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FORSCHUNG & ENTWICKLUNG
Automatisierte mikroskopische
tung zum Nachweis von Cryptosporidien
und Giardien in Wasserproben
Im Rahmen eines DVGW-Forschungsvorhabens wurde eine automatisierte mikroskopische
Auswertungsmethode für Cryptosporidien und Giardien entwickelt und erprobt.
S eit einigen Jahren werden zunehmend Wasserproben auf die parasi
tischen Protozoen Cryptosporidien und Giardien untersucht. Diese Protozoen sind Erreger von Durchfallerkrankungen beim Menschen, und es wurden für beide Erreger mehrere Epidemien beschrieben, die auf kontaminiertes Trinkwasser zurückzuführen waren [1 J. Dies ist vor allem dadurch bedingt, dass die mit den Fäkalien befallener Wirtsorganismen ausgeschiedenen Cysten (bei Giardien) bzw. Oocysten (bei Cryptosporidien) als Dauerstadien sehr resistent insbesondere gegenüber den bei der Trinkwasseraufbereitung üblichen Desinfektionsverfahren sind. Eine Desinfektion alleine stellt daher auf Grund der hohen Resistenz der Cysten und Oocysten keine ausreichende Aufbereitung dar [1, 2J.
Die Cryptosporidien-Oocysten sind in der Regel rund und weisen einen Durchmesser von 4-6 IJm auf, während die Giardien-Cysten oval sind und der Längsdurchmesser etwa 14 IJm und der Querdurchmesser etwa 10 IJm beträgt [1]. Der Nachweis dieser Oocysten und Cysten ist sehr zeit- und arbeitsaufwändig und erfordert die Verarbeitung sehr großer Probenvolumina, da diese Protozoen nur in recht geringen Konzentrationen (1 bis 10/100 I) in Wässern vorkommen. Üblicherweise werden ca. 100 bis 500 Liter Wasser angereichert.
Nach einem Primäranreicherungsschritt über Filterkartuschen muss das angereicherte Sediment unter anderem durch Zentrifugationsschritte so gereinigt werden, dass möglichst nur die Partikel in der Größenklasse von 4-14 IJm erhalten werden. Die resultierende Peilet-Suspension wird über Membranfilter filtriert. Auf diesen erfolgt die Markierung durch spezifische fluoreszenzmarkierte Antikörper. Die Antikörper werden spezifisch
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1: Beispiel für die oetektion von Konturpunkten
2: Konturpunkte nach Anwendung des Verdünnungsveffahrens
3: Verkettung der Konturpunkte
o'J 4: Empsenanpassung und Erkennung der ringförmigen Struktur
5: Beispiel für die effolgreiche oetektion eines Einzellers
Abb.: Oie fünf Schritte der Bildauswertung
an die Oberflächenstrukturen der Protozoen angelagert, sodass diese im Epifluoreszenzmikroskop durch eine typische ringförmige, apfelgrüne Fluoreszenz erkennbar sind. Da normalerweise nur sehr wenige Einzeller pro Kubikmeter Trinkwasser vorhanden sind, ist es erforderlich, das komplette Filter mikroskopisch auszuwerten. Der Einsatz eines statistischen Verfahrens durch Auswertung von Stichproben scheidet auf Grund der geringen Konzentration aus. Falls sehr viel Sediment bzw. Peiletvolumen vorliegt, müssen unter Umständen mehrere Membranfilter von 25 Millimeter Durchmesser mikroskopisch auf die..., Partikel der entsprechenden Größe und Form mit der spezifischen Fluoreszenz durchsucht werden. Diese mikroskopische Auswertung ist somit der zeitaufwändigste Schritt (etwa zwei Stunden pro Filter), der außerdem nur von geschultem Personal durchgeführt werden kann.
Die Automatisierung der Auszählung kann durch die Anwendung von Flow-Cytometern oder Solidphase Laserscannern erfolgen, die allerdings nur in medizinischen Labors verbreitet sind und deren Anschaffung sehr teuer ist.
