le transfert résonnant d’énergie par mesure des temps de vie (fret/flim) et ses applications...
Post on 04-Apr-2015
107 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Le transfert résonnant d’énergie par mesure des temps de vie
(FRET/FLIM) et ses applications pour l’étude des interactions
moléculaires.
07/11/2013 1
Marion-Anne BARRE L3 ENS biologie moléculaire et cellulaire
07/11/2013 2
Extr
ait d
e «
Mol
ecul
ar B
iolo
gy o
f the
Cel
l » 5
th e
ditio
n
Principe du FRET (1)
07/11/2013 3
G. T
rugn
an a
nd a
l «FR
AP, F
LIP,
FRE
T, B
RET,
FLI
M, P
RIM
…. D
e no
uvel
les
tech
niqu
es p
our v
oir l
a vi
e en
cou
leur
» [e
n lig
ne] :
htt
p://
ww
w.e
rudi
t.org
/rev
ue/M
S/20
04/v
20/n
11/0
0970
5ar.h
tmlPrincipe du FRET (2)
07/11/2013 4
Extr
ait d
e «
Mol
ecul
ar B
iolo
gy o
f the
Cel
l » 5
th e
ditio
n
Principe du FRET (1)
07/11/2013 5
Principe du FRET résolu en temps par FLIM
Prés
enta
tion
à l’I
nstit
ut Ja
cque
s M
onod
[en
ligne
] «
http:
//w
ww
.ifr8
7.cn
rs-g
if.fr
/pbc
/ani
mati
on/d
oc/P
iolo
t.pdf
»
En plus
En plus
Comparaison : déclins des différents fluorophores
En plus
07/11/2013 9
Applications
Etudes d’interactions intermoléculaires
Etudes d’interactions intramoléculaires
• Dimérisation de protéines
• Changements conformationnels de protéines et repliement
• Biosenseurs : applications à l’étude d’activités enzymatiques, à la détermination de concentration d’ions (Ca²+ ) ou de métabolites (AMPc)
• Protéine/Protéine
• Protéine/ADN
07/11/2013 10
• Choix de la statégie
• Etude de la colocalisation des protéines d’intérêt en microscopie confocale
• Choix de la place de l’étiquette fluorescente
• Tester l’effet de l’ajout de l’étiquette fluorescente
• Etude de leur interaction éventuelle par FRET
Démarche expérimentale et matériel
07/11/2013 11
Exemple de courbes de déclin de fluorescence
Attention! Échelle en 10-1 ns et non en ns!!
07/11/2013 12
Exemples d’images obtenues par mesure du temps de vie de fluorescence dans une cellule au confocal
référence
Donneur + accepteur
Mutant : contrôle négatif (perte d’interaction)
Photoblanchiment
07/11/2013 13
• Complexité de la mise en œuvre (appareillage, manipulations pour fusion…)• Les résultats négatifs ne permettent pas d’affirmer que les molécules d’intérêt
n’interagissent pas• Cette technique suppose un niveau d’expression élevé des molécules d’intérêt, ce qui
peut perturber leur fonction et/ou la réponse cellulaire
Discussion avantages inconvénients• La durée de vie de fluorescence est indépendante de la concentration• Les fluorophores ont des temps de vie différents (permet de discriminer deux
fluorophores qui ont des spectres très proches, chevauchants contraitement au FRET steady state)
• Dépendant de l’environnement du fluorophore ( intéressant pour ex biosenseurs in vivo)
• Permet de limiter les artéfacts dû à l’autofluorescence (FAUX)• Accès à différentes informations :
- Proportion des molécules en interaction- Efficacité de transfert- En mode image : cartographie des interactions
• Etude dynamique possible
top related