metody identifikace dna –rflp, pcr a rapd

Metody identifikace DNA –RFLP, PCR a RAPD

Jiří Zadina, Klára Polesná

Zařazení metod

• genetické markery (značky, ukazatele s tak silnou genetickou kontrolou, kterou neovlivňuje prostředí)• morfologické markery

• barva květu

• biochemické markery

• za přítomnost určitých látek v těle rostlin mohou geny, pokud prokáži přítomnost látky prokáži i přítomnost genu

• molekulární markery (DNA markery)

• analýzy DNA

RFLP

• restriction fragment lenght polymorphism• polymorfizmus v délce restrikčních fragmentů• základní princip metody

I. štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz

II. elektroforetické rozdělení fragmentů dle délky

III. přenos fragmentů na membránu

IV. hybridizace se značenou sondou

RFLP - I. štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz

Štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz

• restrikční endonukleázy jsou enzymy izolované z bakterií• jméno podle názvu bakterie, z které byl izolován

(např.: EcoRI - Escherischia coli, AluI - Arthrobacter luteus)

• rozeznávají určitou sekvenci DNA a podle ní DNA specificky štěpí• tato sekvence DNA tvoří palindrom - je symetrická kolem centrálního bodu• sekvence sestává nejčastěji z 4 bp (base pair - pár bází) nebo 6 bp

EcoRI -

AluI -

RFLP - II. elektroforetické rozdělení fragmentů dle délky

Elektroforetické rozdělení fragmentů DNA podle jejich délky

• elektroforéza je obecně metoda pomocí níž lze rozdělit makromolekuly (v našem případě fragmenty DNA) podle jejich délky

• princip - makromolekuly s elektrickým nábojem se v elektrickém poli pohybují k jedné z elektrod v závislosti na své relativní molekulové hmotnosti, celkovém náboji a tvaru

• stejně dlouhé fragmenty DNA se v elektrickém poli pohybují stejně rychle a vytvoří proužek

Elektroforetické rozdělení fragmentů DNA podle jejich délky

• výsledek není pouhým okem patrný a proto se gel, na němž elektroforéza probíhá musí specificky barvit a vyzualizovat

• u dlouhého genomu tvoří výsledek souvislá šmouha na níž jednotlivé fragmenty nerozlišíme a tím pádem je jakákoliv případná analýza genomu vyloučena

RFLP - III. přenos fragmentů na membránu

Přenos fragmentů na membránu

• fragmenty DNA je nutné před přenosem (nebo během přenosu) na membránu denaturovat

• denaturací se rozumí rozpletení dvouřetězce DNA ve dva jednořetězce DNA

• na gel je přiložena nylonová membrána na níž je specifickým způsobem otisknuta DNA

RFLP - IV. hybridizace se značenou sondou

Hybridizace se značenou sondou (Southernova metoda)

• proces vzniku dvouřetězcové DNA z jednořetězcových vláken se nazývá renaturace, pochází-li jednořetězcová DNA ze dvou různých zdrojů mluví se o hybridizaci

• membrána s navázanými fragmenty jednořetězců DNA se ponoří do roztoku jednořetězcové DNA, která je radioaktivně (či jinak značena), takto značená DNA se nazývá sonda

• sonda je krátká (150 - 8000 bází) a homologická (přinejmenším z větší části), aby k hybridizaci vůbec došlo

• sonda se navazuje jen na místa, kde se nalézá komplementární řetězec

• po umytí a usušení je membrána přiložena na rentgenový film a ponechá se exponovat, film zčerná v místech, kde je navázána sonda

Hybridizace se značenou sondou (Southernova metoda)

Hybridizace se značenou sondou (Southernova metoda)

Hybridizace se značenou sondou (Southernova metoda)

Pattern

• elektroforetický profil (pattern)

Interpretace RFLP

• porovnávání restrikčních fragmentů vzniklých štěpením odpovídajících úseků DNA• pattern

• restrikční mapa - náročná záležitost

• studium na úrovni rodů, druhů částečně poddruhů, nevhodnost při studiu mezi blízce příbuznými populacemi, nebo dokonce v rámci populace

Interpretace RFLP

• A - divoký kmen (nemutovaný)

• B - mutace - ztráta restrikčního místa

• C - mutace - nové restrikční místo

• D - mutace - delece (ztráta úseku DNA)

• E - mutace - inserce (vmezeření nového úseku DNA)

Zhodnocení metody RFLP

+ • vysoká reprodukovatelnost pattern• vysoká interpretovatelnost

–• velké náklady • bezpečnost práce (radioaktivní materiál)• potřeba velkého množství DNA• nutnost mít velké množství sondy • vysoce kvalifikovaný personál

PCR

• polymerase chain reaction• polymerázová řetězová reakce• základní princip metody

