lecture electrophoresis 2552

Electrophoresis

อาจารย์�พิ�ไลพิร จงรวมกลาง แขนงว�ชาภู�ม�คุ้��มก�นว�ทย์าคุ้ล�น�กและเวชศาสตร�การธนาคุ้ารเล!อด

Content :

# Background & Theory

# Agarose Gel Electrophoresis

# Polyacrylamide Gel Electrophoresis

# IEF & 2-Dimensional Electrophoresis

# Capillary Electrophoresis

Electrophoresis

Principle: Under the influence of an electrical field, charged molecules and particles migrate in the direction of the electrode bearing the opposite charge.

# The substances are in aqueous solution

# Different molecules and particles will migrate at different speed Separated into single fraction

Electrophoresis

Electrophoresis

• โมเลกุ�ลที่�ม�ประจุ�ไฟฟ�า• Electron = อำ�าพั�น ซึ่�งสามารถที่�าให้�เกุ�ดไฟฟ�าสถ�ตได�

เม"อำน�ามาถ#กุ�บผ้�า• Phore = ผ้#�ถ"อำ ห้ร"อำผ้#�ที่�ม�• เป&นเที่คน�คที่�ใช้�แยกุโมเลกุ�ลขอำงสารที่�ม�ประจุ�อำอำกุจุากุกุ�น

โดยใช้�กุระแสไฟฟ�า โดยให้�สารที่�ม�ประจุ�น�,นเคล"อำนที่�ผ้-าน ต�วกุลางช้น�ดห้น�งในสารละลาย สารที่�ม�ประจุ�ต-างกุ�นจุะ

เคล"อำนที่�ไปในที่�ศที่างตรงกุ�นข�าม

โมเลก�ลต$างก�นจะม%การตอบสนองต$อหน$วย์สนามไฟฟ)าหน*+งๆ โดย์การเคุ้ล!+อนท%+ไปได�เร.วไม$เท$าก�น ซึ่*+งเป0นคุ้�ณสมบ�ต�จ2าเพิาะของแต$ละโมเลก�ลเร%ย์กว$าคุ้$า (electrophoretic mobility) ของโมเลก�ล ซึ่*+งหมาย์ถึ*งคุ้วามเร.วของโมเลก�ลชน�ดหน*+งๆ ท%+สถึานะคุ้งต�ว(steady-state)ต$อหน$วย์สนามไฟฟ)า ม%หน$วย์เป0น cm2/volt-sec

อ�ตราการเคุ้ล!+อนท%+ของสารในการท2าอ�เล.กโทรโฟร%ซึ่%สจ*งแปรผั�นตรงก�บประจ�ส�ทธ�ของสาร(Q) แต$แปรผักผั�นก�บขนาดโมเลก�ลของสาร(r) และคุ้วามหน!ดของสาร(h)

= Q/Krh k = constant

เม!+ออย์�$ในสนามไฟฟ)า คุ้วามเร.วของว�ตถึ�หร!อประจ� (migration velocity;v) จะเป0นด�งสมการ

v = EQ/krh

การเคุ้ล!+อนท%+ของสารในสนามไฟฟ)า

The factors affecting Electrophoretic separations1.The sample itself

Charges, size, shape

2. The electric fieldVolt, electric current

& heat3. The medium in which electrophoresis takes place

Stabilizing mediumBuffer ingredients & concentrationElectro-osmosis, EO

Apparatus and materials for electrophoresis

1.The electrophoresis chamber เป0นอ�ปกรณ�ส2าหร�บวาง ต�วกลางคุ้26าจ�น บรรจ�บ�ฟเฟอร�ในการท2าอ�เล.กโทรโฟร%ซึ่%ส และม%ส$วนส2าหร�บต$อก�บข�6วไฟฟ)าบวกและลบ

2. Power supplies ท2าหน�าท%+เปล%+ย์นกระแสสล�บเป0นกระแสตรงแก$ระบบ สามารถึปร�บคุ้$ากระแสและคุ้วามต$างศ�กย์�ท%+จะให�แก$ระบบได�ตามคุ้วามต�องการ

3. Supporting medium ม%หลาย์ชน�ด ใช�ส2าหร�บช$วย์จ2าก�ดการเคุ้ล!+อนท%+แบบไร�ท�ศทางของสารท%+ต�องการแย์ก และต�วกลางบางชน�ดม%คุ้วามสามารถึในการช$วย์จ2าแนกสารด�วย์

