le applicazioni attuali delle biotecnologie non ogm nel settore alimentare diego.mora@unimi.it

Le applicazioni attuali delle biotecnologie NON OGM

nel settore alimentare

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I MICRORGANISMI E GLI ALIMENTI

Streptococcus thermophilus

Lactobacillus delbruecki bulgaricus

Pe

nic

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um

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Saccharomyces cerevisiae

Bifidobacterium bifidum

Quanti microrganismi ingeriamocon gli alimenti?Si ingeriscono anche vivi?

La MICROBIOLOGIA ALIMENTARE può essere considerata una branca dell’ECOLOGIA MICROBICA

Al fine di gestire al meglio le condizioni di crescita e le attività metaboliche dei microrganismi per l’ottenimento di alimenti sono necessarie una serie di informazioni inerenti a:

• L’identità tassonomica, cioè il numero delle specie, e il grado di diversità biologica dei ceppi che colonizzano l’alimento in ogni stadio del processo produttivo, dalla materia prima al prodotto finito;

La valutazione del grado di diversità biologica rimane sempre una stima della reale diversità microbica esistente sia per la difficoltà di recuperare le specie presenti a bassa concentrazione nel campione, sia per l’annoso problema delle specie non coltivabili.

• dati quantitativi che descrivono l’andamento delle popolazioni di specie e ceppi microbici durante le diversi fasi del processo produttivo;

• effetto dei fattori intrinseci e di processo-conservazione che possono influenzare la crescita, la sopravvivenza e le attività metaboliche microbiche;

•distribuzione spaziale delle specie microbiche nel prodotto;

• L’ identità tassonomica e il grado di diversità biologica …

CARATTERIZZAZIONE GENETICA E FENOTIPICA DI MICRORGANISMI DI INTERESSE ALIMENTARE

Identificazione a livello di genere e specie, secondo un approccio POLIFASICO ovvero di un approccio basato su valutazioni fenotipiche e genotipiche.

Analisi filogenetica basata sulla sequenza del gene 16S rRNA del ceppo isolato.

L’ identificazione appropriata di una specie batterica avviene essenzialmente attraverso analisi molecolari … ma non è

mai una pratica semplice e scontata !

… perché la definizione di specie batterica non ha “contorni definiti”

... perché non è così raro individuare ceppi batterici che appartengono a specie o generi non ancora descritti

GENOTIPO(per identificare la specie)

Variabilità fenotipica tra ceppi che appartengono alla stessa specie

GENOTIPO(per ottenere gruppi omogenei di ceppi appartenenti alla stessa specie)

Come procedere quando devo identificare un numero elevato di ceppi isolati da un determinato prodotto alimentare?

Tecniche molecolari basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) e quindi su informazioni presenti a livello del genoma batterico.

ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis)

ITS (Internal Transcribed ribosomal Spacer analysi)

RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA fingerprinting analysis)

Rep-PCR (Repetitive Elements PCR)

PCR-based fingerprinting methods (AFLP)

Poteredi

risoluzione

CeppiIsolatiin colturapura

Specie D Specie E Specie B Specie C Specie A Specie A

Specie ASpecie B e CSpecie D e E

Poteredi

risoluzione

16S rRNA

ITS (16S-23S rRNA)

RAPD, rep-PCR, etc.

Specie B Specie C Specie ASpecie D e E

La CARATTERIZZAZIONE GENOTIPICA ottenuta a livello di CEPPO

Mette in evidenza unaVARIABILITA’ GENOTIPICANON NECESSARIAMENTECORRISPONDENTE ALLA

VARIABILITA’ FISIOLOGICAe alle caratteristiche

TECNOLOGICHE del ceppo

Indispensabile una caratterizzazione FENOTIPICA

Metabolismo Energetico Primario (Respirazione e/o Fermentazione). Questa informazione si può considerare acquisita contemporaneamente all’identificazione molecolare a livello di specie.

Caratterizzazione delle attività metaboliche di interesse tecnologico. Spesso si tratta di caratteristiche dei singoli ceppi piuttosto che della “specie”.

Poteredi

risoluzione

Caratterizzazione delle attività metaboliche di

interesse tecnologico. Caratteristiche dei singoli ceppi piuttosto che della

“specie”.

