kelompok6 polymerase
Post on 29-Jan-2016
237 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
TAQ DNA POLYMERASEDISUSUN OLEH:
Diana Christina, 1306370902
Dyah Paramawidya Kirana, 1306447846
Faustina Prima Martha, 1306404802
Kamila Luthfia Putri, 1306412193
Nadira Putri Pinasthika, 1306370814
Syafira Andyah Putri, 1306371022
TEKNOLOGI BIOPROSES 2013
BIOKATALIS
OUTLINE
Deskripsi enzim
Polymerase
Produksi TAQ DNA Polymerase
Aplikasi TAQ DNA Polymerase
Pembahasan Jurnal
Referensi
JENIS-JENIS ENZIM POLYMERASE
DESKRIPSI ENZIM
DESKRIPSI ENZIM
• Merupakan enzim sentral yang berperan dalam proses replikasi DNA dan reparasi DNA, serta mengkatalisasi reaksi pembentukan DNA dalam sintesis protein.
• Pada proses replikasi, DNA polymerase hanya bisa menempel pada gugus OH (hidroksil) dimana gugus OH hanya ada pada ujung 3’ sedangkan ujung 5’ adalah ujung fosfat
• Hanya bisa mensintesis DNA dari arah 5’-3’ sehingga pertumbuhannya dari 5’-3’ karena penambahan pada ujung 3’, dimana pada ujung 3’ terdapat ujung hidroksil.
DNA POLYMERASERNA POLYMERASE• Enzim ini berperan dalam proses
pembentukan RNA berupa mRNA, rRNA dan tRNA dari DNA sebagai cetakannya. RNA polymerase bekerja melalui 3 tahap pada proses yang disebut sebagai transkripsi (pembentukan RNA).
• Fungsi RNA polymerase digunakan di tahap inisiasi, elongasi, dan terminasi
DESKRIPSI ENZIMRIBOSOMES
Ribosom adalah salah satu organel yang berukuran
kecil dan padat dalam sel yang berfungsi sebagai tempat sintesis
protein. Ribosom berdiameter sekitar
20 nm serta terdiri atas 65% RNA ribosom (rRNA) dan 35% protein ribosom
(disebut Ribonukleoprotein atau
RNP).
DNA NUCLEOTIDYLEXOTRANSFERASE • DNA Nucleotidylexotransferase/Terminal
trasnferase adalah DNA Polimerase khusus yang diekspresikan pada sel limpatik pre-T & pre-B
• Digunakan pada proses amplifikasi cepat cDNA untuk menambahkan nukleotida supaya dapat digunakan sebgai template primer pda PCR Subsekuen
• Antibodi TdT digunakan untuk menunjukkan keberadaan sel B & T muda serta untuk multipotensi stem sel hematopatik
REVERSE TRANSCRIPTASE• Reverse transcriptase
adalah enzim yang digunakan untuk membentuk cDNA dari RNA template
• Aplikasinya sering ditemukan pada pembuatan Obat Anti Virus, Mempermudah proses PCR, dan Produksi Insulin
SUMBER ENZIM TAQ DNA POLYMERASE
DESKRIPSI ENZIM
Thermus aquaticus
Klasifikasi: Bacteria; Deinococcus-Thermus; Deinococci; Themales;
Thermophilus; Aquaticus
Pertama kali ditemukan pada Yellowstone National Park, USA pada suhu 55-100°C dan pH 5-9
Berupa bakteri gram-negative atau bakteri yang hanya memiliki sedikit peptidoglikan pada dinding selnya
Terdapat dalam bentuk filamen-filamen pendek
Ketika dikenakan cahaya, Thermus terlihat warna kuning, merah, atau merah muda (karena pigmen dalam bakteri tsb.)
