jelica biotehnologija
Post on 19-Jan-2016
66 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
Visoka poljoprivredno-prehrambena škola strukovnih studija
u Prokuplju
SEMINARSKI RAD
Profesor: Student:
Dr Jelica Zivkovic Milica Marjanović ZB 100/09
Miloš Dimitrijević ZB 101/09
Miloš Grujić ZB 113/09
Prokuplje, Maj, 2012.
Visoka poljoprivredno-prehrambena škola strukovnih studija
u Prokuplju
SEMINARSKI RAD
KULTURA BILJNIH TKIVA
IN VITRO
Profesor: Student:
Dr Jelica Zivkovic Milica Marjanović ZB 100/09
Miloš Dimitrijević ZB 101/09
Miloš Grujić ZB 113/09
Prokuplje, Maj, 2012.
KULTURA BILJNIH TKIVA
IN VITRO
Sadržaj:
1.Uvod……………………………………………………………………………………..1
2.Teorijski deo……………………………………………………………………………..2
2.1.Različiti tipovi biljnih kultura in vitro................................................................2
2.2.Principi gajenja biljaka u kulturi in vitro………………………………………3
2.3.Postavljanje kulture na medijum……………………………………………….5
2.4.Sterilizacija biljnog materijala…………………………………………….……5
2.5.Mikropropagacija u užem i širem smislu…………………………………….....8
2.5.1.Faze mikropropagacije…………………………………………………...9
2.6.Prednosti vegetativnog razmnožavanja u uslovima in vitro..............................12
2.7.Nedostaci vegetativnog razmnožavanja u uslovima in vitro.............................12
2.8.Organogeneza ………………………………………………………………………..13
2.8.1.Indirektna i direktna Organogeneza……………………………...……..13
2.9.Kultura kalusa…………………………………………………………...…….14
2.9.1.Organogeneza iz kalusa –Embriokultura…………………..……………15
2.10.Kultura meristema……………………………………………………………16
3.Zaključak........................................................................................................................17
4.Literatura........................................................................................................................18
1.Uvod
In vitro kultura biljnih ćelija, tkiva i organa je posebna grana biotehnologije biljaka koja
predstavlja skup tehnika za aseptično (sterilno) gajenje i vegetativno razmnožavanje biljaka,
biljnih organa, tkiva i ćelija, u hranljivom medijumu definisanog sastava i pod kontrolisanim
uslovima sredine.
Biljne ćelije i tkiva imaju sposobnost da rastu i da se razvijaju kada se izoluju iz organizma i
gaje na sintetičkoj podlozi.
• Totipotencija - Sposobnost biljnih ćelija da se in vitro dediferenciraju, dele i da
regenerišu pojedine organe, embrione ili celu biljku
• Plastičnost – sposobnost biljke da menja svoj program rasta, razvića i metabolizma, u
zavisnosti od uslova i signala iz spoljašnje sredine.
Kulture se klasifikuju kao kulture haploida, kulture korenova, kulture za mikropropagaciju, in
vitro propagacija, somatska embriogeneza, somaklonalno variranje...
1
2.Teorijski deo
2.1.Različiti tipovi biljnih kultura in vitro
• Prema tipu eksplantata – za pokretanje kulture in vitro se mogu koristiti gotovo svi
delovi biljke tj. različiti eksplantati, počev od embriona, preko delova klijanaca - korena,
kotiledona, epikotila i hipokotila (kod dikotila), odnosno mezokotila i koleoptila (kod
monokotila) i svih delova odrasle biljke, uključujući listove, lisne peteljke i delove cveta.
• Prema nameni, kulture se klasifikuju kao kulture haploida, kulture korenova, kulture za
mikropropagaciju, in vitro propagacija, somatska embriogeneza, somaklonalno variranje...
• Prema tome kakav je rast: organizovan, neorganizovan i mešovit rast. 2
2.2.Principi gajenja biljaka u kulturi in vitro
Gajenje in vitro kultura podrazumeva kontrolu svih relevantnih činilaca (faktora), počev
od izbora eksplantata i uspostavljanja aseptičnih (sterilnih) uslova, preko manipulacie razvića u
kulturi putem definisanja sastava medijuma, prvenstveno balansa hormona, do kontrole
spoljašnjih faktora sredine kao što su svetlost, vlažnost i temperatura.
