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Métodos Fenotípicos para Detecção dos Mecanismos de Resistência Antimicrobiana em Bacilos Gram-Negativos
Prof. Dr. Rodrigo Elisandro MendesPós-doutorando da Disciplina de InfectologiaUniversidade Federal de São Paulo - EPM
Índice
Principais ProblemasParede celular bacterianaResistência Bacteriana a AntimicrobianosPrincipais Problemas em EnterobactériasPrincipais Problemas em Bacilos Gram-Negativos Não-Fermentadores-lactamasesLocalização dos genes laDetecção de -lactamases-lactamases de espectro ampliadoESBL no BrasilInfecções por amostras produtoras de ESBL SURTOMétodos fenotípicos para detecção das amostras produtoras de ESBLDetecção de amostras produtoras de ESBLTestes para Detecção de Cepas Produtoras de ESBL-lactamases do Grupo 1 (AmpC)Resistência aos carbapenens EnterobactériasDetecção de Metalo- -lactamases Detecção de amostras produtoras de MBL Dissemination of an Epidemic Carbapenem-Resistant Metalo--lactamases emEnteroactérias no Brasil
Principais Problemas
Enterobactérias
• Resistência às cefalosporinas de amplo espectro
• Resistência aos carbapenens (rara)
Bacilos Gram-negativos não fermentadores
• Resistência aos carbapenens
• Resistência às polimixinas (rara)
Parede celular bacteriana
Bactéria Gram-positiva Bactéria Gram-negativa
Pelcza, Microbiology, 1999.
Bactéria Gram-positiva
Bactéria Gram-negativa
Resistência Bacteriana a Antimicrobianos
Principais Problemas em Enterobactérias
Resistência às cefalosporinas de amplo espectro e monobactâmicos
Produção de -lactamases de espectro ampliado (ESBL)Produção de -lactamases AmpC
Resistência aos carbapenens (rara)
Falsa resistênciaProdução de ESBL/AmpC + alt. da membrana externaProdução de Metalo- -lactamases (MBL)
Principais Problemas em Bacilos Gram-Negativos Não-Fermentadores
Resistência aos carbapenens
Produção de AmpC + alt. da membrana externaProdução de Metalo- -lactamases (MBL)Efluxo ativo
Resistência às polimixinas (rara)
Alteração da composição lípidica do LPS e/ou Hiperexpressão da porina OmprH
-lactamases
São enzimas que catalisam a hidrólise do anel beta-lactâmico
Principal mecanismo de resistência entre gram-negativos
Grande diversidade
Produção mediada pelo DNA cromossômico ou extra-cromossômico (plasmídios e transposons)
Localização dos genes bla
Conjugação entre bactérias da mesma espécie
Conjugação entre bactérias de espécies diferentes
Transmissão e disseminação
DNA Cromossomal
DNA Extra-Cromossomal
Divisão bináriaCél. Mãe para cél. filha
Disco de Nitrocefin
Detecção de -lactamases
+ -
+ -
-lactamases de espectro ampliado(extended-spectrum beta-lactamase)Enterobactérias: E. coli e K. pneumoniae
Mediadas por genes plasmidiais não induzíveis
Vários genes: tem, shv, per, ges, ctx, oxa
Degradam todos os monobactâmicos e beta-lactâmicos com exceção dos carbapenens e das cefamicinas
Geralmente, inibidas pelos inibidores de -lactamases (ácido
clavulânico, sulbactam e tazobactam)
Bush et al., AAC 39:1211, 1995
-lactamases de espectro ampliado(extended-spectrum beta-lactamase)
-lactamases de espectro ampliado Importância Clínica
Posso utilizar cefalosporinas de amplo espectro para o
tratamento de Infecções causadas por bactérias
produtoras de ESBL?
Paterson et al., J Clin Microbiol 39:2206, 2001.
-lactamases de espectro ampliado Importância Clínica
MIC ( µg /ml) Falência terapêutica
% (N)
Morte até 14 dias após bacteremia
N(%)
8 100 (6/6) 33 (2/6) 4 67 (2/3) 0 (0/3) 2 33 (1/3) 0 (0/3)
£1 27 (3/11) 18 (2/11)
Total 54 (15/28)
CTX-M-8 - Rio de Janeiro - C. amalonaticus e E. cloacae Bonnet et al., J Clin Microbiol 44:1936, 2000.
BES-1 - Rio de Janeiro - Serratia marcescens
Bonnet et al., Antimicrob Agents Chemother 44:3061, 2000.
CTX-9 e -16 - Rio de Janeiro - E. coli e E. cloacae
Bonnet et al., Antimicrob Agents Chemother. 45:2269, 2001.