4. Buffer ม%หน�าท%+หล�กในการเป0นต�วกลางน2ากระแสไฟฟ)า เป0นต�วคุ้วบคุ้�มคุ้$า pH ให�คุ้งท%+ ซึ่*+งเป0นการร�กษาประจ�บนสารต�วอย์$างไม$ให�ม%การเปล%+ย์นแปลงคุ้$าประจ�

5. Quality control/ standard/ ส%ย์�อม เพิ!+อการตรวจสอบและต�ดตามโมเลก�ล

Apparatus and materials

for electrophoresis

ว�ว�ฒนาการของอ�เล.กโทรโฟร%ซึ่�ส

1.Moving-boundary Electrophoresis

2.Paper Electrophoresis

3.Cellulose acetate electrophoresis

4.Starch Gel electrophoresis

5.Gel electrophoresis

6.Capillary electrophoresis

ใช�เวลานานมาก ใช�สารต�วอย์$างจ2านวนมาก การต�ดตามต�องใช�เทคุ้น�คุ้ท%+เร%ย์กว$า Schlieren ม%คุ้วามซึ่�บซึ่�อนและม%ราคุ้าแพิง คุ้วามส�+นสะเท!อนและคุ้วามร�อน ม%ผัลต$อระบบมาก

Moving-boundary Electrophoresis

Paper Electrophoresis

- Supporting medium : Paper

- ม%ขนาดร�พิร�นไม$สม2+าเสมอ- องคุ้�ประกอบของกระดาษเป0นเซึ่ลล�โลสท%+

ไม$คุ้$อย์บร�ส�ทธ�9- หม�$ไฮดรอกซึ่�ลของเซึ่ลล�โลสสามารถึด�ด

ซึ่�บสารบางชน�ดได� โดย์เฉพิาะโปรต%น- แถึบสารกว�าง ไม$คุ้มช�ด ม%คุ้$าการแย์กต2+า

Cellulose acetate electrophoresis

- เซึ่ลล�โลสอะซึ่�เตตม%คุ้วามบร�ส�ทธ�9ส�งกว$ากระดาษ- ม%ขนาดร�พิร�นสม2+าเสมอ- Chemically inert, ไม$ด�ดซึ่�บโปรต%น - สามารถึใช�สารละลาย์ชะสารท%+ต�องการศ*กษาต$อ

ออกจากแผั$นเซึ่ลล�โลสได�- น�ย์มใช�ในงาน routine clinical analysis

รวมท�6งการแย์กโปรต%นใน serum หร!อแย์ก isoenzyme

- Hemoglobin electrophoresis on cellulose acetate at alkaline pH

Test performed: Cellulose acetate alkaline electrophoresis

Purpose: Screen for hemoglobin variantsPrinciple: Hb has a net negative charge at pH8.6 and move in an electrical filed towards the anode (positive) due to the variation in the amino acid content off different Hb, the net charge of each Hb types varies and this will determine their rate of mobility.

Cellulose acetate > easily available > provides a sharp resolution in a

short time > allow cleaning, densitometric quantitiation

> permanent storage of the transparent filmProcedures:Electrophoresis the plate for 25 minutes at 350 voltsThe plate is stained in ponceau S

taken from http://www.dokkyomed.ac.jp/dep-k/cli-path/a-super/h25.html

http://first6weeks.blogspot.com/2007/07/hello-everyone-i-was-posted-to.html

ต�วอำย-างแสดงผ้ลกุารแยกุฮี�โมโกุลบ�นช้น�ดต-างๆ ด�วย Cellulose acetate alkaline electrophoresis

Hb electrophoresis. cellulose acetate pH 8.4

1. Normal adult 2. HPFH (heterozygote)3. Hb S--HPFH 4. Hb C--HPFH 5. Normal newborn

+ -

Gel electrophoresis

# adjustable gel matrix # Chemically inert & not exhibit electroosmosis# Vertical cylindrical gel rods or plate or horizontal gel slabs are available# Divide into 3 supporting mediums as : Starch gel, Agarose gel, Polyacrylamide gel # Divide into restrictive and non-restrictive media

Starch Gel electrophoresis

- ต�วกลางคุ้26าจ�นเป0นแป)ง- เคุ้ย์น�ย์มใช�แย์กโปรต%นเพิ!+อน2าไปศ*กษาการท2างานต$อ- ขนาดของร�พิร�นสามารถึปร�บได�โดย์อาศ�ย์คุ้วามเข�มข�นของเจล- low reproducibility - Impractical handling- Replace by polyacrylamide gel

