kalitsal metabol k hastaliklarin ğığı tani zlem ...tkbd.org/files/asuman-gedikbaşı.pdftüm...
Post on 16-Oct-2020
9 Views
Preview:
TRANSCRIPT
KALITSAL METABOLİK HASTALIKLARIN TANI ve İZLEMİNDE LABORATUVAR:
MOLEKÜLER ANALİZLERAsuman Gedikbaşı
İstanbul Üniversitesi Çocuk Sağlığı Enstitüsü
Pediatrik Temel Bilimler AD Tıbbi Genetik BD
Uluslararası Laboratuvar Tıbbı ve 19. Ulusal Klinik Biyokimya Kongresi25‐28 Nisan 2019 La Blanche Island Bodrum
Kalıtsal Metabolik Hastalıklar (KMH),
Genetik hastalıkların TEDAVİ EDİLEBİLİR önemli bir grubu
Büyük çoğunluğu tek gen hastalıkları, otozomal resesif kalıtım, AKRABA EVLİLİĞİSIK!
Halk sağlığını kollektif olarak etkileyen «NADİR HASTALIKLAR» ın önemli bir grubu
Nadir hastalıklar, sık görülen hastalıkların patofizyolojik mekanizmalarının anlaşılması, ve tedavi için hedef molekül geliştirilmesi açısından önemli !
29 ŞUBAT
KMH SINIFLAMA
Ara metabolizma bozukluklarıAmino asit metabolizması Organik asidüriler Amonyak detoksifikasyonu Yağ asidi ve ketogenezKarbonhidrat metabolizması ve transport Mitokondriyal hastalıklarKobalamin ve folat metabolizması Amino asit transportPeptid metabolizmasıBakır, demir, çinko transport ve kullanım
Kompleks moleküllerin sentez ve yıkım bozuklukları
Lizozomal depo hastalıkları Peroksizomal hastalıklar Pürin ve pirimidin metabolizmasıKonjenital glikozilasyon bozukluklarıLipoprotein metabolizmasıSafra asidi ve bilirubin metabolizması, kalıtsal kolestaz ve porfiriyalarİzoprenoid ve sterol metabolizması
Nörotransmitter bozukluklarıve ilişkili hastalıklar
Glisin ve serin metabolizmasıPterin ve biyojenik aminler metabolizması
Gama-aminobütirat metabolizmasıB6 vitamini metabolizması Kreatin
metabolizmasıDiğer nörometabolik hastalıklar
BEAH METABOLİZMA LABORATUVARI(2013‐2015..)
4
Altta yatan bir metabolik kusur hakkında güçlü bir şüphe olsa bile, klinik özelliklerde değişkenlik
KMH'nın klinik/biyokimyasal fenotip spektrumu geniştir ve çoğu zaman spesifik değildir, daha sık görülen durumları taklit eder
Semptomların başlangıcı fetustan erişkine kadar her yaşta ortaya çıkabilir.
Daha hafif mutasyonları ve hafif biyokimyasal fenotipleri olan hastalar, pozitif taramasonuçlarını belirlemek için kullanılan kesme değerleri ile kaçabilir
Çocuklarda IEM'in hem klinik hem de biyokimyasal fenotipleri on yıllardır bilinmektedir; tersine, geç başlangıçlı veya erişkin başlangıçlı varyantlar büyük ölçüde tanınamamaktadır.
Kesin tanı moleküler analiz,
The American Journal of Human Genetics 104, 76–93, January 3, 2019
Moleküler Tanı Neden Gerekli;,
Gerekli olmayan invaziv testlerin kesilmesi
Efektif olmayan ve potansiyel olarak zararlı tedavilerden kaçınma
Hastalığın seyri sırasında ortaya çıkmasımuhtemel komplikasyonlarının takip edilebilmesi
Hastalığın kaynağının bilinmesinin hasta ve ailesi üzerinde yarattığı pozitif etki Doğum öncesi tanı seçeneklerinin gündeme gelmesi
Aile bireylerinin erken evrede saptanması ve prognozlarında iyileşme
Olası tedavi seçenekleri
1. EVRE. Kalıtımın hücre içindeki temelini ortaya koyan: KROMOZOMLAR
(1909‐1970)
2.evre :Kalıtımın moleküler temelini ortaya
koyan DNA ÇİFTE SARMALI
25 Nisan 1953 – Nature
3. EVRE Kalıtımın bilgisel temelini ortaya koyan ;
genetik kod ve Rekombinant DNA teknolojilerinin
icadı 1977 SANGER ‐ NATURE
4.EVRE İnsan Genomunun dizilenmesi :GENOMBİLİM (GENOMİK)
Genetikte son yüzyılda sağlanan ilerlemeler kabaca 4 çeyreğe denk gelen 4 ana evre;
13 Ağustos 1918 – 19 Kasım 2013 tarihleri arasında yaşamını sürdürmüş olan Nobel Kimya Ödülü’nü iki kez kazanan İngiliz biyokimyacıdır.
