kfc/stbi strukturní bioinformatikafch.upol.cz/wp-content/uploads/2015/07/02_stbi_struktura.pdf ·...
Post on 25-Dec-2019
5 Views
Preview:
TRANSCRIPT
KFC/STBIStrukturní bioinformatika
02_struktury
Karel Berka
Jak získávat strukturu
• RTG– xyz souřadnice atomů– krystal, rozlišení, – interpretace mezimolekulové
interakce
• EM– elektronový obal– nízké rozlišení– velké komplexy
• NMR– torzní uhly a vzdálenosti– dynamická informace– zpracování pomocí MD
• MS– vzdálenosti– hmotnosti – dostupnost
rozpouštědla– neúplná informace
• a další…– FRET - vzdálenosti
Získávání struktury Xrayzačátek (krystalografického) experimentu
klonování
expreseproteinu
purifikaceproteinu
krystalizace
difrakceRTG zářením
fit modelu vyřešenístruktury
fázový problém
zisk mapyelektronovéhustoty
Rentgenová krystalografie
1. Růst proteinových krystalů
2. Difrakční experiment 3. Výpočet mapy elektronové hustoty.4. Stavba modelu do mapy el. hustoty
Proč X-RayElektromagnetické záření interaguje s objekty jejichžvelikost je srovnatelná s vlnovou délkou (λ).
Např. viditelné světlo má vlnovou délku přibližně od 400 do 700 nm.
Vzdálenosti mezi atomy: C-C = 1,54 Å,C=C = 1,23 Å
1 Å (Ångstrom) = 0.1 nm C-N = 1,45 Å1 Å = 10-10 m N-(H)…..O = 2,8 Å
V laboratoři se běžně používá CuKα - λ = 1,54 Å.Synchrotron – λ = 0,5 Å – 2,5 Å.
Krystaly• X-paprsky se rozptylují na elektronech.
• Tato interakce je však příliš slabá pro detekci rozptylu na jedné molekule.
• Proto používáme krystaly, které obsahují triliony molekul v identické orientaci. Složením rozptýlených vln pak vzniká m ěřitelný difrak ční sign ál.
KrystalizaceEnergetický diagram krystalizace
Airlie J McCoy, Protein Crystallography coursehttp://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/Course/Crystals/intro.html
Experimentální uspořádání
Krystalová mřížka• Krystal má translační symetrii z definice.
– Jestli je ρ(r) elektronová hustota krystalu v bodě r, potom existujívektory a, b, c pro které platí:
ρ(r) = ρ(r + u · a + v · b + w · c)kde u, v, w jsou celá čísla.
• Každá identická kopie se nazývá základní bu ňka.• a, b, c se nazývají vektory základní buňky.• Délka vektorů základní buňky je a = |a|, b = |b|, c = |c|.• α, β, γ označují úhly
mezi vektory základní buňky• Pravotočivý systém souřadnic
Operace symetrie
• Translace (opakování základní buňky)• E – identita (C1)• i - Inverze (symetrie přes bod) (S2)• Cn
m - Rotační symetrie (rotace kolem osy o 360°/ n m-krát)
• σ - Roviny zrcadlení (S1)• Sn
m – Kombinace rotace o 360°/n m -krát následovaná zrcadlením přes rovinu
• Kombinace s translací
Bodové grupy symetrie proteinových krystalů
Asymetrická jednotka a základní jednotka
Asymetrická jednotka = Nejmenší objem z něhož můžeme zrekonstruovat základní jednotku aplikací krystalografické symetrie.
Základní jednotka = Nejmenší objem jehož translací v 3D můžeme zrekonstruovat celý krystal.
asymetrická jednotka
základní jednotka
Krystalové kontakty• Krystaly proteinu
obsahují velké kanály naplněnérozpouštědlem
• Kontakty molekul v rámci krystalu nemají(většinou!!!) vliv na strukturu proteinu.