Kultura in vitro se uvek uspostavlja u aseptičnim uslovima, kako ne bi došlo do razvoja
gljiva i bakterija, koje sprečavaju rastenje i razviće biljaka.
Rad sa in vitro kulturom podrazumeva i neke od vidiva sterilizacije kao što su:
• Sterilizacija autoklaviranjem (na ovaj način se sterilišu medijumi za gajenje biljaka, kao i
posude u kojima se biljke gaje npr. teglice, erlenmajeri, boce, tegle, epruvete, petri
kutije,...)
• Sterilizacija iskuvavanjem ( na ovaj način najčešće se sterilišu instrumenti za rad koji su
neophodni pri manipulativnim tehnikama u laminaru)
• Sterilizacija biljnog materijala ( koja je još označena i kao dezinfestacija). Za ovu
sterilizaciju se najčešće koristi razblažena NaClO (varikina ili domestos).
• Sterilizacija filtriranjem, gde se pomoću specijalnih filter papira vrši sterilizacija
nestabilnih jedinjenja kao što je npr. ABA, GA3, antibiotici ili neki vitamini. Ove
komponente se naknadno dodaju u prohlađeni medijum.
Medijumi za gajenje biljaka mogu biti čvrsti, polučvrsti ili tečni.
Za većinu kultura optimalan pH podloge je 5.8 ± 0.2. Tečni medijum za razliku od
čvrstog ne sadrži agar. Vrlo bitna komponenta svakog medijuma jesu i makro i mikro soli, kao i
vitamini.
3
Metoda kulture tkiva i biljnih stanica “in vitro”, koristi se za vegetativno razmnožavanje
brojnih biljnih vrsta, posebno onih koje stvaraju malu količinu semena, čije seme ima slabu
klijavost ili onih koje se teško razmnožavaju vegetativnim putem. Orhideje je moguće razmnožiti
jedino na ovaj način (iz semena). One stvaraju velike količine semena ali u prirodi njihovo seme
može klijati samo u simbiozi s gljivama. Simbioza im je potrebna zbog toga, što seme orhideja
nema ili ima vrlo mali endosperm te pomoću gljiva dobijaju hranjiva potrebna za klijanje. In vitro
metodom im hranljiva podloga može nadoknaditi potebne hranjive stvari.
Ovom tehnologijom razmnožavanju se razne ukrasne biljke poput gerbera, ruža, ukrasnog
drveća i grmlja, sobnog i akvarijskog bilja i voćaka, a može služiti i za dobivanje nekih
kompleksnih spojeva, koje je teško i skupo dobiti kemijskim putem.
4
2.3.Postavljanje kulture na medijum
Prema vrsti upotrijebljenog materijala, odnosno segmenta biljnog tkiva za regeneraciju,
danas je prihvaćena podela kulture biljnih tkiva na pet grupa:
kultura ćelija
kultura kalusa
kultura meristema
kultura organa
kultura protoplasta
Svi ovi tipovi kulture biljnih tkiva izvode se na relativno maloj površini, gde se uslovi
sredine optimiziraju u odnosu na fizičke, hranidbene i hormonalne činioce i gde se isključuju svi
mikroorganizmi (gljivice, bakterije, virusi) kao i druge štetočine (insekti i nematode).
2.4.Sterilizacija biljnog materijala
Kada se izabere početni biljni materijal pristupa se pripremi za dalji rad. Najpre treba
izvršiti sterilizaciju i izolaciju, a potom inokulaciju i subkulturu tj. dalje razmnožavanje. Za
uspešan rad veoma je bitno da biljni materijal pre njegove izolacije in vitro bude dobro sterilisan.
Pre početka sterilizacije svaki ostatak pre ostalog zemljišta ili mrtvih delova biljke treba ukloniti.
Ako je spoljašnja kontaminacija vrlo uočljiva i velika najbolje je da se delovi biljaka speru u
vodi. U određenim slučajevima može se vršiti i ljuštenje ili guljenje pojedinih delova biljke, što
nije dobro jer ono dovodi do gubitka najvećeg dela spoljašnjih slojeva kao npr. pokožice i dr.
