laporan praktikum isolasi dna.docx
Post on 18-Jul-2016
795 Views
Preview:
TRANSCRIPT
LAPORAN PRAKTIKUM
ISOLASI DNA
Untuk memenuhi tugas Praktikum Biologi Molekuler
Tanggal Praktikum : 10 Oktober 2014
Disusun oleh :
Ana Mawarni 4411411019
Alfiatus Z. 4411412022
Darmawati 4411412059
Saeful Anhari 44114120
Ulin Nikhmatul A. 4411412074
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2014
A. TUJUAN
- Mahasiswa dapat melakukan isolasi DNA dari jaringan tumbuhan dan hewan
dengan metode Dixit dan PCI
B. DASAR TEORI
Langkah awal setiap percobaan di bidang biologi molekuler adalah
memperoleh DNA yang dapat berasal dari berbagai jaringan atau sel makhluk hidup.
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik berfungsi untuk
mengatur keseimbangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler . DNA
terdapat pada nukleus, mitokondira dan kloroplas (Ridwan, 2010).
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan
komponen-komponenya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan
basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter
pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah sel lengkap dari materi genetik (DNA)
yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom (Ridwan, 2010)
Prinsip dari isolasi DNA adalah penghancuran dinding dan membran sel,
pemisahan DNA dari debris sel dan purifikasi DNA (Nita, 2013). Dalam menentukan
metode ekstraksi DNA yang digunakan sangat bergantung pada sumber DNA-nya.
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan
langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran
(Alberts dkk. 1994: 254).
DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida
dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavoid. Sedangkan DNA
dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari
tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini
disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada
beberpa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sukit dipisahkan dari ekstrak asam
nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim (Diah,
2010).
Tujuan isolasi DNA menggunakan metode PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl
Alcohol) adalah untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya. Phenol-
Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid.
Dengan dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi
terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas tempat DNA
berada, protein yang terkoagulasi di fase yang ada di tengah dan fase Phenol-
Chloroform yang ada di paling bawah karena sifat chloroform yang berat jenisnya
besar.
C. ALAT DAN BAHAN
1. Alat :
- Botol kecil
- Label
- Bekerglass
- Tube dan Tip
- Inkubator
- Sentrifus
- Mikropipet
- Mortar dan pestle
- Neraca analitik
- Vortex
- Waterbath
- Freezer
2. Bahan :
- Daging sapi
- Buah Strowberry
- Larutan buffer ekstraksi
- Pottasium asetat 5 M
- Chloroform Isoamyl alcohol (CIAA)
- SDS 20 %
- Ethanol 70 %
- Isopropanol
- Buffer TE
- Proteinase K
- NaCl 5 M
- Phenol
- Ethanol Absolute dingin
D. METODE
a. Isolasi DNA dengan metode Dixit
1. Menggerus 0.5 g sampel dengan menambahan 3ml buffer ekstraksi
2. menambahkan 600µl 20% SDS, kocok kuat
3. Menginkubasi pada suhu 65 °C selama 30 menit, mengocok perlahan tiap 5 menit
4. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 5 menit
5. Memindah supernatant ke tube baru, menambahkan 1 ml Potassium asetat
6. Menginkubasi pada suhu -20 °C selama 10 menit
7. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 2 menit
8. Memindahkan supernatant ke tube baru, menambahkan isopropanol sebanyak 2/3
volume supernatant
9. Mengocok perlahan membentuk angka 8
10. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 2menit
11. Membuang supernatant, cuci pellet menggunakan 1 ml ethanol 70%
12. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 1 menit
13. Mengeringkan pellet pada suhu37 °C selama 60 menit
14. Melarutkan pellet dalam 100µl buffer TE, simpan pada suhu -20 °C
b. Isolasi DNA dengan metode PCI
1. Mnggerus 30 mg sampel dengan mortar hingga halus, menambahkan 500 µl
buffer ekstraksi
2. Menambahkan 20 µl proteinase K (10mg/ml) dan 50 µl SDS, vortex
3. Menginkubasi dalam waterbath 55 °C selama 60 menit, kocok perlahan tiap
10menit
4. Menambahkan 50 µl 5 M NaCl, 400 µl phenol, 400 µl CIAA. Putar pelan selama
60 menit pada suhu ruang
5. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 3,000 rpm selama 5menit
6. Memindahkan supernatant ke tube baru, Menambahkan 50 µl 5 M NaCl dan 1 ml
ethanol absolute dingin, kocok perlahan
7. Menginkubasi di freezer selama 60 menit
8. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 8,000 rpm selama 5 menit
9. Membuang supernatant
10. Menambahkan 1 ml ethanol 70% ke pellet
11. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 8,000 rpm selama 5 menit
12. Membuang supernatant dan meniriskan sampai tidak ada sisa ethanol yang
tertinggal
13. Mengeringkan sisa ethanol padasuhu 37 °C selama 60 menit
14. Menambahkan 50-100 µl buffer TE pada pellet dan simpan pada freezer
E. HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Isolasi DNA menggunakan Metode dixit
Gambar Hasil
Warna larutan kemerahan.
