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MESSA A PUNTO DI UN KIT DIAGNOSTICO MOLECOLARE UNIVERSALE PER LA RILEVAZIONE DI PATOGENI IN ALIMENTI E ACQUE
Regione del Veneto - POR FESR 2014-2020
BANDO PER IL SOSTEGNO A PROGETTI DI RICERCA CHE PREVEDONO L’IMPIEGO DI RICERCATORI
ASSE 1 “RICERCA, SVILUPPO TECNOLOGICO E INNOVAZIONE”
Obiettivo specifico “Incremento dell’attività di innovazione delle imprese”
Azione 1.1.1 “Sostegno a progetti di ricerca alle imprese che prevedono l’impiego di ricercatori (dottori di ricerca e laureati magistrali con profili tecnico-scientifici) presso le
imprese stesse”.
EXPERTEAM srl
via della Libertà 12 30175 Marghera-VE
tel.: 041 5093101 fax: 041 5093102
expertm@vegapark.ve.it
Le malattie derivanti dal consumo di alimenti o acquacontaminata a causa di agenti patogeni e/o dalle lorotossine hanno una vasta gamma di conseguenze per lasalute pubblica ed economica in tutto il mondo
Si rende necessario sviluppare e validare un metodoper il rapido rilevamento dei contaminanti biologici
nel CIBO e nell’ ACQUA
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I metodi microbiologici convenzionali basati su test biochimici e test di coltura per la rivelazione dei patogeni alimentari normalmente sono:laboriosipoco sensibili
Con lo sviluppo di metodi molecolari la Reazione a catena della DNA Polimerasi
(PCR) è diventata un importante strumento per l’individuazione dei
microorganismi patogeni nei prodotti alimentari, migliorando:
SENSIBILITA’SPECIFICITA’ VELOCITA’ DI INDIVIDUAZIONE
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• Validare un kit in multiplex PCRche permetta con un’ unica analisi, l’identificazione contemporanea di m.o patogeni neglialimenti. Ottenendo, attraverso diversi set di primers, l’amplificazione delle sequenze di DNAe cDNA target, di più specie microbiche.
PCR CON DIVERSI SET DI PRIMERNELLA SINGOLA REAZIONE
SCOPI DEL PROGETTO:
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• Analisi dei frammenti amplificatirisultanti dalla multiplex PCR tramite elettroforesi capillare identificandoli tramitespettrofotometria a fluorescenza.
…SCOPI DEL PROGETTO:
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Tra i patogeni di origine alimentare attualmente osservati in una vasta gamma di prodotti, questi 10 sonofrequentemente riportati come agenti che causano intossicazioni alimentari:
• STAPHYLOCOCCUS AUREUS: è un batterio gram positivo di
forma rotonda che causa enteriti acute.
• SALMONELLA ENTERICA: è un batterio gram negativo di forma
bastoncellare e flagellato. Causa disordini nel tratto gastro
intestinale.
• LISTERIA MONOCYTOGENES: è un batterio gram positivo che
causa un’ infezione detta Listeriosi.
• ESCHERICHIA COLI O157:H7: E’ un batterio gram negativo.
Appartiene a un ceppo enteroemorragico e delle volte può
causare persino morte.
• SHIGELLA SPP.: è un batterio gram negativo che causa Shigellosi
che colpisce l’intestino tenue.
• CAMPYLOBACTER JEJUNI: è un batterio gram negative che causa
Campilobatteriosi.
• CLOSTRIDIUM PERFRIGENS: è un batterio gram positivo
sporigeno del genere Clostridium, di forma bastoncellare
anaerobico.
• NOROVIRUS : è un virus senza capside, con genoma a singolo
filamento di RNA.
• HAV: E’ un picornavirus causa dell’ epatite A.