1958’de proteinlerin yapısı, özellikle de insülinin kısmi hidrolizi ile aa dizisinin belirlenmesi çalışması ile kimya dalında Nobel ödülü aldı.
DNA polimerazı kullanarak tek iplikli kalıptan yeni DNA zincirleri sentezleyerek dizileyen Sanger, 1980 Nobel Kimya Ödülü’nü aldı.
Frederick Sanger
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kary Banks Mullis, Amerikalı biyokimyacı. Polimeraz zincir tepkimesini keşfinden (1985) ötürü 1993 yılında Michael Smith ile birlikte Nobel Kimya Ödülüne layık görülmüştür
Biyokimyasal genetik testKlinik sorunlara neden olan enzim/enzimlerineksikliğini, stabilite kaybını, aktivite değişimini tanımlar
Gaz Kromatografi / kütle spektrometri(GS/MS)Sıvı kromatografisi (HPLC)Tandem kütle spektrometresi (MS/MS)
Hangi enzimde sorun olduğu saptanırsa, o enzimi kodlayan gendeki mutasyon, moleküler genetik testler ile saptanır.
Biyokimyasal genetik testKlinik sorunlara neden olan enzim/enzimlerineksikliğini, stabilite kaybını, aktivite değişimini tanımlar
Gaz Kromatografi / kütle spektrometri(GS/MS)Sıvı kromatografisi (HPLC)Tandem kütle spektrometresi (MS/MS)
Hangi enzimde sorun olduğu saptanırsa, o enzimi kodlayan gendeki mutasyon, moleküler genetik testler ile saptanır.
Genetik Test Çeşitleri
Sitogenetik testler
Kromozomları inceler
Karyotip analizi
Hedefe yönelik
FISH testi Tek bölge Çoklu bölgeTelomerikSentromerikTüm kromozom
Array • aCGH • mikroarray
Sitogenetik testler
Kromozomları inceler
Karyotip analizi
Hedefe yönelik
FISH testi Tek bölge Çoklu bölgeTelomerikSentromerikTüm kromozom
Array • aCGH • mikroarray
Moleküler genetik testler
Tüm gen inceleme
Tüm gen dizilemeTüm ekzom dizilemeTüm genom dizileme
Hedefe YönelikPZR + REGerçek zamanlı PZRMLPA
Moleküler genetik testler
Tüm gen inceleme
Tüm gen dizilemeTüm ekzom dizilemeTüm genom dizileme
Hedefe YönelikPZR + REGerçek zamanlı PZRMLPA
Genomda 6 milyar nükleotid, çift sarmal yapıda proteinler ile sıkı bir paketlenme ile interfaz kromatinini oluşturur.
10 nm
147 bç
8-114 bç
Hücre çekirdeği içinde DNA İnsan KromozomlarıBir diploid hücrede 23 çift olarak bulunur
22 çift otozom + 1 çift cinsiyet kromozomu
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 XX
Her kromozom üzerinde, kalıtımın fiziksel ve fonksiyonel ünitesini oluşturan binlerce gen bulunur.
İnsan Genom Projesi, 20.000 protein kodlayan gen, 5.000 fonksiyonel RNA bulunduğunu gösterdi.
Mitokondrial Genom
16,569 baz çifti uzunluğunda 37 gen içerir14
1. OXPHOS structral gene2. OXPHOS assembly factors3. MtDNA maintenance gene4. Mt translation disorders5. Mt fisson/fusion6. Mt protein import7. Mt homeostasis
8.Mt chaperones9.Mt metabolism10.Coenzyme Q10 biogenesis11.Lipid metabolism12.Phospholipid remodeling13.Fe-S cluster assembly homeostasis14.Apoptosis
Hum Mol Gene, ed 2010, Chapter 9: Organization of the Human Genome
Çekirdek ve mitokondrial insan genomunun DNA dizileri, boy, biçim, yapı ve şifreleri birbirinden farklıdır
İnsan genom dizisinin >% 80 özgün bir biyolojik fonksiyonu vardır.