SHV-27 - Aracajú - Klebsiella pneumoniae
Corkill et al., J Antimicrob Chemother 47:463, 2001.
CTX-M - São Paulo - Klebsiella pneumoniae
Carmo Filho. Doutorado UNIFESP/EPM, 2003.
ESBL no Brasil
Infecções por amostras produtoras de ESBLSURTO
No. Ribogrupo PFGE pI1 1019-4 W2 5.4, 7.6, 7.92 1019-4 W3 5.4, 7.6, 7.93 637-8 Z1 5.4, 7.6, 7.94 637-8 Z3 5.4, 7.6, 7.95 637-8 Z2 5.4, 7.6, 7.96 637-8 C 5.4, 7.6, 7.97 637-8 C 5.4, 7.6, 7.9
l 1 2 l 3 4 5 l 6 7
Amostras de P. mirabilis produtoras de ESBL isoladas pelo Programa SENTRY 1997 -1998
Todos os métodos fenotípicos se baseiam na
inibição da atividade da enzima pelos
inibidores de -lactamases (IBL)
Métodos fenotípicos para detecção das amostras produtoras de ESBL
Limites de triagem do CLSI (antigo NCCLS)
Teste de Adição de IBL aos discos de cefalosp.
Discos combinados
Teste de dupla-difusão em disco
Etest
Métodos automatizados
Métodos fenotípicos para detecção das amostras produtoras de ESBL
Detecção de amostras produtoras de ESBLLimites de Triagem do CLSI
E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis*
CLSI, 2005
Disco Difusão MIC
Aztreonam < 27 mm > 2 µ g/mL
Ceftazidima* < 22 mm > 2 µ g/mL
Ceftriaxona < 25 mm > 2 µ g/mL
Cefotaxima* < 27 mm > 2 µ g/mL
Cefpodoxima* < 17 mm > 2 * /> 8 µ g/mL
Disco difusão
• Meio de Müller-Hinton
• Utilizar discos de ceftazidima e cefotaxima sozinhos e os associados ao ácido clavulânico
POSITIVO
Aumento do halo 5 mm da associação
CAZ/AC ou CTX/AC vs. halo de CAZ ou CTX
Detecção de amostras produtoras de ESBLTeste confirmatório recomendado pelo CLSI
E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis
Disco difusão
Ácido Clavulânico• Preparar solução estoque 1000 ml fresca ou congelada a –
70°C• Adicionar 10 ml desta solução sobre os discos de CAZ e
CTX uma hora antes do teste
Controle de Qualidade• - Positivo: K. pneumoniae ATCC 700603• - Negativo: E. coli ATCC 25922
Detecção de amostras produtoras de ESBLTeste confirmatório recomendado pelo CLSI
Teste de adição de IBL
Jacoby & Han, 1996 Carter et al., J Clin Microbiol. 38:4228, 2000.
Detecção de amostras produtoras de ESBLTeste de adição de IBL
Métodos dilucionais• Meio de Müller-Hinton com a concentração de cátions
ajustada• Concentrações dos antimicrobianos:
•ceftazidima: 0.25-128 mg/ml•ceftazidima/ácido clav.: 0.25/4-128/4mg/ml E•cefotaxima: 0.25-64 mg/ml•cefotaxima/ácido clav.: 0.25/4-128/4mg/ml
POSITIVORedução 3.0 diluições
Detecção de amostras produtoras de ESBLTeste confirmatório recomendado pelo CLSI
E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis
CLSI, 2005
Métodos dilucionais
Controle de Qualidade• Positivo: K. pneumoniae ATCC 700603• Negativo: E. coli ATCC 25922
Detecção de amostras produtoras de ESBLTeste confirmatório recomendado pelo CLSI
Teste de adição de IBL
CLSI, 2005
Vantagens• Teste simples;• Fácil interpretação;• Custo
Limitações• Preparo e armazenamento da
solução estoque de ácido clavulânico;
• Caracterização errônea
Detecção de amostras produtoras de ESBLTeste de adição de IBL
1
23
4
56
1.Cefpodoxima, 2. Cefpodoxina + Ác. Clavulânico,
3. Ceftazidima, 4. Ceftazidima + Ác. Clavulânico,
5. Cefotaxima 6. Cefotaxima + Ác. Clavulânico
Detecção de amostras produtoras de ESBLDiscos combinados
1
23
4
5
6
1. Cefpodoxima, 2. Cefpodoxina + Ác. Clavulânico,3. Ceftazidima, 4. Ceftazidima + Ác. Clavulânico, 5. Cefotaxima 6. Cefotaxima + Ác. Clavulânico
Vantagens• Teste simples;• Fácil interpretação;• Custo
Limitações• Substrato (novo disco com
cefpiroma);• Não detecção de amostras
produtoras de SHV-6
Detecção de amostras produtoras de ESBLDiscos combinados
Sensibilidade• Ceftazidima = 86% Cefotaxima = 65.5%• Combinados = 93%
100% das amostras produtoras de ESBL apresentaram aumento no halo > 5 mm, enquanto as produtoras de AmpC e K1 apresentaram aumento < 1 mm.