Metabolismo del LATTOSIO/Galattosio

Sistema PROTEOLITICO

L’AUTOLISI

La produzione di AROMI

La sintesi di ESOPOLISACCARDI

La produzione di MOLECOLE ad ATTIVITA’ ANTIBATTERICA

La RESISTENZA AI BATTERIOFAGI

Metabolismo del LATTOSIO/Galattosio

Effetti diretti sulla velocità di acidificazione

S. thermophilus non utilizza il galattosio derivato dall’idrolisi del lattosio e il suo accumulo nella matrice alimentare può facilitare lo sviluppo di microrganismi alterativi

In alcuni casi si preferisce selezionare ceppi incapaci di utilizzare il lattosio (L. delbrueckii per produzione di yogurt)

?

Sistema PROTEOLITICO

Effetti diretti sulla velocità di acidificazione

Effetti indiretti sul processo di maturazione dei formaggi (endopeptidasi)

Può determinare la formazione di peptidi BIOATTIVI a partire dall’idrolisi delle proteine del latte (Inibitori dell’ACE e casomorfine)

Modulare lo sviluppo di sapori amari dovuti alla formazione di peptidi conteneti amminoacidi idrofobici (Leu, Phe e Pro)

L’AUTOLISI

Effetti diretti sul processo di maturazione dei formaggi. Inoculi con ceppi selezionati autolitici riducono i tempi del processo di maturazione.

endopeptidasi

La produzione di AROMI

Effetti diretti sulle qualità organolettiche del prodotto finito.(Enzimi coinvolti nel catabolismo degli amminoacidi, glutammato-deidrogenasi, transaminasi, idrossimetil-transferasi)Diacetile, acetaldeide etc.

La sintesi di ESOPOLISACCARDI

Effetti diretti sulla texture del prodotto fermentato (Yogurt).

Consente di ridurre la % di sostanza grassa.

batteri patogenie/o alterativi

La produzione di MOLECOLE ad ATTIVITA’ ANTIBATTERICA

Si tratta di molecole di sintesi proteica (batteriocine), direttamente coinvolti nel processo di fermentazione, e in grado di contrastare lo sviluppo di microrganismi alterativi o patogeni.Rappresentano un valore aggiunto nelle caratteristiche di una coltura starter.

ceppo battericopro-tecnologico

La RESISTENZA AI BATTERIOFAGI

Importante sia in fase produttiva di biomasse da utilizzare come starter che in fase di caseificazione

In alcuni casi l’induzione di un ciclo litico viene sfruttato per accelerare il processo di maturazione dei formaggi

L’adesione alle cellule epiteliali intestinali delle specie PROBIOTICHE

… una delle condizioni“essenziali” per definire un ceppo probiotico

Adesione di Bifidobacterium bifidum NAB1 su cellule epiteliali intestinali coltivate in vitro (Caco-2 cell layer)

LactobacillusLactobacillus sp. sp. B. Bifidum NAB1B. Bifidum NAB1..

B. Bifidum NAB1B. Bifidum NAB1..

B. Bifidum NAB1B. Bifidum NAB1

genomi di piccole dimensioni (1,8 – 3 Mbp)

il background culturale (biologia molecolare, genetica, biotecnologie) consente una loro “facile” annotazione

… posso prevedere cosa “sa fare” un microrganismo sulla base della sequenza del suo genoma …

attribuire a ciascun geneuna “funzione” nel

metabolismo cellulare

Un aiuto dal sequenziamento dei genomi microbici

Streptococcus thermophilus - genome

La variabilità genetica e la “biodiversità” esistenti nel mondo microbico consentono, nella maggior parte dei casi, di individuare il microrganismo

(ceppo) più adatto ad un determinato processo produttivo

… quando ciò non è possibile … la selezione di mutanti “naturali” rappresenta un ottimo strumento per ottenere il “nuovo”

microrganismo con le caratteristiche desiderate …

… in ogni caso la costruzione di microrganismi geneticamente modificati può aiutare (in laboratorio) a comprendere le funzioni di

singoli geni o gruppi di geni nel metabolismo cellulare e il loro contributo “tecnologico” …

… esistono tecnologie Food-Grade per ottenere microrganismi ricombinanti …ma non sono attualmente

accettate dai consumatori perché …