lgn - umr 7091 sous la direction du docteur jacques mallet
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Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le
transfert de gène dans le Système Nerveux Central
LGN - UMR 7091sous la direction du Docteur Jacques MALLET
Lahouari AMAR
• Le transfert de gène dans le SNC• Les vecteurs lentiviraux
- caractéristiques
- avantages et méthode de production
- applications• Résultats
Développement d’un seul vecteur lentiviral pour:
1) l’expression régulée d’un facteur protéique
2) l’expression régulée de shARN• Conclusion générale et perspectives
Transfert de gène dans le SNC
Gène thérapeutique: protéine ou séquence nucléotidique (siARN)
In vivo
Ex vivo
Cellules transduites
Spécificités du système nerveux central relatives au transfert de
gène• Présence de la barrière hématoencéphalique
– Limite le passage de molécules thérapeutiques» Nécessité du transfert de gène…
• La majorité des cellules du SN sont quiescentes– Possibilité d’utilisation de vecteurs intégratifs ou épisomaux– Vecteurs non viraux peu efficaces à long terme
» préférentiellement viral…
• Diversité cellulaire– Nécessité d’expression restreinte ou élargie du facteur thérapeutique– Possibilité de ciblage d’une structure ou noyau particulier dans le SN– Transport rétrograde ou antérograde dans les neurones
» avec un vecteur dont le tropisme est modulable.
Vecteurs lentiviraux particulièrement adaptés
Avantages des vecteurs lentiviraux
• Transduction des cellules quiescentes et en division
• Expression stable et à long terme du transgène dans le SNC
• Faible toxicité• Facilité de production à haut titre dénuée
de RCR• Pseudotypage aisé
Vecteurs lentiviraux : méthode de production
Particules virales pseudotypées avec la protéine G du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G)
VSV-G
PhCMV VSV-G pAPlasmide d’enveloppe
Plasmide transcomplémentant
PhCMV pAgag
Pro polΨ
rev
tat
Plasmide vecteur 5’LTR 3’LTRRRE cPPT Pro Transgène
U3
PPT
Ψ
WPRE
Applications des vecteurs lentiviraux
• Thérapie génique
• Production d’animaux transgéniques (modèles de maladies…)
• Etude de fonction de gènes (surexpression ou inhibition par siARN)
Nécessité d’un système régulable
• Etudes cliniques– Moduler l’expression du facteur thérapeutique– Arrêt du traitement en cas de complication
grave
• Etudes fondamentales– Contrôle temporel du transgène – Contrôle du niveau d’expression
Le système de régulation inductible par la Tetracycline
(Tet-on)
PGK rTetR rTetR
VP16
VP16rtTA
Tet
Tet
Tet+
rTetR
VP16Tet
7TetO CMVmin Transgène 7TetO CMVmin Transgène
1. Développement d’un seul vecteur lentiviral pour l’expression régulée
d’une protéine thérapeutique
Nécessité d’un vecteur unique
• Réduction de la quantité de vecteur administrée:– Réduction du risque de mutagenèse
insertionnelle– Réduction du risque d’immunogénicité lié au
vecteur
• Permettre l’expression du transgène et du transactivateur dans la même cellule
Un vecteur lentiviral unique pour l’expression régulée d’un
transgène
5’LTR 3’LTRcPPT Pcmv min Transgène
U3
PPT
Ψ
WPREInsStufferPPGKrtTA2-M2BGH polyA
- Luciférase - Tyrosine hydroxylase
Expression régulée de la luciférase in vitro
Transduction d’une culture primaire d’astrocytes
+ Dox
- Dox
Réversibilité in vitro Dose optimale in vitro
Effet de la doxycycline sur l’activité luciférase
Cinétique d’induction in vitro
Injection du vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la luciférase dans le
striatum de rat
+ Dox
- Dox
Un vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la tyrosine hydroxylase
+ Dox - Dox
Evaluation in vitro
Un vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la tyrosine hydroxylase
Evaluation in vivo
+ Dox - Dox Contrôle non injecté
Résumé
• Construction d’un seul vecteur lentiviral portant un système de régulation Tet-on
• Validation in vitro et in vivo
• Niveau d’induction fort
• Fuite non détectable en absence d’inducteur
• Dose d’inducteur élevée in vivo
Applications, limites et voies d’amélioration
• Application de ce vecteur Tet-on • Utilisation in vitro • Utilisation chez l’animal
» Exemple : stratégie de neuroprotection» Limites dans une stratégie de remplacement?
• Utilisation en clinique exclue
• Nombre faible de cellules exprimant le transgène in vivo après induction• Quantité de vecteur utilisée sous optimale• Défaut de retrotranscription d’un génome vecteur long• Co-expression du transactivateur et du transgène
Un vecteur versus deux vecteurs?