Electrophoresis in gels

Gel shapes; Three main arrangements

1. Tubes/Rod2. Horizontal slabs

3. Vertical slabs

Electrophoresis in gels

Gel sizes ; 4 size groups

Micro : 3-4 cm longMini : 7-8 cmStandard/general : 15-20 cmLong : up to 100 cm

Thickness : ~ 1 mm is frequently use in modern system

: down to 0.3-0.5 mm to avoid temp. gradients

Agarose Gel Electrophoresis-Polysaccharide from red seaweed-Pore size depends on concentration of agarose-น�ย์มใช�ในการว�เคุ้ราะห�ช%วโมเลก�ลขนาดใหญ่$ (> 10 nm)

2. Immunoelectrophoresis- เกุ�ดตะกุอำนในล�กุษณะเส�น ณ จุ�ดสมด�ล ระห้ว-างแอำนต�เจุน(โปรต�นที่�ต�อำงกุารว�เคราะห้5 ) กุ�บแอำนต�บอำด�ที่�จุ�าเพัาะ เป&นมห้โมเลกุ�ลเช้�งซึ่�อำนขนาดให้ญ่- ...antigen-antibody-antigen-antibody-antigen-antibody...- ตะกุอำนเป&นเส�นส�ขาว มอำงเห้7นได�ด�วยตาเปล-า/ย�อำมส�เพั"อำกุารต�ดตามได�- High specificity & sensitivity- Divide into 3 principles

Counter ImmunoelectrophoresisZone electrophoresis/ImmunodiffusionRocket Immunoelectrophoresis

1.Zone electrophoresis น�ยมใช้�ว�เคราะห้5โปรต�นจุากุซึ่�ร�ม, LDH, CK ต�ดตามได�โดยกุารย�อำมที่�จุ�าเพัาะ ห้ร"อำแอำนต�บอำด�ที่�จุ�าเพัาะ

Agarose Gel Electrophoresis (Cont.)

Agarose Gel Electrophoresis The standard method for - Separation & Purification of DNA & RNA fragment- DNA restriction fragment analysis

Horizontal submarine gel use for separation

Stain gel with fluorescent dyes; ethidium bromide, SYBR green

Visible under UV light

Nucleic acid has Phosphate group negative charge

Equal Charge/mass ratio through molecule separate by size

Pulse field gel electrophoresis

กุารที่�าอำ�เล7กุโที่รโฟร�ซึ่�สแบบให้�กุระแสไฟฟ�าเป&นจุ�งห้วะส�,นๆ

โดยม�กุวางระบบกุารให้�ไฟฟ�าแกุ-เจุลในห้ลายที่�ศที่าง

ใช้�เวลาในกุารเปล�ยนที่�ศที่างซึ่�งข�,นอำย#-กุ�บขนาดขอำงโมเลกุ�ล เป&นห้ล�กุกุารแยกุด�เอำ7นเอำตามขนาด

Polyacrylamide gel electrophoresis

Chemically inert & particularly mechanically stable

Clear transparent gel, Very little electroosmosis

Polyacrylamide เกุ�ดจุากุกุาร Polymerization ขอำง acrylamide โดยใช้� acrylamide และ methylene-bis acrylamide มา cross-link กุ�น โดยอำาศ�ยต�วกุระต��นที่างเคม�ค"อำ ammonium persulphate เป&น catalyst และ TEMED เป&นต�วที่�าให้�เกุ�ดอำน�ม#ลอำ�สระเพั"อำเร�มต�นปฏิ�กุ�ร�ยา

ขนาดร#พัร�นขอำงเจุล ข�,นอำย#-กุ�บ ความเข�มข�นขอำง acrylamide;%T และปร�มาณกุาร cross-linking;%C ซึ่�งสามารถกุ�าห้นดได�ตามต�อำงกุาร

ขนาดขอำงร#พัร�นจุะแปรผ้กุผ้�นกุ�บ %T

Gel composition and the molecular mass range of proteins with can be separate on a 2.5%C acrylamide

%T (g/100 ml)Mr(Dalton)

