kromozom bantları ve in situ hibridizasyon · pdf filespectral karyotyping and multifluor...

Kromozom bantları ve in situ hibridizasyon

Rasime Kalkan,PhD

Yöntemler

Konvasiyonel sitogenetik analiz

Kromozomlar büyüklük, sentromer pozisyonu ve bantlama paternine göre ayrılmaktadır

1 kromozom bandı : 5-10 Mega baz çifti(Mbp).

Visualizing Metaphase Chromosomes (Banding)

Sayısal anomaliler

Yapısal anomaliler

High resolution karyotype

AvantajlarTüm genomu taramakRölatif olarak daha ucuzDezavantajları5 mb kadar anomali saptamaktadır

Klasik sitogenetiğin limitleri

Kromozom bantlama tekniklerine bağlı olarak hassastır

İyi kromozom morfolojisi ve bölünen hücrelere ihtiyaç vardır

5 Mb rezolüsyon limiti

Konvansiyonel sitogenetiğin avantaj ve dezavantajları

Avantajları

• 1 defada tüm genomun taranmasına imkan tanır.

• Spesifik anomali bilindiğinde saptanması ( ör KML de Philadelphia) ve ek kromozomal anomalilerin saptanması

Dezavantajları• Majör yapısal anomalilerin saptanması 1band = 5mb of

DNA ~ 150 gen ).

Kromozomal anomali endikasyonları

• Kromozomal anomali süpesi• Mukonjenital anomali ve gelişim geriliği• Mental reterdasyon• Gonadal disgenezi• Infertilite• Düşükler• Ölü doğum öyküsü• Malignensiler

Hangi durumlarda FISH önerilir?

• Metafaz kromozom elde edilememesi halinde – Başarısız kültür

– hastadan alınan dokunun kültüre edilmesinin uygun olmaması (preimplantation analysis, rapid prenatal examinations, examinations of solid tumors or autopsy material)

• Komplike kromozomal anomalilerin analizi

• Marker kromozomun tanımlanması

• Sub mikroskobik, kriptik anomalilerin saptanması– Mikrodelesyon sendromları

– Malignansilerde tümör baskılayıcı ve onkogenkerin amplifikasyonu

• In situ hybridization spesifik nükleotid sekanslarının hücre süspansiyonu yada dokulardan saptanması. İlgili gen bölgesine spesifik prob un hücre yda doku süspansiyonuna hibridizasyonu prensibine dayanmaktadır.

Fluorescence in situ hybridization(FISH)

Fluorescence in situ hybridization(FISH)

• In situ teknikler anomalinin görüntülenmesi için tanı amacı ile kullanılmaktadır veya hastalığa neden olan endojen veya ekzojen DNA veya RNA molekülünün saptanması için kullanılmaktadır.

Moleküler sitogenetik:Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

• RNA ve DNA yapılarının, sayı ve lokasyonlarının yerlerinin hücrede ve in situ olarak tanımlanmasına dayanmaktadır

• FISH :– Morfolojik olarak korunmus kromozom

preperatlarında kullanılmaktadır (Metafaz).

– Fikse hücre veya dokular (Interfaz)

• Spesifik kromozom anomaliler görüntülenmektedir– delesyon, amplifikasyon, translokasyon

Fluorescence in situ hybridization(FISH)

Bölünen(metaphase) ve bölünmeyen (interphase nuclei) hücrelerdeki seçili genetik değişikliğin saptanması

ISH hücresel ve moleküler seviyede bilgi veren bir metoddur.

FISH hematolojik malignensilerin orjin ve progresyonunu belirlemek için kullanılabilmektedir

FISH Analysis

AavantajlarıÇok specific (100 kb)Microdelesyon/Microduplikasyon

DezavantajlarıÇok specific500-600 proba ihtiyaç vardır tüm

genomu tarayabilmek için

• Metafaz kromozomları

• Interfaz nukleusu

• Entire Cells/RNA

• Doku kesitleri

• FISH deneyleri yeterli uzunkluktaki ve ilgili DNA dizisine komplementer floresan işaretli DNA/RNA probları ile yapılmaktadır.

Hedef- Target

FISH analizinde kullanılabilecek dokular

• Periferik kan

• Fibroblasts biyopsisi

• Epitel hücreler, buccal smear

• Kemik iliği (hemoblastosis)

• Solid tumor biyopsisi

Interpfaz FISH’in avantajları

• Hücre kültürene ihtiyaç yoktur ve metafaz için hücrelerin bölünme stimüayonuna ihtiyaç yoktur– interphase FISH metafaza göre daha hızlıdır

– Fikse edilmiş hücrelerin ve bölünmeyen hücrelerin analizine izin verir.

