metode molekularne biologije

Metode za analizu proteina

• Imunohistohemija

• Western blot

• Ko-imunoprecipitacija

ZAJEDNIČKI REAGENS

ANTITELO

Imunohistohemija

Imunohistohemijske metode omogućavaju vizuelizaciju definisanih antigena u tkivnim presecima, vezivanjem antitela za male, specifične regione antigena, antigene determinante ili epitope.

Imunohistohemija kao metoda zasniva se na korišćenje obeleženih antitela kao specifičnih reagenasa za lokalizaciju i detekciju tkivnih konstituenata (antigena) in situ.

Antigen Antitelo + Antigen – Antitelo kompleks

Imunocitohemija

Imunohistohemija

Primarno antitelo

Specifično locira antigen u tkivnom preseku

POLIKLONSKA ANTITELA

Prvootkrivena ili prvosintetisana antitela

• Potrebno je bilo izolovati antigen

• Uraditi imunizaciju životinje

• Dobro biohemijski okarakterisati Ag

Primarno antitelo

MONOKLONSKA ANTITELA

• 1975. godine - George Kohler i Cesar Milstein

• Razvoja hibridoma tehnologije – hibridizacija somatskih ćelija - fuzija splenocita (ćelije koje stvaraju antitela) i ćelija mijeloma (ćelije koje se kontinuirano dele)

Direktan metod obeležavanja antitela

Indirektan metod obeležavanja antitela

Enzim kao obeleživač antitela

• Peroksidaza – supstrat vodonik peroksid - razlaže vodonik peroksid do vode, a oslobođeni elektroni polimerizuju hromogenu supstancu koja se taloži na mestu reakcije antigen – antitelo.

• Talog je nerastvoran i time je omogućena vizuelizacija reakcije – STABILNA, TRAJNA I VIDLJIVA SVETLOSNIM MIKROSKOPOM

• Alkalna fosfataza – supstrat naftol fosfati

PAP tehnika (Peroksidaza anti-peroksidaza)

• Tercijerni sloj PAP kompleks – peroksidaza antiperoksidaza - solubilni imunokompleksi molekula peroksidaze i antitela visokog titra na peroksidazu.

APAAP tehnika (Alkalna fosfataza anti-alkalna fosfataza)

Imunocitohemija

http://www.youtube.com/watch?v=gPpn8LxQjaU&feature=related

Pozitivne i negativne kontrole Automatizacija metode

Primena imunohistohemije

Western blot analiza

Western blotting

• Identifikacija proteina

• Određivanje količine ispitivanog proteina

• Određivanje molekulske težine polipeptida

• Procena efikasnosti ekstrakcije proteina

• Detekcija proteina

• Za izolovanje i karkaterizaciju antitela iz poliklonalnih seruma

• Priprema uzorka – izolovanje protein iz biološkog materijala

• Razdvajanje uzorka proteina elektroforezom na gelu

• Transfer uzorka proteina sa gela na membranu

• Blokiranje nespecifičnog vezivanja antitela na membrani

• Inkubacija membrana sa antitelom za protein od interesa

• Detekcija kompleksa antigen - antitelo

Gel za koncentrovanje 4% akrilamid/N'N'-bis akrilamid

Western blotting

Gel za razdvajanje 15% akrilamid/N'N'-bis akrilamid

Razdvajanje po molekulskoj tezini

SDS – PAGE elektroforeza korišćenjem poliakrilamidnog gela

Western blotting

KO – IMUNOPRECIPITACIJA metoda za ispitivanje interakcije između proteina

• Metoda ko-imunopercipitacije zasniva se na principu precipitacije ciljnog proteina, korišćenjem primarnog antitela, iz rastvora nedenaturisanih totalnih proteina, u prisustvu protein G sefaroze - streptokokni protein sa velikim afinitetom vezivanje za sve klase imunoglobulina različitog porekla.

KO - IMUNOPRECIPITACIJA

Nakon precipitacije, u talogu se nalazi ciljni protein, kao i svi proteini koji su sa njim, u formi dimera, bili povezani slabim nekovalentnim vezama.

KO-IMUNOPRECIPITACIJA

• Nakon imunoprecipitacije prisustvo različitih proteina, analizira se primenom Wester blotting metode (SDS-PAGE)