75% heterozig. NE OBOLEVA!– drugi geni, faktori sredine...

genotip AD Kontr. AD Kontr.

4/4, 4/3, 4/2 64% 31% 47% 17%

3/3, 2/3, 2/2 36% 69% 53% 83%

S A D Japan

Studije asocijacije u čitavom genomu(Genome Wide Association Studies, GWAS)

Studije asocijacije čitavog genoma(Genome Wide Association Studies, GWAS)

• Simultana analiza >10.000 SNP

• Microarray tehnologija

(genski čip)

GWAS i Alzheimerova bolest

GWAS i Alzheimerova bolest

GWAS i Alzheimerova bolest

GWAS i Alzheimerova bolest

GWAS i Alzheimerova bolest

GWAS i Alzheimerova bolest

• Meta analiza 12 GWAS studija

• + 5,043 ispitanika sa Mayo klinike

(2,455 AB : 2,588 K)

“Investigation of 15 of the top candidate genes for late-onset Alzheimer’s disease” Belbin et al, 2011

GWAS i Alzheimerova bolest

• BIN1, bridging integrator-1 • CLU, clusterin ili complement lysis inhibitor (CLI) • CR1,complement receptor

• EXOC3L2, exocyst complex component 3-like 2 • PICALM phosphatidylinositol binding clathrin assembly protein

imunomodulacija

unutraćelijski transport

GWAS i Alzheimerova bolest

• TNK1, tyrosine kinase, non-receptor, 1 • GAB2, GRB2-associated-binding protein 2 (adapter,

aktivator fosfatidil inozitol kinaze 3)

• LOC651924 • GWA_14q32.13,

• PGBD1, piggyBac transposable element derived 1

• EBF3, early B-cell factor 3 Regulator ćelijskog ciklusa, TSG

PSEUDOGEN, sličan sa Ubiquitin-like 1-activating enzyme E1B

“A genome-wide survey of human short-term memory”

• 909.622 lokusa

• Faza 1: Švajcarska (333 ispitanika)– Faza 2: Švajcarska (254 ispitanika)– Faza 3: Nemačka (922 ispitanika)– Faza 4: Srbija (523 ispitanika)

A Papassotiropoulos etal, 2010

“A genome-wide survey of human short-term memory”

rs6731900rs565348

rs10930201

rs2278729

rs11235714

rs225344

Hromozom 2 11 21

Gen SCN1A (sodium channel, voltage-gated, type I, alpha subunit)

SCN1A (rs10930201) genotip:

AC AA

…Funkcionalna NMR

"A genome-wide survey and functional brain imaging study identify CTNNBL1 as a memory-

related gene"

• CTNNBL1 = Beta catenin like protein 1• Hromozom 20

A Papassotiropoulos etal, , 2011.

Problemi kod studija asocijacije

• Nekonzistentnost rezultata usled:

– Različite brojnosti ispitivanih populacija

– Geografskih/etničkih specifičnosti

– Razlika između polova

– Sadejstva gen-gen i gen-sredina

“Missing heritability”

B. Maher, Nature, 2008

Moguća objašnjenja

• Rešenje nam je “pred nosom”

• Odgovorne su retke varijante SNPs, koje GWAS ne analiziraju

• Ključne su CNV (copy number variations) a ne SNP

• U pitanju je vrlo složena interakcija gena i sredine, kroz generacije...

Sinteza proteina:transkripcija i translacija

DNK

RNK

obrada

translacija

G* AAAAAA

Era OMIKS-a

• Genom– Egzom (sve kodirajuće sekvence)

• Transkriptom

• Proteom

• Metabolom

• Interaktom

• ….