Nakon toga vrši se sterilizacija na sledeći način. Biljni organ se prvo potapa u 70%
alkohol u toku nekoliko sekundi da se odstrane mehurići vazduha čime se osigurava
da sterilzovana tečnost ima veći pristup biljnom materijalu. Potapanje se ne vrši u 96% alkoholu
jer je on suviše jak i izaziva izuzetno veliku dehidrataciju. Sterilizacija se nastavlja 10-30’ u 1%
natrijum hipohloritu (NaClO) kome se dodaje nekoliko kapi Tween-a 20 ili 80. Dodavanjem
Tween-a (vlažećeg agensa) smanjuje se površinska tenzija, čime se dopušta jači površinski
kontakt. Posle ovoga vrši se ispiranje u vodi sa česme obično tri puta u toku 2,5 odnosno 15’.
5
Ako su biljke osetljive na beljenje onda se umesto Na-hipohlorita može koristiti Ca-hipohlorit,
koji u biljna tkiva ulazi sporije. Jedna od mana Ca-hipohlorita je to što se može čuvatis samo
ograničeno vreme jer je higroskopan. Izbor vremena sterilizacije i koncentracije belila zavisi
prvenstveno od toga da li površinski slojevi koji se sterilišu treba da ostanu (blaga sterilizacija) ili
treba da budu sasečeni pre inokulacije (jaka sterilizacija). Ponekad je moguće da se sterilizacija
postigne samo pet minuta posle tretiranja na Na-hipohloritom, a u drugim slučajevima potrebno
je i 30’.
Duža sterilizacija može imati štetne uticaje na eksplantat, pa pravilno određivanje vremena
ikoncentracije beljenja treba podesiti za svaki pojedinačni materijal.
Uprkos dobroj hemijskoj sterilizaciji početnog biljnog materijala do infekcije može doći i kasnije, a
uzroci za to su:
tzv. unutrašnje infekcije. One mogu biti veoma ozbiljan problem, jer su prouzrokovane
mikroorganizmima koji su u samoj biljci i ne mogu se eliminisati spoljnom sterilizacijom.
U principu postoje dva načina za savladavanje ovog problema:
kultura meristema (većina mikroorganizama ne naseljava meristem), ili
dodavanje antibiotika hranljivoj podlozi.
Pošto je kultura meristema veomasložena a dodavanje antibiotika podlogama u najvećem
broju slučajeva neefikasno (može usporiti rast biljke i voditi selekciji otpornog mikroorganizma),
najbolje je rešenje da se koriste interno sterilne biljke.
neprecizan rad (neoprane ruke, nesterilisana površina stola, nesterilisane pincete ili
skalpeli,nedovoljno sterilisane čaše, papir ili hranljiva podloga itd.). Upotreba maski
preko lica, pokrivanjekose i upotreba sterilnih rukavica mogu doprineti smanjenju broja
infekcija.
neispravna laminarna komora. Treba da se kontroliše svake godine od strane proizvođača,
ačeoni filtri da se povremeno obnavljaju.
zaprljan alkohol u koji se umaču instrumenti pred opaljivanje, tako da ga treba obnavljati
u pravilnim intervalima.
nesterilni kontejneri po spoljnjoj površini, u kojima se nalaze hranljive podloge.
6
prljavi podovi koji se ne peru redovno i ne vrše dezinfekciju. Kada se ulazi u
inokulacionu prostoriju preko cipela treba imati plastični pokrivač ili stopala treba da se
potope u sterilišuću tečnost. U inokilacionu prostoriju ne treba puštati ni mnogo
nepotrebnih posjetilaca.
insekti (grinje) koje prenose naročito gljivične infekcije, a koji se javljaju ako se
prostorija u kojoj se vrši kultura tkiva ne održava čisto. Pošto ovi prenosioci mogu lako
proći kroz pamučne zatvarače i plastični film, ozbiljnost ovog načina infekcije ne sme se
zanemariti.
nesterilna prostorija u kojoj je laminarna komora. Ovo se može izbeći uduvavanjem
sterilnog vazduha i izračivanjem UV svetlom u toku noći.
infekcije koje se često događaju prilikom izolovanja vrhova biljnih izdanaka, jer se oni
teško sterilišu. Da bi se ovo izbeglo izdanci se često sterilišu postupno tj. u više faza.
Izdanak se najprije opere, speriliše, ukloni nekoliko listova, ponovo steriliše itd. Šanse za
infekciju vrhova izdanaka su manje ako se oni izoluju dok su mali.
7
2.5.Mikropropagacija u užem i širem smislu
Sl. Mikropropagacija u užem i širem smislu
1а -sakupljanje bočnih I vršnih pupoljaka;
2а – uvođenje pupoljaka u kulturu;
3а -rast izdanaka;
4а – multiplikacija izdanaka;
6 – ožiljavanje izdanaka;
7 – adaptacija u staklari.