• Mikroskop kullanılarak FISH ile 200–500 analiz edilebilir– Metafaz prosedürlerine göre daha hassasdır

• Kemik iliği transplantasyonunda rezidüel hastyakığın moniterize edilmesinde kullanılabilir.

Kromozom tanımlama

Aneploidi saptama

Sentromer analizi

Marker kromozom kökenini belirleme

Tüm kromozom analizi, whole chromosome analysis

(chromosome painting)

Kromozom translokasyon analizi

Benzersiz –unique- sekansların analizi (single-copy sequence)

Mikrodelesyon analizleri

Gen amplifikasyon analizleri

Moleküler Sitogenetiğin Kullanımı

FISH PROSEDÜRÜ

• Kromozom denatürasyonu

• Prob denatürasyonu

• Hibridizasyon

• Floresan boyma

• Slide ların analizi

Fluorescent in situ Hybridization (FISH) kullanımı

Sayısal ve yapısal krozom anomlilerinin tanımlanması ve karekterizasyonu

Mikroskobda görülemeyen delesyonların saptanamsı

Sub relomerik anomalilerin saptanması.

Prenatal tanı,bilinen sayısal kromozomlar için(interphaseFISH).

FISH limitleri

• Probun bağlandığı bölgeler dışındaki anomaliler saptanamaması

• İnterfaz fısh için hücre preparasyonu önemlidir– to permeabilize the cells for optimal probe target interaction

– to maintain cell morphology.

• Küçük mutasyonlar saptanamaz

• Uniparental dizomi saptanamaz.

• Inversiyonlar saptanamaz

• Tüm kromozomal bölgeler için problar tivcari olarak yoktur

• Pahalı bir yöntemdir

Problar

• Hedef nükleik asit dizisinin komplamenteri

• Problar floresanboyalar ile işaretlenmektedir biotin, fluorescein, Digoxigenin

• Büyüklükleri20-40 bpto 1000bp

Fluorescein

Biotin

• Indirect Probe labeling, antikorlar aracılığı ile FISH prosedürü tamamlanmaktadır Haptens---Biotin-dUTP, digoxigenin-dUTP

• Labeling-İşaretleme teknikleri: a) Nick translationb) Random primingc)PCR (Polymerase chain reaction)

• Direct Probe labeling, problar direkt olarak SpectralGreen veya SpectralOrange gibi florokromlar ile işaretlenmişlerdir One-step hybridization.

5‘ 3‘

3‘ 5‘

5‘ 3‘

3‘ 5‘+※++※+ ++※++++※++※

DNA Polymerase adds dNTP, labeled dUTP at 3’ and remove dNTP at 5’ DNase I makes nicks

Principle of Nick Translation

Faktörler Seviye Stringency Sonuçlar

(if inappropriate)

Isı Yüksek

Düşük

Yüksek

Düşük

Düşük

verim

Yüksek

arkaplan

Tuz çözeltisi

(SSC) konsantrasyonu

Yüksek

Düşük

Düşük

Yüksek

Yüksek

arkaplan

Düşük

verim

Formamid Konsantrasyonu

Yüksek

Düşük

Yüksek

Düşük

Düşük

verim

Yüksek

arkaplan

Denaturation Stringency

Prob Tipleri

Sentromer Probları• Alpha ve Satellite

III probes• Sentromer gibi

tekrarlayan dizilerde bulunmaktadırlar

• Sentromer bölgeleri parlak boyanmaktadır

Tüm Kromozom Probları• Tüm kromozom boyuna bağlanan prob kombinasyonlarının toplamıdır• Multiple probe labels are used• Tüm kromozom boyuna hibridiza olmaktadırlar

TelomerTelomer bölgelerine spesifiktirKromozom uçlarındaki 300 kb locus spesifiktir

LokusDelesyonTranslokasyon problarıGen saptanama & lokalizasyonGen amplifikasyon probları

Denatürasyon & Hibridizasyon

Denatürasyon Hibridizasyon

Isı veya alkali metodu ile olabilir Prob ve hedef DNA denatürasyonu Hibridizasyon için ön koşuldur

İki komplementer nükleotid sekanısının dupleks oluşturmasıdır

• DNA-DNA• DNA-RNA• RNA-RNAArasında l olabilmektedir

Detection & Visualization

Saptama-Detection Hibridizasyon

• Direct İşaterleme: Prob direkt floresan isaretlidir Daha az hassastır

• Indirect İşaretleme: Saptanması için ek basamaklara ihtiyaç vardır Alkalin fosfotaz gibi konjuge antiboylere ihtiyaç vardırSinyal amplifikasyonu ile saptanabilir

• Floresan prob hibridizasyon sırasında hedef sekansa bağlanmaktadır

• Bu uygun filtreler ile mikroskopta görüntülenebilmektedir.