In den meisten Laboratorien, die diese Untersuchungen durchführen, wird deshalb die mikroskopische Auswertung vorgenommen. Die Personalkapazität eines Wasserlabors wird dadurch sehr stark belastet. Fast alle auszuwertenden Gesichtsfelder enthalten viele Fremdkörper und nur wenige die gesuchten Protozoen, sodass die Konzentrationsfähigkeit eines menschlichen Betrachters nachlassen kann. Dieses Nachlassen der Auswerteleistung birgt die Gefahr in sich,
~ dass Protozoen insbesondere nach län~ gerer Tätigkeit in nicht vertretbarem Aus8 maß übersehen werden.
energie I wasser-praxis 2/2005
Zielstellung Das Ziel dieses Projektes war daher eine Automatisierung des mikroskopischen Auswerteverfahrens für Cryptosporidien und Giardien. Die Membranfilteroberflächen sollen dabei über ein Epifluoreszenzmikroskop in Verbindung mit einer empfindlichen Videokamera und einem PC-gesteuerten Kreuztisch vollständig untersucht und durch ein Bildanalysesystem die "verdächtigen" Befunde mit Lage und Aussehen gespeichert werden. Dadurch ist vom Fachpersonal nur eine Verifizierung vorzunehmen, was eine deutliche Zeit- und Kostenersparnis bedeutet und auch geringere Fehlermöglichkeiten beinhaltet.
Käufliche Bildanalyseverfahren können nur mit erheblichen Modifikationen bzw. einer völligen Neukonzeption eingesetzt werden. Deshalb wurde schließlich der Auftrag zur Erstellung der Software an die Firma Gevitec vergeben, die auf Bildauswerteverfahren spezialisiert ist und die Erarbeitung, Erprobung sowie Installation direkt im mikrobiologischen Labor des DVGW-Technologiezentrums Wasser (TZW) vornahm.
Im Rahmen des Projektes stand ein Epifluoreszenzmikroskop mit motorgetriebenen XY-Kreuztisch und Z-Antrieb einschließlich Schrittmotorsteuerung sowie eine Schwarz-Weiß-CCD-Kamera zur Verfügung. Ziel des Projektes war die Entwicklung eines Bildauswertungssystems bestehend aus einem Arbeitsplatzrechner mit Bildeinzugskarte und einem Programmpaket, das möglichst vollautomatisch die Auswertung der Membranfilter durchführt.
Implementiertes Auswertesystem Zunächst wurden die Schnittstellenprogramme entworfen und implementiert, sodass sich der XY-Kreuztisch und der Z-Antrieb vom Arbeitsplatzrechner ansteuern ließen und die aktuelle Position abgefragt werden konnte. Anschließend wurden die Programme zur Bildaufnahme und Bildarchivierung auf Festplatte installiert.
Auch die grafische Benutzeroberfläche wurde erstellt, die sowohl die Ansteue
rung des Kreuztisches und Z-Antriebes als auch die Bilddarstellung und -abspeicherung ermöglicht. Darüber hinaus ist dadurch auch der automatische Ablauf festzulegen.
Nachdem die Implementierung der Hardwaresteuerung des Mikroskops und des Kreuztisches abgeschlossen waren, konnte mit der Entwicklung der Software für die Bildauswertung begonnen werden. Hierzu wurden Proben mit angefärbten Cryptosporidien und Giardien mikroskopisch analysiert und der Bildauswertung unterzogen.
Es gelang, ein leistungsfähiges Verfahren zur Bestimmung von Bereichen mit optimaler Schärfe zu erstellen. Dabei hängt die hierfür benötigte Rechenzeit von der notwendigen Rauschunterdrückung ab.
Darüber hinaus gelang es, das Bildauswerteverfahren zur Erkennung der Cryptosporidien und Giardien zu erstellen und zu implementieren. Die Erkennung beruht auf der Detektion der angefärbten Zellwand der Einzeller, die als ringförmige Struktur im Mikroskop sichtbar ist.
Der bei dem implementierten Bildauswertungsverfahren verfolgte Ansatz besteht darin, die mit fluoreszierendem Farbstoff markierte Zellwand der Einzeller zu detektieren. Dieser Ring ist ausreichend charakteristisch für die zu detektierenden Einzeller und kann daher als Schlüsselmerkmal herangezogen werden. Nach den Ergebnissen lassen sich die Zellwandringe mit ausreichender Genauigkeit durch Ellipsen beschreiben, wobei je eine innere und äußere Ellipse an den Ring angepasst werden kann. Die Unterscheidung zwischen Cryptosporidien und Giardien erfolgt über die unterschiedlichen Halbmesser und die Dicke des Rings, da sich die beiden Gruppen deutlich in der Größe unterscheiden.