Desno su osnovni koraci razmnožavanja in vitro putem regeneracije izdanka iz kalusa:
1б- izolovanje delova listova i stabla kao primarnih eksplantata;
2б – uvođenje eksplantata u kulturu;
3б – indukcija kalusa na eksplantatima;
4б – kultura nediferenciranih kalusa;
5б- indukcija izdanaka u kalusu;
6– ožiljavanje izdanaka;
7– adaptacija u staklari.
8
2.5.1.Faze mikropropagacije:
Postoje četiri osnovne faze mikropropagacije:
Faza I – uspostavljanje eksplantata u kulturi
Faza II – umnožavanje
Faza III – regeneracija korena
Faza IV – aklimatizacija
Faza I
U fazi I se prethodno sterilisani i obrađeni pupoljci uvode u kulturu. Nakon sterilizacije
I ispiranja može se započeti izolacija tj. sečenje biljnih komadića u sterilnim uslovima (laminarna
komora) i uz upotrebu sterilnih instrumenata. Eksplantati se pažljivo prihvataju pincetom i
prenose na hranljivu podlogu razlivenu u malim epruvetama. Smeštaj ovih primarnih eksplantata
je pojedinačan, odnosno u jednu epruveticu se stavlja jedan pupoljak. U ovoj fazi eksplantati se
mogu razvijati bilo u pojedinačne izdanke ili u masu umnoženih izdanaka, pa čak i u ožiljene
biljke. Prva dva slučaja se koriste u mikropropagaciji dok se u trećem slučaju, regeneraciji u
jednom koraku, obično daje prednost pri stvaranju bezvirusnih biljaka putem kulture meristema.
Rastenje apikalnog meristema odnosno rastenje i grananje izdanaka uslovljeno je odgovarajućim
odnosom auksina i citokinina u hranljivoj podlozi. Koncentracije regulatora rasta zavise od biljne
vrste koja se gaji, od faze u kojoj se biljke nalaze i drugih činilaca. Kod masline se odseče vršni
deo grančice dužine oko 20 cm. Odstrane se listovi sa delom peteljke. Eksplantati su delovi
vršnih grančica dužine 1,5 – 2 cm sa vršnim ili bočnim pupoljcima koji se pre postavljanja na
hranljivu podlogu sterilišu 70% etanolom ili Na hipohloritu. Eksplantati tkiva se ne smeju
direktno dotaći rukom već pincetom ili drugim priborom koji je prethodno sterilisan potapanjem
u 96% alkohol, a potom opaljivanjem tj. provlačenjem kroz plamen. Eksplantati u principu mogu
biti isecani na dva načina: na staklenoj ploči (podlozi) sterilsanoj sa 96% alkoholom (ovde se kao
problem javlja brzo tupljenje noževa), ili između sterilnog filter papira (noževi ostaju duže oštri).
Veoma je lako raditi sa dva tabaka filter papira: jedan se koristi u isecanju eksplantata (redovno
se zamenjuje), a jedan za postavljanje sterilnih instrumenata (na njemu ili između).
9
Kada se eksplantat postavi pomoću sterilnih pinceta na filter papir ili staklenu ploču pristupa
se sečenju. Ako su površine sečenja bile u dodiru sa belilom, ovi delovi se uklanjaju pomoću
sterilisanog skalpera. Sterilisana semena (ako ne treba izolovati klicu) mogu se direktno
inokulisati bez ikakvog dodatnog tretmana.
Faza II – Umnožavanje
Glavni cilj ove faze je da se proizvede maksimalan broj jedinica za umnožavanje. Kada se
apikalni meristem organizuje u lisnu rozetu ili izduženi izdanak subkultivira se na hranljivu
podlogu za umnožavanje. Iz aksilarnih pupoljaka lisne rozete formiraju se novi izdanci. Od
formiranog izduženog izdanka izoluju se nodalni segmenti i gaje na podlozi za umnožavanje.
Stopa umnožavanja u ovoj fazi je različita za različite biljne vrste i sa svakom narednom
subkulturom broj aksilarnih izdanaka se povećava logaritamski. Tako se u toku godine broj
izdanaka može povećati do milionskih cifara.