M'Zali et al. J Antimicrob Chemother45:881-5 , 2000. Carter et al. J Clin Microbiol 38:4228-32, 2000.
Detecção de amostras produtoras de ESBLDiscos combinados
De Gheldre et al. J Antimicrob Chemother. 52:591-7, 2003
Sensibilidade/Especificidade (%)
Escherichia coli e Klebsiella spp.• CAZ/clav: 88% e 92%• CTX/clav: 90% e 92%• CPR/clav: 95% e 84%• CAZ/clav + CPR/Clav: 100% e 82%
Enterobacter aerogenes• CAZ/clav: 94% e 100%• CTX/clav: 94% e 100%• CPR/clav: 94% e 100%• CAZ/clav + CPR/Clav: 100% e 100%
Detecção de amostras produtoras de ESBLDiscos combinados
Pereira et al. J Bras Patol Med Lab 39:301-308, 2003.
134 amostras de K. pneumoniae do Hospital Säo Paulo – 1996/2001
Discos da Oxoid
Cefotaxima e cefpodoxima: S e E = 100%
Etest ESBL
S = 96% e E = 100%
Detecção de amostras produtoras de ESBLDiscos combinados
Jarlier, 1988
Distância de 30 mm
CAZ
ATM
CRO/CTX
CPM
AMX/AC
Detecção de amostras produtoras de ESBLDisco-difusão dupla ou teste de aproximação
Jarlier, 1988
Teste Positivo
Detecção de amostras produtoras de ESBLDisco-difusão dupla ou teste de aproximação
Teste Positivo
Vantagens• Teste simples;• Não necessita de reagentes
especiais
Limitações• Distância entre os discos;• Armazenamento dos discos
com ácido clavulânico;• Interpretação
Detecção de amostras produtoras de ESBLDisco-difusão dupla ou teste de aproximação
Fitas disponíveisCeftazidima, cefotaxima e cefepima
Critério de positividade Redução 3.0 diluições Razão TZ/TZL > 8Razão CT/CTL > 8
TZ = 32 TZL =232 16 8 4 2
Cormican & Jones, 1996
Detecção de amostras produtoras de ESBLEtest®
Cormican & Jones, 1996
Detecção de amostras produtoras de ESBLEtest®
Cormican & Jones, 1996
Zona Fantasma
Detecção de amostras produtoras de ESBLEtest®
Zona Fantasma
Vantagens• Teste simples;
Limitações• Substrato específico;• Não detecção de amostras,
cuja as MICs situem acima das diluições testadas;
• Custo
Detecção de amostras produtoras de ESBLEtest®
MicroScan – Painéis de Gram-negativos
Triagem para ESßLPoços que contêm cefpodoxima 4 mg/mL e ceftazidima 1 mg/mL associados ao clavulanato
ESßL plus Confirmation PanelAntimicrobiano (conecntação testada em mg/ml)
Aztreonam 0.5 – 64 Cefpodoxima 0.5 – 64Cefepima 1 – 32 Ceftazidima 0.5 – 128Cefoxitina 2 – 32 Ceftazidima/Clav4 0.12/4 – 16/4Cefotaxima 0.5 – 128 Ceftriaxona 1 – 64Cefotaxima/Clav4 0.12/4 – 16/4 Meropenem 0.5 – 16Cefotetan 1 – 32 Piperacillina 16 – 64
Imipenem 0.5 – 16
Detecção de amostras produtoras de ESBLMétodos Automatizados
Vitek – Painéis de Gram-negativos
Triagem para ESßL
Poços que contêm cefotaxima e ceftazidima 0,5 mg/mL associados ao clavulanato
Detecção de amostras produtoras de ESBLMétodos Automatizados
Vantagens• Padronização intra- e inter-
laboratorial;
Limitações• Substrato específico;• Não detecção de amostras,
cuja as MICs situem acima das diluições testadas;
• Custo
Detecção de amostras produtoras de ESBLMétodos Automatizados
CLSI, 2005
Detecção de amostras produtoras de ESBLK. pneumoniae ATCC 700603 – CQ ESBL +
Avaliação da Sensibilidade e Especificidade de Diferentes Testes para Detecção de
Cepas Produtoras de ESBL
Reis et al., J Bras Patol Clin 37:43, 2001.