3-5 > 105

5-10 1.5x105-1x104

10-15 105-104

>15 <1.5x104

เคร"อำงม"อำพั",นฐานส�าห้ร�บ PAGE

การเล!อกระบบให�สอดคุ้ล�องก�บ ว�ตถึ�ประสงคุ้�ของการท2างาน

1.Cylindrical gel VS Slab gel

2.Native gel/ non-denaturing gel electrophoresis VS Denaturing systems

3.continuous buffer system VS discontinuous buffer system

4 .เล!อก pH

5. เล!อกคุ้วามเข�มข�นของเจล

Native gel/ non-denaturing gel electrophoresis

ว�ธี�น�,โปรต�นอำย#-ในสภาพัธีรรมช้าต� ซึ่�งสมารถน�าโปรต�นที่�แยกุได�ไปตรวจุสอำบห้าแอำคต�ว�ต�,ต-อำได� แต-ไม-สามารถแยกุความแตกุต-างขอำงร#ปร-าง ขนาดห้ร"อำประจุ�ขอำงโปรต�นได� ด�งน�,นโปรต�นที่�ม�น�,าห้น�กุโมเลกุ�ลต-างกุ�นอำาจุเคล"อำนที่�ได�เที่-ากุ�น ระบบน�,เห้มาะส�าห้ร�บใช้�แยกุโปรต�นช้น�ดต-างๆ กุ�นอำอำกุจุากุกุ�น แต-ไม-เห้มาะส�าห้ร�บใช้�ตรวจุสอำบห้ร"อำย"นย�นความบร�ส�ที่ธี�< ห้ร"อำห้าน�,าห้น�กุโมเลกุ�ลขอำงสาร

ต�วอำย-างเช้-น Blue-Native Polyacrylamide Gel Electrophoresisซึ่�ง Schägger และ von Jagow ได�ที่�ากุารศ�กุษาในป= 1991 เพั"อำแยกุ enzymatically active membrane protein complexes ภายใต�สภาวะที่�ไม-ร�นแรง

ระบบท%+ท2าให�โปรต%นและพิอล%น�วคุ้ล%โอไทด�เส%ย์สภูาพิ โดย์การเต�ม detergent ในระบบ โปรต%นท%+แย์กได�ไม$สามารถึน2ามาทดสอบหาแอคุ้ต�ว�ต%6ได�ประย์�กต�หาน26าหน�กโมเลก�ลของโปรต%น หร!อคุ้วามย์าวของ

พิอล%น�วคุ้ล%โอไทด�Detergent ท%+น�ย์มเช$น SDS(sodium dodecyl

sulphate), urea

Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis

Separation in continuous buffer system: simple separation

Separation in discontinuous buffer system more than one gel mix, buffer systemMost commonly 2 gels : 1 stacking/spacer/top gel

2 separating/running/resolving gel

3 buffers : 2 for each gel 1 for electrode

compartment

• Stacking process ท%+เก�ดข*6นใน stacking gel เป0นห�วใจส2าคุ้�ญ่ของระบบน%6 เน!+องจากท2าให�เก�ดการบ%บสารต�วอย์$างให�เข�มข�นข*6น

Separation in discontinuous systemThe stacking process & The stacking gel

# Leading ion-sample-trailing ion# ร#พัร�นใน stacking gel ม�ขนาดให้ญ่- ไม-สามารถค�ด

กุรอำงโปรต�นได�# โมเลกุ�ลจุะไม-เคล"อำนผ้-านแถบขอำง leading ion ได�

แถบแคบๆ ขอำงโปรต�นที่�เข�มข�นข�,น (stacked)

The resolving or separating gel# ม� pH ส#ง trailing ion เกุ�ดกุารเปล�ยนไปเป&นประจุ�ลบ

ประกุอำบกุ�บเจุลม�ขนาดร#พัร�นเล7กุลง โปรต�นจุ�งเคล"อำนที่�ได�ช้�าลง เกุ�ดกุารค�ดแยกุ

เล!อก pH ให�เหมาะสมPAGE ที่�าได�ในช้-วงบ�ฟเฟอำร5 2.5-11 แต-ที่�น�ยมค"อำ 3-10

Discontinuous system เล"อำกุให้�เห้มาะสมที่�จุะเกุ�ด stacking process

Native gel system pH ม�ความส�าค�ญ่มากุ เพัราะสามารถเปล�ยนประจุ�ขอำงโปรต�นได�Continuous system กุารเล"อำกุ pH ที่�เห้มาะสมข�,นอำย#-กุ�บ 2 ป>จุจุ�ย ค"อำ

- เป&น pH ที่�โปรต�นที่�ต�อำงกุารศ�กุษาย�งที่นได�ไม-เส�ยสภาพั

- ที่�าให้�โปรต�นที่�ต�อำงกุารศ�กุษาม�ประจุ�

http://www.imb-jena.de/~rake/Bioinformatics_WEB/proteins_purification.html

Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)