U fazi umnožavanja citokinin se koristi da bi se savladala apikalna dominacija izdanaka i da bi
se povećalo grananje lateralnih pupoljaka iz lisnih pazuha. Tokom 4-8-12 nedelja prati se rastenje
kulture u epruvetama I vrši umnožavanje. U fazi umnožavanja, materijal dobijen postavljanjem
kulture se presađuje na svežu hranljivu podlogu onoliko puta koliko je potrebno da bi se dobio
željeni broj izdanaka.
Faza III- Regeneracija korena
Cilj ove faze je regeneracija adventivnih korenova iz izdanaka dobijenih u fazi II ili u
nekim slučajevima u fazi I i formiranje kompletnih biljaka. Obično in vitro dobijeni izdanci od
10 mm ili duži se seku i koriste za ožiljavanje. Za ožiljavanje izdanaka ne mora uvek da se
primenjuje in vitro metoda. Umesto rastvora auksina koji se koriste in vitro mogu se koristiti I
komercijalno pripremljeni hormoni za ožiljavanje potapanjem ili uranjanjem osnove izdanka pre
sadnje. Postoje tri faze uključene u rizogenezu: a) indukcija, b) inicijacija i c) elongacija korjena.
S obzirom da je teško izdvojiti fazu indukcije u mnogim eksperimentima ova faza se uključuje u
fazu inicijacije. Odavno je poznato da inicijacija korena zavisi od odnosa visoke koncentracije
auksina i niske koncentracije citokinina. Pošto u izdancima iz faze II ima dosta rezidualnih 10
citokinina potrebno je malo ili uopšte nije potrebno dodati citokinin u medijum faze III. Negde je
dovoljno redukovati samo citokinine ili pak sve hormone, a negde je ta redukcija radikalnija i ide
do smanjenja i mikro- i makroelemenata. Nasuprot citokininima, auksini su esencijalni za
inicijaciju korena. Najčešće se koriste auksini kao što su NAA, 1BA, IAA i 2,4-D. Kod mnogih
vrsta auksin nije potrebno dodavati u medijum faze III, jer su mladi izdanci bogati auksinom.
Kada je koncentracija auksina suviše visoka, u bazalnom delu izdanka formira se kalus
koji inhibira normalan razvoj korena. Visoka koncentracija auksina inhibira elongaciju korena.
Da bi se ovo izbeglo, izdanci se prvo gaje na podlozi sa auksinom 4-8 dana da bi se inicirao
koren a zatim subkultivišu na podlogu bez auksina da bi on porastao.
U literaturi postoje različita mišljenja u vezi uticaja giberelina na ožiljavanje I njihove upotrebe u
ovoj fazi, ali se može reći da se oni veoma retko koriste za ožiljavanje izdanaka. Ožiljavanje traje
u proseku 4 nedjelje s tim što se inicijale korenova zapažaju 4-14 dana nakon postavljanja na
podlogu za ožiljavanje. Brzina rasta i eventualno grananje korenova su varijabilni i zavise od
same biljne vrste kao i od metodike i uslova ožiljavanja.
Faza IV – Aklimatizacija
Nakon ožiljavanja, in vitro regenerisane biljke se prenose iz aseptičnih kontejnera u saksijeradi
aklimatizacije. Pre same sadnje u staklari korenov sistem se vodom ispira od zaostalih čestica
agara, a cela biljka se potapa u rastvor nekog fungicida na bazi kaptana. Faktori koji utiču na
presađivanje su infekcija i desikacija. Ozbiljni problemi infekcije mogu se eliminisati
sterilizacijom zemljišne mešavine, a da bi se novo presađene biljke adaptirale na spoljne uslove
potreban je period humidne aklimatizacije, zato što je odmah nakon presađivanja ustanovljen
preterano visok gubitak vode iz listova biljaka. Visok nivo gubitka vode pripisuje se redukovanoj
količini epikutikulamog voska, visokom volumenu intercelularnih prostora u mezofilu I
usporenoj reakciji stoma na vodni stres. Tokom aklimatizacije, vlažnost se postepeno redukuje u
periodu od 2-3 nedelje. U međuvremenu, biljke podležu morfološkim i fiziološkim adaptacijama
koje im omogućuju da razviju normalan vodni režim.