Teste Sens. Espec.
Disco difusão (bkpts ESBL - NCCLS) 89 62
Dupla Difusão 41 100
ESBL Etest® 89 98
Disco difusão (CTX + AZT - NCCLS) 88 83
Adição de clavulanato 97 47
MICs para 5 substratos (Etest) 100 100
Detecção de amostras produtoras de ESBL
Sugestão
• Limites de triagem estabelecidos pelo CLSI;+
• Teste de dupla-difusão em disco, ou• Discos combinados
-lactamases do Grupo 1 (AmpC)
Livermore. Scand J Inf Dis 79(Suppl):7-16, 1991
• Antimicrobianos hidrolisados: aztreonam, cefalosporinas de amplo espectro e penicilinas de amplo espectro
• Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Morganella morganii, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Serratia spp., Pseudomonas aeruginosa - cromossomal
• Não são inibidas por inibidores de β-lactamases
• Produzidas em pequena quantidade a menos que sejam induzidas
• Agente retirado produção volta a níveis basais ou pode ocorrer mutação e desrepressão
CAZCFOCRO
D
Distância em mm = raio do beta-lactâmico - 3 2
-lactamases do Grupo 1 (AmpC)Teste de indução de -lactamases AmpC
Resistência aos carbapenensEnterobactérias
Checar resultados das cepas ATCCs
Verificar a validade e a estocagem dos discos;
Verificar a identificação;
Repetir o teste de sensibilidade técnica
Confirmada Lab. de referência
Resistência aos carbapenensMetalo--lactamases
• Hidrolisam penicilinas, cefalosporinas e carbapenens
• Genes cromossômicos e plasmidiais (transposons, integrons)
• Zn++ como cofatores enzimáticos
• Inibidas por EDTA e compostos derivados do thiol
• Família IMP-1 a -16 (Japão, China, Europa, Canadá, Portugal, Taiwan, Brasil)
• Família VIM-1 a -11 (Argentina, Colômbia, Europa, Coréia, Taiwan, EUA)
• GIM-1 (Alemanha)
• SPM-1 (São Paulo Metalo- -lactamase)
(Page 2002, Rossolini et al 2001; Nordmann & Poirel 2002, Toleman et al 2002)
Detecção de Metalo- -lactamases Importância Clínica
A maior parte da produção destas enzimas é mediada por genes plasmidiais, que podem se disseminar entre espécies distintas
Medidas de Controle
Detecção do mecanismos – opções terapêuticas – Novas drogas como IMBL.
Detecção de amostras produtoras de MBL Disco- aproximação IMBL
Distância de 15-25
mm
CAZ IMP
IMBL
Arakawa J Clin Microbiol 38:40-43, 2000.
Distância de 4-5 cm
IMBLEDTA – 5 ml 100 mM2-MPCA puro – 2 a 3 ml
Disco- aproximação com ácido 2-mercaptopropiônico
NEGATIVA POSITIVA
Arakawa J Clin Microbiol 38:40-43, 2000.
Detecção de amostras produtoras de Metalo--lactamases
IMP
IMP/EDTA
Critério de positividade: 5 mm?
Detecção de amostras produtoras de Metalo- -lactamases - Adição de EDTA
Detecção de amostras produtoras de Metalo- -lactamases - Etest
Walsh et al., J Clin Microbiol 40:2755-9, 2002.
Critério de positividade : Redução 3.0 diluições
Detecção de amostras produtoras de Metalo- -lactamases
Controles de Qualidade
• CQ -: P. aeruginosa ATCC 27853
• CQ +: P. aeruginosa 48-1997A (produtora de SPM) P. putida 48 – 1234 (produtora de IMP -1)
Dissemination of an Epidemic Carbapenem-Resistant Pseudomonas aeruginosa Producer of SPM Metallo--
Lactamase in Distinct Brazilian Regions
Gales et al. J Antimicrob Chemother 52:699, 2003.
First Isolation of a Metallo--lactamase-Producing-multiresistant Klebsiella pneumoniae from a Patient in Brazil
Lincopan et al. J Clin Microbiol 43:516, 2005.
Outbreak caused by a Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae Producer of IMP-1 Metallo--Lactamase in a Brazilian Teaching Hospital
Grimbaun et al. 44th ICAAC, Washington, DC. 2004.
Metalo--lactamases em Enterobactérias no Brasil
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