Spakování krystaluglykolátoxidasy(schematicky)
Difrakce X-paprsků
Rosalind Franklin & Raymond GoslingNature 171 (1953)
Princip difrakce
Braggův zákonn.λ= 2d.sinθ(W. H. Bragg & W. L. Bragg,
1912)
Difraktované záření - sety rovin, které nejsou navzájem rovnoběžné
Výpočet mapy elektronové hustotyCílem krystalografie je pomocí amplitud a fázítisíců Fhkl vypočítat mapu elektronové hustoty ρ(x,y,z)
Fázový problém
• Amplitudy a fáze Fhkl jsou zakódovány v paprscích záření,které rozptylujíatomy v krystaluAmplituda |Fh,k,l| je druháodmocnina intenzity rozptýleného záření, kteréměříme standardním difrakčním experimentem.
• Φhkl je fáze rozptýlené vlny. Ta nemůže být měřena přímo – Fázový problém.
Fázový problém názorně
Difrakčnídata s fázovou informací
Reálnádifrakčnídata
Rekonstrukce objektu
FT
snadné
FT
obtížné
Význam fáze
F1, Φ1 F2, Φ2
F1, Φ2 F2, Φ1
Metody řešení fázov ého problému
• Přímé metody– Založeny na systematických souvislostech mezi určitými reflexemi.– Nutné mít data s vysokým rozlišením a relativně malý systém.– Velmi populární při řešení struktur malých molekul.
• Molekulární nahrazení– Když existuje vyřešená struktura podobná té kterou chceme řešit,potom
ji můžeme použít k odhadu fází.– Je stále více populární s tím jak roste počet vyřešených struktur.
• Metody t ěžkých atom ů
– Do krystalu vneseme těžký atom, který silně rozptyluje (např. Hg, Fe, Pb, I,Se ..). Nebo nahradíme všechny Met v proteinu Se-Met.
– Použijeme vícečetné isomorfní nahrazení (Multiple IsomorphousReplacement).MIR
– Použijeme vícečetnou nebo jednoduchou anomální difrakci (Multiple nebo Single Anomolous Diffraction). MAD
there is an app for that… SOLVE, SHELL-X, Phaser…
První mapa• Jakmile známe experimentální fáze, můžeme provést Fourierovu
transformaci.• Když získáme dostatečně kvalitní mapu elektronové hustoty, potom
začneme budovat model.• Nejdříve řetězec Cα atomů pomocí poly-Ala modelu.• Poté identifikujeme elementy sekundární struktury.• Poté stavíme postraní řetězce s pomocí znalosti sekvence.
• Programy: CNS, O, COOT, ARPwARP
Rozlišení (R) • v jednotkách Å, (více reflexí-lepší zesílení signál-šum)
• schopnost rozlišit detaily na vzdálenost. Teoreticky rozlišitëlné detaily separované nejméně 0.7x rozlišení.
• Čím lepší rozlišení, tím lepší mapu dostaneme -snadnější stavba modelu!
3.5 Å mapa fotosystému II
2.3 Å mapa fotosyntetického reakčního centra
0.95 Å mapa elastasy
Nízké rozlišení
• Mapy s nízkým rozlišením ukazují pouze obecnévlastnosti jako je např. tvar molekuly a umístěníelementů sekundární struktury.
R = 7 Å, tropomyosin.
Klasické rozlišení proteinů• běžné rozlišení u proteinových struktur pod 2.5 Å• Při tomto rozlišení je snadné sledovat průběh
hlavního řetězce a řada postraních řetězců mátaké dobře definovanou hustotu. U proteinů je limit pro publikaci struktury rozlišení 3.0 Å.
R = 2.6 Å
Vysoké rozlišení
• Mapa elektronovéhustoty s velmi vysokým rozlišením jasněukazuje pozice jednotlivých atomů.
R = 1.2 ÅH-vazby (fialová) mezi N a O atomy.
Validace
• Rfree (Brünger, 1992)
– test set (~5-10%) of reflekcívynecháno z určovánístruktury
• StereochemieRamachandranův diagram
– WHATIF– MOLPROBITY
• Bad contacts– stérické problémy ve
struktuře
And now somethingcompletelydifferent…
Nukleární magnetická rezonanceNMR
• NMR spektroskopie využívá magnetických vlastnostíjader atomů.
• Absorpční(emisní) spektroskopie, podobně jako IČ neboUV. Detekuje absorbci radiofrekvenčního záření jádry atomů v molekule.