Die Bildauswertung erfolgt nach dem Bildeinzug in den Schritten - Detektion von Konturpunkten - Verdünnung der Konturpunkte - Verkettung der Konturpunkte - Ellipsenanpassung - Erkennung ringförmiger Strukturen und - Zuordnung zu Ein
zeller-Klassen. Die Ausführung der verschiedenen Algorithmen erfolgt hintereinander im Pipelinebetrieb. Um die äußere und innere Ellipse des Zellwandringes zu bestimmen, werden bei dem implementierten Ansatz zuerst die Konturpunkte detektiert. Ein Bildpunkt (Pixel) wird dabei als Konturpunkt bezeichnet, wenn an seiner Position ein Hell-Dunkel-Übergang im Bild maximalen Kontrast besitzt. Die Abbildung verdeutlicht die nacheinander vorzunehmenden Schritte.
Anforderungen an die Implementierung Als Probleme sind zwei Faktoren zu nennen: zum einen die reine Datenmenge, die abgespeichert werden muss und zum anderen der notwendige Zeitbedarf. Die für eine Tiefenebene anfallende Datenmenge berechnet sich wie folgt: Die Filteroberfläche beträgt 490 mm2 bei einem Durchmesser von 25 mm. Die Größe der zu detektierenden Einzeller (Cryptosporidien) liegt bei ca. 4-6 fl.m. Für eine sichere Detektion der charakteristischen Merkmale (Zellwand-Ring) wird eine Abbildungsgröße von ca. 30 Bildpunkten gefordert. Es ergibt sich eine Auflösung von 0,14 j.Lm pro Bildpunkt. Die Auflösung der eingesetzten Kamera beträgt 720 x 576 Bildpunkte. Das Gesichtsfeld der Kamera überdeckt dadurch 0,0079 mm2.
Bei einer vorgegebenen Überlappung der Gesichtsfelder von zehn Prozent werden ca. 70.000 Aufnahmen pro Tiefenebene benötigt.
Der Speicherbedarf für eine Aufnahme (8 Bit Grauwertauflösung) beträgt ca. 395 kByte. Für jede Tiefenebene benötigt man daher ca, 27 GByte Festplattenkapazität. Festplatten mit 200 GByte Kapazität stehen zum heutigen Stand der Technik zur Verfügung, und es lassen sich bis zu drei Festplatten ohne Zusatzaufwand in einen Arbeitsplatzrechner einbauen. In dieser Ausbaustufe lassen sich 22 Tiefenebenen abspeichern. Die Kamera liefert die Bildinformation mit 25 Bildern pro Sekunde. Für die Aufnahme einer Tiefenebene werden ca. 47 Minuten benötigt. Bei der derzeit notwendigen Anzahl von 30 Tiefenebenen würde der Gesamtzeitbedarf bei 23,5 Stunden ~
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FORSCHUNG & ENTWICKLUNG
Tabelle 1: Derzeitiges und prinzipiell mögliches Auswertesystem im Vergleich zur manuellen Auswertung
Anzahl Zeitaufwand Speicherbedarf Tiefenebenen
Manuelle Auswertung
Implementierung mit vorhandener Hardware
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Implementierung mit verbesserter Hardware
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liegen. Hierfür wären 81 0 GByte erforderlich, wobei man derzeit nur 3 x 200 GByte in einem Arbeitsplatzrechner verwalten kann.
Zur Reduzierung der Anzahl der Tiefenebenen wäre eine automatische Einstellung der aktuellen Schärfenebene erforderlich, die allerdings durch das starke Bildrauschen erschwert wird. Dies wiederum hängt von der eingesetzten Kamera ab. Daneben wäre auch eine dynamische Anpassung der Anzahl der Tiefenebenen denkbar, die allerdings ebenfalls eine ausreichend empfindliche Kamera erforderte, die auch außerhalb der Schärfenebene das Fluoreszenzleuchten eines Objektes detektiert.
Anforderungen an die Kamera Die Anforderungen an die Kamera sind generell der Dreh- und Angelpunkt für weitere Optimierungsmöglichkeiten. Die im Rahmen des Projektes implementierten Bildauswerteverfahren zur Detektion und Klassifikation von Einzellern wurden an zahlreichen Aufnahmen von verschiedenen Filterproben überprüft. Die Aufnahmen wurden dabei im stationären Zustand gewonnen, d.h. ohne Bewegung des Kreuztisches. Nach dem bisherigen Kenntnisstand lässt sich mit den Bildauswerteverfahren eine sichere Detektion erreichen, wenn die vom Sensor gelieferten Bilddaten ein ausreichendes SignalRausch-Verhältnis aufweisen. Dies wird von den getesteten CCD-Kameras im stationären Zustand erreicht. Die Qualität der Kamerabilder nimmt jedoch beim kontinuierlichen Abtasten der Filteroberfläche stark ab. Dafür sind die folgenden Ursachen ausschlaggebend:
• Die kamerainternen Regelkreise für die Anpassung des Verstärkungsfaktors funktionieren nicht mehr, da sich die im Vergleich zur Umgebung recht hellen Objekte nur kurz im Blickfeld der Kamera befinden.