SDS-PAGE separation procedure:- proteins are exposed to the ionic detergent SDS before and during gel electrophoresis - SDS denatures proteins, causing multimeric proteins to dissociate into their subunits - all polypeptide chains are then forced into extended conformations with similar charge / mass ratios - SDS treatment eliminates the effect of differences in shape

chain length = unique determinant of the migration rate of proteins

- individual polypeptide chains migrate as a negatively charged SDS-protein complex through the porous polyacrylamide gel - speed of migration is proportional to the size of the proteins

smaller polypeptides running faster than larger polypeptides

http://www.imb-jena.de/~rake/

Bioinformatics_WEB/proteins_purification.html

Isoelectric focusing (IEF)-Takes place in a pH gradient

-Only for amphoteric substances such as peptides and proteins

-Generated between the cathode and anode

-A solute will migrate to a point where its net charge is zero

-At the solutes isoelectric point (pI), migration stops and the sample is focused into a tight zone

-pI = pH at which a dissolve protein has a net charge of zero & doesn’t move in an electric field

http://mcb.berkeley.edu/courses/mcb102/handouts/Doudna/Lecture4.pdf

2-Dimensional Electrophoresis

3 4 5 6 7 8 9 10 pH

Pathogen non-pathogenPathogen non-pathogen

กุารต�ดตามโมเลกุ�ลห้ล�งกุารที่�า electrophoresis

1.Visualization of separated materials

Electropherogram, Densitometer

Color stain : Amido Black,Coomassie Brilliant Blue R-250, Colloidal Gold (Progold),Ponceau S, Silver stain

Fluorescence and radioactivity as localization signals

Biological basis- Signals from catalytic processes by sample components- Immunological binding

2. Blotting

- The transfer of large molecules on to the surface of an immobilizing membrane

Choices in electrophoresis

Media

Electrophoretic system

Size

Format

Separation principle

GelsTarget groupsTarget molecules

NativeModified (during pre-treatment)

Choices in electrophoresis (Cont.)

Detection

Principle

Signal generation

Analysis

Result type

Approach

State-of-the art : Capillary Electrophoresis

# Two buffer reservoirs

# Very small diameter capillary tube

<0.5 metre in length & < 0.1 mm in diameter

# High voltage power supply (10-60 kV)

# A detection system : absorbance detector

conductivity detector

mass spectrometric detector

CE ชน�ดต$างๆ ท�6งหมดอย์�$ในร�ปแบบของเคุ้ร!+องว�เคุ้ราะห�อ�ตโนม�ต�

Electroosmotic flow (EO)การไหลของสารละลาย์ภูาย์ในแคุ้พิ�ลลาร�

ป=จจ�ย์หล�กในการแย์กสารด�วย์ CEผัน�งด�านในของแคุ้พิ�ลลาร�ม% silanol ซึ่*+งจะแตกต�วเม!+อสารละลาย์อ�เล.ก

โทรไลต�ท%+ส�มผั�สอย์�$ม% pH ส�ง การแตกต�วจะท2าให�ผัน�งม%ประจ�ลบท2าให�เก�ดช�6นของประจ�ซึ่*+งจ�บก�บโมเลก�ลของน26าได� เม!+อให�กระแสไฟฟ)า ประจ�เหล$าน%6จะสามารถึน2าโมเลก�ลของน26าไปย์�งข�6วไฟฟ)าลบท2าให�เก�ดการไหลของสารละลาย์ น2าเอาสารต�วอย์$างไปย์�งข�6วไฟฟ)าลบด�วย์

The aqueous buffer move in CE

because of Electroosmotic flow

Computer

การประย์�กต�ใช� CE

1 .การว�เคุ้ราะห� DNA และ Nucleic acid

2. การประย์�กต�ในงานด�านการแพิทย์�และน�ต�เวช3. การว�เคุ้ราะห�คุ้าร�โบไฮเดรต4. การว�เคุ้ราะห�โลหะ สารอ�นทร%ย์�และอน�นทร%ย์�ประจ�ลบท%+ม%

ขนาดเล.ก 5. การประย์�กต�ในงานด�านย์า6. การแย์ก Chiral

7. การแย์กโปรต%นและเปปไทด�8.Affinity capillary electrophoresis และการ

ว�เคุ้ราะห�ด�านว�ทย์าภู�ม�คุ้��มก�น

References

• ส�กุ�ญ่ญ่า ส�นที่รส. อำ�เล7กุโที่รโฟร�ซึ่�ส. ส�าน�กุ พั�มพั5แห้-งจุ�ฬาลงกุรณ5มห้าว�ที่ยาล�ย

กุร�งเที่พัมห้านคร, 2549• Hawcroft DW. Electrophoresis : The

basics. USA: Oxford university press Inc., 1997

• Westermeier R. Electrophoresis in practice. 2nd ed. VCH., 1997