• Radiofrekvenční energie (∆E přechodů jaderného spinu):
λ = 1011 až 3 x 107 nmν = 106 až 1010 Hz
Nastavením frekvence elektromagnetického záření (ν, nebo ω) narezonanční podmínku dojde k indukci přechodů mezi hladinamijaderného spinu
(tzn. můžeme měřit NMR spektrum!).
• Externí magnetické pole => energetický rozdíl mezi spinovými stavy jaderných magnetických momentů (m)
• Rozdíl v populaci stavů je dán rozdílem energií
• např. ∆E=3.8x10-5 kcal/mol pro 1H při 400 MHz (Bo=9.5T) Nα/Nβ= 1.000064
• Rozdíly populací velmi malé
NMR
Pravidla pro určení spinu izotopu
Nukleon. č.(A) Proton. č.(Z) I Detekceliché sudé nebo liché 1/2, 3/2, 5/2 anosudé sudé 0 nesudé liché 1, 2, 3 ano
Možný počet spinových stavů = 2I + 1:Jádro Spin.kvant.č. Počet stavů Mag.spin.č.1H I = 1/2 2(1/2) + 1 = 2 m = ±1/214N I = 1 2(1) + 1 = 3 m = -1, 0, 1
NMR-aktivní jádra v proteinech
• Přirozená:1H, spin ½31P, spin ½
• Obohacená díky bakteriální expresi:2H, spin 113C, spin ½15N, spin ½
Orientace mag.spinů
• Bez externího magnetického pole– náhodné orientace– degenerace
• S magnetickým polem– Makroskopická
magnetizace (Mz)
Vliv magnetického pole
Energie µ v poli Bo
E = - µ·Bo
pro jednu hladinu:Em= -m·Bo·γ·ħ
Projekce je kvantována, takže E závisí na:1) typ jádra (γ)2) spinový stav (m)3) síla magnetu (Bo)
Rezonance
rezonanční podmínka: ∆E = hν = ħω = Boγħ
ωo = Boγ
∆E = ħωo
Excitace a podélná relaxace (Mz -> rovnováha)
• nárůst
• pokles
Chemický posun• Různá jádra mají různé rezonanční frekvence• Magnetické pole, ve kterém se jádro nachází není rovno
vnějšímu magnetickému poli.– Elektrony v okolí jádra (chemické okolí) stíní vnější pole –
výsledné efektivní magnetické pole Beff je tvořeno vnějším polem B0 a polem lokálním B loc .
Beff = B0 – B loc = B0(1-σ), kde σ je konstanta magnetického stínění
NMR – řešení struktury makromolekul
• Pozorujeme protony (1H)– (! x-ray difrakce, kde
elektronová hustota atomů s vyšším počtem elektronů (C, N, O)!)
• Protein je v roztoku.
NMR proteinů
• Přiřazení pozorovaných 1H rezonancí individuálním aminokyselinám.
• Protonové rezonance jsou často rozlišeny na základě rozdílů v chemickém posunu.
• Měříme intra-aminokyselinové a inter-AK proton-protonovévzdálenosti prostřednictvím dipolárních spřáhnutí.
• Měříme torzní úhlyprostřednictvím J- spřáhnutí.
• Získané vzdálenosti a torzníúhly použijeme k určenísekundární a terciární struktury.
NMR interakce1H mezi sebou, ale také se značenými 13C a 15N
Přenos magnetizace• Mezi 1H, 13C a 15N může dojít k
přenosu magnetizace, což můžeme použít k určení konektivity.