Kromozomal sekansların sınıflandırılması

• Beta satellite

• Alpha satellite

• Classical satellite

• Telomeric sequences

• Unique gene sequences

Spesifik kromozom yapılarına özel Problar

• Kromozom spesifik sentromer probları(CEP)– Sentromer bölgelerine hibridize olmaktadır – İnterfaz ve metafazda anoploidilerin saptanması için kullanılmaktadır

• Chromosome painting probes (WCP)– Tüm kromozoma hibridize olan problardır– Metafaz üzerinde yapısal kromozom anomalilerin saptanması için kullanılmaktadır

• Unique DNA sequence probes (LSI)– Benzersiz DNA dizilerine hibridize olmaktadır – Gen yeniden düzenlenmeleri, delesyon ve gen amplifikasyonlarının saptanması için

kullanılmaktadır

• Telomere-specific probes (TEL)– Subtelomerik bölgelere hibridize

olmaktadır

– Subtelomerik delesyon veya yenidendüzenlenmelerin saptanması için kullanılmaktadır

α-satellite DNA – centromeres

Sayısal anomalilerin saptanması, marker kromozomun sentromer orjininin belirlenemsi, kemik iliği transplantasyonu sonrası hücre görüntülemesi (opposite sex of donor and recipient)

Locus specific DNA probes:

Kromozom üzerindeki genlerin görüntülenmesi ve yapısal kromozom anomalilerinin saptanması (translocations, deletions)

trizomi-21 kız fetus

chromosomes 18 (aqua), X (green), and Y (red).

chromosomes 13 (green), and 21 (red)

X–ckromozomu için Satellite (centromeric) probe

45,X or 46,XYKaryotip?

X- and Y-centromeric probes

46,XYDetermine probable karyotype.

Green = X

Red = Y

Interfaz FISH ile yapısal anomaliler LSI

Probe (Fusion Probe) ile saptanmaktadır

Interfaz FISH ile yapısal anomaliler LSI Probe (Break Apart Probe)

Dual color break-apart probes

• Translokasyon kırık noktalarına spesifik olarak tasarlanmıştır.

• Traslokasyon olması halinde prob birbirinden ayrılmakta ve sinyal vermektedir

0.6–1.5 Mb

Translokasyonu saptamaktadır

FISH kullanılan mikrodelesyonsendromları

Syndrome Chromosome Location

Probe/Gene Locus

DiGeorge 22q11.2 D22S75

Velocardiofacial 22q11.2 D22S76

Miller-Dieker 17p13.3 D17S379

Smith-Magenis 17p11.2 D17S29

Prader-Willi 15q11.2 SNRPN

Angelman 15q11.12 D15S10

Williams 7q11.23 Elastin

Cri du chat 5p15.2 D5S23

Wolf-Hirschhorn 4p16.3 D4S96

Microdeletion konfirmasyonu(1 kırımızı sinyalin kaybı)

Red signal –TUPLE1 (HIRA)

locus

Green signal –ARSA locus

(control probe)

Deleted chromosome – red signal absent

normal chromosome –red signal on HIRA locus is

present

Microdeletion 22q11.2 is associated with

DiGeorge syndrome.

Chromosome painting probes:

İlgili kromozom bölgesi veya tüm kromozama komplementer sekans hey contain sequences from whole chromosomes or chromosomal parts (partial probes) yapısal yenidendüzenlenmelerin saptanması (translocations and deletions of large extent),veya marker kromozomun kökeninin belirlenmesi için kullanılmaktadır

der 5

der 5

SpectrumGoldWCP 5

+SpectrumRed

WCP 9

95

9

9

der 5

Multicolor FISH - mFISH

her kromozm çifti için farklı florersan kombinkeri kullanılmakta ve her kromozm çifti farklı floresanvermektedir

Hematolojik malignensilerde kompleks kromozom anomalilerin saptanmasına imkan tanımaktadır

kompleks yapısal anomaliler saptanabilmektedir

Spectral karyotyping and multifluor FISH paint each human chromosome in one of 24 colors (SKY)

Multicolor banding with high resolution - mBAND

Klasik bant tekniklerine oranla daha yüksek çözünürlükte kromozom kırık noktaları saptanmaktadır

Kromozom 4 de küçük bir terminal delesyon var mı?