% 5704
X genleri
OMIM’de (Online Mendelian Inheritance in Man insan genleri ve fenotipleri kataloglayan bilgi bankası)
tanımlı insan genleri
37 mt gen
49 Y geni
732 X geni, % 515.230 otozom geni, % 95
http://www.omim.org/statistics/entryŞubat, 2019
http://www.omim.org/statistics/entryŞubat, 2016
OMIM istatistikleri
moleküler temeli bilinen fenotipler4.667
% 74
moleküler temeli bilinmeyen fenotipler
1.634
% 26
moleküler temeli bilinen fenotipler
6.369
% 80.3
moleküler temeli bilinmeyen fenotipler
1.569
% 19.7
http://www.omim.org/statistics/entryŞubat, 2019
2016 2019
İnsan GenomuGRCh38.p12 (Genome Reference Consortium Human Build 38), INSDC Assembly
GCA_000001405.27, Dec 2013
• Yaklaşık 3,609,003,417 baz çifti
• Yaklaşık 20,418 protein kodlayan gen
• Yaklaşık 22,107 kodlanmayan gen
• Gen transcripti 206,762
• Short Variants665,437,818
• Genomun yaklaşık %50 si tekrar dizilerinden oluşur
• %5‐10’u CNV (Copy Number Variation) : Fenotipik genotipik çeşitlilik! Structural variants 6,013,031
https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Annotation
Genetik Varyasyonlar• Kromozomlardaki bir bölgede (lokus) DNA dizisi bireylerde alternatif
şekillerde bulunabilir (genetik varyasyon), bunlar o genetik dizinin ‘allelik
formları’ olarak adlandırılır.
• DNA’da çok sayıda genetik varyasyon meydana gelmekte (% 0.1’lik yani
yaklaşık 3 milyon bazlık varyasyon), ancak bunların çoğu hastalıklarla ilişkili
olmamaktadır.
• Bir genetik varyasyon için şayet bir allel toplumda % 1’den daha sık
görülüyorsa ‘polimorfizm’ olarak adlandırılırken, görülme sıklığı daha
düşükse ‘nadir allelik varyant’ adını alır.
Genetik Varyasyonlar: Bireyler ve toplumlar arasında DNA dizi veya yapılarındaki değişimler
Mutasyon: Nükleotit dizinse kalıcı bir değişim
Oluşum mekanizmalası
Popülasyona özgüMAF* değerleri
Polimorfizm: nispeten yaygın varyant (MAF> 0.01)
Nadir Varyant: MAF< 0.01Nadir Varyant: MAF< 0.01
- Genellikle nötr- Hastalıkla ilişkili- Genellikle nötr
- Hastalıkla ilişkili
- Genetik hastalıklar- Genetik hastalıklar
- Genellikle önemi
bilinmiyor
- Genellikle önemi
bilinmiyor
?
*Bir popülasyonda bir varyant için en nadir allelinin görülme sıklığı
Kısa Genetik Varyasyonlar Yüksek Genetik Heterojenite
Ataksi için >300 gen
Aynı Varyasyon: Farklı seviyede etkilenmiş bireyler
Ağır fenotip Daha hafif hatta subklinik fenotip
Eksik penetrans
Değişken ekspresivite
Hastalık ilişkili bozukluğun mutasyon tipine,hastalık ilişkili gen/genleresaptanma oranlarına göre karar verilir.
Eğer belli bir hastalık için iki farklıyöntemin rezolüsyonu benzer ise laboratuarın en iyi optimize ettiği ve ucuza mal ettiği yöntem tercih edilir.
Hangi yöntem/lerin kullanılması gerektiğine nasıl karar verilir?
Sanger zincir sonlanma yönteminde istenilen DNA kalıbının çoğaltılması ve dizi analizinin yapılabilmesi için özgül oligonükleotitlere yani primerlere ihtiyaç vardır.
Primer çiftleri kullanılacak kalıp DNA’ nın genomik DNA’dan eldesinde, çoğaltılmasında kullanılır.