• Chemické posuny• J-spřáhnutí (skrze vazby)• Dipolární spřáhnutí (skrze prostor)
Obecný 2D experiment
FT
COSY (Correlated Spectroscopy)
NOESY (Nuclear OverhauserEnhancement Spectroscopy)
Intenzita cross-píků odpovídá inter-jaderné vzdálenosti
Určování struktury pomocí NMR
Určení struktury pomocí NMR
• Přiřazení sekvence (určenívedlejších řetězců)– COSY– NOESY– 3D-NMR experimenty
• Sekundární struktura– chemické posuny (backbone)– dipolární spřáhnutí => prostor– J-spřáhnutí => torzní úhly
• Terciární struktura (do modelu)– NOE intenzity (neodpovídající
COSY pro vedlejší řetězce)
Získané parametry z NMR• Raw
– Time-domain: 1D,2D,3D,4D spektrum
• Processed (FT)– frekvency domain
• NMR parametry– peak list– chemical shifts– 1H-1H NOE– J-couplings– residual dipolar couplings– NMR relaxation rates
• Derived data– NMR peak assignments– % expected in observed data– covalent structure– bond hybridizations
• Derived data– secondary structure– interatomic distances– torsion angles– hydrogen bonds– order parameters– solvent exposure– 3D structure– binding constant– pH titration parameters– hydrogen exchange rates– termodynamics and kinetics of
structural rearangements– disordered regions
Kvalita struktury NMR
• Výsledkem NMR experimentu
= Zisk celé sady struktur, kterésplňují podmínky
• Kvalita:– Stereochemie – Ramachandran– Ekvivalent Rfree – vynechá se část dat při určování struktury a pak se to přes ně kontroluje není standardizováno!
Elektronový mikroskop – EM
magnetickéčočky
rozlišení R = 0.61λ/nsin α– zelené světlo λ=400nm => R=150 nm– elektrony 200 kV~ λ=0.0025nm => R=0.02nm (teoretický limit)
R=1 nm (TEM), méně cryo-HRTEM
TEM
• transmisní elektronový mikroskop
• do tloušťky 100 nm
SEM
• skenovací elektronový mikroskop
• krystalografie– odražené e.– sekundární e.
– transmitované e.– Xray
Elektronová tomografie
• programy: Chimera, Modeller, IMP
Kryoelektronová tomografie200kDa – 400 MDa
Protein/RNA or DNA complexese.g.Ribosome, ~2 MDa
Asymmetric monomericproteinse.g.DNA-PKcs, 470 kDa
Icosahedral viruses60-fold symmetrye.g.Adenovirus, ~150 MDa
Detergent solubilized membrane proteins
e.g.Voltage-sensitive sodium channel~300 kDa, Sato et al., Nature 2001
e.g.Platelet integrin αIIbβ3~230 kDa, Adair & Yeager, PNAS 2002
How to… EM
Fluorescence• Jablonskiho diagram
Fluorescence
Zvýšení polarity rozpouštědla většinouzpůsobuje červený posun fluorescence.
Z Jablonskiho diagramu vyplývá, že energie emitovaného záření (fluorescence) je typicky nižší než energie absorbovaného záření. (G.G.Stokes,1852,U.of Cambridge)
Fluorescence (Förster) Resonance Energy Transfer (FRET)
• Vzdálenosti - r
• Když se tyto dva fluoroforydostanou blízko k sobě, tak po excitaci dojde k FRET
• R0 je vzdálenost mezi D a A při které je přenos energie 50% (polovina energie se přenese z D na A).
• R0 je typicky mezi 20-90Å
Typické hodnoty Ro
Donor Akceptor Ro (Å)Fluorescein Tetramethylrhodamine 55IAEDANS Fluorescein 46EDANS Dabcyl 33Fluorescein Fluorescein 44BODIPY FL BODIPY FL 57Fluorescein QSY 7,QSY 9 dyes 61
Take home message• X-ray:
– krystaly (kontakty), vnitřní elektrony – elektronová mapa– R do 2.5 A se dá, jinak jen obálky – velikost neomezená
• NMR– roztok, značené proteiny, jádra protonů – vzdálenosti a torzní úhly– korelační 2D, 3D-spektra, je výhodné pro homologní modelování– omezení na velikost
• EM– jednotlivé molekuly, vnitřní elektrony – elektronová mapa – nemá atomární rozlišení (R > 5 A) – použitelné pro struktury komplexů
jako obálka• Fluorescence (FRET), MS
– vzdálenosti
• kontrola: Ramachandran, Rfree (Xray, NMR), krystalovékontakty, stérické kontakty
Nobelovsk éporovnání jednotlivých metod
2009 Venkatraman Ramakrishnan, Thomas A. Steitz, and Ada E. Yonath (Chemistry) ribosome (1ffk, 1fjg, 1fka, 1gix, 1giy)
2006: Roger Kornberg (Chemistry) molecular basis of eukaryotictranscription (1i3q, 1i50, 1i6h)
2003: Peter Agre and Roderick MacKinnon (Chemistry) membrane channels (1bl8, 2f2b, 2evu)
2003: Paul C. Lauterbur, Peter Mansfield (Physiology or Medicine) magnetic resonance imaging (MRI)
1996: Paul D. Boyer, John E. Walker, and Jens C. Skou (Chemistry) F1-ATPase (1bmf, 1cow)
2002: Kurt Wüthrich (Chemistry) nuclear magnetic resonance (NMR)1988: Johann Deisenhofer, Robert Huber, and HartmutMichel (Chemistry) photosynthetic reaction centre (1PRC).