Hematolojide sitogenetik ve moleküler sitogenetiğin önemi

Diyagnoz

karyot,ip hakkında bilgi

* Tanının spesifikleşmesi

*prognoz hakkında bilgi

* Tedavinin izlenmesi

Sık kullanılan florokromların Absorption Spectrası

Fluorochrome Absorption Emission

Cascade Blue 400 420Fluorescein 494 518Rhodamine 570 590Texas Red 595 615Cy5 650 670

Diagnostic Potential For Karyotype, FISH, and Chromosomal Micro- array Analysis (CMA) For Selected Disorders

CMATelomere FISHDisease

specific FISH

KaryotypeLocus studied

Condition

~100%Detected by karyotype

Not detected~100%variousAneuploidy

Karyotype better for

present

Detected by karyotype

Not detected~100%variousLarge deletions, large dupllications, translocation of large segments

~100% for unbalanced

~100%Not detectedNot

detected

variousCryptic

Rearrangements of telomeres

~99%>95%~99%Few1p36.31p36 deletion

~99%>95%~99%Most4p16.3Wolf-Hirschhorn

~99%>95%~99%Most5p15.2Cri-du-chat

~99%Not detected~99%Almost none

7q11.2Williams-Beuren

~70%Not detected~70%Unreliable15q11-q13Prader-Willi

~70%Not detected~70%Unreliable15q11-q13Angelman

>90%Some detected>90%Few17p13.3Miller-Dieker lissencephaly

>95%Not detected>95%Some17p11.2Smith-Magenis

>95%Not detected>95%Rarely22q11.2Velocardiofacial/DiGeorage 1

FISH vs. Karyotyping

Case 1

• 2 yaşında, MR erkek

• Inborn cardiac defect –supravalvular aortic stenosis.

Abnormal fenotipik özellikler mevcut

irides stellataehypertelorism

open mouth, thick lip

abnormal teeth

„elfin face“

low set ears

Case 1

Case 2• Williams-Beuren syndrome çağrıştırmakta

• Microdeletion sendromu, 7q11.23

• %95 microdeletion FISH ile tanımlanabilmektedir

• Öncelikle konvansiyonel sitogenetik önerilmiştir

Kromozom 7 microdeletion tanımlamak için hangi prob kullanılmalıdır?

Case 1

Case 1 - karyotype

Normal sonuç:

46,XY

Microdeletion FISH analizi ile konfirme edilmelidir

7q11.23 MICRODELETION MOLECULAR SİTOGENETİK ANALİZ

LOCUS SPECIFIC PROBE FOR THE CRITICAL REGION ELN/LIMK/D7S613– (labeled with the Spectrum

Orange, red signal)

CONTROL PROBE D7S522 – (labeled with the Spectrum

Green, green signal)

ELN LIMK1 D7S613

CENTROMERE TELOMERE

180 kb

Case 1 –molecular cytogeneticardından sonuç

• 7q11.23

microdelesyon

doğrulandı

• Tanı: Williams-

Beuren syndrome

Case 2

• Turner syndrome?

• 11 yaşında, 128 cm-kısa boy, zayıf okul performansı

• Doğumda :900 gr

• Hormon seviyeleri:

*FSH :106,1 uU/mL

*LH: 21.38 uU/mL

*UE: <5,00

*G6PD: 0,4u/g Hb.

• 128 cm

• 35,5 kg.

Fenotipik Değerlendirme :

• Dismorfik özellikler:

*simian çizgisi-her iki elde mevcut

*klinodaktili-sağ elde

*kısa ve hipoplastik tırnaklar

*düşük ense saç çizgisi

*düşük yerleşimli gözler

* hipertelorizm

*basık burun

*uzun filtrum

• Abdominal USG yumurtalıklar gözlenmedi

Testler• Karyotip analiz;

*G/LTB

*C-Bantlama

*NOR Bantlama

• Karyotip:

45,X [95]/46,X,+mar[5] (5%)

• Moleculer Cytogenetic Tests:– Multicolor FISH

– LSI AR and LSI SHOX and XIST

Androgen Receptor / SHOX gene/ XIST

AR, Xq11.2-

Xq12SHOX:sp red

Cep X: Sp aqua

SHOX:sp red

Cep X: Sp aqua XIST, Xq13.2