Agak berlendir dan keruh
Larutan homogen setelah
di sentrifuse
Hasil Isolasi DNA menggunakan Metode PCI
Warna agak keruh
tekstur agak berlendir
larutan homogen
supernatan yang telah di
pindahkan ke tub yang
baru. Dan pallet di buang
supernatan tidak berwarna
Pallet setelah yang telah di
keringkan menggunakan
microwave
Pada praktikum isolasi DNA ini menggunakan sumber jaringan dari tanaman
strawberry dan hewan yaitu daging sapi. Tanaman yang digunakan menggunakan
jaringan tanaman yang mengandung sedikit kontaminan di atas, misalnya
menggunakan daging buah. Pada saat proses destruksi jaringan tanaman atau hewan
tersebut dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim
endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi yang mengandung senyawa Tris,
EDTA, CTAB dan buffer lisis yang mengandung potasium asetat dan SDS. Proteinase
K digunakan untuk membantu mendenaturasi protein pada jaringan.Senyawa CTAB
dan SDS merupakan detergen yang dapat melisis dinding sel dan juga mendenaturasi
protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat
menghambat aktivitas enzim nuklease. Potasium asetat adalah senyawa yang dapat
berikatan dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks
dengan CTAB-Potasium asetat-protein-debris sel. Kloroform isoamyl alkohol (CIAA)
digunakan untuk mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom,
sedangkan untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan ethanol 70%. DNA dalam
ethanol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam air akan larut, tetapi
protein tidak dapat larut dalam air.
Dengan menggunakan kedua bahan tersebut yaitu daging sapi dan buah
strawberry, kami melakukan isolasi DNA dengan dua metode. Metode yang pertama
menggunakan metode PCI ( Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol ) metode yang
kedua menggunakan metode dixit.
Pada kedua Metode Penambahan buffer ekstarksi pada kedua bahan tersebut
dimaksudkan untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer dan
menjaga struktur DNA ketika proses penggerusan. Bahan yang telah di tambahkan
buffer ekstraksi di gerus untuk mempermudah dan mempercepat proses melisiskan
membran sel. Sama halnya dengan pada metode dixit penambahan buffer ekstraksi
juga dimaksudkan untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid. Terjadinya
proses lisis ditandai dengan adanya tekstur lendir.
Kedua metode menggunakan SDS dimaksudkan untuk melisiskan dinding dan
membran sel. Untuk PCI ditambahkan proteinase-K untuk mendegradasi protein
globuler dan membantu melarutkan lipid dan membran sel.
Inkubasi dimaksudkan membantu proses denaturasi pada suhu optimum lipid
atau protein dapat terdenaturasi. Pengocokan dimaksudkan supaya denaturasi merata
pada seluruh bagian. Pada metode PCI dilakukan di waterbath dan inkubasi pada
metode dixit dilakukan di oven. Kemudian pengocokan setiap 10 dan 5 menit.
Sebelum di sentrifuse isolasi DNA yang menggunakan metode PCI
ditambahkan NaCl, CIAA, dan phenol. NaCl berfungsi untu menghilangkan
polisakarida. Tujuan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) untuk memisahkan
antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform berfungsi sebagai
pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. Dengan dilakukannya ekstraksi
menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari
fase air yang ada di paling atas tempat DNA berada, protein yang terkoagulasi di fase
yang ada di tengah dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling bawah karena sifat
chloroform yang berat jenisnya besar.
Fase air yang diambil kemudian diendapkan. untukmenciptakan kondisi netral
dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga DNA
mengendap dengan sentrifugasi. Pelet yang didapat kemudian dimurnikan dengan
penambahan etanol 70% yang kemudian disentrifugasi lagi untuk didapatkan pelet.
Sentrifus pada kedua metode dimaksudkaan supaya larutan dapat homogen
lebih cepat. Pada metode PCI setelah sentrifus pertama supernatan ditambahkan
larutan NaCl dan absolute dingin kemudain di kocok perlahan selama 60 menit. Hal
tersebut di maksdukan agar larutan dapat homogen namun tidak merusak struktur
DNA.
F. KESIMPULAN
Dari praktikum isolasi DNA dapat disimpulkan bahwa DNA dapat diisolasi,
baik pada hewan maupun pada tumbuhan. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi
DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Isolasi DNA memiliki beberapa
tahapan, yaitu isolasi jaringan, dinding dan membran sel dilisiskan, ekstraksi dalam
larutan, purifikasi, dan presipitasi.
DAFTAR PUSTAKA
Mulyani, Yanuar dkk. 2010. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA untuk
Deteksi Dini Koi Herpes Virus (KHV ) pada Ikan Mas ( Cyprinus carpio L.) .
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran Jatinangor,
UBR 40600.
Kusumawaty, Diah. 2010. Isolasi DNA Skala Kecil. Program Studi Biologi Jurusan
Pendidikan Biologi UPI
Maulana, Ridwan dkk. 2010. Isolasi DNA Tanaman dan Elektroforesis DNA.
http://www.academia.edu/6610678/Laporan_isolasi_DNA. Diakses pada 10
Oktober 2014.
top related