• namnožení části DNA v podmínkách IN VITRO pomocí cyklického střídání tří teplotních fází

PCR - potřebné komponenty• vzorek DNA

• velmi malé množství zkoumané DNA (ca ng)

• deoxynukleotidtrifosfáty• dATP, dTTP, dCTP a dGTP (jde o báze (A, T, C a G) navázané na cukr

deoxyribózu a trifosfát, který dodává energii (DNA se skládá z bází, deoxyribózy a fosfátu), z těchto stavebních jednotek bude namnožen určitý úsek DNA

• DNA polymeráza• Taq - termostabilní polymeráza (enzym izolovaný z bakterie Thermus

aquaticus žijící v horkých pramenech snášející vysoké teploty (blížící se 100 °C)) množící úsek DNA

• primery (2 různé)• známý oligonukleotid - určitá sekvence DNA o délce 10 - 40 nukleotidů,

která je homologní ke zkoumanému vzorku DNA

• primery vymezují zkoumaný úsek DNA

• vhodný pufr• stabilizace reakčního prostředí

Replikace DNA

• dvoušroubovice DNA má antiparalelní strukturu• prodlužování řetězce DNA ve směru 5´ 3´

PCR - 1. teplotní fáze

• 1. teplotní fáze 95 °C - denaturace• zvýšením teploty dojde k oddělení obou řetězců dvoušroubovice od

sebe (řetězce jsou k sobě poutány vodíkovými můstky, dodání energie zapříčiní zánik těchto vazebných interakcí)

PCR - 2. teplotní fáze

• 2. teplotní fáze 35 - 65 °C annealing• ochlazení umožní přisednutí primerů k homologním místům a vytvoření

krátkých dvoušroubovic DNA

PCR - 3. teplotní fáze

• 3. teplotní fáze 72 °C - polymerace• upravením teploty (zvýšením) na hodnotu vhodnou pro působení DNA

polymerázy dochází k prodlužování dvoušroubovice DNA (5´ 3´) až po začátek další denaturace (nového cyklu)

Průběh PCR

Průběh PCR • daný fragment DNA přibývá exponenciální rychlostí (2n = počet

fragmentů po n cyklech)• v praxi se používá ca 30 cyklů, při nichž dojde k vyčerpání

reakčních složek a růst se zastavuje

poznámka: billion je v češtině miliarda

Další zpracování PCR• namnožený vzorek DNA se elektroforeticky zpracuje, čímž se zjistí

délka fragmentů, z nichž se vzorek skládá (fragmenty jsou stejně dlouhé a vytvoří dobře zachytitelný proužek)

• výsledek elektroforézy není pouhým okem patrný, proto se DNA specificky barví EtBr (ethidium bromidem), který se díky své struktuře vloží dovnitř dvoušroubovice a po ozáření UV světlem oranžově fluoreskuje, zmíněné se fotografuje a dále hodnotí

• výstupy PCR nacházejí významné uplatnění v taxonomii a populační biologii

Zhodnocení metody PCR

+ • oproti RFLP levnější a technologicky snazší• malé množství zpracovávané DNA

–• vysoká čistota práce (případná kontaminace vzorku cizí DNA se

fatálně projeví)• nutnost znalosti sekvencí v bezprostředním sousedství úseku

DNA, který chceme pomnožit (syntéza primerů)

RAPD

• random amplification of polymorphic DNA• jedná se o modifikaci PCR

Některá specifika metody RAPD oproti klasické metodě PCR

• R v názvu, zkracuje random, znamenající náhodný, protože výběr úseku, který bude pomnožen je ponechán náhodě

• v reakční směsi je přítomen pouze jeden primer o délce deseti nukleotidů

• reakční podmínky jsou odlišné (teplota 2. teplotní fáze je nižší (ca 34 °C), počet cyklů je vyšší (40 - 45 cyklů))

Zhodnocení metody RAPD

+ • použitelnost pro jakýkoliv (neznámý) genom• technologicky jednoduchá a rychlá metoda• výsledky lze dobře kvantifikovat (sestavení matice a statistické

zpracování)

–• nízká specifita reakce, nereprodukovatelnost výsledků mezi

laboratořemi (lze srovnávat jen interpretace)• lze hodnotit maximálně dva blízce příbuzné druhy (použití

především v populační biologii)

Nejvýznamnější zdroje informací

• www.ueb.cas.cz/download/manual.rtf

• http://botany.natur.cuni.cz/fer/markers/Markery3-DNA,PCR,RAPD.pdf

• http://botany.natur.cuni.cz/fer/markers/Markery5-RFLP,cpDNA.pdf

• Ferák, V. et Sršeň, Š. (1990): Genetika človeka, SPN, Bratislava, 447 s.

Děkujeme za pozornost.