11
2.6.Prednosti vegetativnog razmnožavanja u uslovima in vitro
1. In vitro razmnožavanje mnogo je brže od in vivo razmnožavanja
2. Moguće je umnožiti i one biljke koje nije moguće umnožiti u in vivo uslovima
3. Mikroklonirane biljke često rastu bolje i brže od biljaka koje rastu u in vivo uslovima
(oslobođene su od patogena i infekcija bakterijama i gljivama)
4. U in vitro kulturi se razmnožavaju samo zdrave biljke
5. Vegetativno razmnožavanje u in vitro uslovima može početi sa vrlo malo biljnog materijala
kao početnog eksplantata
6. Zahvaljujući kontrolisanim uslovima moguće je predvideti vremenski proizvodnju određenih
kultura
7. Veliki značaj ovaj vid razmnožavanja našao je u ex situ zaštiti ugroženih i retkih biljnih vrsta
(npr. Nepeta rtanjensis)
2.7.Nedostaci vegetativnog razmnožavanja u uslovima in vitro
1. U nekim kulturama koje se razmnožavaju na ovaj način genetička stabilnost je niska
2. Kod drvenastih vrsta teško je uspostaviti formiranje korenovog sistema in vitro
3. Prenos biljaka iz uslova in vitro u uslove in vivo nekada je jako težak i mukotrpan posao
4. Regenerativna sposobnost se može izgubiti nakon nekoliko subkultura kalusnog tkiva
5. U nekim slučajevima sterilizacija eksplantata koji se uvode u kulturu in vitro je izuzetno teška
12
2.8.Organogeneza
Organogeneza u najosnovnijem obliku značenja predstavlja proces obrazovanja jedinki.
U in vitro uslovima kontrolisanje organogeneze se vrši dodavanjem određenih komponenti, a
najbitnije među komponentama jesu FITOHORMONI.Skoog i Miller hipoteza (1957)
-Balans citokinina i auksina reguliše organogenezu kalusa. Ova hipoteza govori o odnosu
koncentracija auksina i citokinina u hranljivom medijumu i kako zapravo date koncentracije utiču
na morfogenezu u uslovima in vitro.
Dokazi Milerove hipoteze:
• Ako se kalusno tkivo prenese na hranljivu podlogu koja sadrži veću koncentraciju
auksina negocitokinina, pojaviće se korjenovi.
• Ako je koncentracija citokinina veća od koncentracije auksina, pojaviće se pupoljci.
2.8.1.Indirektna i direktna Organogeneza
Indirektna Organogeneza je proces u kome se pupoljci regenerišu iz ćelija kalusa.
Eksplantat indukuje nediferenciranu masu kalusnog tkiva, u kojoj se javljaju meristemski centri,
ili meristemoidi. Meristemoid se sastoji iz grupe ćelija I predstavlja inicijalni centar koji se lako
uočava, jer se udaljavanjem od njega u ćelijama značajno smanjuje mitotski indeks. Meristemoidi
postaju ili centri za proliferaciju kalusnog tkiva, ili se transformišu u nodule iz kojih će se javiti
apikalni meristemi ili korenske primordije. Direktna Organogeneza (a-d) posle faze indukcije
nema fazu proliferacije ćelije kalusa. Direktno na eksplantatu dolazi do regeneracije pupoljaka iz
epidermalnih ili subepidermalnih ćelija.
13
2.9.Kultura kalusa
Kultura tkiva odnosno kultura kalusa je tehnika kojom se tkivo može održavati u
nediferenciranom stanju neograničeno dugo. Kalus je neorganizovana masa diferenciranih biljnih
ćelija. On može nastatii nakon povrede nekog biljnog organa kao što je stablo ili koren. Kultura
kalusa se može dobiti iz bilo kog vegetativnog tkiva dediferencijacijom, tako da kalusna tkiva
najčešće nisu fotosintetička. Kalusi se često gaje u mraku jer svetlost može podstaći
diferencijaciju. Kalusi se, generalno, mogu podeliti na dva tipa: kompaktne i rastresite.
Najveći značaj kalusa je u tome što ima sposobnost da se iz njega začne pupoljak, koren ili embrion.
Inicijacija i rast kalusa zavisi od biljne vrste (genotipa), vrste i koncentracije hormona i
nekihorganskih supstanci kao i od uslova kulture. Prilikom inokulacije podloge bitno je da
inokulum ne bude isuviše mali, jer je tada i slab rast kalusa. Najbolja veličina inokuluma je 5-
10mm u prećniku ili 20-100 mg. Znatno je lakše raditi subkulturu sa kompaktnim kalusom, jer se
on lako seče na manje dolove, dok se rastresit kalus raspada i mora se direktno prebaciti na novu
podlogu.