• YERSINIA ENTEROCOLITICA: è un batterio gram negativo con forma
bastoncellare che causa Yersiniosi.EXPERTEAM srl
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In base alla frequenza dell’ intossicazione dapatogeni nei prodotti alimentari, la PCR in multiplexè stata testata a partire da matrici rappresentativeusando campioni di cibo e acqua
• Insalata imbustata• Pollo• Formaggio morbido• Gamberetti• Salse (mayonnaise)• Latte• Acqua
I patogeni elencati precedentemente si possono trovare in molti cibi contaminati:
DNA and RNA dei patogeni sono stati estrattiusando 3 kit che sono stati confrontati valutandola loro compatibilità con il nostro protocollo. Tuttie 3 hanno dimostrato paragonabile efficienza diestrazione a partire da tutte le matrici testate.AllPrep DNA/RNA
Mini KitDNeasy mericonFood Kit
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Le sequenze target di ciascun patogeno sono state scelte in base alla specificità di ciascuno di essi all’ internodella specie, del genere o della famiglia.
Tutte le sequenze scelte sono state ottenutetramite GenBank (NCBI)
Le analisi per la specificità e la potenziale erroneaindividuazione di altri patogeni è stata verificata con Blast
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Dopo aver selezionato le sequenze target, 10 coppie di primers specifici e compatibili sono stati disegnati:
• Amplificando regioni target specifiche delle proteine virali del capside con bassi tassi di mutazione
• Considerando le regioni conservate del gene batterico target
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Ogni coppia di primer è stata disegnata in modo da generare frammenti aventi lunghezza in paia di basidiversi, per ogni microorganismo presente. Proprio in funzione della diversa lunghezza e del fluoroforolegato all’estremità del primer sarà possibile individuare il patogeno.
Yersinia enterocolitica
Salmonella enterica
Campylobacter jejuni
Shigella spp.
Escherichia coli O157:H7
329 bp
284bp
279bp
219bp
205bp
Listeria mono cytogenes
Clostridium perfrigens
Staphylococcus aureus
Norovirus
HAV
116bp
101bp
330bp
225bp
119bp
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VALIDAZIONE DI UN KIT IN MULTIPLEX-PCR, CON SUCCESSIVA ANALISI DEI FRAMMENTI
AMPLIFICATI
MASTER MIX 1Mix contenente primers e reagenti peramplificare i patogeni batterici:
MASTER MIX 2Mix contenente primers e reagenti peramplificare i patogeni virali che prevede unostep precedente di retrotrascrizione da RNAvirale in cDNA:Yersinia enterocolitica
Salmonella enterica
Campylobacter jejuni
Shigella spp.
Escherichia coli O157:H7
Staphylococcus aureus
Listeria mono cytogenes
Norovirus
HAV
Primer marcato HEX
Primer marcato 6-FAM
Primer marcato HEX
Primer marcato 6-FAM
Primer marcato HEX
Primer marcato 6-FAM
Primer marcato 6-FAM
Primer marcato 6-FAM
Primer marcato 6-FAM
Clostridium perfrigens Primer marcato HEX
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Escherichia coli O157:H7
Shigella spp.Staphylococcus aureus
Yersinia enterocolitica
Salmonella enterica
Campylobacter jejuni
Listeria monocytogenes
Clostridium perfrigens
I frammenti amplificati vengono separati con l’ elettroforesi capillare ad alta risoluzione. Essisi presentano come dei picchi separati sull’ elettroferogramma così da identificare ilpatogeno grazie alla dimensione e posizione del picco.
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RISULTATI MASTER MIX 1:
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La sensibilità del protocollo standardizzato di PCRmultiplex è stata controllata utilizzando tre diversediluizioni di L. monocytogenes, Y. enterocolitica, S.aureus e S. enterica, Cl. Perfigens, Esch. Coli, C.jejuni, Shigella spp. 104, 103, 102. La sensibilità dellareazione è espressa in termini di copie di genomabatterico.
Yersinia enterocolitica
Salmonella enterica
Campylobacter jejuni
Shigella spp.
Escherichia coli O157:H7
Listeria monocytogenes
Clostridium perfrigens
Staphylococcus aureus
Yersinia enterocolitica
Salmonella enterica
Campylobacter jejuni
Shigella spp.