> 2 h (Personal)
23,5 h (Rechenzeit) 0,3 h (Personal) 810 GByte
~1,8 h (Rechenzeit) 0,3 h (Personal) 67 GByte 'ffi
a;
<3
• Bedingt durch das Zeilensprungverfahren bei Videokameras, bei dem die Sensorinformation in zwei verzahnten Halbbildern (gerade und ungerade Zeilennummern) ausgelesen wird, treten an den vertikalen Konturen Störungen durch Ausfransen der Konturen auf.
Basierend auf den bisherigen Erfahrungen werden an eine für diese Anwendung geeignete Kamera die Forderungen hohe Auslesegeschwindigkeit, hohe Empfindlichkeit, hohe Dynamik und geringes Bildrauschen gestellt.
Fazit Mit dem derzeit am TZW implementierten System ist eine automatische Erkennung der Cryptosporidien und Giardien möglich. Um alle Tiefenebenen und die gesamte Filterfläche sicher abzudecken, war bei der eingesetzten Computertechnik noch ein sehr hoher Zeitbedarf erforderlich. Außerdem wurden die Speicherkapazitätsgrenzen des eingesetzten Arbeitsplatzrechners erreicht, da die notwendige Speicherkapazität 810 GByte beträgt.
Allerdings zeigte sich im Betrieb mit bewegter Kamera (bzw. bewegtem Filter), dass dadurch die Bildqualität so stark abnimmt, dass ein vollautomatisches Absuchen der Filteroberfläche derzeit nicht möglich ist. Als weitere Entwicklung müsste daher eine hoch empfindliche und gleichzeitig hochdynamische Kamera eingesetzt werden. Solche sind zwar in Entwicklung, aber noch nicht kommerziell für diesen Einsatzzweck verfügbar. Eine Bildauswertung mit Echtzeit-Filterung (Bildeinzugskarte mit Vorverarbeitungsfunktion) wäre prinzipiell verfügbar, müsste jedoch noch an das Gesamtsystem angepasst werden. Eine dynamische Tiefenschärfeanpassung müsste ebenfalls noch erarbeitet werden.
Wären diese drei Randbedingungen in absehbarer Zeit zu lösen, ließe sich der
Gesamtzeitbedarf auf rund 1,8 Stunden und die Speicherkapazität auf 62 GByte verringern. Dementsprechend ist zur Weiterentwicklung dieses Verfahrens noch eine Optimierung der Hardwarekomponenten erforderlich. Die Problematik der großen Datenmengen ist bei Automatisierungsverfahren insbesondere bei Echtzeitanforderungen in der Bildauswertung nicht trivial und diese wird daher zumindest derzeit noch durch die Hardware begrenzt.
Ein Vergleich des prinzipiell Erreichbaren mit dem derzeit implementierten System ist in der Tabelle 1 zusammengestellt.
Durch Einsatz der elektronischen Bildauswertung mit einer optimieren Hardwareausstattung ließe sich demnach eine Senkung des Personal- und Zeitaufwandes für die Giardien- und Cryptosporidien-Analytik im Vergleich zur bisher eingesetzten manuellen Auswertung erreichen. Darüber hinaus könnten Fehler bedingt durch das Nachlassen der Konzentrationsfähigkeit des Betrachters vermieden werden. Mittelfristig ist daher eine Weiterverfolgung dieses Ansatzes durchaus sinnvoll, wobei jedoch zunächst die weitere Entwicklung in der Hardwaretechnologie abgewartet werden muss.
Literatur'
[IJ Wiedenmann, A: Cryptosporidien und Giardien. In: Schulze, E. (Hrsg.): Hygienisch mikrobiologische Wasseruntersuchungen, 1996.
[2J Rödelsperger, M. u. Rohmann, U.: Möglichkeiten der Rohwasserbehandlung zur Inaktivierung von Cryptosporidien und Giardien sowie zur Bimination von Parasiten mit Rltrationsverfahren - Literaturstudie - Veröffentlichungen aus dem 7Z\IY, Band 10,1999,
Autorin: Dr. Beate Hambsch DVGW-Technologiezentrum Wasser (TZW)
Karlsruher Straße 84 76139 Karlsruhe Tel.: 0721 9678-220
. Fax: 0721 9678-101
E-Mail: hambsch@tzw.de
Internet: www.tzw.de
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