PCR reaksiyonları sonucu elde edilen DNA parçaları, elektroforezde yan yana yürütülür
Otomatik DNA Dizi Reaksiyon Basamakları
• DNA İzolasyonu• PCR• PCR sonrası Pürifikasyon• Cycle Sequencing (floresan işaretli dideoksinükleotidlerin kullanıldığı döngüsel sekanslama reaksiyonuna)
• Pürifikasyon (Alkol Çöktürme)• Pürifikasyon sonrasında örnekler sekans cihazına yüklenir ve cihaz otomatik olarak örnekleri kapillere çeker, yürütür, lazer ışığı altında optik sensör tarafından okur ve okuduğu ham bilgileri bilgisayar programına aktarır
PKU ilişkili, tanımlanmış ekzonik mutasyon: c.782G>A, p.R261Q, CM910287, Highest population MAF: < 0.01, Abadie (1989) Genomics 5, 936 (Homozigot)
Normal dizi
Hasta
PKU ilişkili, tanımlanmış ekzonik mutasyon: c.842C>T, Pro281Leu, p.P281L, CM910292 (Heterozigot)
Normal dizi
Hasta
Yeni Nesil Dizileme? (Next Generation Sequencing?)
(NGS)
Yeni Nesil Dizileme? (Next Generation Sequencing?)
(NGS)• …. Yeni nesil?
– 1., 2., 3.. ?
• Sanger dizilemesi sonrasındaki teknoloji
• Paralel bir şekilde milyonlarca okuma
• Daha kıza diziler ve okumalar
• Farklı dizileme platformları & özgü yaklaşımlar
• DNA & RNA karışımları analizi
• Tüm genom yaklaşımlar
Yeni Nesil Dizileme (NGS)
Örneğe ait GenomRastgele parçalara bölme ve büyüklük ayrımı
Eşleşmiş dizileme(paired-end sequencing)
Parçacıkları yerleştirme
(read mapping)ReferansGenomu
Maps toForward strand
Maps toReverse strand
NGS Panel TestlerYüksek kalitede hedefe yönelik veri
• Yüksek kapsam derinliği– Bir bölgenin dizileme esnasında kaç kez okunduğu bilgisi
– Mutasyonları kaçırma olasılığı azdır• Ancak,
– Sonuç seçilen genlerle sınırlıdır– Tanı yapan laboratuvarın hangi paneli kullandığıönemlidir
– Bir hastalıkla ilgili yeni genler bulunduğunda kullanılan panel hızlıca ‘demode’ olabilir
Tüm exome dizileme (Whole exome sequencing, WES)
Ekzom: Genomun ‘fonksiyonel’bölgelerine toplu bir bakış
WES İş Akış Şeması
LaboratuvarLaboratuvarVeri analizi
BiyoinformatikVeri analizi
Biyoinformatik
2 Ana Husus
DNA fragmentasyonu
Fragman uçlarına adaptör
Ekzom yakalaması& amplifikasyon
Oligonükleotid hibridizayonu
Dizileme
kütüphane zenginleştirilmesi40‐500bç
Tüm Genom Ekzom Dizilemesi
>~200.000 varyant ~400‐700:dbSNP, gnomAD, ExAC, 1000 Genom, NHLBI (ESP6500)
Temel Yeni Nesil Dizileme Terminolojisi
Reads & Tags (Okumalar & İşaretlemeler)
Paired‐end ; Mate pair dizileme
Alignment, reference bias (Hizalama, referans etkisi)
Coverage & depth (Kapsama & derinlik)
2 strands (2 sarmal)
Assembly, dustbin, sequencability
Kapsama & Derinlik
Population data – frequencyFunctional data Segregation studies De novo observations Allelic data Computational (in silico) pathogenicity predictions
KMH Tanısında Moleküler Analizörler
Klinik exome (medeliome) dizileme
Whole humanexome sequencing
Yaklaşık 6.000 klinik ilişkisi kesin olan raporlanabilir gen Kodlanan tüm genlerin
dizilenmesi
Yeni gen keşifleri
Whole mitochondrial genome sequencing
Dizi derinliğini artırarak heteroplazminin tespiti
mümkün
Wh
K
in
John D McPherson S2 |VOL.6 NO.11s |NOVEMBER 2009 | nature methodSSuPPLement
Ins/del & tekrar bölgeleri Sınırların doğru çizilmesi
45 46
Variant prioritization after pathway analysis with Metabolomic raw data by LC / MS
Teşekkürler
poliklinik
hücre kültürü
sitogenetik
array NGS ve Sanger
moleküler genetik
ITF Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı1985 -
odalar
ımız
SBÜ Bakırköy Dr. Sadi Konuk E&A Hastanesi Metabolizma Laboratuvarı
top related