Escherichia coli O157:H7
Listeria monocytogenes
Clostridium perfrigens
Staphylococcus aureus
Yersinia enterocolitica
Salmonella enterica
Campylobacter jejuni
Shigella spp.
Escherichia coli O157:H7
Listeria monocytogenes
Clostridium perfrigens
Staphylococcus aureusEXPERTEAM srl
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104 copie
103 copie 102 copie
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HAV Norovirus
I frammenti amplificati vengono separati con l’ elettroforesi capillare ad alta risoluzione. Essisi presentano come dei picchi separati sull’ elettroferogramma così da identificare ilpatogeno grazie alla dimensione e posizione del picco.
RISULTATI MASTER MIX 2:
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La sensibilità del protocollo standardizzato di PCRmultiplex è stata verificata utilizzando tre diversediluizioni di HAV E Norovirus 104, 103, 102. Lasensibilità è stata in termini di copie del genomavirale
HAV Norovirus
HAV NorovirusHAV Norovirus
104 copie
103 copie 102 copie
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Sistema di refertazione
universale, in grado di acquisire i dati provenienti dal sequenziatore
automatico rielaborandoli generando il
referto.
DATI IDENTIFICATIVI DEL LABORATORIO N° accettazione: Data accettazione:
Data analisi:
Alimento analizzato: Quantità (mg): Sistema di estrazione: Data estrazione: Indagine eseguita: Metodica utilizzata: m-PCR, corsa di frammenti in elettroforesi capillare Patogeni testati: vedere tabella sottostante
RISULTATI
PATOGENO RILEVATO : Norovirus Commento: Operatore Direttore della struttura
Patogeno testatoEscherichia
col i O157:H7
Salmonel la
enterica
Staphylococcus
aureus
Listeria
monocytogenes
Campylobacter
jejuni
Shigel la
spp.
Clostridium
perfrigens
Yers inia
enterocol i ticaHAV Norovirus
Patogeno rilevato X
DATI IDENTIFICATIVI DEL LABORATORIO N° accettazione: Data accettazione:
Data analisi:
Alimento analizzato: Quantità (mg): Sistema di estrazione: Data estrazione: Indagine eseguita: Metodica utilizzata: m-PCR, corsa di frammenti in elettroforesi capillare Patogeni testati: vedere tabella sottostante
RISULTATI
PATOGENO RILEVATO : Clostridium perfrigens Commento: Operatore Direttore della struttura
Patogeno testatoEscherichia
col i O157:H7
Salmonel la
enterica
Staphylococcus
aureus
Listeria
monocytogenes
Campylobacter
jejuni
Shigel la
spp.
Clostridium
perfrigens
Yers inia
enterocol i ticaHAV Norovirus
Patogeno rilevato X
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RISULTATI INTERMEDI:
CONCLUSIONI:
Il kit messo a punto per la ricerca di microrganismi patogeni in alimenti ed acque permette, tramite un protocollo basato sumetodologia multiplex PCR, di rilevare contemporaneamente e con il medesimo protocollo 10 m.o. diversi individuabili equindi da utilizzarsi indipendentemente dal tipo di alimento e lavorazione.
Il nostro kit ha la caratteristica di essere rapido e di semplice utilizzo, soprattutto non necessita di conoscerepreventivamente quale contaminante ricercare.
Grazie ai risultati ottenuti con il kit messo a punto si è in grado di rilevare la quasi totalità dei microrganismi e virusresponsabili di tossinfezioni alimentari con tempi e protocolli compatibili con le necessità sanitarie, preventive edell’industria alimentare, e soprattutto con un’elevata specificità e sensibilità rispetto ai protocolli presenti nel mercato.
I primers sono stati disegnati e le sequenze target sono state definite, però èancora in fase di sviluppo l’inserimento delle due coppie di primers per ipatogeni in questione all’interno della multiplex
Bacillus CereusVibrio spp.
Difficoltà nel reperire controlli positivi
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