Dapat memiliki flagella atau dapat berupa immotile (tidak bergerak)
Ketahanannya terhadap suhu tinggi, TAQ DNA Polymerase dari Thermus aquaticus sering digunakan untuk PCR
KARAKTERISTIK DNA POLYMERASE DARI Themus aquaticus
Kegunaan• Mengoptimalk
an PCR• DNA labeling
yang melibatkan primer
• DNA Sequencing
Properti fisis/kimiawi• MR = 94 kDa• pH optimal =
7.5 - 9• Suhu optimal
= 80°C (namun juga tergantung senyawa buffer)
< ContinueTitik Isoelektrik : 6.03 (Theoretical)Extinction Coefficient : 110,380 cm-1 M-1 (Theoretical)
E1%, 280 = 11.75 (Theoretical)Waktu Paruh : >40 menit, 95°C
InhibitorBromophenol blue (Wittwer and Garling 1991)Pyranicin (Takahashi et al. 2008)KCl (greater than [75 mM])Urea, DMSO, DMF, formamide, and SDS (Wittwer and Garling 1991)
HARGA TAQ DNA POLYMERASESKU-Pack Size Availability Price (SGD) Quantity
D1806-5KUEstimated to ship on 17.01.16
3,780.00
D1806-250UNEstimated to ship on 04.12.15
260.50
D1806-1.5KUEstimated to ship on 17.01.16
1,370.00
D1806-20X250UNEstimated to ship on 04.12.15
3,910.00
D1806-10X1.5KUEstimated to ship on 17.01.16
10,500.00
STRUKTUR TAQ DNA POLYMERASE
MEKANISME KERJA TAQ DNA POLYMERASE
DESKRIPSI ENZIM
Sumber: http://www.worthington-biochem.com/DNAPTAQ/default.html
KLONING GEN TAQ DNA POLYMERASE
PRODUKSI ENZIM
Isolasi genom DNA Thermus aquaticus dan
plasmid DNA nya
Amplifikasi gen Thermus aquaticus DNA polymerase dengan PCR
Ligasi fragmen amplikon ke dalam vektor
ekspresi pET yang sudah didigest dengan
EcoRI dan SalI
Hasil ligasi ditransformasikan ke sel kompeten E.coli TOP10 dengan CaCl2 & heat shock pada 42oC (45
menit)
E.coli rekombinan dikultur dalam 10 ml LB
broth 1 malam pada 37OC, mengandung 100ug/ml ampicilin
sebagai seed culture
Medium LB mengandung100ug/ml
ampicilin diinokulasi dengan 1% seed culture
ditumbuhkan pada 37OC
Ekspresi protein rekombinan diinduce
oleh 0,52 mM IPTG pada kultur dengan OD600 0,6-
0,8 (fase mid-log) yield enzim maksimal
Pemanenan sel
Ekstraksi dan purifikasi
Primer :F 5’ - CGG AAT TCT GAG GAG GTA ACA TGA GGG -3’ RE: EcoRIR 5’-CGT CGA CTA GAT CAC TCC TTG GCG GAG AG -3’ RE: SalI
mid-log phase yield enzim maksimal
EKSTRAKSI DAN PURIFIKASI TAQ DNA POLIMERASE
PRODUKSI ENZIM
3. Penambahan lisozim
Sebelumnya didinginkan dua kali dengan nitrogen cair, lalu dicairkan
pada suhu ruang
Ditambahkan 1 ml lisozim dan 1 ml lysis buffer
Diinkubasi pada 75°C selama 30 menit
2. Pelarutan sel kembaliSentrifugasi kembali Dilarutkan kembali dengan 50 ml buffer
A
1. Pemanenan SelSentrifugasi Dicuci dengan 50 ml buffer A per liter volume
kultur
6. Mendenaturasikan Dnase I
Direndam dalam water bath pada suhu 75°C selama 30 menit
Sentrifugasi pada 16.000 x g selama 10 menit pada suhu 4°C
5. Penambahan digestive solution1% digestive solution dengan PMSF ditambahkan ke larutan untuk menghilangkan DNA
dan RNA setelah suhunya turun menjadi suhu ruangan
4. Pemisahan padatan selSentrifugasi pada 16.000 x g selama 10 menit pada suhu 4°C
8. Pengambilan Taq PolimeraseSentrifugasi 16.000 x g selama 15
menit pada suhu 4°C untuk memperoleh Taq Polimerase
Endapan dilarutkan pada 25 ml buffer penyimpanan lalu disimpan pada suhu -
20°C
7. Penambahan etanolSupernatan dipindahkan ke botol plastik Ditambahkan etanol sampai
konsentrasinya 55%
APLIKASI ENZIM
ALIKASI
Taq Polymera
se Mutagenesis
Sequencing
PCR
Kloning
DNA polimerase membantu proses sintesis. Dimana enzim ini akan "memeriksa" apakah nukleotida yang benar telah
dimasukkan ke dalam template. Jika ketidakcocokan terdeteksi
DNA ditransfer dari domain polimerisasi ke 3'→
5'exonuclease domain N-terminal dari polimerase.
Nukleotida salah dimasukkan dipotong dan DNA pindah
kembali ke domain polimerisasi, proses penyalinan dilanjutkan.
