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KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN
Verfahren, das Bakterien außerhalb
des natürlichen Standortes zur
Vermehrung bringt (unbelebte
Substrate oder Zellkulturen)
KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN
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Voraussetzungen für Bakterienwachstum
n Nährmedium
n Temperaturoptimum
n pH-Wert
n Sauerstoff
(aerob/anaerob)
Bakterienwachstum durch binäre Teilung
Pro Stunde = 2 Teilungen Anfangskeimzahl 1Ø 1 Stunde 4Ø 2 Stunden 16Ø 3 Stunden 64Ø 4 Stunden 256Ø 5 Stunden 1024Ø 6 Stunden 4096Ø 7 Stunden 16384Ø 8 Stunden 65536Ø 9 Stunden 262144Ø 10 Stunden 1048576Ø 11 Stunden 4194304Ø 12 Stunden 16777216Ø 13 Stunden 67108864Ø 14 Stunden 268435456Ø 15 Stunden 1073741842Ø 16 Stunden 4294967296Ø 17 Stunden 17179869184
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Identifizierung von Bakterien
n Morphologische Merkmale– Gramverhalten– Form– Größe– Kapsel– Kolonieform– Farbe
n Physiologische Merkmale– Nachweis verschiedener Enzyme (Bunte Reihe, API)
n Chemische Merkmale– Zellwand– Antigene– DNA
n Bakterien bilden auf festen Nährböden Kolonien. Man versteht
darunter mit bloßem Auge sichtbare Teilaggregationen, die infolge
einer einzelnen Bakterienzelle entstanden sind.
n Kolonien entstehen nicht nur unter Laborbedingungen (künstlichen
Bedingungen), sondern auch unter natürlichen Bedingungen auf
Substraten mit fester Oberfläche (z.B. auf Kartoffeln, Fleischwaren,
Früchten).
n Form, Struktur und Farbe der am Kolonieaufbau beteiligten Einzelzellen
bestimmen u.a. die Koloniemerkmale (Morphologie).
KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN
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KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN
n Farbe:
n Koloniegröße:
n Oberfläche:
n Konsistenz:
n Geruch:
n Profil:
n Kolonieform:
n Kolonierand:
KEIMZAHLBESTIMMUNGEN
n Verdünnungsreihen müssen angelegt werden, um bei der
späteren Kultivierung auswertbare Koloniezahlen auf dem Agar
zu erhalten.
n In der Praxis ist die dezimale Verdünnung am gebräuchlichsten.
n Zum Anlegen einer Verdünnungsreihe wird die Originalprobe
(Verdünnungsstufe 0) 1:10 verdünnt.
n 10 g auf 100 ml mit Verdünnungsflüssigkeit auffüllen,
Verdünnungsstufe 1.
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KEIMZAHLBESTIMMUNGEN
n Aus dieser Stufe wird 1 ml entnommen und zu 9 ml
Verdünnungsflüssigkeit pipettiert (Verdünnungsstufe 2).
n Nach dem Durchmischen auf dem Reagenzglasschüttler werden weitere
Dezimalverdünnungen angelegt.
n Für jede Verdünnungsstufe wird eine frische Pipette verwendet.
n Benutzte Pipetten werden in einer Desinfektionslösung abgestellt.
n Aus der zuvor hergestellten Verdünnungsreihe werden genau
abgemessene Mengen zur Anzüchtung von Mikroorganismen verwendet
(1ml für Plattengussverfahren und 0,1 ml für Oberflächenverfahren.
Stufe 0 Stufe 1 Stufe 2 Stufe 3 Stufe 4 Stufe 5 Stufe 6
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• 1 ml einer Verdünnungsstufe wird mit einer sterilen Pipette in eine leere, sterile Petrischale eingebracht.
• Dazu gibt man ca. 10-15 ml verflüssigten und ca. 40°C warmen Agar (z. B. PCA).
• Diese beiden Lösungen werden durch kreisende Bewegungen (in Form einer 8) verteilt.
• Die verschlossene Petrischale bleibt bis zum Erstarren des Nährbodens stehen und wird anschließend mit dem Deckel nach unten bebrütet.
Plattengussverfahren
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• 0,1 ml einer Verdünnungsstufe wird mit einer sterilen Pipette auf eine fertig gegossene Agarplatte aufgebracht.
• Der Tropfen wird mit einem sterilen gebogenen Glasstab (Drigalski-Spatel) gleichmäßig auf der Platte verteilt.
• Die Petrischale wird mit dem Deckel verschlossen. • Erst wenn der Ausstrich getrocknet ist, wird die
Schale mit dem Deckel nach unten bebrütet.
Oberflächenspatelverfahren
Plattengussverfahren
Oberflächenspatelverfahren
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VERDÜNNUNGSREIHE (Gruppenbeispiel)DI
Ü4
STUFE Gesamt Keimzahl PCA, 22°C/2d
Coliforme Bakterien/E. coli CCA,37°C/ 1d
EnterokokkenKANA, 44°C/1d
S. aureusBP, 37°C/1d
0 /
1 /
2 /
3 /
4 /
Ergebnis (Mittelwert)KBE/ml
/
n Anlegen einer Verdünnungsreihe aus einer Mischkultur (0rginal Probe, 1, 2, 3, 4)n Bestimmung der Kolonie Bildende Einheiten KBE/ml einer Keimsuspension mittels
Koch'schem Plattenverfahren– Gesamtkeimzahl (OF, PCA Agar, 22°C), – E. coli und coliformen Bakterien (OF, CCA Agar, 37°C), – Enterokokken (OF, KANA Agar, 44°C), – S. aureus (OF, BP Agar, 37°C).
Gesamtkeimzahl (PCA)n Auswertung
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Coliforme, E. coli (CCA)n Auswertung
Staphylokokken (BP)n Auswertung
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Enterokokken (KANA)n Auswertung
Berechnung am Beispiel PCA
Stufe Wert
2 418 x 102 = 418 x 1023 34 x 103 = 340 x 1024 4 x 104 = 400 x 102
1158 x 102Mittelwert bilden 1158 x 102 :3 = 386x102
Ergebnis 3,9 x 104
n Auswertung
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