2. Développement d’un seul vecteur lentiviral permettant
l’expression régulée de shARN
L’ARN interférence
Expression des siARN
Pol III
+1
Un promoteur d’ARN Polymérase III
Le promoteur U6 L’expression des shARN nécessite l’utilisation d’un promoteur d’ARN polymérase III
- Débute la transcription à un nucléotide défini (G)- Arrêt de la transcription par 5 thymidines
Site de démarrage de la transcription
ESD ESP TATA
-24-29-47-66-149-244
G
TTTTT
core
SNAPc TBPSTAF1 Oct1
shARN
Sans inducteur : inhibition de la synthèse des siARN
Stratégie négative : encombrement stérique inductible d’un promoteur polymérase III
Protéine
ESD ESP shARNTATA
SNAPc TBPPol III
Avec inducteur : synthèse des siARN
inducteur
Pol III
ESD ESP shARNTATA
SNAPc TBP
Pol III
Avec Doxycycline : synthèse des siARN
doxycycline
Sans Doxycycline : inhibition de la synthèse des siARN
Encombrement stérique inductible du promoteur U6 par le système tétracycline
répresseur Tet
ESD ESP shARNTATATet0
SNAPc
ESD ESP shARNTATATetO
SNAPc TBP
TBPPol III
Un promoteur U6 régulable :Stratégie négative
ESD ESP TetOTetOTetOTetO TATA TetO
ESD ESP TetOTATA
ESD ESP TetO TATA
ESD ESP TetO TATA TetO
ESD TATA
+1-24-29-47-66-149-244
ESP
ESD ESP TetOTetO TATA TetO
ESD ESP TetOTetOTetO TATA TetO
Inhibition de l ’expression de la GFP dans des cellules HEK 293T-GFP
inhibition de la GFP par un vecteur lentiviral exprimant un siGFP régulable
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
293T-GFP LVsiGFP - Dox LVsiGFP+Dox
% d
e ce
llule
s G
FP
posi
tive
s%
de
cell
ule
s G
FP
pos
itiv
es
Stratégie positive : adaptation du système Tet-on à un promoteur d’ARN polymérase III
• Utilisation d’un transactivateur de l’ARN polymerase III
• Utilisation d’un promoteur polymérase III minimal inductible par la tétracycline
Développement d’un transactivateur de promoteur polymérase III inductible par la
doxycycline
Un nouveau transactivateur rtTA-Oct2
rtTA
Domaine de liaison à l’ADN du rtTA2-M2
VP16
Domaine transactivateur VP16 du virus HSV
Domaine transactivateur
Q18III(QA) Q18III(QA) Q18III(QA) Q18III(QA)
Un nouveau promoteur
ESP Boîte TATA
Développement d’un promoteur U6 minimal inductible par la doxycycline
DSE
7 TetO
Pol III
Un promoteur d’ARN Polymérase III inductible par la doxycycline
ESP Boîte TATA
7 TetO
+1SNAPc TBP
sens boucle
antisens TTTTT
19 pb 19 pb9 pb
antisenssens5’
UUshARN
Oct-2
rtTADox
Un vecteur lentiviral pour l’expression régulée de shARN
dirigé contre la GFP
5’LTR 3’LTRcPPT
U3
PPT
Ψ
PPGK rtTA-Oct2 WPREP
U6 min shGFP
- dox
+ dox
Pas d’expression de shGFP Synthèse de la GFP
Expression de shGFP Inhibition de la GFP
Une expression de shGFP régulée
+ Dox
- Dox
Northern Blot
Transduction de cellules HEK293T-GFP avec différentes quantités de vecteur lentiviral exprimant de façon régulée un shGFP
Expression de shGFP en fonction de la concentration de
doxycycline
- Dox + Dox
Cinétique d’expression du shARN
- Dox
+ Dox+ Dox- Dox
Application du système pour la régulation d’un gène endogène :
p53 HEK293T
A549
MCF-7
Résumé
• Construction d’un système de régulation qui permet une expression contrôlée par la doxycycline de shARN
• Validation du contrôle d’un gène endogène
• Forte inductibilité
• Système réversible
• Forte concentration de doxycycline
Limites et perspectives
• Dose de doxycycline
• Validation in vivo
Expression de shARN par promoteur pol III versus promoteur pol II
Conclusion générale
• Construction d’un seul vecteur lentiviral pour l’expression régulée par le système Tet-on d’une protéine thérapeutique.
• Développement d’un système de régulation de l’expression de shARN inductible par la tétracycline et sa vectorisation.
Problème de l’immunogénicité du transactivateur pour utilisation clinique
Perspectives pour une utilisation clinique
• Se tourner vers un système de régulation d’origine humaine ou « humanisé » pour la clinique–Rapamycine–ZFP synthétique
• Régulation Physiologique
• La régulation en cas de complication–Alternatives :excision du vecteur ou suicide des cellules transduites
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