Skema Reaksi Taq Polimerase
POLYMERASE CHAIN REACTION
PEMBAHASAN JURNAL
DNA polymerase berfungsi untuk manipulasi DNA secara in vitro seperti cloning, sekuensing, DNA labeling, mutagensesis, dll
DNA polymerase dari Thermus aquaticus (Taq Polimerase) merupakan enzim yang paling sering digunakan diseluruh dunia
untuk proses PCR
Untuk meningkatkan performance PCR yang menggunaka taq polymerase sebagai enzimnya, perlu dilakukan mutagenesis
Sebelum dilakukannya mutagenesis, DNA polymerase diamplifikasikan dengan PCR dari DNA microorganism yang
didapat dari tanah
Kemudian corresponding region gen pol untuk taq polymerase di ganti dengan fragment gen yang telah diamplifikasi dan
membandingkannya dengan beberapa chimeric DNA polymerase untuk mencari titik kritis untuk kemampuan elongasinya
• Host yang membawa plasmid rekombinan ditumbuhkan pada LB Medium 100µg/ml ampicillin
• Sel dikultur hingga nilai absorbansinya mencapai 0,2-0,3
• Pol gen kemudian di kultur selama 3 jam lagi dengan kehadiran IPTG
• Sel dipanen dan dihancurkan dengan proses sonifikasi pada larutan lysis (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF)
• Untuk persiapan WT dan polimerase Taq mutan, ekstrak sel larut, diperoleh dengan sentrifugasi pada 12.000 x g selama 20 menit, dipanaskan pada suhu 75 ° C selama 30 menit.
• Hasil akhir dari purifikasi ini berupa protein yang terelusi pada 0,8 M NaCl di kromatografi kolom hidrofobik
Ekstraksi DNA
•Ekstraksi DNA mikroorganisme yang berada di tanah menggunakan UltraClean Soil DNA Isolation Kit (MO BIO, San Diego, CA, USA)
•Ekstrak DNA diseleksi dengan elektroforesis
Persiapan Enzyme dan Substrat
• Enzim untuk manipulasi DNA in vitro dibeli dari New England Biolabs (Ipswich, MA,USA). [metil-3H] TTP dibeli dari Amersham (Buckinghamshire, Inggris) dan [γ32-P] ATP dibeli dari Nen Life Science Produk (Boston, MA, USA).
Konstruksi plasmid untuk chimeric Taq Polimerase
• Vector: pTV-Taq (asal: pTV118N)
• RE: B1pI dan Bg1II
Amplifikasi fragment gen pol dari metagenomic DNA
• PCR dilakukan dalam reaksi 50μl, mengandung 10ng DNA, 25p mol masing-masing primer, 0.2mm dNTP, dan 1 unit PFU polimerase DNA Ultra (Stratagen). Setelah inkubasi dari campuran tanpa enzim untuk 3 menit di 95◦C, tiga puluh siklus PCR, dengan profil suhu 30-an di 95◦C, 30sat 55◦C, dan 1 menit pada 72◦C, dilakukan.
Konstruksi mutan Taq Polimerase
• pTV-Taw plasmid kemudian dimutagenesis pada bagian E742 dan A73
• Pada reaksi PCR campuran mengandung 20ng DNA template, 1 × PCR buffer KOD-Plus-Neo, 1.5mm Mg2SO4, 0.2mm setiap dNTP, 0.3μM primer masing-masing, dan 0,5 Unit KOD-Plus-Neo DNA polimerase (TOYOBO, Osaka , Jepang) dalam volume akhir 20μl. Campuran dipanaskan pada 95◦C untuk 30-an detik dan kemudian mengalami siklus termal (14 siklus 95◦C untuk 30-an, 55◦C selama 1 menit, dan 68 ◦ C untuk 8 menit). Produk PCR dirawat dengan DpnI pada 37 ◦C untuk 1h
Purifikasi Wild-type dan mutan DNA PolimeraseAnalisis hasil amplifikasi
• Meligasi fragment gen dari metagenomic DNA ke plasmid dan host
• Host: E.coli JM109
MATERIAL DAN METODE
Pemanjangan Primer lebih Cepat dan Kenaikan
Kinerja PCR dengan
Mutan Taq Polimerase
HASIL
• Chen, Sique, dkk. 2015. A Simple and Efficient Method for Extraction of Taq DNA Polymerase. Tiongkok: Electronic Journal of Biotechnology.
• http://www.worthington-biochem.com/DNAPTAQ/default.html• https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Thermus_aquaticus*• http://eol.org/pages/974560/overview• http://bioinfo.bact.wisc.edu/themicrobialworld/LAHT/b27.html
REFERENSI
THANK YOU!
top related