14
2.9.1.Organogeneza iz kalusa -Embriokultura
Embriokultura je postupak gajenja embriona ili njegovih pojedinih delova na veštačkoj
hranljivoj podlozi pod aseptičnim uslovima. Ova metoda se može primeniti u svim onim situacijama
kada dođe do oplodnje ali embrion počne da degeneriše tj. abortira u određenom stadijumu
razvitka pre pune zrelosti. Degeneracija embriona nastupa zbog:
- nesposobnosti endosperma da odigra svoju normalnu ulogu u snabdevanju embriona hranivima,
- zbog antagonizma materinskog tkiva prema embrionu.
Embrion obično abortira 5 do 35 dana nakon oplodnje, što najčešće zavisi od vrsta koje se
međusobno ukrštaju.
U principu postoje dve vrste embriokulture: kultura nezrelih embriona poreklom iz nedozrelih
semena i kultura zrelih embriona poreklom iz zrelih semena.
- kultura nezrelih embriona uglavnom se koristi da bi se izbegla rana smrt klice (abortus), sa
ciljem da se razvije normalna biljka. Ovaj tip kulture je izuzetno težak ne samo zbog zamorne
disekcije klice već i zato što je neophodna složena hranljiva podloga.
- kultura zrelih embriona je relativno laka i koristi se da bi se eliminisala apsolutna inhibicija
klijanja semena. Za ovaj tip kulture u većini slučajeva dovoljno je korišćenje jednostavne
hranljive podloge sa agarom, šećerom i mineralima.
Mehanizam embriokulture
Kada se pripremi odgovarajuća hranljiva podloga pristupa se njenom razlivanju u epruvete do
visine od 2-3 cm. Zatim se epruvete zatvore zapušačima i stave u autoklav radi sterilizacije u
vremenu 20-35’, a pod pritiskom 1,5-2,0 atm i temperature od 100ºC.
15
Sl. Organogeza iz kalusa
2.10.Kultura meristema
Eliminacija virusnih oboljenja kulturom meristema je jedna od mnogih interesantnih
primena kulture tkiva.
U suštini postoje dva tipa meristemskog eksplantata:
- apikalni meristem izdanka - nediferencirano tkivo, locirano unutar apeksa izdanka, koji se
pojavljuje kao sjajna pupolika struktura distalno u odnosu na najmlađu lisnu primordiju, veličine
manje od 0,1 mm u dužini.
- apeks izdanka - struktura koja se sastoji od apikalnog meristema izdanka i jedne do nekoliko
lisnihprimordija, obično veličine od 0,1-1 mm u dužinu. U slučaju da je u apeks uključeno više
odraslih listova struktura može iznositi i do nekoliko centimetara u dužini. Ako se koristi
eksplantat veći od 0,1 mmdužine šanse za rast i razvoj u kulturi in vitro su veće. Lokacija
meristema. Kod biljaka su razlikuju meristemi koji se nalaze u vršnim I aksilarnim pupoljcima.
Eksplantati uzeti sa vrha izdanka nalaze se u mlađem razvojnom stadijumu nego oni iz bazalnog
dela. Za regeneraciju izdanka optimalan je mlađi razvojni stadijum eksplantata.
Terminalni pupoljci imaju jači potencijal rasta nego lateralni. Zato je, kod većine biljnih vrsta,
bolje koristiti terminalne eksplantate. Ukoliko ima samo jedan terminalni pupoljak po izdanku,
mogu se koristiti i aksilarni.
16
3.Zaključak
Gajenje in vitro kultura podrazumeva kontrolu svih relevantnih činilaca (faktora), počev
od izbora eksplantata i uspostavljanja aseptičnih (sterilnih) uslova, preko manipulacie razvića u
kulturi putem definisanja sastava medijuma, prvenstveno balansa hormona, do kontrole
spoljašnjih faktora sredine kao što su svetlost, vlažnost i temperatura.
Prema tipu eksplantata – za pokretanje kulture in vitro se mogu koristiti gotovo svi delovi
biljke tj. različiti eksplantati, počev od embriona, preko delova klijanaca - korena, kotiledona,
epikotila i hipokotila (kod dikotila), odnosno mezokotila i koleoptila (kod monokotila) i svih
delova odrasle biljke, uključujući listove, lisne peteljke i delove cveta.
17
4.Literatura
-www.wikipedija.org
18
top related