2002: John B. Fenn, Koichi Tanaka (Chemistry) soft ionization massspectrometry (MS)
1962: Max F. Perutz and John C. Kendrew (Chemistry) globularproteins – myoglobin, hemoglobin
1994: Bertram N. Brockhouse and Clifford G. Shull (Physics) neutron scattering
1962 Francis H.C. Crick, James D. Watson, Maurice H.F. Wilkins(Physiology or Medicine) – DNA
1991: Richard R. Ernst (Chemistry) high resolution nuclear magneticresonance (NMR) spectroscopy
1954: Linus Pauling (Chemistry) – chemical bond, peptide bond, andthe structures of the alpha helix and beta strand
1986: Ernst Ruska, Gerd Binnig, Heinrich Rohrer (Physics) TEM, STM 1985: Herbert A. Hauptman and Jerome Karle (Chemistry) phaseproblem
1982: Aaron Klug (Chemistry) crystallographic electron microscopy
(EM)
1964: Dorothy C. Hodgkin (Chemistry) structures of penicillin andvitamin B-12.
1952: Felix Bloch, Edward M. Purcell (Physics) nuclear magneticprecision measurements (NMR)
1915: William H. Bragg and William L. Bragg (Physics) – Bragg’sequation
1944: Isidor I. Rabi (Physics) resonance method for recording themagnetic properties of atomic nuclei (NMR)
1914: Max von Laue (Physics) diffraction of X-rays by crystals
1943: Otto Stern (Physics) magnetic moment of the proton (NMR)1901: Wilhelm C. Röntgen (Physics) – X-ray
OthersX-Ray
Validační metody – servery
www.doe-mbi.ucla.edu/Services/Verify 3DProteinBowie, Luthy andEisenberg, 1991
Verify3D
xray.bmc.uu.se/cgi-bin/gerard/Protein (Caplha)
Kleywegt, 1997MOLEMAN2
www-lbit.iro.umontreal.ca/mcannotateRNAGendron, Lemieux, and Major, 2001
MC-Annotate
www.doe-mbi.ucla.edu/Services/ERRATProteinColovos and Yeates, 1993
ERRAT
cmbi1.cmbi.kun.nl:1100/WIWWWI/oldqua.html
ProteinVriend and Sander, 1993
DACA
ebi.ac.ukProteinEU 3-D ValidationNetwork, 1998
PROCHECK,PROVE, WHAT IF
www.fundp.ac.be/sciences/biologie/bmsProteinMelo and Feytmans, 1998
ANOLEA
URLProtein/NA Reference Program
R.A. Laskowski – Structural quality assurance
Validační metody – programy
www.cmbi.kun.nl/whatifVriend, 1990 WHAT IF
www.cmbi.kun.nl/gv/whatcheckHooft et al.,
1996WHATCHECK
www.yorvic.york.ac.uk/∼oldfield/squidmain.htmlOldfield, 1992 SQUID
www.ucmb.ulb.ac.be/SCMBB/PROVEPontius,
Richelle, andWodak, 1996
PROVE
www.biochem.ucl.ac.uk/∼roman/procheck/procheck.html
Laskowski et al., 1993
PROCHECK
www.doe-mbi.ucla.edu/People/Yeates/Gallery/Errat.html
Colovos andYeates, 1993
ERRAT
pdb.rutgers.edu/softwarePDBADIT
URLReference Program
R.A. Laskowski – Structural quality assurance
top related